專利名稱：制備亞氨基環(huán)多醇的酶化學方法
制備亞氨基環(huán)多醇的酶化學方法 發(fā)明領域
本發(fā)明涉及制備亞氨基環(huán)多醇的酶化學方法。合成的產(chǎn)物可以用 作食品工業(yè)的食品添加劑和功能性成分，以及治療藥物(例如，治療 糖尿病)。
背景技術：
多羥基化合物，例如低聚糖、復合糖以及脂質(zhì)和其蛋白質(zhì)軛合物， 是例如器官發(fā)育和轉(zhuǎn)移中的細胞粘附、病毒感染、細胞分化等生物學
識別的生化過程中非常重要的分子(Koeller， K. M. , Wong， C. H.， Nat. W"e由o入18 ( 2000 ) 835 )。因此，參與它們的合成或降解的 酶，糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶分別構成抑制或活化靶(根據(jù)Kolter， T.， Wendeler， M. ， C力e/z/6/oc力e邁4 ( 2003 ) 260 ),因為它們涉及代謝性 障礙和疾病，例如II型糖尿病、乙型和丙型肝炎、戈謝病、法布萊病、 嚢性纖維化、結腸癌或者包括HIV的病毒感染(Asano, N. ， /. f/7z//z/e
15 ( 2000 ) 215; Asano， N. ， 67/co6/o/o^r 13 ( 2003 ) 9 3R; Fiaux， H., Popowycz， F. ， Favre， S., Schutz, C., Vogei， P.， Gerber-Lemaire， S. ， Jui 1 lerat-J"eanneret, L. ， /. #et/. C力e邁.48 (2005 ) 4237 )。
在作為糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶抑制劑的多羥基化合物中，突出的亞 氨基環(huán)多醇的類型是吡咯烷、旅啶、吲咪雙烷(indolizidine)、吡 咯雙烷(pyrrolizidine)、去曱莨菪烷和七元多羥基亞氨基環(huán)多醇， 在其他化合物中，其中一些是糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶的強效抑制劑。 (Asano， N. , J.紐/邁e 15( 2000 ) 215; Asano， N. ， C77C由.o/og/
13 ( 2003 ) 93R; Lillelunh， V. H. ， Jensen, H. H. ， Liang, X. ， Bols， M. ， 1 02 ( 2002 ) 515 ; Compain， P. ，Martin, 0. R.，
C"rr. 7b/ U. J ( 2003 ) 541; Mehta， G. ， Lakshminath， S.，7Wr由d濯Ze". 43 ( 2002 ) 331; Moris-Varas， F. ， Qian， X.-H.， Wong, C.-H. ， /K:/ e瓜紋118 10 ( 1996 ) 7647; F畫tes， J.， Olano， D. , Pradera， M丄，7Wr由d價Ze". 40 ( 1999 ) 4063; Li， H. Q. , Bleriot， Y. ， Chantereau， C. ， Mallet, J. M. , Sollogoub, M. ， Zhang,Y.M. ， Rodr iguez-Garcia， E. , Vogel， P. ,J imenez-Barbero， J. , Sinay， P. ， (Zrg. "/o邁o/. C力e瓜2 ( 2004 ) 1492; Lin， C. C. , Pan, Y.S. ， Patkar， L. N. ， Lin， H. M. ， Tzou, D. L. M. ， Subramanian， T., ^/oorg. #e《C力eyz7. 12 ( 2004 ) 3259; Godin， G. , Garnier， E. ， Compain, P. ， Martin, 0. R， ， Ikeda， K. ， Asano， N. , 7Wi"a力e^ro/7 45 (2004 ) 579 )。
某些衍生物例如米格列醇和麥格司他是治療II型糖尿病的上市 藥物(Platt， F.M.， Butters, T. D. ， "r喂63 ( 2003 ) 2435 )。
述為食品工業(yè)中的功能性成分或者食品添加劑。因此，US20010018090 公開了 l-脫氧野尻霉素或其類似物作為可以摻入至食品或飲料中的 卡路里減少劑的用途。US20060222720公開了含有夜香牛(Vernonia cinerea )和桑椹的含水溶劑提取物作為活性成份的厭食藥。 W02004037001公開了桑椹提取物添加至含糖食品中用于調(diào)節(jié)血糖水平。
到目前為止，公開的亞氨基環(huán)多醇合成的化學酶策略是基于使用 醛縮酶，能夠催化醛和酮立體選擇性的羥醛縮合反應的酶。(Vonder Osten， C. H. ， Sinskey， A. J. ， Barbas， C. F. ， III, Pederson， R丄， Wang, Y. F. , Wong, C. H. , /. J邁.C力e邁.Soc. Ill ( 1989 ) 3924, Romero, A. , Wong, C. H. , /. ^r《.65 ( 2000 ) 8264， Look, G. C. , Fotsch, C. H. , Wong, C. H.，力cc. C力e瓜紐26 ( 1993 ) 182, Machajewskif, T.D. ， Wong, C.H. ， /l/^e^ /"t fcr. 39 ( 2000 ) 1 353 ;專利
(US005329052A))。在已知的醛縮酶中，磷酸二羥丙酮(DHAP) -依賴性醛縮酶由于四種原因而備受矚目
1 )其可得性，因為它們中的一些是商業(yè)可獲得的或者因為由修飾的A co7/制備它們是相對容易的，
2) 其高立體選擇性，
3) 其對受體酪的廣泛的結構耐受性，以及
4) 其手性能力。
DHAP依賴性醛縮酶(DHAP-醛縮酶)催化與受體醛可逆的DHAP羥 醛加成，得到具有兩個新的手性中心的a, (3-二羥基酮。特別有趣的 是注意到四種立體互補的(stereocomplementary ) DHAP-趁縮酵(圖 l)是已知的D-果糖-1， 6-二磷酸醛縮酶(FruA) ;L-鼠李樹膠糖-l-磷酸醛縮酶(RhuA) ;L-墨角藻糖-1-磷酸醛縮酶(FucA );和D-塔格 糖-1， 6-二磷酸醛縮酶(TagA)。有利地，這些生物催化劑具有某些 控制羥醛加成立體化學的能力，新生成的手性中心的構型取決于酶而 非試劑。
使用DHAP-醛縮酶的亞氨基環(huán)多醇合成的一般化學酶合成方案如 圖2所示。該方案的關鍵步驟是由DHAP-醛縮酶催化的DHAP加成至氨 基醛或其合成等價物的羥醛加成。在該步驟中生成兩個構型取決于酶 的手性中心，雖然有大量的實例，其中取決于底物，酶失去選擇性， 得到非對映產(chǎn)物。接下來的步驟是通過酸性磷酸酶水解醛醇加合物的 磷酸酯部分。最后，Cbz消除和轉(zhuǎn)化為亞氨基環(huán)多醇通常在一步中進 行。
磷酸二羥丙酮(DHAP)的制備是該合成的關鍵步驟。根據(jù)Jung 等公開的內(nèi)容(Jung, S.-H. ， Jeong, J.-H. , Miller， P. ， Wong， C.-H. ， /. C力e瓜59 ( 1994 ) 7182 )，通過五步實現(xiàn)磷酸二羥丙酮 的化學合成，總產(chǎn)率為約60% (圖3)。
DHAP "原位"生成的多酶系統(tǒng)是一種可選擇的方法。這些是需要 非常精確控制反應條件和反應混合物中妨礙最終產(chǎn)物的分離和純化的 組分的存在的復雜過程(Fessner ， W. D. , Sinerius , G.,
( 1994 ) 209; Cha簡ntray， F. , El Blidi， L. ， Geff laut, T. ， Hecquet， L. ， Bolte, J. , Lemaire，M. ， /. Org. C力e瓜69 (2004) 9310， Sanchez—Moreno, I. ， Francisco Garcia—Garcia,J. ， Bastida， A. ， Garcia Junceda， E. , Co/z/邁肌(2004 ) 1634 )。
在專利(US005329052A)中以及如Von der 0s ten等公開的(Von der 0sten, C. H. , Sinskey， A. J. ， Barbas， C. F. , III， Pederson， R. L. ， Wang， Y. F. ， Wong， C. H. ， /. j邁.C力e瓜Soc. Ill ( 1989 ) 3924 )， 在砷鹽的存在下二羥基丙酮作為DHAP的替代物用于酶的羥酪加成。雖 然簡化了方法，但由于其毒性以及因此它們的環(huán)境和健康危害，使用 砷鹽是不適用的。
已經(jīng)公開的亞氨基環(huán)多醇的化學酶合成從受體醛開始使用大約8 步其中兩步是酶步驟，DHAP的羥醛加成至醛，和磷酸酯水解；DHAP 合成的6個化學步驟，以及相應亞氨基環(huán)多醇的生成。如果使用多酶 系統(tǒng)進行反應，還需要2種酶 一種用于關鍵中間體DHAP的生成，另
一種用于再生酶磷酸化試劑。因此，這些是具有大量步驟或者非常復 雜并因此具有有限的工業(yè)實用性的策略。
發(fā)明概述
本發(fā)明的一個目的是制備對應于式(i) 、 (n) 、 (in)或(iv)
的亞氨基環(huán)多醇的化學酶方法
-W和W相同或不同，并且獨立地選自H、 0H、羥曱基、甲基、 乙基、丁基、戊基、己基、辛基、異丙基、異丁基、2-甲基丁基和芐
基；
-f選自H、羥曱基、輕乙基、乙基、丁基、戊基、己基、辛基、 十二烷基、異丁基、異丙基、異戊基、2-甲基丁基、芐基和苯乙基； -n: 0或1;
-式I的亞氨基環(huán)多醇中R'和R2取代基連接的碳原子的構型相同 或不同，并且獨立地選自i 和《和-式ii、 in或iv的亞氨基環(huán)多醇中手性中心(*)相同或不同，
并且獨立地選自y 和5，
其特征在于其包括下述步驟
i )由D-果糖-6-磷酸醛縮酶(FSA)催化的二羥基丙酮(DHA)和 受體氨基醛的羥醛加成，所述受體氨基醛對應于式V、 VI或VII:
(V)(VI) (VII)
其中
-Ri、 f和n如上述定義；
-式v中r和R2取代基連接的碳原子的構型和式vi和vn中的手
性中心相同或不同，并且獨立地選自A和《和 -Cbz代表節(jié)氧羰基； 和
ii )在金屬催化劑的存在下，步驟U )得到的加成加合物與H2 的分子內(nèi)還原氨基化，任選與式R3-CH0的醛進行所述的步驟(ii)， 其中R3如上述定義，導致雙重還原氨基化。
發(fā)明詳述
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過基于使用D-果糖-6-磷酸醛縮酶，下文稱 為FSA,作為用于二羥基丙酮和式V、 VI或VII的氨基醛的羥醛加成 反應的生物催化劑的方法合成亞氨基環(huán)多醇是可能的。
FSA催化DHA和羥乙醛、D, L-甘油醛-3-磷酸、D-甘油醛和D-赤 蘚糖的羥醛力p成的能力是已知的(Schtirmann, M. ; Sprenger ， G. A./.萬/o人C力e瓜(2001 ) 276 11055 )。而且，已知FSA的活性位 點包括精氨酸殘基，精氨酸殘基是令人滿意地安排其天然底物和引發(fā) 酶反應所必需的。酶活性位點的性質(zhì)決定用作底物的化合物的性質(zhì)， 并且由Schurman等(s"; ra )可以推斷最好的受體底物是其描述的親令人驚訝的，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)雖然式(V) 、 (VI)和(VII)
的氨基醛具有完全不同的理化性質(zhì)，與現(xiàn)有技術已知的底物相比是高 度疏水性的，但羥醛加成可以有效地進行。
此外，在Schurman等(s";;ra)中，通過光譜技術沒有完全表征 通過FSA生產(chǎn)的羥醛加成加合物，也沒有解析加合物的立體化學。因 此，不可能推論式V、 VI和VII的氨基醛是FSA的底物，或者反應的 最終立體化學適于本發(fā)明的產(chǎn)物。
使用FSA獲得的另外的好處如下
-FSA使用二羥基丙酮(DHA)代替磷酸二幾丙酮(DHAP)用于羥 醛加成反應，與上述DHAP依賴性醛縮酶方法相比，節(jié)省了 5個合成步 驟。
-避免了通過酸性磷酸酶酶水解磷酸酯基團的步驟，因此，減少了 合成步驟和生產(chǎn)成本。
-FSA制備和純化是簡單和低成本的。
-FSA作為生物催化劑在4'C下至少穩(wěn)定7個月而不喪失活性，以
及
-不使用也不生成毒性殘留物。如上文提及的，在砷鹽的存在下， DHAP-醛縮酶會使用DHA,高毒性產(chǎn)物，這對健康和環(huán)境有害。
最后，這些生物催化劑的另一個好處是它們具有某些控制羥醛加 成立體化學的能力。因此，新生成的手性中心的構型取決于酶而非羥
醛力口成試齊'j 。
因此，本發(fā)明的一個目的是如上文所定義的化學酶方法。 胺保護基的消除，以及步驟(ii)中的分子內(nèi)還原氨基化可以發(fā)
生于一鍋反應，優(yōu)選地發(fā)生于一鍋反應。
優(yōu)選的實施方案是本發(fā)明的方法，其中亞氨基環(huán)多醇是式I的亞
氨基環(huán)多醇，其選自米格列醇；麥格司他；D-蕎麥堿(fagomine);
l-脫氧野尻霉素；其^取代衍生物，例如，^丁基-D-蕎麥堿；以及l(fā)，
4-二脫氧-1, 4-亞氨基-D-阿拉伯糖醇。更優(yōu)選地，亞氨基環(huán)多醇選自D-蕎麥堿；l-脫氧野尻霉素；和薩丁基-D-蕎麥堿。
本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案是方法，其中U)的氨基醛是V 型保護的氨基醛，其作為舉例而不限制本發(fā)明的范圍，并且屬于下組 薩Cbz-3-氨基丙醛，和(S)-A^Cbz-3-氨基-2-羥基丙醛。
本發(fā)明特別的實施方案是本發(fā)明的方法，其中步驟U)中所用的 FSA酶對應于具有SEQ ID N02的E. coli FSA。本發(fā)明所用的D-果糖 -6-磷酸醛縮酶(FSA)已被克隆于來源于A co//K-12菌林的A co7/ MC4100菌林(Schti r隠n, M. ; Sprenger, G. A./.腸/. (7力復(2001 ) 276 11055; Casadaban, M. J. ( 1976 ) /. 5/o人104, 541—555 ) 并隨后被純化。因此，所用的優(yōu)選的FSA酶在于野生型，該野生型天 然地存在于所述微生物體中并具有符合SEQ IDN02的氨基酸序列。由 于現(xiàn)有技術中存在的信息和方法，可以分離和鑒定其他微生物體中的 任何其它野生型D-果糖-6-磷酸醛縮酶(FSA)。因此，本發(fā)明的其他 實施方案是方法，其中FSA酶是從除f. co7i外的微生物體分離的具 有與SEQ ID N02類似的序列的酶。
如本文使用的，術語"類似的，，意在包括任何可以從微生物體分 離的并且具有二幾基丙酮(DHA)和式V、 VI或VII的受體醛(圖4) 羥醛加成能力的氛基酸序列。 一般的，類似氨基酸序列與前面引用的 氨基酸序列是基本上同源的。如本文使用的，表述"基本上同源的" 是指所述的氨基酸序列具有至少30%，優(yōu)選至少85%,或者更優(yōu)選至少 95%的同一性程度。
本發(fā)明的其他特別的目的是本發(fā)明的方法，其中步驟(ii)中所 用的金屬催化劑，作為舉例而不限制本發(fā)明的范圍，屬于下組Pd、 Pt、 Rh以及Pd和氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)的組合物。
附圖
描述
圖l-DHAP-醛縮酶的立體化學。
圖2-亞氨基環(huán)多醇酶合成的一般方案。Nequiv:保護的胺或疊氮， 例如千氧羰基-NH-、叔-丁氧羰基-NH-、 9-芴曱氧羰基-NH-、苯乙?；?-NH-和疊氮基。a) DHAP-醛縮酶，b)酸性磷酸酶，c)在金屬催化劑或還原劑的存在下與H2的分子內(nèi)還原性氨基化。
圖3-磷酸二幾基丙酮(DHAP)的合成方案。a) HC(0Et)3， H2S04 催化劑，EtOH， b) Cl (O)P(OPh)"無水吡淀，DMAP催化劑，c)H250 psi，晶體Pt02， EtOH， d) H20， 65匸，e)NaOH水溶液，pH高達7， f ) Do證H+， 65°C。
圖4-使用本發(fā)明的方法合成D-蕎麥堿、^丁基-D-蕎麥堿和1-脫 氧野尻霉素的舉例反應的方案a)FSA, b ) Pd/C H2壓力50 ps i，和 c) CH3CH2CH2COH， Pd/C H2壓力50 psi。
實施例
接下來，用5個實施例舉例說明使用該方法制備D-蕎麥堿、^丁 基-D-蕎麥堿、1-脫氧野尻霉素和1, 4-二脫氧-l， 4-亞氨基-D-阿拉 伯糖醇(DAB)。接下來詳述的反應的一般方案如圖4所示。
實施例1 D-蕎麥堿的合成
步驟1 )羥醛加成加合物的制備
通過Espelt等(Espelt， L , Parella， T. , Bujons， J. ， Solans, C. ， Joglar， J. ， Delgado, A. ， Clap 6 s， P. ， C力e瓜-紐./, 9 ( 2003 ) 4887; Ocejo， M. ， Vicario, J.L., Bad { a， D. ， Carrillo， L. ， Reyes, E. ， ( 2005 ) 2110 )公開的常規(guī)方法由3-氨基丙醇得到起始
醛，戶Cbz-3-氨基丙醛。
使用二甲基酰胺(40mL)將^Cbz-3-氨基丙醛(2. 1 g, 22. 9 mmol ) 溶解于容積為250 mL并且裝有軌道攪拌的的反應器中。將使用硼酸硼 酸鹽緩沖劑50mMpH7( 155mL)溶解的二羥基丙酮(4. 7 g, 22. 9 mmol ) 和FSA酶原粉(raw powder ) ( 2. 09g， 3445U )加入到該溶液中。在 軌道攪拌(120rpm)下，在4'C使混合物反應24小時。在這一點反應 轉(zhuǎn)化大于98°/。。然后，向反應混合物中加入MeOH( 200mL),出現(xiàn)沉淀， 通過離心分離沉淀。通過反相液相色譜法純化上清液。收集純的餾分， 蒸發(fā)溶劑，得到4. 7g白色固體(產(chǎn)率69%，非對映體過量99%)。
通過在75。C下熱處理來自發(fā)酵和細胞破碎的粗蛋白質(zhì)提取物40 分鐘實現(xiàn)FSA的制備和純化(Sch畫ann， M. ， Sprenger， ， G. A,/. C力e邁.276 ( 2001 ) 11055; Thorell， S. ， Schurmann， M，， Sprenger， G. A， ， Schneider, G. , /. 萬/o人319 ( 2002 ) 161; Sch畫ann， M. ， Sprenger， G. A. ， /. #o7. C"a/. 5-紐/邁.19 ( 2002 ) 247 )。從來源于A co//'K-12 ( Casadaban, M. J./.脫"/o人(1976 ) 104， 541)的& co// MC4100菌林獲得蛋白提取物，其包含Acoh' FSA蛋白(SEQ ID N01)的編碼序列。克隆、與質(zhì)粒連接以及轉(zhuǎn)化為 i". co// 菌抹詳細描述于 Schurmann ， M. ， Sprenger ， G. A.，
276 ( 2001 ) 11055;如此得到的FSA蛋白(SEQ ID顧) 保持其活性而蛋白雜質(zhì)沉淀，通過簡單的過濾或離心加以分離。 步驟2)脫保護和分子內(nèi)還原氨基化
上一步得到的加合物(373mg， 1.26mmol)溶解于乙醇/水1:9 (50mL)中。在鈀/碳(lOOmg)的存在下將溶液置于壓力50 psi的 H2中。在這些條件下，Cbz基團的消除和分子內(nèi)還原性氨基化同時進 行12小時?？蛇x擇的，在氰基硼氫化鈉(NaCNBH3) (50mg)的存在 下，上一步得到的加合物(373mg, 1. 26畫1 )溶解于乙醇/水1: 9( 50mL) 中。在4巴/碳(100mg)的存在下，將溶液置于室內(nèi)壓的H2中。在這些 條件下，通過鈀作用實現(xiàn)Cbz基團的消除以及在NaCNBH3的存在下分 子內(nèi)還原氨基化。反應同時進行6小時。然后，通過失活的氧化鋁過 濾反應混合物，蒸發(fā)濾液，得到164 mg的D-蕎麥堿固體(產(chǎn)率89%)。,+20. 4 ( c 1. 0 H20) ; 5H ( 500 MHz; D20; 22°C ) 3. 86 ( 1H, dd， J 11. 8和3. 0， 7—H) ， 3. 66 ( 1H， dd， J 11. 8和6. 5， 7-H ), 3. 56 ( 1H， ddd, J 11. 5, 9. 0和5. 0， 4-H ) ， 3. 21 ( 1H t, J 9. 5和 9. 5, 3-H) , 3. 06 ( 1H， ddd， J 12. 9， 4. 4和2. 3, 6-H ) ， 2. 68 ( 1H， dt, J 12. 94， 12. 92和2. 70， 6-H) ， 2.61 ( 1H， ddd， J 9. 68， 6.44 和2. 97, 2-H) ， 2. 01 ( 1H， tdd， J 13. 0， 4. 9， 2. 5和2. 5, 5-H) y 1.48ppm(lH, dq， J 13. 0, 12.9， 11. 5和4. 5， 5-H ) ; 101 MHz;
D20; 22。C)72.9， 72.7, 61.1， 60.9， 42. 6和32. 1。
實施例2 ^丁基-D-蕎麥堿的合成
步驟1)如前一部分羥醛加成加合物的制備。步驟2 )脫保護和雙重還原氨基化
前步得到的加合物(150mg, 0. 51mmol )和丁醛溶解于乙醇/水7: 3 (lOmL)中。鈀/碳(50mg)加入到該溶液中，在50psi的H2中，混 合物反應12小時。然后，方法與前一實施例類似，使用MeOH/CHCh 混合物作為洗脫液通過二氧化硅柱純化反應粗產(chǎn)物后，得到52mg的 #-丁基-D-蕎麥堿固體(產(chǎn)率52%)。D22=_24. 5 "1. 2MeOH) ; S ( 500MHz， D20， 22。C ) 3. 90 ( 1H， dd， J 12. 7和2. 4， 7-H) ， 3. 82 ( 1H， dd， J 12. 7和2. 9, 7-H ), 3. 45 ( 1H, ddd， J 11. 5， 9. 1和5. 1, 4—H ) , 3. 30 ( 1H， t, J 9. 4， 3-H) , 2. 90 ( 1H， td， J 12. 2， 3. 5和3. 5， 6-H ) , 2. 73 ( 1H， ddd， J 13. 3， 11. 2 y 5. 4， 8-H ) , 2. 50 ( 1H， ddd， J 13. 3, 11. 1和5. 2， 8-H) ， 2. 36 ( 1H， dt, J 12. 6, 12. 6和2. 4， 6-H ) ， 2. 16 ( 1H, td， J 9. 8， 2. 6和2. 6Hz, 2-H ) ， 1. 92 ( 1H tdd， J 12. 7， 5. 0， 2. 5和 2.5, 5-H ) ， 1.55-1. 35 ( 3H， m， 5-H和2 x 9-H ) , 1. 30-1.21 (2H， m， 2 x 10-H)和0. 88 ( 3H， t， J 7. 4和7. 4， 11-Me);&, OOlMHz, D20， 22。C)73.2， 72.0， 65.8， 58.1， 52.2, 49.1， 30.5， 25.6， 20.4 和13. 3。
實施例3 1-脫氧野尻霉素的合成
步驟1 )羥醛加成加合物的制備
通過De Luca等(De Luca， L. ， Giacomelli， G. ， Porcheddu， A. ， Org.Ze". 3 ( 2001 ) 3041 )公開的方法由(S)-3-氨基-2-羥基丙 醇得到起始醛，(S)-fCbz-3-氨基-2-羥基丙醛。方法與實施例l公開 的方法相同，但在這種情況下不同的是在25。C下進行反應。
步驟2)脫保護和分子內(nèi)還原氨基化
如實施例l一樣進行，得到164mg的1-脫氧野尻霉素白色固體(產(chǎn) 率89%)。
[a]D22 + 4 8 . 00H2O) 。 'H NMR ( 500 MHz, D20. S ppm 3. 74 (dd, J-11.8, 3.00Hz， 1H), 3.56 (dd， J=ll. 9， 6. 2Hz， 1H)， 3. 4(ddd, J=10.96， 9.06， 5. 25Hz， 1H)， 3. 24(t， J=9.1, 9. 1Hz， 1H) , 3.18 (t， J=9.4， 9.4Hz， 1H) , 3.1 (dd， J=12. 3， 5.2Hz，1H) , 2.54 (hept， J-9.4, 6.0， 3.0, 1H) ， 2.43 (dd， J-12. 3, 11. 0Hz， 1H)。
實施例4 1-脫氧野尻霉素的合成
步驟1)由羥醛加成制備加合物
通過使用IBX (鄰碘?；郊姿?氧化由(R，S)-AK:bz-3-氨基-2-羥基-丙醇(lg， 4.4mmo1)得到起始醛(R， S) -Cbz-3-氨基-2-羥基-丙醛。在裝有軌道振搖的250mL反應器中，回流薩Cbz-3-氨基-2-羥 基-丙醇(lg， 4. 4mmoi )溶解于乙酸乙酯(150mL)中。向該溶液中加 入IBX ( 2. 5g; 2當量)，將反應回流反應3小時。
過濾得到的溶液，使用5% (p/v) NaHC03和飽和的NaCl洗滌乙酸 乙酯層以消除反應副產(chǎn)物。在500mL的反應器中將含有 (R， S) "^-Cbz-3-氨基-2-羥基-丙醛的乙酸乙酯溶液加至二羥基丙酮 (510mg, 5. 7mino1 )和FSA粗粉(235mg, 3445U )的硼酸-硼酸鹽緩沖 液50mM pH8 ( 250mL)的水溶液中。從得到的兩相混合物中蒸發(fā)乙酸 乙酯，這使醛擴散進入水相。隨后在25。C軌道振搖(120rpm)下保持 反應24小時。在這一點反應轉(zhuǎn)化高于98%。然后，向粗反應混合物中 加入MeOH ( 250mL)，通過離心分離固體殘留物。通過反相液相色譜 法純化上清液得到白色固體(600mg，產(chǎn)率44%)。
步驟2)脫保護和分子內(nèi)還原氨基化
前一步得到的加合物(600mg， Ulmmol)溶解于乙醇/水1: 4 (80raL)中。在鈀/碳(176mg)的存在下，溶液置于壓力50psi的H2 中12小時。在這些條件下，Cbz的消除和分子內(nèi)還原氨基化同時進行 12小時。然后通過中性氧化鋁過濾粗反應混合物，蒸發(fā)濾液，得到白 色固體(164mg， 89%產(chǎn)率)。
力NMR ( 500 MHz， At ) S ppm 3. 74 ( dd, 8， 3. OOHz， 1H),
3.56(dd， /-11.9， 6. 2Hz， 1H ) ， 3. 4(ddd， /-10. 96， 9.06, 5. 25Hz, 1H) ， 3. 24 ( t， /=9. 1， 9. lHz， 1H) ， 3. 18 ( t，風4， 9. 4Hz， 1H), 3.1(dd, /-12.3， 5.2Hz， 1H), 2.54(hept， /=9. 4, 6.0， 3.0， 1 H) ， 2.43 Ud, /-12.3， 11. OHz， 1H)。實施例5 1， 4-二脫氧-1， 4-亞氨基-D-阿拉伯糖醇(DAB)的合
成
步驟1 )由羥醛加成制備加合物
通過例如Espelt， L， Parella， T. ， Bujons， J. ， Solans, C.， Joglar， J. ， Delagado, A. ， Clap", P. ， C細.-脫/ 9 ( 2003 ) 4887; 0cejo， M. , Vicario， J丄，Bad "， D. ， Carri 1 lo， L ， Reyes， E. ， 5y"7e〃 ( 2005 ) 2110描述的那些標準方法由2-氨基乙醇得到起 始醛^Cbz-2-氨基乙醛。
在裝有軌道振搖的250mL反應器中將^Cbz-3-氨基乙醛(1. 51g, 7. 8rarao1)溶解于二曱基酰胺(8mL)中。向該溶液中加入溶解于硼酸-硼酸鹽緩沖液50mM pH7. 0 ( 72mL)的二羥基丙酮(0. 71g， 7. 9mmo1 ) 和具有FSA活性的凍干制劑(0. 7g， 1150U)。在25。C軌道振搖(U0rpm) 下反應進行120小時。在這一點反應轉(zhuǎn)化為49%。然后加入MeOH U00mL)，通過離心分離固體殘留物。通過反相液相色語法純化上清 液。收集純的餾分，蒸發(fā)溶劑，得到白色固體(0. 50g， 23%產(chǎn)率)。
步驟2 )脫保護和分子內(nèi)還原氨基化
前一步得到的加合物(500mg， 1.77mmol)溶解于乙醇/水1:9 (90mL)中。在作為催化劑的Pd/CO(Mmg)的存在下，將溶液置于 壓力為50psi的&中12小時。然后通過中性氧化鋁過濾粗反應混合 物，蒸發(fā)濾液，得到白色固體(253mg)。通過陽離子交換色諳法從該 固體中純化得到最終產(chǎn)品，得到lOmM的冊3水溶液。收集純的餾分， 蒸發(fā)溶劑，得到白色固體(129mg， 10%的總產(chǎn)率，99°/。非對映體過量)。 [a ] D20+26. 2 ( c 1. 0 H20 ) ; [ a ] D2。+35. 2 ( c 1. 0 MeOH ) 力NMR ( 500 MHz, D20， 22°C ) 5 (ppm) : 4. 35 ( m, 1H， H4 )， 4.11 (t， /-3. 3Hz， 1H， H3) ， 3.97 ( dd， /-12.2, 4. 6Hz， 1H， H6 )， 3. 85(dd, /-12.2, 8. 3Hz， 1H, 6H) ， 3. 63(dd， /=8. 3, 4. 2Hz， 1H， H2 ) , 3. 59 ( dd， /-12. 6， 4. 8Hz， 1H， H 5 ) ， 3. 37 ( dd, /-12. 6， 2. 7Hz， 1H， H5) 。 13CNMR(101 MHz, D20, 22°C ) 5 ( ppm) : 78.37 (C3 ) , 77. 00 (C4) ， 69.30 ( C2 ) , 61.66 (C6) ， 52.68 ( C5 )。
權利要求
1、制備式(I)、(II)、(III)或(IV)的亞氨基環(huán)多醇的酶化學方法，其中-R1和R2相同或不同，并且獨立地選自H、OH、羥甲基、甲基、乙基、丁基、戊基、己基、辛基、異丙基、異丁基、2-甲基丁基和芐基；-R3選自H、羥甲基、羥乙基、乙基、丁基、戊基、己基、辛基、十二烷基、異丁基、異丙基、異戊基、2-甲基丁基、芐基和苯乙基；-n0或1；-式I的亞氨基環(huán)多醇中R1和R2取代基連接的碳原子的構型相同或不同，并且獨立地選自R和S；和-式II、III或IV的亞氨基環(huán)多醇中的手性中心(*)相同或不同，并且獨立地選自R和S，其特征在于其包括下列步驟i)由D-果糖-6-磷酸醛縮酶(FSA)催化的二羥基丙酮和受體氨基醛的羥醛加成，所述氨基醛對應于式V、VI或VII其中-R1、R2和n如上述定義；-式V中R1和R2取代基連接的碳原子的構型和式VI和VII中的手性中心相同或不同，并且獨立地選自R和S；和-Cbz代表芐氧羰基；和ii)在金屬催化劑的存在下，步驟(i)得到的加成加合物與H2的分子內(nèi)還原氨基化，任選與式R3-CHO的醛進行所述的步驟(ii)，其中R3如上述定義，導致雙重還原氨基化。
2、 權利要求1的方法，其特征在于亞氨基環(huán)多醇選自米格列醇、 麥格司他、D-蕎麥堿、1-脫氧野尻霉素、丁基-D-蕎麥堿和1, 4-二 脫氧-1， 4-亞氨基-D-阿拉伯糖醇。
3、 權利要求2的方法，其特征在于亞氨基環(huán)多醇選自D-蕎麥堿、 1-脫氧野尻霉素、f丁基-D-蕎麥堿和l, 4-二脫氧-l，軒亞氨基-D-阿 拉伯糖醇。
4、 權利要求3的方法，其特征在于亞氨基環(huán)多醇選自D-蕎麥堿、 l-脫氧野尻霉素和f 丁基-D-蕎麥堿。
5、 權利要求1的方法，其特征在于(U中的氨基醛是選自薩Cbz-3-氨基丙醛和(S)-^Cbz-3-氨基-2-羥基丙醛的V型保護的氨基醛。
6、 權利要求1的方法，其特征在于步驟(ii)中所用的金屬催化 劑選自Pd、 Pt、 Rh以及Pd和氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)的組合。
7、 權利要求l的方法，其特征在于FSA酶具有與SEQ ID N0: 2至 少85%的同一性程度。
8、 權利要求7的方法，其特征在于FSA酶具有與SEQ ID N0: 2至 少95%的同一性程度。
9、 權利要求8的方法，其特征在于FSA酶包括SEQ ID N02的氨基 酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了制備對應于式(I)、(II)、(III)或(IV)的亞氨基環(huán)多醇的化學酶方法，其中R¹和R²相同或不同，并且獨立地選自H、OH、羥甲基、甲基、乙基、丁基、戊基、己基、辛基、異丙基、異丁基、2-甲基丁基和芐基；R³選自H、羥甲基、羥乙基、乙基、丁基、戊基、己基、辛基、十二烷基、異丁基、異丙基、異戊基、2-甲基丁基、芐基和苯乙基；n0或1；該方法包括(i)由D-果糖-6-磷酸醛縮酶(FSA)和受體氨基醛催化的羥醛加成；和(ii)在金屬催化劑的存在下，步驟(i)得到的加成加合物與H₂的分子內(nèi)還原氨基化，任選在式R³-CHO的醛的存在下進行所述的步驟(ii)，其中R³如上述定義。
文檔編號C12P17/10GK101522905SQ200780036851
公開日2009年9月2日 申請日期2007年8月30日 優(yōu)先權日2006年9月1日
發(fā)明者C·羅扎諾皮雷茲, J·A·卡斯提羅伊科珀斯托, J·尤格拉塔瑪格, P·克拉佩斯薩伯里特 申請人:科學研究高級委員會;比奧格雷恩有限公司