專利名稱：突變ilv5基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及突變乙酰羥酸還原異構(gòu)酶基因(突變ILV5基因)及其用途， 特別涉及用于制造具有優(yōu)良風(fēng)味的酒精飲料的釀造酵母、使用該酵母制造的 酒精飲料、所述酒精飲料的制造方法等。
背景技術(shù)：
Lager啤酒釀造由生成乙醇及風(fēng)味化合物的一次發(fā)酵、及使啤酒風(fēng)味物 質(zhì)熟化的二次發(fā)酵(或儲(chǔ)存期間(largringperiod))的2個(gè)發(fā)酵階段組成。在 一次發(fā)酵中，酵母細(xì)胞生成分別為異亮氨酸及纈氨酸合成中的中間體a-乙酰 基-ct-羥基丁酸及(x-乙酰乳酸。這些乙酰羥酸的一部分向細(xì)胞外擴(kuò)散，通過啤 酒中的非酶氧化脫羧，分別轉(zhuǎn)變?yōu)?種連二酮(vicinal diketone， VDK)，即 2,3-戊二酮及雙乙酰(參照?qǐng)D1)。 VDK會(huì)帶來如黃油味的不愉快味道，2,3-戊二酮及雙乙酰的閾值分別為0.9mg/L及0.15mg/L(非專利文獻(xiàn)l:Meilgaard 1975，詳細(xì)的引用文獻(xiàn)如說明書的最后所記載)。
a-乙酰乳酸的自發(fā)脫羧是雙乙酰生成的限速步驟。VDK量在儲(chǔ)存期間降 低到允許水平?？s短啤酒熟化時(shí)所需的時(shí)間，可通過使用VDK生成量少的 釀造酵母菌株來實(shí)現(xiàn)。乙酰羥酸合酶(11v2p/Ilv6p)、乙酰羥酸還原異構(gòu)酶 (Hv5p)、 二羥酸脫水酶(Hv3p)及支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Batlp) /轉(zhuǎn)氨 酶(Bat2p)催化異亮氨酸及纈氨酸合成的2個(gè)同類反應(yīng)。
為構(gòu)建VDK生成量少的酵母菌株，有使乙酰羥酸合酶失活及強(qiáng)化乙酰 羥酸還原異構(gòu)酶活性的2種不同的研究方法。通過編碼乙酰羥酸合酶的催化 亞基的ILV2基因的反義RNA的負(fù)控制，使酶活性減少超過80%，其結(jié)果， 使發(fā)酵中間點(diǎn)的雙乙酰量降低40% (非專利文獻(xiàn)2: Vakeriaetal. 1991)。
另一方面，編碼乙酰羥酸還原異構(gòu)酶的ILV5基因的數(shù)量對(duì)VDK生成產(chǎn) 生很大影響。用具有ILV5的多拷貝載體轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞與對(duì)照菌株相比， 顯示出還原異構(gòu)酶的活性增加了 5 10倍，同時(shí)顯示出雙乙酰生成減少了 50
4 60%(非專利文獻(xiàn)3: Dillemansetal. 1987;非專利文獻(xiàn)4: Gjermansen et al.
1988)。已知參與異亮氨酸及纈氨酸合成的酶定位于線粒體基質(zhì)中(非專利文 獻(xiàn)5: Ryan及Kohlhaw 1974)。線粒體由2個(gè)親水區(qū)(膜間隙及基質(zhì))、及2 個(gè)膜(外膜及內(nèi)膜)組成(非專利文獻(xiàn)6: Wiedemann etal. 2003;非專利文 獻(xiàn)7: Koehler2004)。
線粒體因只合成8種由線粒體DNA編碼的穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，所以，達(dá)1000 種的線粒體蛋白質(zhì)的大部分由核基因組編碼，在細(xì)胞質(zhì)中的游離型核糖體上 作為前體蛋白質(zhì)合成后，借助于被稱為TOM及TIM的蛋白質(zhì)集合體[分別為 線粒體外膜及內(nèi)膜的轉(zhuǎn)位酶(非專利文獻(xiàn)8: Endoetal.2003;非專利文獻(xiàn)9: Tmscotetal. 2003)]，被轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體膜內(nèi)或跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。11v2p及11v5p在細(xì) 胞質(zhì)中作為前體蛋白質(zhì)被合成后，通過TOM及TIM23轉(zhuǎn)位酶轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體 基質(zhì)中。
N末端前序列在向線粒體基質(zhì)移動(dòng)時(shí)由線粒體的特異性加工肽酶切割 (非專利文獻(xiàn)10: Gakh et al. 2002)。 N末端的47個(gè)殘基作為Uv5p可切割的 前序列而被鑒定(非專利文獻(xiàn)ll: Kassow 1992)。如Kassow所述，構(gòu)建編 碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的區(qū)域中具有缺失的ILV5基因，其構(gòu)建物可影響雙乙酰生成量。
如在典型的線粒體靶向前序列中所常見，11v5p前序列帶大量正電荷，在 從切割位點(diǎn)開始-2位(負(fù)2位)的位置存在精氨酸(非專利文獻(xiàn)12: vonHeijne et al. 1989;非專利文獻(xiàn)10: Gakh et al. 2002)。已知11v5p作為在線粒體DNA
的穩(wěn)定性以及支鏈氨基酸的生物合成中起作用的雙功能蛋白(非專利文獻(xiàn) 13: Zelenaya-Troitskaya et al. 1995)。線粒體DNA作為蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物[類 核體(nucleoid)]被繼承。與其它主要因素結(jié)合，11v5p根據(jù)氨基酸缺乏狀況， 通過將線粒體DNA分配(parsing)到各個(gè)類核體來維持線粒體DNA和類核 體的化學(xué)計(jì)量關(guān)系(非專利文獻(xiàn)14: MacAlpineeta1.2000)。 11v5p在支鏈氨 基酸合成中的酶功能及對(duì)于線粒體DNA穩(wěn)定性的功能，可根據(jù)突變不同通 過不同的研究方法來區(qū)別(非專利文獻(xiàn)15: Batemaneta1.2002)。酶的突變， 位于底物及與輔助因子結(jié)合的重要的保守的內(nèi)部結(jié)構(gòu)域，另一方面，與對(duì)于 線粒體DNA穩(wěn)定性的功能有關(guān)的突變，位于Ilv5p表面的C末端區(qū)域。已知 呼吸缺陷型(rh0-)酵母生成大量的VDK (非專利文獻(xiàn)16: Ernandes et al. 1993)。因此而導(dǎo)出如下假設(shè)，酵母為"異常"(riio-)時(shí)，乙酰羥酸合酶(Ilv2p)
5未在線粒體中恰當(dāng)定位，反而有定位于細(xì)胞質(zhì)的趨勢(shì)，因此，容易由細(xì)胞質(zhì)
的丙酮酸鹽生成a-乙酰乳酸。
基于此假設(shè)，為代謝細(xì)胞質(zhì)中生成的(x-乙酰乳酸，進(jìn)行了細(xì)胞質(zhì)11v5p 的表達(dá)的研究(非專利文獻(xiàn)lh Kassow 1992)。不具有N末端的47個(gè)殘基 的細(xì)胞質(zhì)Ilv5p，在ilv5A株中補(bǔ)足異亮氨酸缺陷，但未補(bǔ)足纈氨酸缺陷，說 明N末端缺失型Uv5p的極小一部分仍然定位于維持異亮氨酸合成的線粒體 中。
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發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)上述狀況，希望開發(fā)出可降低VDK (連二酮)、特別是DA (雙乙 酰)的生成的酒精飲料的制造方法。
為解決上述課題，本發(fā)明者不斷銳意研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在Lager啤酒酵 母中的N末端具有46個(gè)殘基缺失的細(xì)胞質(zhì)Ilv5p的表達(dá)，在結(jié)果上不使得到 的啤酒的品質(zhì)產(chǎn)生大的變化的情況下，可有效減少VDK生成。
即本發(fā)明涉及特定的突變ILV5基因、該基因編碼的蛋白質(zhì)、該基因的 表達(dá)受到調(diào)控的轉(zhuǎn)化酵母、使用該基因的表達(dá)受到調(diào)控的酵母控制產(chǎn)品中的 VDK量、特別是DA量的方法等。具體地說，本發(fā)明提供如下所示多核苷酸、 含有該多核苷酸的載體、導(dǎo)入該載體的轉(zhuǎn)化酵母、使用該轉(zhuǎn)化酵母的酒精飲 料的制造方法等。
(1)多核苷酸，其選自由以下(a) (c)組成的組
(a) 多核苷酸，其由序列號(hào)1的核苷酸序列組成；
(b) 多核苷酸，其編碼由序列號(hào)2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；及 (C)多核苷酸，其編碼以下蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是在添加及/或缺失不
發(fā)生在N末端的條件下，由添加序列號(hào)2中1 15個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取 代、插入及/或添加后的氨基酸序列組成，且具有乙酰羥酸還原異構(gòu)酶活性 的蛋白質(zhì)。(2) 上述(1)中所述的多核苷酸，其選自以下(d)組成的組
(d)多核苷酸，其編碼由序列號(hào)2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)、或編 碼序列號(hào)2中1個(gè)至幾個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或添加的氨基 酸序列，且所述蛋白質(zhì)具有乙酰羥酸還原異構(gòu)酶活性。
(3) 上述(1)中所述的多核苷酸，其由序列號(hào)l組成。
(4) 上述(1)中所述的多核苷酸，其編碼由序列號(hào)2組成的蛋白質(zhì)。
(5) 上述(1) (4)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其為DNA。
(6) 蛋白質(zhì)，其由上述(1) (5)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸編碼。
(7) 載體，其含有上述(1) (5)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。 (7a)上述(7)中所述的載體，其含有包含以下(x) (z)的構(gòu)成要素
的表達(dá)盒
(x)在酵母細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子；
(y)與該啟動(dòng)子以正向或反向結(jié)合的、上述(1) (5)中任一項(xiàng) 所述的多核苷酸；及
(z)與RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止及多聚腺苷酸化有關(guān)的、在酵母細(xì)胞 內(nèi)起作用的信號(hào)。
(8) 酵母，其導(dǎo)入了上述(7)中所述的載體。
(9) 上述(8)中所述的酵母，所述酵母的總連二酮生成能力或總雙乙 酰的生成能力通過導(dǎo)入上述(7)中所述的載體而得到降低。
(10) 上述(8)中所述的酵母，所述酵母的總連二酮生成能力或總雙乙 酰生成能力通過增加上述(6)中所述蛋白質(zhì)的表達(dá)量而得到降低。
(11) 酒精飲料的制造方法，其使用上述(8) (10)中任一項(xiàng)所述的酵母。
(12) 上述(11)中所述的酒精飲料的制造方法，其中，釀造的酒精飲 料是麥芽飲料(malt beverage)。
(13) 上述(11)中所述的酒精飲料的制造方法，其中，釀造的酒精飲 料是葡萄酒(wine)。
(14) 酒精飲料，其由上述(11) (13)中任一項(xiàng)所述的方法制造得到。
(15) 評(píng)價(jià)方法，其使用基于具有序列號(hào)1的核苷酸序列的乙酰羥酸還原異構(gòu)酶基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)的引物或探針，評(píng)價(jià)被測(cè)酵母的總連二酮 生成能力或總雙乙酰生成能力。
(15 a)方法，其根據(jù)上述(15)中所述的方法，篩選總連二酮生成 能力或總雙乙酰生成能力降低了的酵母。
(15 b)方法，其使用根據(jù)上述(15 a )中所述方法篩選的酵母，制 造酒精飲料(例如、啤酒)。
(16) 評(píng)價(jià)方法，其通過培養(yǎng)被檢酵母和測(cè)定編碼具有序列號(hào)1的核
苷酸序列乙酰羥酸還原異構(gòu)酶基因的表達(dá)量來評(píng)價(jià)被測(cè)酵母的總連二酮生成 能力或總雙乙酰生成能力。
(16a)方法，其使用上述(16)中所述的方法，評(píng)價(jià)被測(cè)酵母，篩選 乙酰羥酸還原異構(gòu)酶基因表達(dá)量高的酵母，從而選擇總連二酮生成能力或總 雙乙酰生成能力得到降低的酵母。
(16b)方法，其使用通過上述(16a)中所述方法篩選的酵母，制造 酒精飲料(例如、啤酒)。
(17) 酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)被測(cè)酵母，對(duì)上述(6)中所述的蛋 白質(zhì)定量或測(cè)定具有序列號(hào)1的核苷酸序列的乙酰羥酸還原異構(gòu)酶基因的 表達(dá)量，以及選擇蛋白質(zhì)量或上述基因表達(dá)量與目標(biāo)總連二酮生成能力或總 雙乙酰生成能力相應(yīng)的被測(cè)酵母。
(17a)酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)被測(cè)酵母，對(duì)總連二酮生成能力 或總雙乙酰生成能力或乙酰羥酸還原異構(gòu)酶活性定量，以及選擇具有目標(biāo)總 連二酮生成能力或總雙乙酰生成能力或乙酰羥酸還原異構(gòu)酶活性的被測(cè)酵 母。
(18) 上述(17)中所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被 測(cè)酵母，測(cè)定各酵母中具有序列號(hào)1的核苷酸序列的乙酰羥酸還原異構(gòu)酶 基因的表達(dá)量，選擇與標(biāo)準(zhǔn)酵母相比該基因?yàn)楦弑磉_(dá)的被測(cè)酵母。
(19) 上述(17)中所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被 測(cè)酵母，對(duì)各酵母中上述(6)中所述的蛋白質(zhì)定量，選擇其蛋白質(zhì)量多于標(biāo) 準(zhǔn)酵母的被測(cè)酵母。
(20) 酒精飲料的制造方法，其包括使用上述(8) (10)中所述的酵 母或通過上述(17) (19)中所述方法選擇的酵母中的任一種酵母，進(jìn)行用于酒精飲料制造的發(fā)酵，降低總連二酮生成量或總雙乙酰生成量。


圖l表示異亮氨酸及纈氨酸的生物合成的簡(jiǎn)圖。5個(gè)酶中乙酰羥酸合酶 (AHAS)、乙酰羥酸還原異構(gòu)酶(RI)、 二羥酸脫水酶(DHA)、及支鏈氨基 酸氨基轉(zhuǎn)移酶/轉(zhuǎn)氨酶(BAT)在2個(gè)途經(jīng)中共通。相應(yīng)的基因在括號(hào)內(nèi)表 示。TD:蘇氨酸脫氨酶、KB: (x-丁酮酸、AHB: a-乙酰基-a-羥基丁酸、AL: a-乙酰乳酸、DHMV: a，卩-二羥基-P-戊酸甲酯(a,P-dihydroxy-(3-methylvalerate)、 DHIV: (X， P-二羥基異戊酸。
圖2表示11v5p前體蛋白質(zhì)的N末端的切割。表示IW5p前體蛋白質(zhì)中 的氨基酸編號(hào)。用箭頭表示8種突變蛋白質(zhì)的切割位點(diǎn)。第48位的亮氨酸殘 基(成熟Ilv5p的N末端)處有星號(hào)。將堿性殘基、有羥基的殘基及疏水殘 基分別用黑點(diǎn)、白點(diǎn)及下線表示?？騼?nèi)的殘基是參與乙酰羥酸還原異構(gòu)酶的 NADPH結(jié)合的結(jié)構(gòu)域I中保守的氨基酸(Dumasetal. 1995)。
圖3表示酵母M1-2B株(Stinchcombetal. 1980)中野生型及N末端缺 失型11v5p-GFP融合構(gòu)建物的定位的照片。表示被切割的殘基數(shù)。具有對(duì)照 空載體DNA的細(xì)胞不顯示熒光。比例尺(bar)為5pm。
圖4表示N末端缺失型Ilv5p-GFP的免疫印跡分析的結(jié)果。以各裂解物 中的對(duì)照肌動(dòng)蛋白為內(nèi)標(biāo)使用。從增殖到對(duì)數(shù)期的細(xì)胞中制備總RNA，將標(biāo) 記的ILV5及ACT1 ORF DNA片段作為探針使用，進(jìn)行用于Northern分析的 處理。
圖5表示用于確認(rèn)啤酒發(fā)酵中野生型ILV5基因及細(xì)胞質(zhì)ILV5A46基因 表達(dá)的Northern印跡分析的結(jié)果。從發(fā)酵管中每天1次抽取的樣品中制備總 RNA，將標(biāo)記的ILV5及PDA1 (Wenzel et al. 1993)的ORF片段作為探針使 用，進(jìn)行Northern分析。
圖6表示Lager啤酒酵母中Uv5p過表達(dá)對(duì)啤酒發(fā)酵性能的影響。圖6(a)、 6(b)及6(c)分別表示親株FOY422 ( )、野生型11v5p表達(dá)株FOY437 (o)、 及11v5pA46表達(dá)株FOY438 (▲)在試釀中麥汁中的表觀浸出物、細(xì)胞增殖 及總VDK生成的變化。結(jié)果是3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。標(biāo)準(zhǔn)偏差用誤差條 (errorbar)表不。
具體實(shí)施例方式
連二酮(VDK)是導(dǎo)致如黃油味的啤酒異常味道的原因，其通過a-乙酰 基-a-羥基丁酸及(x-乙酰乳酸的非酶氧化脫羧形成，a-乙?；?a-羥基丁酸及a-乙酰乳酸是在線粒體中發(fā)生的異亮氨酸及纈氨酸生物合成中生成的中間體。 由于ILV2及ILV6基因編碼、參與的乙酰羥酸合酶錯(cuò)誤定位的原因，a-乙酰 乳酸的一部分即使在細(xì)胞質(zhì)中也會(huì)形成，基于此設(shè)想，研究用于代謝細(xì)胞質(zhì) 中形成的a-乙酰乳酸的乙酰羥酸還原異構(gòu)酶(Hv5p)在細(xì)胞質(zhì)中的功能表達(dá)， 并由此發(fā)現(xiàn)總VDK生成量減少了 。在具有各種N末端缺失的突變11v5p酶中， 通過11v5pA46-GFP融合蛋白質(zhì)的顯微鏡觀察判斷出具有46個(gè)殘基缺失的酶 (11v5pA46)在細(xì)胞質(zhì)中有明確的定位，表明ilv5A株中11v5pA46未能補(bǔ)足 異亮氨酸/纈氨酸缺陷。導(dǎo)入工業(yè)用Lager啤酒菌株中時(shí)，Uv5pA46的強(qiáng)表 達(dá)雖然使2L規(guī)模的試釀中總VDK生成量減少，但與野生型11v5p具有同等 程度的效果。與野生型11v5p不同的是，11v5pA46進(jìn)一步的表達(dá)，從芳香族 化合物及有機(jī)酸的含量上來說，結(jié)果未使所得到的啤酒的品質(zhì)發(fā)生變化。本 發(fā)明基于以上結(jié)論得以完成。
1.本發(fā)明的多核苷酸
首先，本發(fā)明提供選自(a)由序列號(hào)1的核苷酸序列組成的多核苷酸、 或(b)編碼由序列號(hào)2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸。由序列號(hào) 2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，是N末端的46個(gè)氨基酸殘基發(fā)生缺失的突變 Hv5p蛋白質(zhì)(也稱為Ilv5pA46)。序列號(hào)1的核苷酸序列編碼Hv5pA46的 氨基酸序列。多核苷酸可以是DNA也可以是RNA。
本發(fā)明中作為對(duì)象的多核苷酸，不只限于上述鑒定的多核苷酸，還包含 (c):在添加及/或缺失不發(fā)生在N末端的條件下，編碼由序列號(hào)2中1 15個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或添加的氨基酸序列組成，且具有乙 酰羥酸還原異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
此種蛋白質(zhì)，可例舉由序列號(hào)2的氨基酸序列中，例如1 15個(gè)、l 14個(gè)、1 13個(gè)、1 12個(gè)、1 11個(gè)、1 10個(gè)、1 9個(gè)、1 8個(gè)、1 7 個(gè)、1 6個(gè)(1 數(shù)個(gè)氨基酸)、1 5個(gè)、1 4個(gè)、1 3個(gè)、1 2個(gè)或1個(gè) 氨基酸殘基發(fā)生缺失、取代、插入及/或添加的氨基酸序列組成，且具有乙酰羥酸還原異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)。上述氨基酸殘基的缺失、取代、插入及/ 或添加的數(shù)量， 一般優(yōu)選較小的數(shù)量。此外，此種蛋白質(zhì)包括(d):具有與序
列號(hào)2的氨基酸序列有約85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89% 以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96% 以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1°/。以上、99.2%以上、99.3%以上、 99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上同
-一性的氨基酸序列，且具有乙酰羥酸還原異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)。上述同源性 的數(shù)值一般越大越好。
乙酰羥酸還原異構(gòu)酶活性，例如可根據(jù)Methods Enzymol., 17: 751-755(1970)中記載的Arfin et al.的方法測(cè)定。
此外，本發(fā)明也可包含(d)多核苷酸，其含有與由序列號(hào)1的核苷酸序 列的互補(bǔ)核苷酸序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有乙酰羥 酸還原異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；及(f)多核苷酸，其含有與由編碼序 列號(hào)2的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)核苷 酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有乙酰羥酸還原異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的多核 苷酸。編碼N末端47個(gè)氨基酸殘基發(fā)生缺失的突變11v5蛋白質(zhì)的多核苷酸， 應(yīng)從本發(fā)明中除去。
在此，"在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的多核苷酸"，是指通過以由序列號(hào)1的 核苷酸序列的互補(bǔ)核苷酸序列組成的多核苷酸、或編碼序列號(hào)2的氨基酸
序列的多核苷酸的全部或一部分為探針而使用的菌落雜交法、噬菌斑雜交法
或Southern雜交法等得到的核苷酸(例如DNA)。雜交方法，例如可利用 Molecular Cloning 3rd Ed.、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997等中記載的方法。
本說明書中所述的"嚴(yán)謹(jǐn)條件"可為低嚴(yán)謹(jǐn)條件、中嚴(yán)謹(jǐn)條件、高嚴(yán)謹(jǐn) 條件中的任一種。"低嚴(yán)謹(jǐn)條件"，例如，為5xSSC、 5xDenhardt溶液、0.5 %SDS、 50%甲酰胺、32'C的條件。"中嚴(yán)謹(jǐn)條件"，例如，為5xSSC、 5xDenhardt溶液、0.5%SDS、 50%甲酰胺、42。C的條件。"高嚴(yán)謹(jǐn)條件"， 例如，為5xSSC、 5xDenhardt溶液、0.5%SDS、 50%甲酰胺、50。C的條件。 在上述條件中，越提高溫度，越能期待高效獲得具有高同源性的多核苷酸(例 如DNA)。但影響雜交嚴(yán)謹(jǐn)性的因素有溫度、探針濃度、探針長(zhǎng)度、離子強(qiáng)度、時(shí)間、鹽濃度等多種因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員均可適當(dāng)選擇這些因素。
雜交中使用市售試劑盒時(shí)，例如，可使用Alkphos Direct Labelling Reagents [Amersham Pharmacia公司制]。此時(shí)，根據(jù)試劑盒中附帶的說明方 案，與標(biāo)記了的探針進(jìn)行一夜培養(yǎng)后，將膜在55°C的條件下，用含有0.1% (w/v) SDS的1次洗滌緩沖液洗滌，之后可檢測(cè)雜交后的多核苷酸(例如DNA)。
其他可雜交的多核苷酸包括，如通過FASTA、 BLAST等同源性搜索軟 件，使用默認(rèn)參數(shù)計(jì)算，與編碼序列號(hào)2的氨基酸序列的多核苷酸有約85% 以上、86%以上、87%以上、88%以上、89°/。以上、90%以上、91%以上、92% 以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99% 以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6% 以上、99.7%以上、99.8%以上、99.9%以上同一性的多核苷酸。
氨基酸序列間或核苷酸序列間的同一性，可使用根據(jù)Kariin及Altschul 的BLAST算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87， 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873， 1993)確定。開發(fā)了基于BLAST算法、被稱為 BLASTN、 BLASTX的程序(Altschul SF， et al: J. Mol. Biol. 215: 403， 1990)。 使用BLASTN分析核苷酸序列時(shí)，參數(shù)例如為score=100、 wordlength=12。 使用BLASTX分析氨基酸序列時(shí)，參數(shù)例如為score=50、 wordlength=3 。使 用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)，使用各程序的默認(rèn)參數(shù)。
2.本發(fā)明的蛋白質(zhì)
本發(fā)明還提供由上述多核苷酸(a) (d)中任一個(gè)編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的 優(yōu)選蛋白質(zhì)，包含在添加及/或缺失不發(fā)生在N末端的條件下，序列號(hào)2 的氨基酸序列中1或幾個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或添加的氨基酸 序列，且具有乙酰羥酸還原異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)。
此種蛋白質(zhì)，包括具有序列號(hào)2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及 /或添加上述數(shù)量的氨基酸殘基的氨基酸序列，且具有乙酰羥酸還原異構(gòu)酶 活性的蛋白質(zhì)。此種蛋白質(zhì)還包括與序列號(hào)2的氨基酸序列有如上所述的 約85%以上、更進(jìn)一步優(yōu)選約卯％以上、或最優(yōu)選約95%以上同源性，且具 有乙酰羥酸還原異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)。
此種蛋白質(zhì)，可使用《分子克隆》第3版、《Current Protocols in MolecularBiology》、"Nuc. Acids. Res., 10， 6487 (1982)"、 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)"、 "Gene, 34, 315 (1985)"、 "Nuc. Acids. Res" 13， 4431 (1985)"、 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82， 488 (1985)"等中記載的定點(diǎn)誘變法獲得。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)氨基酸序列中1個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基發(fā)生缺失、取代、 插入及/或添加，是指在同一序列中的任意l個(gè)或幾個(gè)位置上，有l(wèi)個(gè)或幾 個(gè)氨基酸殘基發(fā)生缺失、取代、插入及/或添加之意。缺失、取代、插入及 添加中的2種以上也可同時(shí)發(fā)生。
以下，舉例說明可相互取代的氨基酸殘基。以下同一組中包含的氨基酸 殘基可相互取代。
A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o-甲基絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、環(huán)己基 丙氨酸；B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸、2-氨基己二酸、 2-氨基辛二酸；C組天冬酰胺、谷氨酰胺；D組賴氨酸、精氨酸、鳥氨 酸、2， 4-二氨基丁酸、2， 3-二氨基丙酸；E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸；F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；G組苯丙氨酸、酪氨酸。
另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可通過Fmoc法(9-芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔 丁氧羰基法)等的化學(xué)合成法制造。也可利用Advanced ChemTech公司制、 珀金埃爾默(Perkin Elmer)公司制、Pharmacia公司(Pharmacia公司)制、 Protein Technology Instruments公司制、Synthecell-Vega公司帝lj、 PerSeptive 公司制、島津制作所等制作的肽合成儀進(jìn)行化學(xué)合成。
3.本發(fā)明的載體及導(dǎo)入該載體的轉(zhuǎn)化酵母
其次，本發(fā)明提供含有上述多核苷酸的載體。本發(fā)明的載體含有上述 (a) (d)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸(例如DNA等)。本發(fā)明的載體通常如下 構(gòu)成，其含有包含以下構(gòu)成要素的表達(dá)盒(x)在酵母細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng) 子；(y)與該啟動(dòng)子以正向或反向結(jié)合的、上述(a) (i)中任一項(xiàng)所述的多核 苷酸(例如DNA等)；以及(z)與RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止及多聚腺苷酸化有 關(guān)的、在酵母中起作用的信號(hào)。
導(dǎo)入酵母時(shí)使用的載體可以是多拷貝型(YEp型)、單拷貝型(YCp型)、 染色體整合型(Yip型)中的任一種。例如，YEp型載體的YEp24 (J. R. Broach
14et al" Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983)、 YCp型載體的YCp50 (M. D. Rose et al.， gene， 60, 237, 1987)、 Yip型載體的YIp5 (K. Struhl et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1035, 1979)
均已為人所知，且易獲得。
只要能在釀造用酵母中起作用，同時(shí)又不影響醪液中氨基酸及浸出物等 成分的濃度，可任意組合用于調(diào)控酵母中基因表達(dá)的啟動(dòng)子/終止子。例如 可利用甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(TDH3)的啟動(dòng)子、3—磷酸甘油酸激酶基 因(PGK1)的啟動(dòng)子等。這些基因已被克隆，例如在M.F.Tuiteetal.,EMBO J., 1, 603 (1982)中已詳細(xì)記載，可通過己知方法很容易地獲得。
因?yàn)獒勗煊媒湍笗r(shí)不能利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記作為轉(zhuǎn)化時(shí)使用的選擇性標(biāo) 記，所以可利用氨基糖苷類抗生素抗性基因(G418r)、銅抗性基因(CUP1) (Marin et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81， 337 1984)、淺藍(lán)菌素抗性基因 (fas2m, PDR4)(分別為豬腰淳嗣等,生化學(xué)，64， 660, 1992; Hussain et al., gene, 101, 149, 1991)等。
如上所述構(gòu)建的載體被導(dǎo)入宿主酵母。宿主酵母可例舉為可用于釀造的 任意酵母，例如可為啤酒、葡萄酒和清酒等的釀造用酵母等。具體地說，可 例舉酵母屬(Sacc/wram^M)等的酵母。在本發(fā)明中，Lager啤酒酵母例如 可使用巴斯德酵母(fecc/wramyc^ ) W34/70 、卡氏酵母
(Sacc/zaramyca cw/Awge"^) NCYC453或NCYC456 ，或釀酒酵母 (Sacc/7a國(guó)戸s ce固ie ) NBRC1951 、 NBRC1952 、 NBRC1953 或 NBRC1954。葡萄酒酵母可使用例如協(xié)會(huì)(Brewing Society of Japan)葡萄酒用1 號(hào)、3號(hào)、和4號(hào)等；清酒酵母可使用例如協(xié)會(huì)酵母、清酒用7號(hào)和9號(hào)等， 但不限于此。本發(fā)明中，Lager啤酒酵母例如可優(yōu)選使用巴斯德酵母。
酵母的轉(zhuǎn)化方法，可利用一般可使用的公知的方法。例如，可使用電穿 孔法"Meth. Enzym.， 194, pl82(1990)"、原生質(zhì)球法"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 pl929(1978)"、醋酸鋰法"J.Bacteriology, 153， pl63(1983)"、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 pi929(1978)、 Methods in Yeast Genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中所述的方法實(shí)施，但不限于 此。
更具體地說，將宿主酵母置于標(biāo)準(zhǔn)酵母營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基[例如YEPD培養(yǎng)基
15"Genetic Engineering. Vol.1, Plenum Press, New York, 117(1979)"等]中培養(yǎng)， 使OD600nm值為1 6。將該培養(yǎng)酵母離心分離后收集、洗滌，用濃度約為 1 2M的堿金屬離子(優(yōu)選鋰離子)進(jìn)行預(yù)處理。將此細(xì)胞在約3(TC下、靜 置約60分鐘后，與待導(dǎo)入的DNA (約1 20嗎) 一起在約3(TC下、靜置約 60分鐘。加入聚乙二醇，優(yōu)選加入約4,000道爾頓的聚乙二醇，使最終濃度 約為20% 50%。在約3(TC下、靜置約30分鐘后，將此細(xì)胞在約42"C下、 加熱處理約5分鐘。優(yōu)選將此細(xì)胞懸浮液用標(biāo)準(zhǔn)酵母營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基洗滌后，放 入規(guī)定量的新鮮標(biāo)準(zhǔn)酵母營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，約3(TC下、靜置約60分鐘。之后， 接種到含有作為選擇性標(biāo)記使用的抗生素等的標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基中，獲得轉(zhuǎn)化 體。
其他有關(guān)一般性的克隆技術(shù)可參照(《分子克隆》第3版)、"Methods in Yeast Genetics 、 A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 、 Cold Spring Harbor, NY)，，等。
4. 本發(fā)明的酒精飲料制造方法及根據(jù)其制法獲得的酒精飲料
將上述本發(fā)明的載體導(dǎo)入適合釀造目的酒精產(chǎn)品的酵母中。使用該酵母， 可降低所需酒精飲料的VDK、特別是DA的量，制造出風(fēng)味提高了的酒精飲 料。也可使用通過本發(fā)明的酵母評(píng)價(jià)方法選擇的酵母。作為制造對(duì)象的酒精 飲料包括并不限于，例如，啤酒、啤酒味飲料等的發(fā)泡酒、葡萄酒、威士忌、 清酒等。
制造上述酒精飲料時(shí)，除使用本發(fā)明中所得到的釀造酵母代替親株以外， 其他為公知方法。因此，原料、制造設(shè)備、制造管理等可與以往方法完全相 同，不會(huì)因制造VDK、特別是DA的量減少了的酒精飲料而增加成本。即根 據(jù)本發(fā)明，可在使用已有設(shè)備、不增加成本的情況下，制造出風(fēng)味提高了的 酒精飲料。
5. 本發(fā)明的酵母的評(píng)價(jià)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用基于具有序列號(hào)1核苷酸序列的乙酰羥酸還原異構(gòu)酶 基因的核苷酸序列而設(shè)計(jì)的引物或探針，評(píng)價(jià)被測(cè)酵母的總連二酮生成能力 或總雙乙酰生成能力的方法。此種評(píng)價(jià)方法的一般技術(shù)是公知的，例如，如WO01 / 040514號(hào)公報(bào)、日本特開平8—205900號(hào)公報(bào)等中所記載。以下， 就此評(píng)價(jià)方法進(jìn)行以下說明。
首先，制備被測(cè)酵母的基因組。制備方法可使用Hereford法、醋酸鉀法 等公知的任何方法[例如，Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pl30 (1990)]。以所得到的基因組為對(duì)象，使用基于乙酰羥 酸還原異構(gòu)酶基因的核苷酸序列(優(yōu)選ORF序列)而設(shè)計(jì)的引物或探針，測(cè) 定被測(cè)酵母的基因組中是否存在該異構(gòu)酶基因或其特異性序列。引物或探針 的設(shè)計(jì)可使用公知的方法進(jìn)行。
基因或特異性序列的檢測(cè)可使用公知的方法進(jìn)行。例如，將包含特異性 序列的一部分或全部的多核苷酸或包含其核苷酸序列的互補(bǔ)核苷酸序列的多 核苷酸作為一個(gè)引物使用，另一個(gè)引物使用包含此序列的上游或下游序列的 一部分或全部的多核苷酸或包含與所述核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的多核 苷酸，通過PCR法擴(kuò)增酵母的核酸，并測(cè)定擴(kuò)增物的有無(wú)、擴(kuò)增物分子量的 大小等。用于引物的多核苷酸的堿基數(shù)通常為10bp以上，優(yōu)選為15 25bp。 夾在兩引物間的堿基數(shù)通常為300 2000bp是適宜的。
PCR法的反應(yīng)條件無(wú)特別限定，例如，可使用變性溫度90 95°C、退 火溫度40 60°C、延伸溫度60 75°C、循環(huán)數(shù)10次以上等的條件。所 得到的反應(yīng)生成物可使用瓊脂糖凝膠等的電泳法等分離，測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的分 子量。根據(jù)此方法，通過擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量是否是含有特異部分的DNA分 子的大小，來預(yù)測(cè)、評(píng)價(jià)其酵母的總連二酮生成能力或總雙乙酰生成能力。 還可通過分析擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列，更進(jìn)一步正確地預(yù)測(cè)、評(píng)價(jià)上述能力。
此外，本發(fā)明中，可通過培養(yǎng)被測(cè)酵母，測(cè)定具有序列號(hào)1的核苷酸 序列的乙酰羥酸還原異構(gòu)酶基因的表達(dá)量，來評(píng)價(jià)被測(cè)酵母的總連二酮生成 能力或總雙乙酰生成能力。此時(shí)，可通過培養(yǎng)被測(cè)酵母，對(duì)乙酰羥酸還原異 構(gòu)酶基因產(chǎn)物mRNA或蛋白質(zhì)的定量來進(jìn)行。mRNA或蛋白質(zhì)的定量，可 使用公知的方法進(jìn)行。mRNA的定量例如可通過Northern雜交法、定量 RT-PCR，蛋白質(zhì)的定量例如可通過Western印跡法進(jìn)行(Current Protocols in Molecular Biology,ohn Wiley & Sons 1994-2003)。
進(jìn)一步可通過培養(yǎng)被測(cè)酵母，測(cè)定具有序列號(hào)1的核苷酸序列的本發(fā) 明基因的表達(dá)量，選擇與目的總連二酮生成能力或總雙乙酰生成能力相應(yīng)的
17上述基因表達(dá)量的酵母，來選擇適合所期望酒精飲料釀造的酵母。另外，也 可培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被測(cè)酵母，測(cè)定并比較各酵母中上述基因的表達(dá)量，來選 擇所期望的酵母。具體地說，例如培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及1種或多種被測(cè)酵母，測(cè) 定具有序列號(hào)1的核苷酸序列的乙酰羥酸還原異構(gòu)酶基因在各酵母中的表 達(dá)量。通過選擇與標(biāo)準(zhǔn)酵母相比該基因?yàn)楦弑磉_(dá)的被測(cè)酵母，可選擇適合酒 精飲料釀造的酵母。
或可通過培養(yǎng)被測(cè)酵母，選擇總連二酮生成能力或總雙乙酰生成能力低 或乙酰羥酸還原異構(gòu)酶活性高的酵母，來選擇適合所期望酒精飲料釀造的被 測(cè)酵母。
此時(shí)，被測(cè)酵母或標(biāo)準(zhǔn)酵母，例如可使用上述導(dǎo)入了本發(fā)明載體的酵母、 上述本發(fā)明的基因得以擴(kuò)增表達(dá)的酵母、上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)得以擴(kuò)增表達(dá) 的酵母、實(shí)施了誘變處理的酵母、自發(fā)突變的酵母等?？傔B二酮量，可根據(jù)
Drews etal.、 Mon. fur Brau.、 34、 1966中記載的方法定量?？傠p乙酰量，例 如可根據(jù)J.Agric. Food Chem. 50(13): 3647-53、 2002中記載的方法定量。乙 酰羥酸還原異構(gòu)酶活性，例如可通過Methods Enzymol.、 17:751-755 (1970) 中記載的Arfm et al.的方法測(cè)定。誘變處理，例如可例舉為紫外線照射、放 射線照射等物理方法，EMS (甲基磺酸乙酯)、N-甲基-N-亞硝基胍等藥劑處 理的化學(xué)方法等任何方法(例如參照大嶋泰治編著、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)法39酵 母分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)法、p67-75、學(xué)會(huì)出版中心等)(日語(yǔ)原名「大嶋泰治編 著、生物化學(xué)実験法39酵母分子遺伝學(xué)実験法、p 67-75、學(xué)會(huì)出版七^夕 —」)。
此外，可作為標(biāo)準(zhǔn)酵母、被測(cè)酵母使用的酵母，可例舉為可用于釀造的 任意酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母等。具體地說，可使用 酵母屬(&"/^ramj;cM)等的酵母(例如巴斯德酵母、釀酒酵母及卡氏酵母)。 本發(fā)明中，可使用Lager啤酒酵母，例如巴斯德酵母(^cc/zaramyc" / osfon'awus) W34/70等、卡氏酵母(;Socc/2ara，ces car/Aergem^)NCYC453、 NCYC456等、釀酒酵母(Sacc/wrawj;ces cwevWae)NBRC1951、 NBRC1952、 NBRC1953、 NBRC1954。可使用威士忌酵母，例如釀酒酵母NCYC90等； 可使用葡萄酒酵母，例如協(xié)會(huì)葡萄酒用1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)等；可使用清酒酵母， 例如協(xié)會(huì)酵母、清酒用7號(hào)、9號(hào)等，但不限于此。本發(fā)明中，可優(yōu)選使用
18Lager啤酒酵母，例如巴斯德酵母。標(biāo)準(zhǔn)酵母、被測(cè)酵母，可從上述酵母中 以任意組合選擇。
實(shí)施例
以下，根據(jù)實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，但本發(fā)明不限于以下實(shí)施例。 實(shí)施例1:含有細(xì)胞質(zhì)11v5p的質(zhì)粒的制備
用以下方法制備用于使特定數(shù)量(17、 33、 40、 46、 53、 66、 83或99) 的N末端氨基酸殘基發(fā)生缺失的突變11v5p-GFP融合蛋白質(zhì)表達(dá)的質(zhì)粒。使 用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切及連接(Sambrooketal. 1989)。使用TOPO (商標(biāo))TA克隆試劑盒(invitrogen公司、Carlsbad、 CA)，克隆聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物，確定序列。實(shí)施例中使用的寡核苷酸如下記載。
表l 參照編號(hào)序列
1 5'-gagctcATGTTGAGAACTCAAGCCGCCAGATTGATCTGCA-3'(序列號(hào):3)
2 5'-TTGGTTTTCTGGTCTCAACTTTCTGACTTCCTTA-3'(序列號(hào)4)
4 5'-ggatccCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTCCCGGGGTACCTTATTTGT-3'(序列號(hào)6)
5 5'-gagctcATGGCTAAGAGAACCTTTGCTTTGGCCACC-3'(序列號(hào):7)
6 5'-gagctcATGCCAGCTGCCCGTTTCGTTAAGCCAATG-3'(序列號(hào)8)
7 5'-gagctcATGCCAATGATCACTACCCGTGGTTTGAAG-3'(序列號(hào)9)
8 5'，ctcATGGGTTTGAAGCAAATCAACTTCGGTGGT-3'(序歹U號(hào):IO)
9 5'-gagctcATGGGTGGTACTGTTGAAACCGTCTACGAA隱3'(序列號(hào):11)
10 5'陽(yáng)gagctcATGCCAAGAGAAAAGTTGTTGGACTACTTC-3'(序列號(hào):12)
11 5'現(xiàn)ctcATGGGTTACGGTTCCCAAGGTTACGGTCAA-3'(序列號(hào):13)
12 5'-gagctcATGGGTTTGAACGTTATCATTGGTGTCCGT-3'(序列號(hào)〗4)
13 5'-TaccggtGACATCGTTCCAGACGGCGT-3'C序列號(hào)15)
14 5'-accggtAAGG CTCACGAAAAGGCCCAAGCT-3'(序列號(hào)16)
15 5'-gtogacTTAT TGGTTTTCTG GTCTCAACTT-3'(序列號(hào)17) (注釋)
-小寫的堿基表示限制位點(diǎn)。-畫下線的堿基，相當(dāng)于添加于N末端缺失型ILV5的N末端的追加的
起始密碼子。
將寡核苷酸1+2作為引物，以釀酒酵母(Sacc/^rawyc" cewWw'"e) (X2180-1A株)的染色體DNA為模板，通過PCR進(jìn)行制備相當(dāng)于在5'末 端具有Sacl限制位點(diǎn)的ILV5開放閱讀框(ORF)的1.2kb的DNA片段。寡 核苷酸3包含在閱讀框內(nèi)融合的ILV5 ORF的3'末端(25個(gè)堿基)及綠色熒 光蛋白(GFP) ORF的5'末端(20個(gè)堿基)序列。以寡核苷酸3+4為引物， 以質(zhì)粒pYES-GFP (Omuraeta1.2001)為模板，擴(kuò)增編碼GFP的840bp的片 段?；旌仙鲜?個(gè)PCR產(chǎn)物，作為用于進(jìn)行寡核苷酸1+4的PCR的重疊模 板，得到2.0kb的ILV5-GFP融合基因片段。
將DNA片段用Sacl及Bamffl酶切，亞克隆至酵母著絲粒表達(dá)載體 pYCGPY (Kodama et al. 2001)的SacI-BamHI間隙中，得到pYC-ILV5-GFP。
使用反向引物(寡核苷酸13)、作為模板的質(zhì)粒pYC-ILV5-GFP和作為 正向引物的寡核苷酸5、 6、 7、 8、 9、 10、 11及12 (相當(dāng)于圖2的N末端缺 失A17、 A33、 A40、 A46、 A53、 A66、 A83及A99)之一，通過PCR，得到 相對(duì)于11v5p的N末端中一系列的嵌套(nested)缺失的DNA片段。
將所得到的片段(370bp 620bp)用Sacl及Agel酶切，通過與 pYC-ILV5-GFP的Sacl-Agel間隙連接并取代ILV5-GFP構(gòu)建物中的野生型 Sacl-Agel序列，得到8種質(zhì)粒，即pYC-ILV5A17-GFP、 pYC-ILV5A33-GFP、 pYC-ILV5A40-GFP 、 pYC-ILV5A46國(guó)GFP 、 pYC畫ILV5A53國(guó)GFP 、 pYC畫ILV5A66-GFP、 pYC國(guó)ILV5A83-GFP及pYC畫ILV5A99畫GFP。 N末端缺失 Uv5p-GFP具有用于在N末端開始翻譯時(shí)必需的蛋氨酸起始密碼子(ATG)。
實(shí)施例2:轉(zhuǎn)化體的制備/定位及穩(wěn)定性試驗(yàn)
將釀酒酵母M1-2B株(Stinchcombetal. 1980)用pYC-ILV5-GFP (野生 型融合蛋白質(zhì))及其衍生物pYC-ILV5Ax-GFP ( x表示各構(gòu)建物缺失的N末 端殘基數(shù))轉(zhuǎn)化。將該轉(zhuǎn)化細(xì)胞在添加了 300pg/ml的新霉素類似物G418的 YPD中增殖到對(duì)數(shù)期，用于熒光顯微鏡觀察。通過熒光顯微鏡(Eclipse E600、 Nikon、東京、日本)使細(xì)胞可視化，使用Color Chilled 3CCD Camera (C5810、浜松Photonics、靜岡、日本)，用100x拍攝圖像。結(jié)果如圖3所示。
如圖3所示，11v5pA17-GFP雖顯示出與野生型11v5p-GFP同樣的定位模 式，但突變?nèi)诤系鞍踪|(zhì)11v5pA33-GFP、 11v5pA40-GFP、 11v5pA46-GFP、及 11v5pA53-GFP在細(xì)胞質(zhì)整體中顯示強(qiáng)熒光，表明后面4種融合蛋白質(zhì)不是定 位在線粒體而是主要定位在細(xì)胞質(zhì)中。另一方面，具有更大缺失的 11v5pA66-GFP、 11v5pA83-GFP、及11v5pA99-GFP的融合蛋白質(zhì)，與其他構(gòu)建 物相比細(xì)胞質(zhì)的熒光弱，表明這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中不能穩(wěn)定存在。
而后，用Brondijk (1998)中記載的方法制備全細(xì)胞提取物(該提取物將 用于十二垸基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中)，使用蛋白檢 測(cè)試劑盒(Bio-RadLaboratories、 Hercules、 CA)，根據(jù)考馬斯亮蘭法測(cè)定蛋 白質(zhì)濃度。將60嗎的蛋白質(zhì)用于SDS-PAGE分析，然后再進(jìn)行以前記載過 的使用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系(Omuraeta1.2001)的免疫印跡分析。為進(jìn)行抗原 檢測(cè)，將針對(duì)GFP的兔抗體(Medical and Biological Laboratories、名古屋、 日本)及針對(duì)肌動(dòng)蛋白的兔抗體(Santa Cruz Biotechnology、 Santa Cruz、 CA) 以l: IOOO稀釋使用。作為細(xì)胞提取物的內(nèi)標(biāo)，使用抗肌動(dòng)蛋白抗體檢測(cè)肌 動(dòng)蛋白量。結(jié)果如圖4所示。
如圖4所示，在試驗(yàn)的N末端缺失型Ilv5p-GFP融合蛋白質(zhì)中，規(guī)定量 的細(xì)胞提取物中，Ilv5p-GFPA46的量最多，依次較多的是Ilv5p-GFPA53及 Ilv5p-GFPA40的量。因此，可知N末端有46個(gè)氨基酸殘基的缺失最適合制 備細(xì)胞質(zhì)11v5p。
實(shí)施例3:啤酒試釀
將野生型11v5p或細(xì)胞質(zhì)11v5p(N末端的46個(gè)氨基酸殘基發(fā)生缺失的突 變Ilv5pA46)導(dǎo)入Lager啤酒酵母，構(gòu)建用于穩(wěn)定表達(dá)的表達(dá)質(zhì)粒。為制備 3'末端具有終止密碼子的ILV5 ORF，使用寡核苷酸14+15作為引物并使用 質(zhì)粒pYC-ILV5-GFP作為模板進(jìn)行PCR。將所得到的530-bp片段用Agel及 Sacl酶切，與從pYC-ILV5-GFP (670-bp)及pYI-ILV5A46 (540-bp)分別切 出的Sacl-Agel片段之一連接到整合表達(dá)載體pUP3GLP (Omura et al. 2001 ) 的Sacl-Sall空隙。表達(dá)質(zhì)粒分別稱為pIY-ILV5及pIY-ILV5A46，導(dǎo)入Lager 啤酒酵母FOY422[來自J株(從Versuchs-und Lehranstalt flir Brauerei、 Berlin獲得)的高VDK生成株)]。將這些菌株稱為FOY437 (含有野生型Ilv5p) 及FOY438 (含有細(xì)胞質(zhì)Ilv5pA46)，用于以下的試釀。啤酒試釀?dòng)靡韵聴l件實(shí)施。
試驗(yàn)規(guī)模2升大型發(fā)酵管
麥汁100%麥芽汁(添加啤酒花)
初期麥汁比重12.9柏拉圖(Plato)度
a。p相當(dāng)于p/。w/w蔗糖溶液的比重)
酵母投入量1.5xl()7細(xì)胞/mL 麥汁浸出物濃度11.85%
麥汁溶解氧濃度8.0mg/L
發(fā)酵溫度15°C
為確認(rèn)野生型ILV5基因及細(xì)胞質(zhì)ILV5A46基因的表達(dá)，從發(fā)酵開始的 1、 2、 3、 4、 5及6天后的醪液中收集酵母。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Roseetal. 1990) 進(jìn)行總RNA的分離、瓊脂糖凝膠電泳及印跡分析。步驟是將40昭的RNA 用瓊脂糖凝膠電泳展開，再提供給Northern印跡分析。使用含有標(biāo)記的ILV5 ORF序列的探針檢測(cè)mRNA。結(jié)果如圖5所示。另外，作為對(duì)照，PDA1基 因的表達(dá)量也如圖5所示。
如圖5所示，與親株FOY422相比，野生型ILV5株及細(xì)胞質(zhì)ILV5A46 株使表達(dá)質(zhì)粒中含有的組成型啟動(dòng)子TDH3p誘導(dǎo)的基因過表達(dá)。特別是與 第1天及第2天的親株(對(duì)照)之間差異顯著。
發(fā)酵中，糖的減少速度及細(xì)胞增殖速度未因野生型ILV5基因及細(xì)胞質(zhì) ILV5A46基因的導(dǎo)入而受到不良影響。圖6(a)、 6(b)及6(c)分別表示麥汁中的 表觀浸出物、細(xì)胞增殖及總VDK生成的變化。酵母的增殖速度，通過用660nm 的吸光度測(cè)定懸浮酵母量來確定。VDK量，作為VDK及其前體的總量"總 VDK"，通過Drews,etal(1966)中記載的方法定量。
如圖6所示，總VDK量在發(fā)酵開始后第3天達(dá)到峰值。盡管FOY422 株的總VDK量達(dá)到2.4mg/L，但野生型ILV5株及細(xì)胞質(zhì)ILV5A46株的總 VDK量均減少到0.9mg/L。并且，與對(duì)照親株相比，兩轉(zhuǎn)化體的VDK值在 很早階段已低于閾值(即雙乙酰為0.15mg/L)。
而后，對(duì)發(fā)酵后的啤酒進(jìn)行化學(xué)分析。表2表示用親株(FOY422)及使野生型Ilv5p (FOY437)或11v5pA46 (FOY438)過表達(dá)的轉(zhuǎn)化株發(fā)酵10天 的啤酒進(jìn)行化學(xué)分析的結(jié)果。
表2. —次發(fā)酵后的啤酒的分析
FOY422FOY437FOY438
凍)(野生型ILV5)(ILV5厶46)
乙醇(gr1)44.5±0.1544.7±0.2544.1±0.30
甘油(gi—1)1.8±0.021.6±0.031.8±0.01
游離氨基氮(mgl-1)155±0.3145±1.8148±3.0
氨(mgl1)35.3±0.637.5±1.331.0±1.2
亞硫酸(mgr1)12.5±0.329.3±0.669.1±1.26
乙醛(mgl1)0.9±0.180.9±0.180.8±0.06
有機(jī)酸
檸檬酸(mgl-1)303±6.7312±2.5313±1.3
丙酮酸(mgl-1)152±1.991.2±6.1176±1.8
蘋果酸(mgl-1)171±2.1177±2.3166±0.8
琥珀酸(mgl-1)99.1±0.8101逸498.3±1.5
乳酸(mgl1)316±9.9324±8.4336±6.6
乙酸(mgl1)181±2.6133±3.5170±2.3
雜醇
丙醇(mgl—1)11.1±0.312.6±0.111.1±0.4
異丁醇(mgr1)9.7±0.613.1±0.28.9±0.7
戊醇(mgr1)46.9±1.757.9±0.843.8±2.6
酯
乙酸乙酯(mgr1) 34.2±0.238.1±0.1 34.8±0.5
乙酸異戊酯(mgr1) 1.20士0.02 1.72±0.01_1.09±0.06
所示結(jié)果全部是包含3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值。
使用FOY438的啤酒的品質(zhì)與使用親株的啤酒沒有區(qū)別。另一方面，使 野生型11v5p過表達(dá)的FOY437的啤酒與使用親株的啤酒相比，具有一些不同的特征，例如，丙酮酸(使用FOY422的對(duì)照啤酒的60。/。)及乙酸(73%) 的量少、及異丁醇(135%)、戊醇(123%)及乙酸異戊酯(143%)的量多。
從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，通過使細(xì)胞質(zhì)ILV5A46高表達(dá)，可不損壞啤酒的 品質(zhì)而可降低VDK量。
工業(yè)實(shí)用性
根據(jù)本發(fā)明酒精飲料的制造方法，可通過降低與產(chǎn)品中異常味道有關(guān)的 VDK、特別是DA的生成量，來制造具有優(yōu)良風(fēng)味的酒精飲料。 本說明書中引用的參考文獻(xiàn)如下
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1.多核苷酸，其選自以下(a)～(c)組成的組(a)多核苷酸，其由序列號(hào)1的核苷酸序列組成；(b)多核苷酸，其編碼由序列號(hào)2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；及(c)多核苷酸，其編碼以下蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是在添加及/或缺失不發(fā)生在N末端的條件下，由序列號(hào)2中1～15個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列組成，且具有乙酰羥酸還原異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)。
2. 權(quán)利要求1中所述的多核苷酸，其選自由以下(d)組成的組(d)多核苷酸，其編碼由序列號(hào)2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)、或編 碼序列號(hào)2中1個(gè) 幾個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或添加的氨基 酸序列，且其中所述蛋白質(zhì)具有乙酰羥酸還原異構(gòu)酶活性。
3. 權(quán)利要求1中所述的多核苷酸，其由序列號(hào)l組成。
4. 權(quán)利要求1中所述的多核苷酸，其編碼由序列號(hào)2組成的蛋白質(zhì)。
5. 權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其為DNA。
6. 蛋白質(zhì)，其由權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸編碼。
7. 載體，其含有權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
8. 酵母，其含有權(quán)利要求7中所述的載體。
9. 權(quán)利要求8中所述的酵母，其中，所述酵母的總連二酮生成能力或總 雙乙酰的生成能力通過導(dǎo)入權(quán)利要求7的載體而得到降低。
10. 權(quán)利要求8中所述的酵母，其中，所述酵母的總連二酮生成能力或 總雙乙酰的生成能力通過權(quán)利要求6所述蛋白質(zhì)的表達(dá)量的增加而得到降低。
11. 酒精飲料的制造方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求8 10中任一項(xiàng)所述的酵母。
12. 權(quán)利要求ll中所述的酒精飲料的制造方法，其中，釀造的酒精飲料 是麥芽飲料。
13. 權(quán)利要求ll中所述的酒精飲料的制造方法，其中，釀造的酒精飲料是葡萄酒。
14.酒精飲料，其由權(quán)利要求11 13中任一項(xiàng)所述的方法制造得到。
全文摘要
本發(fā)明涉及突變乙酰羥酸還原異構(gòu)酶基因(突變ILV5基因)及其用途，特別是涉及用于制造具有優(yōu)良風(fēng)味的酒精飲料的釀造酵母、使用該酵母制造的酒精飲料、其制造方法等。根據(jù)本發(fā)明的酒精飲料制造方法，通過降低與產(chǎn)品中異常味道有關(guān)的VDK、特別是DA的生成量，可制造具有優(yōu)良風(fēng)味的酒精飲料。
文檔編號(hào)C12N9/04GK101679985SQ200780027468
公開日2010年3月24日 申請(qǐng)日期2007年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月17日
發(fā)明者大村文彥 申請(qǐng)人:三得利株式會(huì)社