專利名稱：：自吸脂后脂肪吸取物分離及純化造血干細胞的制作方法自吸脂后脂肪吸取物分離及純化造血干細胞
背景技術：
：造血干細胞(HSCs)為一種形成血液及免疫細胞的干細胞，并且最終負責生物生命期間生物中不斷的血液更新。數(shù)十年來HSCs己成為研究焦點，并且現(xiàn)在口常地用于許多醫(yī)療應用，包含白血病、淋巴瘤、遺傳型血液疾病的治療、以及特別是深度化療方案之后的HSC挽救。HSCs是存在于成人生物組織中的全能干細胞的最佳特征化實例。在Trentin及同事的創(chuàng)新研究中(Trentin,1965,Cardiovasc,Res.Cent.Bull4:38-4;Till&McCulloch,1961,Rad.Res.14:213-222)經致死量照射的小鼠因為它們無法更新它們的循環(huán)血液細胞而死亡。然而，來自同源供體動物的骨髓細胞的移植拯救該宿主動物。該供體細胞負責再增殖所有循環(huán)血液細胞。近來，已顯示負責再造接收骨髓移植體的人類中的造血作用的細胞位于表達CD34抗原(CD34+)的細胞的子集中(Berenson等，1991，血液77:1717-1722)。換言之，CD34+細胞包含造血干細胞。已尋求不依靠細胞表面免疫表型來辨識及分離富含造血干細胞的細胞群的其它方法。初期人類造血祖細胞已基于醛脫氫酶(ALDH)活性而分離(Storms等，1999,美國國家科學院學報(Proc.Natl.Acad.Sci.)96:9118-9123;Hess等，2004,血液(Blood)104:1648-1655)。此外，人類的植入與經灌注具ALDH活性(ALDH^及低側向角(SSC'。)的細胞數(shù)目高度相關(Fallon等，2003,Br.J.Haematol.122:99-108)。豐富的研究已證實有限數(shù)目的未分化造血干細胞的捐贈能夠再生宿主動物中的八個或更多不同血液細胞血源的每一個。此大型研究已為骨髓移植提供基礎，其為一種己廣泛接受的癌癥及先天性代謝缺陷的治療方式。于是，在人類一生中造血干細胞仍維持存在于正常的人類骨髓；它們不限于新生兒期。目前存在三種用于骨髓移植目的的造血干細胞(HSCS)的主要來源成人骨髓、成人外周血液、及嬰兒出生后臍帶血的單核細胞部份。分離用于移植目的的細胞典型地自成人的骨髓或外周血液分離。然而，不利地是，CD34+細胞在成人骨髓中非常稀少(l-2。/。)，這需要得到顯著量的骨髓以產生足夠量的HSCs以植入成人。得到骨髓的步驟對骨髓提供者是冗長及不舒適的步驟，需要延長住院以使得骨髓恢復。典型上需要多重血球分離術從外周血液分離CD34+或ALDHbr細胞對捐贈者是較少不舒適的，然而，其需要使用細胞因子預先接種供體以使HSCs遷移至外周血液。盡管進行了該遷移，則外周血液中CD34+或ALDHbr細胞的數(shù)目，及接著HSCs的數(shù)目典型地仍為相當?shù)偷?。與骨髓或經遷移的外周血液相較，臍帶血(UCB)稍微更富含CD34+細胞(Wang等，1997,血液(Blood)89:3919-3924)，但是臍帶血中可提供的少量血液限制可恢復的可植入HSCs的絕對量，使得UCB的可用性較原先預期更低。理論上，我們可以通過匯集多個臍帶血樣品而提供足夠數(shù)目的HSCs，然而，匯集在臨床實踐中是情勢不佳的。于是，臍帶血來源的CD34+細胞在它們在成人中的應用上受限，因為分離所得的低HSCs數(shù)目太少而不足以成功植入成熟的成人。己研究傳代流程，以試驗及增加細胞數(shù)目。典型地，然而HSC傳代伴隨著總是不理想的顯著分化。存在越來越多的證據顯示造血祖細胞可不受限于骨髓微觀環(huán)境。卡爾加里大學(UniversityofCalgary)的研究人員已檢查了神經元干細胞，其沿神經細胞譜系路徑例常地分化。當這些細胞移植進入經致死量照射的宿主時，研究人員檢測到供體細胞標記在新產生骨髓及淋巴細胞中的存在(B—son,1999,科學(Science)283:534-537)。貝勒醫(yī)學院(BaylorCollegeofMedicine)的研究人員已使用從小鼠骨骼肌所分離的衛(wèi)星細胞進行類似研究(Jackson等，1999,PNAS96:14482-14486)。當這些肌肉-來源的細胞移植進入經致死量照射的宿主時，研究人員檢測到肌肉基因標記在所有血液細胞血源中的存在。這些研究一起顯示神經及肌肉組織包含能夠造血分化的干細胞。此建議骨髓以外的部位能提供具有潛在應用于人類疾病治療的可更新造血祖細胞來源(Quesenberry等，1999，神經外傷雜志(J.Neurotrauma)16:661-666:Scheffler等，1999，神經科學趨勢(TrendsNeurosci)22:348-357;Svendsen&Smith,1999,神經科學趨勢(TrendsNe聽ci)22:357-364)。6近來，脂肪來源的基質血管成分(SVF)細胞己顯示可成功地重構經致死量照射的小鼠中的主要造血細胞譜系(Cousin等，2003,生物化學和生物物理學研究通訊(BiochemBiophys.Res.Commun.)301:1016-1022及美國專利公布號2004/0067218)。自脂肪組織分離的間充質基質干細胞也已與自經移動的外周血液分離的CD34+細胞共同灌注，并且發(fā)現(xiàn)促進CD34+細胞的成功植入(Kim等，2005，生物化學和生物物理學研究通訊(BiochemBiophys.Res.Commun.)329(1):25-31)。美國專利公布號2001/0033834公開了一種已分化表達造血祖細胞的至少一個特征的分離的脂肪來源的基質細胞。還公開的是去分化為全功能多潛能干細胞的脂肪來源的基質細胞，其可接著分化為造血細胞譜系。除上文所總結的研究外，存在需要豐富的造血干細胞來源的需求以用于醫(yī)療及其它應用。本發(fā)明解決并且滿足這些需求。發(fā)明概述本發(fā)明包括自脂肪組織分離造血干細胞的方法，該方法包括下述步驟得到脂肪組織；自該脂肪組織制備基質血管成分(SVF);及分離在SVF中的非黏附細胞，其中該非黏附細胞包含造血干細胞。優(yōu)選地，該脂肪組織為人類的。在一個實施方案中，該脂肪組織得自脂肪吸取物(lipoaspimte)。在一個實施方案中，該造血干細胞選自由下列各項組成的組ALDHbrsSC1。細胞、CD34+細胞、CD34+SSC'°細胞、CD34+CD45+細胞、CD34+CD38—CD4r細胞、CD34+CD45tffl胞、CD34+CD38XX)4rSSC1。細胞、及ABCG2-表達細胞。在另一個實施方案中，該造血干細胞選自由下列各項組成的組集落形成單位粒細胞巨噬細胞(CFU-GM)、爆發(fā)集落形成單位紅細胞(BFU-E)及集落形成單位粒細胞紅細胞巨噬細胞巨核細胞(CFU-GEMM)。在另一實施方案中，分離造血干細胞的方法進一步包括從該非黏附細胞分離CD34hi細胞。在另一實施方案中，該方法進一步包括從該非黏附細胞分離ALDHbr細胞。在一方面，該ALDHbr細胞為ALDHbrSSC1。。本發(fā)明還提供一種分離CD34+細胞的方法，該方法包括下列步驟得到脂肪組織；自該脂肪組織制備基質血管成分(SVF);分離在SVF中的非黏附細胞與該黏附細胞，及從該黏附細胞分離CD34+細胞，由此分離CD34+細胞。優(yōu)選地，該脂肪組織為人類的。包含根據該方法所分離的CD34+細胞的組合物由本發(fā)明提供，其中該CD34+細胞以每約1毫升脂肪組織分離至少約1x1()SCD34+細胞的比率分離。在一個實施方案中，該脂肪組織由脂肪吸取物得到。在一個實施方案中，該SVF包含至少約40%CD34+細胞。在一個方面中，該CD34+細胞以每約100毫升脂肪組織分離至少約1x1(^CD34+細胞的比率分離。在另一實施方案中，該CD34+細胞選自由下列各項組成的組CD34+SSC1。細胞、CD34+CD45+細胞、CD34hiCD38-CD4r細胞、CD34+CD38.CD4rSSC1。、CD34'。CD45-細胞、CD34'。CD45十細胞、CD34+ALDHbl"細胞和CD34+ALDHbrsSC'°細胞。在一個實施方案中，分離CD34+細胞的方法進一步包括分離CD34hi細胞或CD34'。細胞。本發(fā)明還提供一種為受試者供給造血干細胞的方法。該方法包括下列步驟自供體受試者得到脂肪組織；自該脂肪組織制備基質血管成分(SVF);分離在SVF中的非黏附細胞；分離造血干細胞與該非黏附細胞；及施用來自所述非黏附細胞的治療有效量的細胞；及施用治療有效量的造血干細胞到需要其的受體受試者。優(yōu)選地，該供體受試者及受體受試者為人。在一個實施方案中，該供體受試者及該受體受試者為相同的人。在另一個實施方案中，該供體受試者及受體受試者不是相同的人。在提供造血干細胞的方法的一個實施方案中，該造血干細胞為CD34+，并且以每約100毫升脂肪組織分離至少約1x107CD34+細胞的比率分離。在該方法的一個實施方案中，所述獲得步驟包含脂肪吸取。在另一實施方案中，所述分離步驟包括分離ALDH^SC^細胞或CD34+CD38-CD4rSSC'。細胞。本發(fā)明提供包含至少約40。/。非黏附、基質血管成分(SVF)CD34+細胞的分離的細胞的組合物。在一個實施方案中，該分離的細胞包含至少約20%CD34+CD45—細胞。在另一實施方案中，該基質血管成分得自人脂肪組織。在一個實施方案中，該CD34+細胞包含CD34+CD38—CD4rALDHbr細胞。8在另一實施方案中，該CD34+細胞包含CD34+CD38-CD4rSSC'。細胞。在另一實施方案中，該CD34+細胞包含集落形成單位粒細胞巨噬細胞(CFU-GM)、爆發(fā)集落形成單位紅細胞(BFU-E)及集落形成單位粒細胞紅細胞巨噬細胞巨核細胞(CFU-GEMM)。在另一實施方案中，該細胞是基因修飾的。還提供包含至少約10%非黏附、基質血管成分(SVF)ALDHbr細胞的分離的細胞的組合物。在一個實施方案中，該組合物包含至少約15%非黏附SVFALDHbr細胞。在一個實施方案中，該ALDHbr細胞為ALDHbrsSC'°細胞。優(yōu)選地，該SVF得自人類脂肪組織。還提供包含本發(fā)明的一種組合物及藥用載體的藥物組合物。附圖簡述為舉例說明本發(fā)明的目的，在附圖中說明本發(fā)明的某些實施方案。然而，本發(fā)明并不限于在所述附圖中描述的實施方案中的精確裝置及儀器工具。圖1為分離自脂肪組織非黏附基質血管成分(SVF)的各種CD34+細胞亞群的一系列流式細胞散射光數(shù)據的圖。在中央版的四個框起的亞群中的數(shù)字表示代表亞群的總細胞百分率。在兩個左邊及兩個右邊版，閘控(gated)型群以黑點繪制，并且非閘控型群以灰階密度繪制。SSC-HH則向散射；FSC-H^前向散射。圖2為分離自脂肪組織非黏附SVF的兩種主要CD34+細胞群(低側散射及高側散射)的一系列關于CD38及CD41表達的流式細胞術數(shù)據的圖。在右側的兩個圖為CD34+細胞的低側散射。圖3為分離自脂肪組織非黏附SVF的兩種主要CD34+細胞群的一系列關于CD31、CD105及CD90表達的流式細胞術數(shù)據的圖。在右側的三個圖為CD34+細胞的低側散射。圖4為在Methocult⑧(干細胞技術)培養(yǎng)第14天BFU-E集落的影像，該集落在培養(yǎng)20,000非黏附SVF細胞之后發(fā)現(xiàn)(100x放大率)。圖5為在培養(yǎng)20,000非黏附SVF細胞(100x放大率)之后第14天的兩個BFU-E集落的影像。圖6為在培養(yǎng)20,000非黏附SVF細胞(lOOx放大率)之后第14天的CFU-GM集落的影像。圖7為在培養(yǎng)20,000非黏附SVF細胞(lOOx倍率)之后第14天的CFU-GEMM集落的影像。圖8，包括圖8A及圖8B，為一系列說明在非黏附SVF細胞中ABCG2表達的兩個影像。圖8A為非黏附SVF細胞的光散性質的圖。在非黏附SVF細胞中ABCG2-表達細胞一般發(fā)現(xiàn)于離散區(qū)域(圈起部分)。圖8B為非黏附SVF細胞的ABCG2表達數(shù)據的圖。這些數(shù)據說明約16%非黏附SVF細胞是表達ABCG2的。發(fā)明詳述本發(fā)明是部份基于這樣的觀察，即，在脂肪組織基質血管成分(SVF)中的非黏附細胞富含CD34+細胞、ALDHbr細胞、ALDHbrSSC'°細胞及ABCG2-表達細胞、用于HSC鑒定的關鍵標記。此外，表明這些細胞包含全能造血祖細胞及譜系-決定型造血祖細胞。本發(fā)明由此提供從脂肪組織分離造血干細胞的方法。定義除非另外定義，本文所使用的所有技術及科學術語一般具有與本發(fā)明所屬
技術領域：
的普通技術人員通常了解的相同意義。一般言之，本文所使用的名詞及關于細胞培養(yǎng)、分子遺傳、有機化學、及核酸化學及雜交的實驗室步驟為在該領域內所熟知及常用的步驟。標準技術用于核酸及肽合成。該技術及步驟通常根據該領域中常規(guī)方法及各種一般參考文獻(例如，Sambrook及Russell,2001，分子克隆，實驗室方法(MolecularCloning,ALaboratoryApproach),冷泉港實驗室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress),冷泉港，NY,及Ausubel等，2002，現(xiàn)代分子生物學方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology),JohnWiley&Sons,紐約,NY)進行，其在此文件中通篇提供。冠詞"一(a)"及"一(an)"在本文中用以表示一個或超過一個(即至少一個)該冠詞的語法對象。作為實例，"一個組件"表示一個組件或超過一個組件。10術語"約"由本領域普通技術人員所了解，并且基于使用其的上下文在一定程度內變化。當用于本文時，"體外(invitro)"及"離體(exvivo)"交替使用以表示在活生物身體外的條件。于是，體外培養(yǎng)及離體培養(yǎng)都表示在活生物身體外培養(yǎng)。"脂肪"表示任何脂肪組織。該脂肪組織可為棕色、黃色或白色脂肪組織。脂肪組織包含脂肪細胞及基質。脂肪組織可于動物身體全身發(fā)現(xiàn)。例如，在哺乳動物中，脂肪組織存在于網膜、骨髓、皮下間隙、脂肪墊(例如肩胛骨或髕骨后脂肪墊)中，并且圍繞大多數(shù)器官。該脂肪組織可來自擁有脂肪組織的任何生物。人脂肪組織的方便及豐富來源得自吸脂外科手術的脂肪組織。然而，脂肪組織的來源或脂肪組織的分離方法對于本發(fā)明不是關鍵性的。術語"脂肪組織-來源的細胞"是表示源自脂肪組織的細胞。得自脂肪組織的細胞可以是原代細胞培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、或是無限增殖的細胞系。分離自脂肪組織的初始細胞群為異質細胞群，其包括但不限于，基質血管成分(SVF)細胞。當用于本文時，術語"脂肪來源的基質細胞"、"脂肪組織-來源的基質細胞"、"脂肪組織-來源的成人基質(ADAS)細胞"、或"脂肪-來源的干細胞"(ASCs)可以交替使用，并且表示源自脂肪組織的基質細胞，其可以作為各種不同細胞形式例如但不限于，脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、肌肉及神經/神經膠質細胞譜系的干細胞樣前體。ASCs為來源自脂肪組織的子群，其可使用在本領域中己知的標準培養(yǎng)步驟與脂肪組織的其它成分分離。此外，ASCs可基于在本領域已知的細胞表面標記從細胞混合物中分離。當用于本文時，術語"脂肪來源的造血干細胞"表示存在于脂肪組織基質血管成分的非黏附細胞，其包含選自由下列各項所組成的組中的一個或多個HSC特征CD34+、ALDHbf、SSC'°、ABCG2表達及多能造血祖細胞能力。當用于本文時，"非黏附細胞"表示在SVF細胞標準組織培養(yǎng)條件下不會黏附于組織培養(yǎng)瓶的細胞。經驗豐富的技術人員熟悉用于SVF細胞的標準組織培養(yǎng)條件。當用于本文時，"ALDHb"'表示在向細胞施用產生熒光產物的ALDH底物之后，表達高ALDH水平的細胞的亮細胞內熒光。檢測ALDHbr細胞為本領域所熟知。此外，用于辨識ALDH-表達細胞的ALDEFLUOI^試劑盒(干細胞技術(StemCellTechnologies),溫哥華，BC,加拿大)可商購。還參看美國專利第5,876,956號。術語"前體細胞"，"袓細胞"，及"干細胞"在本領域可交替使用，并且當用于本文時是表示多能或譜系-未定型祖細胞，其潛在地能夠進行無限數(shù)目的有絲分裂以更新其本身或是產生后代細胞，其會分化為需要的細胞形式。與多能干細胞相反，譜系決定型祖細胞一般被認為是無法產生彼此表型不同的數(shù)目眾多的細胞形式。而是祖細胞產生一個或可能兩個譜系決定型細胞類型。當用于本文時，術語"多能的"或"多能性"表示干細胞分化成超過一種細胞類型的能力。當用于本文時，"生物相容的"表示當植入哺乳動物時其不會引起哺乳動物中不良反應的任何物質。當引入個體時，生物相容物質對該個體是無毒的或是沒有傷害的，其也不會在哺乳動物中誘發(fā)該物質的免疫排斥。當用于本文時，"自體移植的"表示生物物質得自與該物質稍后要再度引入的個體相同的個體。當用于本文時，"同種異體的"表示生物物質得自與該物質要引入的個體為相同物種的遺傳上不同的個體。當用于本文時，"同源的"表示生物物質得自與該物質要引入的個體是遺傳上相同的個體(例如同卵雙生)。當用于本文時，"減輕"疾病、缺陷、失調或病癥表示減低疾病、缺陷、失調或病癥的一個或多個癥狀的嚴重性。當用于本文時，"治療"表示減低病患所經歷的疾病、缺陷、失調或不利病癥、及其類似的癥狀的頻率。當用于本文時，"治療有效量"是足以對施用組合物的個體提供有利效用的本發(fā)明組合物的量。例如，關于將細胞施用至個體，"治療有效量"是足以對施用細胞的個體提供有利效用的細胞的量。"治療"性處理是為了治療或緩和至少一種癥狀的目的對表現(xiàn)出至少一種病理癥狀的受試者實施的處理。當用于本文時，術語"生長培養(yǎng)基"表示促進細胞增殖的培養(yǎng)基。生長培養(yǎng)基一般包含動物血清。在一些情形中，生長培養(yǎng)基可以不包含動物血清。"分化培養(yǎng)基"在本文用于表示一種生長培養(yǎng)基，其包含一種添加劑或缺乏一種添加劑，以使得當在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)時未完全分化的干細胞、HSC、CD34+細胞、脂肪來源的成人干細胞或是其它此種祖細胞發(fā)展為具一些或所有經分化的細胞的特征的細胞。當用于本文時，"生長因子"表示一種刺激細胞的增生、分化及/或成熟的物質。用于本發(fā)明的生長因子的非限制實例包括紅細胞生成素(EPO)、巨噬細胞集落刺激因子、血小板生成素(TPO)、生長激素(GH)、白介素1-a及1-p、白介素3(IL-3)、白介素4(IL-4)、白介素5(IL_5)、白介素6(IL-6)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素IO(IL-IO)、白介素ll(IL-ll)、白介素13(IL-13)、c-kit配體/干細胞因子(SCF)、胰島素、胰島素樣生長因子，如IGF-2、表皮生長因子(EGF)、及成纖維細胞生長因子(FGF)，如FGF-1、FLT-3/FLK-2配體、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、及巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)。生長因子典型地以微微克廣升-毫克慮升水平之間的濃度使用。細胞的"免疫表型"在本文用于表示關于細胞的表面蛋白質圖譜的細胞表型。"分離的細胞"表示已與在組織或哺乳動物中自然伴隨該細胞的其它成分和/或細胞分離的細胞。當用于本文時，"實質上純化的細胞"為一種已與其以其自然存在狀態(tài)通常相伴隨的其它細胞類型純化的細胞。"擴增性"在本文用于表示細胞增殖的能力，例如以倍數(shù)擴增或是，在細胞群的情況下進行細胞群加倍的能力。當在促進細胞生長和/或分化的情況下將細胞置于生長培養(yǎng)基時，細胞在培養(yǎng)物中擴增，產生更多的細胞群。"增殖"在本文用于表示類似形式，特別是細胞，的再生或倍增。艮P，增殖包含較大細胞數(shù)目的產生，并且可尤其是僅由計數(shù)細胞數(shù)目，測量進入細胞的3H-胸腺嘧啶的結合，及其類似方式而測量。細胞增殖的速率典型地可由細胞數(shù)目加倍所需的時間測量，細胞數(shù)目加倍所需的時間另外稱為倍增時間(doublingtime)。當用于本文時，"細胞培養(yǎng)"表示一種方法，由此方法取自活的生物的細胞在經控制的條件下生長。"原代細胞培養(yǎng)"表示一種直接取自生物并在第一次傳代培養(yǎng)之前的細胞、組織或器官的培養(yǎng)。當用于本文時，"傳代培養(yǎng)"表示將細胞從一個生長容器至另一個生長容器的轉移。當用于本文時，"傳代"表示一輪傳代培養(yǎng)。因此，當細胞進行傳代培養(yǎng)時，它們被稱為已傳代。有時稱為特定細胞群，或是細胞系，或是由己傳代次數(shù)表征。例如，己傳代十次的經培養(yǎng)的細胞群可稱為P10培養(yǎng)物。原代培養(yǎng)物，即，細胞從組織分離后的第一次培養(yǎng)物，稱為P0。第一次傳代培養(yǎng)之后，細胞被敘述為次代培養(yǎng)物(P1或傳代1)。在第二次傳代培養(yǎng)之后，細胞成為三代培養(yǎng)物(P2或傳代2)，等等。本領域熟練的技術人員應該了解，在傳代期間存在許多細胞群加倍；所以培養(yǎng)物的細胞群加倍數(shù)目大于傳代數(shù)目。在傳代之間的期間細胞的擴增(即，細胞群加倍的數(shù)目)依據許多因素而定，其包括，但不限于，接種密度、基底、培養(yǎng)基、及傳代之間的時間。當用于本文時，術語"非免疫原的"表示在體外于混合淋巴細胞反應(MLR)中或在體內不會誘發(fā)T細胞增生的細胞性質。當用于本文時，"組織工程"表示離體產生用于組織置換或再造的組織的方法。組織工程為一種"再生醫(yī)學"的實例，其包含通過與生物工程材料與技術一起并入細胞、基因或其它生物性結構單元而修復或置換組織和器官的方法。當用于本文時，"內源的"表示在生物、細胞或系統(tǒng)中產生或是源自其內部的任何物質。"外源的"表示引入生物、細胞或系統(tǒng)或是在其外部產生的任何物質。當用于本文時，術語"表型特征"應解釋為表示至少一個下列特征14形態(tài)外觀、特定蛋白質的表達、染色模式，其包括，但不限于，細胞質染色模式、特定細胞相關酶催化活性、及能使用物質染色的能力。"編碼"表示在多核苷酸中的特定核苷酸序列，如基因、CDNA、或mRNA的固有性質，以用做在生物過程中合成其它聚合物及大分子的模板，其具有確定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或是確定的氨基酸序列及由此得到的生物性質。因此，基因編碼一種蛋白質，只要對應于該基因的mRNA的轉錄及轉譯在細胞或其它生物系統(tǒng)中產生該蛋白質。編碼鏈，其核苷酸序列與mRNA序列相同，并且通常提供在序列表中，及非編碼鏈，其用做基因或cDNA轉錄的模板，都可稱為編碼該蛋白質或該基因或cDNA的其它產物。除非另外指定，"編碼氨基酸序列的核苷酸序列"包括為彼此簡并的形式及編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質的核苷酸序列及RNA可包括內含子。"分離的核酸"表示已與在自然存在狀態(tài)中在其側翼的序列分離的核酸鏈段或片段，即，己從正常相鄰于該片段的序列，即在其天然存在的基因組中鄰近該片段的序列中移出的DNA片段。此術語也應用于已基本上從自然地伴隨該核酸的其它成分，即，在細胞中自然地伴隨該核酸的RNA或DNA或蛋白質中純化的核酸。因此，該術語包括，例如，并入載體中、并入自主復制質?；虿《局?、或是并入原核生物或真核生物的基因組DNA中的重組DNA.，或是其以不依賴于其它序列的獨立的分子(g卩，作為cDNA或基因組或由PCR或限制酶消化所產生的cDNA片段)存在。其還包含作為編碼額外多肽序列的雜合基因的一部分的重組DNA。在本發(fā)明的內容中，對于常見核酸堿基使用下列簡稱，"A"表示腺嘌呤，"C"表示胞嘧啶，"G"表示鳥嘌呤，"T"表示胸腺嘧啶，及"U"表示尿嘧啶。當用于此處時詞組"在轉錄調控下"或"操縱性地連接"表示啟動子處在相對于多核苷酸的正確位置及方向，以控制RNA聚合酶起始反應及多核苷酸的表達。當用于本文時，術語"啟動子/調控序列"表示表達操縱性連接至該啟動子/調控序列的基因產物所需的核酸序列。在一些實例中，此序列可為核15心啟動子序列，并且在其它實例中，此序列還可以包含基因產物表達所需的增強子序列及其它調控元件。例如，該啟動子/調控序列可以是以組織特異性方式表達基因產物的序列。"組成型"啟動子為一種核苷酸序列，當與編碼或指定基因產物的多核苷酸操縱地連接時，其使得基因產物在大多數(shù)或所有細胞生理條件下在細胞中產生。"可誘導的"啟動子為一種核苷酸序列，當與編碼或指定基因產物的多核苷酸操縱性地連接時，其使得基因產物基本上僅當細胞中存在對應于該啟動子的誘導物時才在細胞中產生。"組織特異性"啟動子為一種核苷酸序列，當與編碼或指定基因產物的多核苷酸操縱地連接時，其使得基因產物基本上僅當該細胞為一種與該啟動子相對應的組織類型的細胞時才在細胞中產生。"載體"為一種物質組合物，其包含分離的核酸，并且其可用于將經分離的核酸遞送至細胞內部。數(shù)種載體在本領域中是己知的，其包含，但不限于，線型多核苷酸、與離子或兩親性化合物相關的多核苷酸、質粒和病毒。于是，術語"載體"包括自主復制的質?；虿《尽Ｔ撔g語還應該解釋為包含促進核酸轉移進入細胞的非質粒和非病毒化合物，諸如例如，聚賴氨酸化合物、脂質體等。病毒載體的實例包括，但不限于，腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、反轉錄病毒載體等。"表達載體"表示一種包含重組多核苷酸的載體，所述重組多核苷酸含有與要表達的核苷酸序列操縱地連接的表達控制序列。表達載體包含用于表達的足夠的順式作用元件；用于表達的其它元件可由宿主細胞提供或是處在體外表達系統(tǒng)中。表達載體包括所有在本領域中已知的載體，例如黏端質粒、質粒(即，裸露的或包含在脂質體中)及結合該重組多核苷酸的病毒。"重組多核苷酸"表示具有未自然連接在一起的序列的多核苷酸。擴增的或經組裝的重組多核苷酸可以包含在合適的載體中，并且該載體可用于轉化合適的宿主細胞。重組多核苷酸也可提供非編碼功能(例如，啟動子、復制起點、核醣體結合位點，等)。當用于本文時，"血液疾病"表示這樣的任何病癥，慢性的或急性的，其中受試者缺乏或具有醫(yī)學顯著減少量的至少一種類型的成熟、功能性的血液細胞，其包含，但不限于，單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、T-細胞、B-細胞、NK-細胞、紅細胞、巨核細胞及樹突狀細胞。所述病癥可為慢性的或急性的。該病癥的深層原因可以是已知的，如但不限于，化學誘發(fā)的或是基因誘發(fā)，或者該深層原因可以是未知的或是不確定的(即自發(fā)性的)。血液疾病包括伴隨不足量的至少一種類型的成熟血液細胞或由之表征的過度增生性疾病及再生障礙性疾病。"藥用載體"表示與藥物組合物的生物成分相容并且對接受者沒有害處的任何載體、稀釋劑或賦形劑。發(fā)明敘述在本發(fā)明中，已證實CD34+細胞、ALDHbr細胞及ABCG2-表達細胞以高量從脂肪組織中得到。還顯示所得到的細胞包含多種HSCs的亞群特征。亞群的非限制實例包括ALDHbfSSC'°細胞、CD34+SSC'。細胞、CD34+ALDHbr細胞、CD34+CD38-CD4r細胞、CD34+CD38-CD4rALDHbr細胞、CD34+CD38-CD4rSSC'。細胞、CD34+CD45鄰胞、CD34+CD45+細胞、及CD34+ALDHb'SSC'。細胞。進一步顯示所得到的CD34+細胞包含多種多能造血祖細胞及譜系決定性造血祖細胞。因此，本發(fā)明提供以高產率從脂肪組織分離包含HSCs的CD34+細胞、ALDHbr細胞或ABCG2-表達細胞的群的方法。本發(fā)明進一步提供一種包含HSCs的CD34+細胞、ALDHbr細胞或ABCG2-表達細胞的組合物，其通過本發(fā)明方法分離以產生高度富含HSCs的群作為原代培養(yǎng)物。本發(fā)明進一步提供一種治療需要HSCs的受試者的方法。有利地是，所以，本發(fā)明的方法及組合物減少或排除在用于治療性處理之前將包含HSCs的分離的CD34+細胞、ALDH^細胞、或ABCG2-表達細胞進行擴增的要求。脂肪組織提供作為多潛能造血干細胞來源的骨髓或臍帶血的有利的替代物。脂肪組織是容易可得的并且在許多個體中是豐富的。事實上，在美國肥胖是一種流行性比例的病癥，在美國超過50%的成人超過基于他們的身高及體重所建議的身體質量指數(shù)(BMI)。脂肪組織可以基于門診病人通過吸脂而獲得。吸脂為獲得美容效果的最少非侵入性方法，其為大多數(shù)患者接受。而且，充分記載脂肪細胞為一種可補給細胞群。事實上，通常可見到脂肪細胞在相同部位隨時間在個體中的再現(xiàn)。所以，不期望脂肪組織移除的初始美容效果的人仍應易于遵從此步驟。與包含骨髓、外周血液及臍帶血的傳統(tǒng)來源顯著相反，已知脂肪組織為CD34+細胞、ALDHbr細胞及ABCG2-表達細胞的豐富來源。具體而言，本文顯示從人類脂肪組織所得到的SVF細胞包含至少約5%及可能至少約10%的CD34+細胞(其包含HSCs)。進一步顯示至少約40至約60%的非黏附SVF細胞為CD34+。顯示至少約10至約20%非黏附SVF細胞為ALDHbr。還顯示至少約10至約20%非黏附SCF細胞為ABCG2-表達細胞。該高比率允許產生顯著高產率的包含HSCs的CD34+細胞、ALDHbr細胞或ABCG2-表達細胞，其可以從適度量的脂肪組織獲得。例如，在本發(fā)明方法的一個實施方案中，至少約1x107的CD34+細胞可以通過吸脂步驟從約100毫升(ml)的脂肪組織分離。相反，IOO毫升骨髓或臍帶血典型地產生僅約l-2x1()6CD34+細胞。典型美容吸脂步驟產生約3至約4升脂肪吸取物，使用本發(fā)明方法，此脂肪組織量潛在地產生至少約3-4x108的CD34+細胞，且不需延長的培養(yǎng)或擴增。在典型的HSC移植步驟中，需要將約2x106CD34+細胞/千克體重灌注至接受者以達到快速植入。所以100kg的人需要約2x108的CD34+細胞。因此，自單一脂肪吸取物的產率有力地足以治療及植入平均尺寸的成人。結果，脂肪組織可以是目前所鑒定的最臨床相關且最豐富的HSC來源。本發(fā)明的組合物及方法具有無數(shù)有用的應用。本發(fā)明方法有效用于大量包含HSC的CD34+細胞、包含HSC的ALDHbr細胞，或包含HSC的ABCG2-表達細胞的制備，其是快速地并且不需擴增或多重傳代以得到用于治療應用的足夠數(shù)目的HSCs。脂肪來源的造血干細胞的組合物可以用在減緩或治療個體中血液疾病的醫(yī)療方法中。該組合物及方法也可用于研究目的，其包括，但不限于，鑒定影響HSCs的擴增或分化的化合物。I.從脂肪組織分離HSCs18用于本發(fā)明的脂肪組織可使用熟練的技術人員已知的任何方法從任何哺乳動物獲得。在本發(fā)明方法中用做脂肪組織來源的哺乳動物包括，但不限于，牛、綿羊、山羊、狗、馬、貓、非人類靈長類及人類。優(yōu)選地，脂肪組織是從靈長類分離，并且更優(yōu)選地，從人類分離。優(yōu)選地，脂肪組織為皮下白色脂肪組織。優(yōu)選的脂肪組織來源為網膜脂肪。在人類中，脂肪典型地通過吸脂分離。如本發(fā)明的細胞要被移植進入人體受試者，優(yōu)選地該脂肪組織應該從相同個體分離以提供用于自體移植，或是從基因相同的同胞(例如同卵雙生)分離以提供用于同源移植。然而，備選地，施用的HSCs可以是同種異體的。根據本發(fā)明一個實施方案，脂肪來源的HSCs通過分離SVF的CD34+、非黏附細胞而分離。在另一個實施方案中，HSCs通過分離SVF的ALDHb「、非黏附細胞而從脂肪組織分離。在一個方面中，包含脂肪來源的HSCs的ALDHb「SSC'。非黏附SVF細胞被分離。在另一個實施方案中，脂肪來源的HSCs通過分離SVF的ABCG2-表達、非黏附細胞而分離。熟練的技術人員己知的從脂肪組織制備SVF的任何方法可用于實施本發(fā)明。例如，此種方法敘述于美國專利第6,153,432號，其以其全文并入本文。典型地，處理該脂肪組織是用濃度介于0.01至0.5%之間，優(yōu)選地0.04至0.3%之間，最優(yōu)選為約0.2%的膠原酶，濃度介于0.01至0.5%之間，優(yōu)選地0.04%，最優(yōu)選為約0.2%的胰蛋白酶；禾卩/或在0.5ng/ml至10ng/ml濃度的中性蛋白酶；和/或有效濃度的透明質酸酶或DNA酶；和在濃度為約0.01至2.0mM，優(yōu)選地在約0.1至約l.OmM，最優(yōu)選為0.53mM的乙二胺四乙酸(EDTA);在介于25。C至50。C之間，優(yōu)選地介于33°C至40°C之間，最優(yōu)選為在37°C的溫度處理10分鐘-3小時的期間，優(yōu)選地介于30分鐘至1小時之間，最優(yōu)選為45分鐘。任選地，可將該細胞通過介于20微米至800微米之間，更優(yōu)選為介于40至400微米之間，最優(yōu)選為70微米的尼龍或粗棉布網過濾器。接著將該細胞直接在培養(yǎng)基中或是在Ficoll或Percoll或其它顆粒梯度進行差速離心。細胞將以介于100至3000Xg，更優(yōu)選為200至1500Xg，最優(yōu)選為500Xg的速度離心1分鐘-1小時之間的期間，更優(yōu)選為介于2至15分鐘，最優(yōu)選為5分鐘，在4°至50。C之間，優(yōu)選地介于20。至40。C之間，最優(yōu)選為在約25°C的溫度下進行。該細胞團塊為SVF。接種該SVF細胞團塊，以得到非黏附細胞。SVF的非黏附細胞通過首先將SVF細胞在培養(yǎng)裝置中在基質細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間再分離。"一段時間"可為適合體外細胞培養(yǎng)及允許黏附細胞黏附的任何時間。在一個實施方案中，該段時間為約12小時。在優(yōu)選實施方案中，該段時間為24小時。該培養(yǎng)裝置可為常用于體外培養(yǎng)細胞的任何培養(yǎng)裝置。優(yōu)選的培養(yǎng)裝置為培養(yǎng)瓶，且更優(yōu)選的培養(yǎng)裝置為T-225培養(yǎng)瓶。接種密度可在約10,000細胞/cn^至約100,000細胞/cm2的范圍內。在一個實施方案中，細胞以約50,000細胞/cr^及介于其間的任何整數(shù)接種在培養(yǎng)瓶中。然而，本發(fā)明不限于該接種密度。熟練的技術人員可以通過常規(guī)實驗決定適當?shù)慕臃N密度。包含HSCs的非黏附細胞在培養(yǎng)期間在任何時間從該培養(yǎng)裝置收集。收集該非黏附細胞的非限制方法包含從該培養(yǎng)裝置取出液體培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基可在SVF細胞培養(yǎng)期間在任何時間更換；可每日收集包含非黏附SVF細胞(并因此含HSCs)的經移除的培養(yǎng)基，直到第一次傳代胰蛋白酶消化作用。優(yōu)選地，該基質細胞培養(yǎng)基每3至4天更換一次。如果需要，以黏附成分存在的脂肪組織來源的基質細胞(ASCs)，也可從該培養(yǎng)裝置收集。該ASCs可立即使用或是冷凍保存以稍后使用。脂肪組織來源的基質細胞可通過胰蛋白酶消化作用、EDTA處理、或是用于從該培養(yǎng)裝置收集黏附細胞的任何其它步驟收集。脂肪組織來源的基質細胞可施用給接收HSCs的個體，例如，以提供造血支持細胞以幫助HSCs的植入。HSCs可由熟練技術人員己知的任何方法進行表征?？衫肏SCs的免疫表型做為HSCs的唯一識別碼。即在目的細胞上的該唯一細胞表面標記可用以從來源于脂肪組織的混合細胞群分離特定細胞亞群。HSCs的表型標記是本領域普通技術人員所熟知的，并且大量地在文獻中公布。其它表型標記持續(xù)被公開或是可被辨識且不需過度的實驗。對HSCs特異的一些表型標記包括CD34、CD45、CD38lo/-、CD41、及ABCG2。HSCs的其它特征為高醛脫氫酶(ALDHbr)活性及低側向散射(SSC'G)。HSCs及各種造血決定譜系的其它標記包括CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD13、CD14、CD15、CD19、CD20、CD32、CD51、CD52、CD53、CD56、CD57、CD60、CD61、CD62L、CD65、CD72、CD73、CD81、CD82、CD83、CD90、CD99、CDIOO、CD117、TCR、P-選擇蛋白、HLA-DR，等。本領域的普通技術人員應該認識到，已知比色、熒光、免疫化學、聚合酶鏈式反應、化學或放射化學方法可容易地確認譜系特異性標記或酶活性的存在或不存在。優(yōu)選地，該脂肪來源的HSCs特征在于，CD34的細胞表面表達、高ALDH活性(ALDH^)、光散射性質(例如SSC'。)和/或ABCG2表達。自該SVF所分離的非黏附細胞包含至少約10%CD34+細胞、優(yōu)選地至少約20%CD34+，及更優(yōu)選為至少約40c/。CD34+細胞。從該SVF所分離的非黏附細胞包含至少約10%ALDH^細胞，優(yōu)選地至少約15%ALDHbr細胞及更優(yōu)選為至少約20%ALDHbr細胞。從該SVF所分離的非黏附細胞包含至少約10%ABCG2-表達細胞，優(yōu)選地至少約15%ABCG2-表達細胞并且更優(yōu)選為至少約20%ABCG2-表達細胞。本領域技術人員將進一步了解，特定于細胞表面標記的抗體可與物理支持物(即鏈霉抗生物素蛋白珠子)綴合，并且，所以，可用于結合并分離具有該特定細胞表面標記的HSCs。特異結合至HSC的抗體的實例包括，但不限于，抗-CD34+抗體。在結合后，經結合的HSCs可通過如使用磁珠粒(包括但不限于Dynabeads(DynalBiotech,BrownDeer,WI))的磁分離與其它細胞分離。進一步關于Dynabeac^的使用，MACS分離試劑(MiltenyiBiotec,Auburn,CA)可用于從混合細胞群移出HSCs。備選地，免疫表型、光散射性質、和/或HCS的可檢測的HSCs-特征酶產物的存在允許使用基于流式細胞技術的細胞分選儀進行分選。作為分離步驟或細胞分選的結果，得到富含HSCs的CD34+細胞、ALDHbr細胞禾口/或ABCG2-表達細胞的群。在一個實施方案中，HSCs群為一種純化的細胞群，該分離的HSCs可立即用于治療性應用，而不需進一步擴增，可使用在本領域中己知技術冷凍保存或是可使用本文所公開的方法或常規(guī)方法進行體外培養(yǎng)及擴增和，任選地，進行分化。HSCs還可由進行集落形成測試法表征，以評估多潛能及譜系決定性造血祖細胞?？墒褂檬炀毤夹g人員已知的任何方法執(zhí)行集落形成測試。優(yōu)選地，從該SVF分離的在非黏附細胞中的HSCs包含集落形成單位粒細胞21巨噬細胞(CFU-GM)、爆發(fā)集落形成單位紅細胞(BFU-E)及集落形成單位粒細胞紅細胞巨噬細胞巨核細胞(CFU-GEMM)。有效用于培養(yǎng)ASCs的培養(yǎng)基在本文中稱為"基質細胞培養(yǎng)基"。有效用于培養(yǎng)HSCs的培養(yǎng)基在本文中稱為"造血干細胞培養(yǎng)基"。細胞培養(yǎng)中能夠支持成纖維細胞的任何培養(yǎng)基可用做基質細胞培養(yǎng)基、造血干細胞培養(yǎng)基或是做為ASCs及HSCs共培養(yǎng)的培養(yǎng)基。典型地，基質細胞培養(yǎng)基或造血干細胞培養(yǎng)基包含堿性培養(yǎng)基、血清及抗生素/抗真菌素?；|細胞培養(yǎng)基的非限制實例是包含DMEM/F12Ham，s、10。/。胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、100嗎/ml鏈霉素(Pen-Strep)及0.25嗎/ml兩性霉素B的培養(yǎng)基。造血干細胞培養(yǎng)基的非限制實例是包含DMEM、10。/。胎牛血清(FBS)、4mML-谷氨酰胺、50mg/ml青霉素及鏈霉素、及100ng/ml的Flt-3配體、干細胞因子及巨核細胞生長及發(fā)育因子(MGDF)中每一種的培養(yǎng)基。造血干細胞培養(yǎng)基的另一個實例為具有2%FBS的Iscove's培養(yǎng)基。例如，該培養(yǎng)基在稀釋用于CFU測定的細胞是有用的。然而，ASCs及HSCs可在補充至少一種生長因子、細胞因子或激素且無抗生素/抗真菌素的堿性培養(yǎng)基中培養(yǎng)。有效用于根據本發(fā)明的方法分離和增殖HSCs的培養(yǎng)基在本領域中是已知的。這些培養(yǎng)基還有效用于ASCs的分離和增殖。有效用于本發(fā)明方法的堿性培養(yǎng)基的非限制實例包含Eagle極限必需培養(yǎng)基、ADC-1、LPM(不含牛血清白蛋白)、F10(HAM)、F12(HAM)、DCCM1、DCCM2、RPMI1640、BGJ培養(yǎng)基(具有和不具有Fitton-Jackson改良)、Eagle基本培養(yǎng)基(BME-添加Earle's鹽基)、Dulbecco，s改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM-不含血清)、Yamane、IMEM-20、格拉斯哥改良的Eagle培養(yǎng)基(GMEM)、LeibovitzL-15培養(yǎng)基、McCoy's5A培養(yǎng)基、培養(yǎng)基M199(M199E-具有Earle's鹽基)、培養(yǎng)基M199(M199H-具有Hank's鹽基)、Eagle極限必需培養(yǎng)基(MEM-E-具有Earle's鹽基)、Eagle極限必需培養(yǎng)基(MEM-H-具有Hank's鹽基)及Eagle極限必需培養(yǎng)基(MEM-NAA具有非必需氨基酸)、尤其在數(shù)種其它培養(yǎng)基中，其包括培養(yǎng)基199、CMRL1415、CMRL1969、CMRL1066、NCTC135、MB75261、.MAB8713、DM145、William，G、Neuman&Tyte11、Higuchi、MCDB301、MCDB202、MCDB501、MCDB401、MCDB4U、MDBC153。用于本發(fā)明的優(yōu)選培養(yǎng)基為DMEM。這些及其它有用培養(yǎng)基特別可購自GIBCO,GrandIsland,紐約,美國，及生物工業(yè)(BiologicalIndustries),BetHaEmek，以色列。數(shù)種這些培養(yǎng)基總結在酶學方法(MethodsinEnzymology)，第LVIII巻，"細胞培養(yǎng)(CellCulture)",第62-72頁，由WilliamB.Jakoby及IraH.Pastan編輯，由學院出版社公司)AcademicPress,Inc)出版。尤其是西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aidrich),干細胞技術(StemcellTechnologies),StemGenix,Mabio及QualityBiologicalInc提供用于造血干細胞增殖的專賣培養(yǎng)基。有效用于本發(fā)明的血清，包括，但不限于，濃度至少1%至約30%，優(yōu)選地至少約5%至15%，最優(yōu)選為約10%的?；蚱渌锓N的胎兒血清。雞或其它物種的胚提取物可以約1%至30%，優(yōu)選地至少約5%至15%，最優(yōu)選為約10%的濃度存在。在一些人的治療實施方案中，因為血清中偶發(fā)傳染性污染物的可能傳播的安全風險，不希望使用非人類血清。有經驗的執(zhí)業(yè)醫(yī)生熟悉醫(yī)療應用的HSCs的醫(yī)藥適當?shù)奶幚怼?生長因子、細胞因子、激素"指下列特定因子，其包括，但不限于，紅細胞生成素(EPO)、巨噬細胞集落刺激因子、血小板生成素(TPO)、生長激素(GH)、白介素l-a及l(fā)-P、白介素3(IL-3)、白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、白介素6(IL-6)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素IO(IL-IO)、白介素ll(IL-ll)、白介素13(IL-13)、c-kit配體/干細胞因子(SCF)、胰島素、胰島素樣生長因子、如IGF-2、白血病抑制因子(LIF)、巨噬細胞抑制蛋白la(MIPla)、表皮生長因子(EGF)、及成纖維細胞生長因子(FGF)、如FGF-1、FLT-3/FLK-2配體、巨核細胞生長發(fā)育因子(MGDF)、粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、及巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)，其以介于微微克/ml至毫克/ml水平的濃度存在。有效用于HSCs擴增的因子包括，但不限于，IL-3、SCF、FLT-3/FLK-2配體、IL-6及GM-CSF。當在治療應用中要將HSCs施用至人類時，在培養(yǎng)基中任何生長因子、細胞因子和/或激素優(yōu)選是人類的。應該進一步認識到，可以向該培養(yǎng)基中加入額外成分。此種成分可為抗生素、抗真菌藥、白蛋白、氨基酸、及細胞培養(yǎng)工藝中已知的其它成分。此外，可添加成分以加強分化作用?？商砑拥脚囵B(yǎng)基中的抗生素包括，但23不限于，青霉素及鏈霉素。青霉素在培養(yǎng)基中的濃度為約10至約200單位/毫升。培養(yǎng)基中鏈霉素的濃度為約10至約200pg/ml。然而，本發(fā)明決不應解釋為受限于用于培養(yǎng)基質細胞和/或HSCs的任何一種培養(yǎng)基。而是，可使用能夠在組織培養(yǎng)中支持脂肪組織SVF細胞及HSCs的任何一種培養(yǎng)基。依本文所敘述分離的脂肪來源的HSCs可根據常規(guī)步驟冷凍保存。優(yōu)選地，在包含10%DMSO的基質細胞培養(yǎng)基中的約一百萬至一千萬個細胞冷凍保存在液態(tài)N2的氣相。經冷凍的細胞可于37。C浴由渦流解凍，再次懸浮于新鮮生長培養(yǎng)基，并且如上文所敘述擴增。II.使用HSCs由本發(fā)明方法所得到的脂肪來源的HSCs可以用在本領域中使用HSCs的已知的任何方法中。額外地，HSCs可用于目前待揭示的方法及組合物中。使用HSCs的一個方法是將它們施用至需要HSCs的受體受試者。受體受試者可為任何哺乳動物，包括馬、山羊、牛、狗、綿羊、貓、非人類靈長類、及人類。優(yōu)選地，該受體受試者為人。用于得到移植用HSCs的脂肪組織來源可以是與進行治療的受體受試者相同的(自體移植)或是可得自供體受試者。該供體受試者可與受體受試者是基因相同的(同源移植)或是可以是相同物種的非基因相同個體(同種異體移植)?？捎伤_的細胞灌注而治療的疾病包括，但不限于，由正常血液細胞產生及成熟的功能障礙的失效導致的疾病(即，再生障礙性貧血及再生障礙性干細胞疾病)。HSCs的施用意欲補充或置換有缺陷的內源血液細胞產生及成熟。此種疾病一般為造血器官中的贅瘤、惡性疾病(例如白血病及淋巴瘤)；非造血器官起源的廣譜惡性實體腫瘤；自體免疫病癥；或是遺傳疾病。此種疾病包括，但不限于，由正常血液細胞產生及成熟的功能障礙的失效導致的疾病、過度增生干細胞疾病，其包括再生障礙性貧血、各類血細胞減少癥、粒細胞缺乏、血小板缺乏、紅細胞發(fā)育不良、布-戴二氏貧血綜合征(Blackfan-Diamondsyndrome),因為藥物、輻射、或感染引起的、自發(fā)性的；造血惡性病，包括急性淋巴性(淋巴細胞性)白血病、慢性淋巴細胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、惡性脊髓髓硬化、多發(fā)性骨髓瘤、真性紅細胞增多癥、原因不明的骨髓化生、Waldenstrom氏巨球蛋白癥、霍奇金(Hodgkin)氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤；患有包括惡性黑素瘤、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、小細胞肺癌、成視網膜細胞瘤、睪丸癌、成神經膠質細胞瘤、橫紋肌肉瘤、成神經細胞瘤、Ewing氏肉瘤、淋巴瘤的惡性、實體腫瘤的患者的免疫抑制；自體免疫疾病，包括類風濕關節(jié)炎、I型糖尿病、慢性肝炎、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡；遺傳(先天性)疾病，包括貧血、家族性再生障礙、范科尼綜合征、二氫葉酸還原酶缺乏癥、甲酰氨基轉移酶缺乏癥、萊希一尼亨綜合征、先天性紅細胞形成不良性綜合征I-IV、Chwachmann-Diamond綜合征、二氫葉酸還原酶缺乏癥、甲酰氨基轉移酶缺乏癥、萊希一尼亨綜合征、先天性球形紅細胞癥、先天性橢圓紅細胞癥、先天性裂口紅細胞癥、先天性Rh無效應性疾病、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿癥、G6PD(6-磷酸葡萄糖脫氫酶缺乏癥)變體1,2,3，丙酮酸激酶缺乏癥、先天性紅細胞生成素敏感癥、缺乏癥、鐮刀形細胞貧血癥及特征、地中海型貧血a、P、Y、正鐵血紅蛋白血癥、先天性免疫失調、重度合并性免疫缺陷癥(SCID)、bare淋巴細胞綜合征、離子載體-反應聯(lián)合免疫缺陷癥、具有帽化異常(cappingabnormality)的聯(lián)合免疫缺陷癥、核苷磷酸化酶缺乏癥、粒細胞肌動蛋白缺乏癥、嬰兒型粒細胞缺乏癥、戈謝病、腺苷脫胺嗨缺乏癥、Kostmann氏綜合征、網狀組織發(fā)育不全、先天性白細胞功能異常綜合征；及其它如骨質疏松、骨髓硬化、后天性溶血性貧血、獲得性免疫缺陷癥、引起原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷癥的感染性疾病、細菌感染(例如布魯氏菌癥、利斯特氏菌癥、結核病、麻瘋病)、寄生性感染(例如瘧疾、利什曼原蟲癥)、真菌感染、涉及淋巴樣細胞組中不平均及因老化引起的受損免疫功能的疾病、吞噬細胞疾病、Kostmann氏粒細胞缺乏癥、慢性肉芽腫病、Chediak-Higachi綜合征、嗜中性粒細胞肌動蛋白缺乏癥、嗜中性粒細胞膜GP-180缺乏癥、代謝性儲存疾病、粘多醣貯積癥、粘脂質貯積癥、涉及免疫機制的各種疾病、尤其是Wiskott-Aldrich綜合征、a1-抗胰蛋白酶缺乏癥。細胞可以各種方式施用至受體受試者。優(yōu)選的施用模式為腸胃外的、腹膜內的、靜脈內的、皮內的、硬膜外、脊椎內、胸骨內的、關節(jié)內的、滑膜內的、鞘內的、動脈內的、心腔內的、肌肉內的、鼻內的、皮下的、眼眶內的、囊內的、局部的、透皮藥貼、包括經由栓劑的經由直腸的、陰道的或尿道的施用、經皮膚、鼻內噴霧劑、外科手術植入、內科糊劑、輸液泵、或經由導管。在一個實施方案中，該試劑及載體以緩釋型配方施用，例如直接組織注射或推注(bolus)、植入物、微粒、微球粒、納米粒子及納米球粒。優(yōu)選的施用方法為靜脈內滴注。骨髓移植的方法為本領域中所熟知，并且敘述于如美國專利第4,678,470號，和美國專利第5，571,083號，其教導將細胞移植至身體內任何解剖部位的方法。為將本發(fā)明的細胞移植至人類，所述細胞依本文所敘述分離。隨后，分離的HSCs可以以移植所需的任何方式醫(yī)學處理。任選地，使用本領域中已知的方法從HSCs去除細胞如T-細胞。此種方法包括，但不限于，逆流離心分離、大豆凝集素/E-花紋樣體形成(soybeanagglutinin/E-rosetteformation)、密度梯度離心及免疫消耗。作為癌癥治療的一部分的自體移植體中腫瘤細胞的清除方法也為本領域所己知。優(yōu)選地，要移植的細胞來自要移植所述細胞的受試者(自體移植)。在細胞不是來自該患者的情況下(同種異體移植)，典型地要決定在供體細胞及患者之間的血型或單元型相容性。本領域熟練的醫(yī)生熟悉同種異體移植的相容性問題。將介于約105及約1013之間的CD34+、ALDHbr和/或ABCG2-表達細胞/100kg的人的細胞施用至人。在一些實施方案中，將介于約1.5xl(^及約1.5x1(^之間的細胞/100kg的人施用至人。在一些實施方案中，將介于約1x108及約5x1011之間的細胞/100kg的人施用至人。在一些實施方案中，將介于約lxl(f及約2xl0"之間的細胞/100kg的人施用至人。在其它實施方案中，將介于約5x108及約1x10'Q之間的細胞/100kg的人施用至人。這些細胞可由各種方法施用至人，所述方法包括但不限于輸注及靜脈內施用。在一些實施方案中，提供單次細胞施用。在一些實施方案中，提供多次施用。在一些實施方案中，于3-7天連續(xù)期間提供多次施用。在一些實施方案中，于3-7天連續(xù)期間提供3-7次施用。在其它實施方案中，于5天連續(xù)期間提供5次施用。在一些實施方案中，提供約105-約1(^個細胞/100kg的人的單次施用。在一些實施方案中，提供約1.5X108-約1.5X10"個細胞/100kg的人的單次施用。在一些實施方案中，提供約lxl()S-約5xlO"個細胞/100kg的人的單次施用。在一些實施方案中，提供約lxl0Mxl(^個細胞/100kg的人的單次施用。在一些實施方案中，提供lx1()W個細胞/100kg的人的單次施用。在一些實施方案中，提供約105-約1(^個細胞/100kg的人的多次施用。在一些實施方案中，提供約1.5x108-約1.5x10^個細胞/100kg的人的多次施用。在一些實施方案中，于3-7天連續(xù)期間提供約1x108-約5x10'1個細胞/100kg的人的多次施用。在一些實施方案中，于3-7天連續(xù)期間提供約4xl(^個細胞/100kg的人的多次施用。在一些實施方案中，于3-7天連續(xù)期間提供約2x1()H個細胞/100kg的人的多次施用。在一些實施方案中，于5天連續(xù)期間提供約3.5xl(f個細胞的5次施用。在一些實施方案中，于5天連續(xù)期間提供約4x109個細胞的5次施用。在一些實施方案中，于5天連續(xù)期間提供約1.3x10"個細胞的5次施用。在一些實施方案中，于5天連續(xù)期間提供約2x1011個細胞的5次施用。在另一實施方案中，在施用HSCs之前，用生長因子、細胞因子或激素處理HSCs，以誘發(fā)對特定分化狀態(tài)的決定。脂肪來源的HSCs可通過使用于本文他處所敘述的分化因子處理細胞和通過在本領域中已知的標準方法而進行體外分化。部分或終端分化的細胞可以特征在于，指示HSCs至特定終端分化狀態(tài)的譜系決定的表面及胞內蛋白、基因、和/或其它標記的識別。這些方法可包括，但不限于，(a)由免疫熒光法使用以第二熒光標記連接的蛋白質特異性單克隆抗體的細胞表面蛋白質檢測，其包括流式細胞技術方法的使用；(b)由免疫熒光法使用以第二熒光標記連接的蛋白質特異性單克隆抗體的胞內蛋白檢測，其包括流式細胞技術方法的使用；(c)由聚合酶鏈式反應、原位雜交、及/或RNA印跡分析的細胞基因的檢測。在另一個實施方案中，脂肪來源的基質細胞(ASCs)也施用至受體受試者，以提供造血支持細胞以協(xié)助HSCs的植入。ASCs可與HSCs共灌注或可以在HSC施用之前或之后施用。ASCs可使用提供用于HSCs的類似劑量指南施用。27III.基因修飾在另一個實施方案中，基因修飾本發(fā)明的脂肪來源的HSCs，例如以表達外源基因或編碼序列，或是抑制或是改變內源基因的表達。當將該HSCs施用至受試者時，此種基因修飾可具有醫(yī)療效益。備選地，基因修飾可提供一種追蹤或辨識這樣修飾的細胞的方式，例如，在將此種基因修飾的脂肪來源的HSCs移植進入個體之后，追蹤或辨識該如此修飾的細胞。追蹤細胞可包括追蹤移植的基因修飾細胞的遷移、同化及存活。基因修飾還可以包括至少第二基因。第二基因可編碼，例如，可選擇性抗生素抗性基因或是其它可選擇性標記。有效用于追蹤細胞的蛋白質包括，但不限于，綠色熒光蛋白(GFP)、任何其它熒光蛋白(例如，增強型綠色、藍綠色、黃色、藍色及紅色熒光蛋白；Clontech,PaloAlto，CA)，或是其它標記蛋白(例如，LacZ、FLAG-標簽、Myc、His6等)。追蹤本發(fā)明的細胞的遷移、分化及整合不限于使用由載體或病毒表達的可檢測分子。細胞的遷移、整合、及分化可使用允許移植的HSCs的局部化的一系列探針確定。追蹤移植的細胞可進一步由使用于本文他處所詳述的針對細胞特異性標記的抗體或核酸探針完成?；蛐揎椀腍SCs的治療使用包括，但不限于，提供在患者中是突變的、缺乏的或另外是功能異常的蛋白質的表達。例如，可以基因修飾HSCs，以提供血紅蛋白A取代血紅蛋白S，或是除血紅蛋白S之外還提供血紅蛋白A，以進行鐮刀形細胞貧血癥的治療。地中海型貧血及X-連鎖的重度聯(lián)合免疫缺陷癥是使用離體基因修飾的HSCs的基因療法的其它、非限制候選病癥。表達所欲分離的核酸的細胞可用于向另一個細胞、組織、或是整個哺乳動物提供分離的核酸的產物，其中較高含量的基因產物有效用于治療或減緩伴隨不正常的表達和/或活性的疾病、失調或病癥。所以，本發(fā)明包括表達編碼需要序列的經分離的核酸的HSC，其中增加表達、蛋白質水平、和/或需要的蛋白質的活性可以對治療或減緩涉及造血系統(tǒng)的疾病、失調或病癥是有用的。本發(fā)明還包括HSC，當向其中引入分離的核酸，并且由該核酸編碼的28蛋白質由此表達時得到益處，其先前不存在或是不在細胞中表達，或是其現(xiàn)在以一種水平表達或是在與引入轉基因之前不同的情況下表達。此種益處可包括已提供一種系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中所需核酸的表達可在實驗室或是該細胞所在的哺乳動物中進行體外研究，提供一種系統(tǒng)，其中包含所引入的核酸的細胞可用做研究、診斷及醫(yī)療工具，并且提供一種系統(tǒng)，其中產生有效用于哺乳動物中所選擇疾病狀態(tài)的新診斷及醫(yī)療工具的開發(fā)的哺乳動物模型。因此，本發(fā)明包括表達載體及將外源DNA引入到HSCs中使該外源DNA在細胞中表達的方法。熟練的技術人員熟悉產生表達載體及使用它們轉化細胞的技術。參考如Sambrook等(2001,分子克隆實驗室手冊(MolecularCloning:ALaboratoryManual),冷泉港實驗室(ColdSpringHarborLaboratory),紐約)，及Ausubel等(1997,分子生物當代流程(CurrentProtocolsinMolecularBiology),JohnWiley&Sons,紐約)。表達載體為一種適合用于將表達盒遞送至細胞的基因載體。依據所需的終端應用而定，可如此利用任何此種載體以基因修飾該細胞(例如，質粒、裸DNA、病毒如腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、慢病毒、乳頭狀瘤病毒、反轉錄病毒、等)?？墒褂迷诖朔N載體內構建所需表達盒的任何方法，這些方法中的許多為本領域所熟知，如直接克隆、同源重組、等。所需載體主要地決定用于將該載體引入細胞的方法，其為本領域所普遍熟知。適當技術包括原生質體融合、磷酸鈣沉淀、基因槍、電穿孔、光穿孔、DEAE葡聚糖或脂質載體介導的轉染、及使用病毒載體的感染。表達載體包含表達盒，所述表達盒包含與表達控制序列如啟動子操縱性連接的要表達的核苷酸序列。要表達的核苷酸序列可編碼一種蛋白質，或是其可編碼生物活性RNA，如反義RNA.、siRNA或核酶。因此，該編碼多核苷酸可編碼一種賦與例如針對下列各項的抗性的基因毒素、激素(如肽生長激素、激素釋放因子、及細胞因子如干擾素、白介素、及淋巴因子)、細胞表面結合的胞內信號傳導部分(如細胞黏附分子及激素受體)、及促進已提供分化譜系的因子，或是任何其它編碼序列。合適的啟動子的實例包括原核生物啟動子及病毒啟動子(例如，反轉錄ITRs、LTRs、即時早期病毒啟動子(IEp)、如皰疹病毒IEp(例如ICP4-IEp及ICPO-IEEp)、巨細胞病毒(CMV)IEp、及其它病毒啟動子，如勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、及鼠白血病病毒(MLV)啟動子)。其它合適的啟動子為真核生物啟動子，如增強子(例如，兔e-珠蛋白調節(jié)元件)、組成型主動啟動子(例如，J3-肌動蛋白啟動子，等)、信號特異性啟動子(例如，可誘導的啟動子如對應于RU486的啟動子，等)，及組織特異性啟動子。選擇適合用于在預定細胞背景下驅動基因表達的啟動子也在本領域的技術內。該表達盒可包括超過一個編碼多核苷酸，并且如果需要的話，其可以包括其它組件(例如，多聚腺苷酸化序列、編碼膜嵌入信號或分泌前導肽的序列、核醣體進入序列、轉錄調控元件(例如、增強子、沉默子等)，等)。實驗實驗例本發(fā)明進一步參考下列實驗例詳細敘述。這些實施例僅提供用于說明目的，除非特別指定，其并不欲為限制性的。因此，本發(fā)明絕不解釋為限制于下列實例，而是，應解釋為包含任何及所有變化，所述變化因為本發(fā)明提供的教導而是顯而易見的。實施例1:從脂肪吸取物脂肪組織分離造血干細胞脂肪組織得自因美容原因而在人受試者中獲得的吸脂脂肪吸取物。將50毫升(ml)脂肪吸取物物質通過與50毫升PBS(磷酸緩沖鹽水)混合及抽取脂肪下的水層進行清洗。再用PBS洗細胞懸浮液兩次直到洗液為淡黃色。將水相洗液集中起來，并儲存做為"脂肪吸取物洗后團塊"(APWP)。95mg膠原酶溶解于50mlPBS+l。/。牛血清白蛋白(BSA)的五十(50)ml溶液加至經清洗的細胞懸浮液，并將混合物移至T-185燒瓶。將燒瓶在BellyDancer震蕩器(StovallLifeScience,Greensboro,NC)上于37。C溫育1小時。將溶解的脂肪于約550xg(1600rpm)離心6分鐘。將約10-20ml的頂部脂肪層倒掉。將細胞團塊再次懸浮于剩余的上層清液中，并倒出通過100微米細胞過濾網以除去殘屑。通過的流體于約550xg(1600rpm)離心6分鐘以沉淀細胞。丟棄上層清液。將細胞沉淀懸浮于紅細胞裂解緩沖液(eBioscience)中。將所懸浮的細胞置于冰上3分鐘，接著于約550xg(1600rpm)離心6分鐘。丟棄上層清液。(后續(xù)工作顯示紅細胞裂解步驟對從SVF分離HSCs不是必要的或理想的)。將細胞沉淀懸浮于PBS以清洗細胞，并且細胞如上述沉淀。接著將細胞沉淀懸浮于5ml培養(yǎng)基(補充了10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素及抗生素和0.25微克(Ug)/ml兩性霉素B的DMEM/F12Ham，s)中。這些細胞為"未分離的SVF"。計數(shù)未分離的SVF細胞，并使用錐蟲藍染色排除法決定存活力。接著將細胞以約50,000活細胞/cn^接種在T-185燒瓶中。將燒瓶于處于5%C02的37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在24小時后，移除包含非黏附細胞的培養(yǎng)基，并更換新鮮培養(yǎng)基。非黏附細胞部分保留做為"非黏附SVF"。非黏附SVF細胞的表面免疫類型通過流式細胞技術表征。先檢查CD34及CD45的表達，其是HSCs的典型標記。如在圖l中所示，中央版，發(fā)現(xiàn)來自此脂肪組織樣品的約40.88。/。的非黏附SVF細胞表達CD34+，CD34+是一種HSCs的熟知標記。(使用來自其它供體的脂肪組織的實驗顯示多至約50%-約60%的非黏附SVF細胞表達CD34+)。這些數(shù)據顯示來自約100ml人脂肪組織可能產生至少約1x107CD34+細胞。在該非黏附SVF群中觀察到多種CD34+亞群。對此代表性供體觀察到兩個不同的側向角散射群，低CD34+(CD34'。)及高CD34+(CD34hi)。CD34hi細胞包括約27.2%(23%+4.29%)的該非黏附SVF細胞，并且CD34"。包括約13.59%(8.88%+4.71%)。CD34hiCD45—群包括約23%的該細胞。CD34'。CD45-群包括約8.88%的該非黏附SVF細胞。CD34+CD45+群包括約9%的該非黏附SVF細胞(4.29%+4.71%)。還進行了反向圈選(back-gating)以檢查各種CD34+亞群的正向及側向散射。此分析顯示存在許多不同側向角散射群(圖1，在左側的兩版及在右側的兩版)。與CD34'。群(底部左側及底部右側版)相較，發(fā)現(xiàn)CD34hi群(頂部左側及頂部右側版)具有較低側向角散射(SSC1。)。低側向角散射典型地與造血干細胞群相關。CD38及CD41為已用于辨識CD34+細胞亞群的細胞表面標記，并且適度地有效用于預測改善的HSC移植。CD41表達顯示造血作用的開始，并且也用于在CD34+細胞混合群中區(qū)分內皮祖細胞(CD34+CD41+細胞)和HSCs(CD34+CD38-CD4r細胞)。如在圖2中所示(左兩版)，包含約13%非黏附SVF群的高側向角散射CD34+群包含顯著量的CD41+細胞。值得注意地，該低側向角散射CD34+群(非黏附SVF群的16%)缺乏CD38和CD41二者的表達，這與HSCs典型的免疫表型一致。在鑒定光散射采集點圖中兩個主要CD34+細胞群之后，分別閘控(gated)細胞以決定內皮(CD31)或基質標記(CD105及CD90)是否與CD34共表達。雖然CD90也可以在造血細胞上表達，但是Endogin(CD105)是排他性的基質譜系標記。如在圖3中所示，在具有低側向角散射的CD34+細胞及具有高側向角散射的CD34+細胞中觀察到各種共表達及譜系陰性群的水平。預測CD31及CD105不在CD34+HSCs上表達，CD34+CD31+細胞和CD34+CD105+細胞可能是內皮和基質細胞譜系。因此，非黏附SVF細胞包括異相混合物內不同表型標記表達的多種置換CD34+SSC'。群、CD34+SSC'。群、CD34hiSSC'。群、CD34hiCD38-CD4rSSC'°群；CD34'。CD45-群；及CD34'。CD45+群。c醒kit(CD117)的表達，其也是一種與HSCs相關的標記，也在約2-3%的非黏附SVF細胞上觀察到。另--種HSC標記即ABCG2的表達，在約16%的非黏附SVF細胞上觀察到(圖8B)。有利的是，具有光亮ABCG2熒光的非黏附SVF細胞具有不連續(xù)的光散射模式。在圖8A中，圈起的細胞區(qū)域，表示約25%的總細胞，包含具有光亮ABCG2熒光的細胞。此特征允許僅基于光散射數(shù)據富集這些細胞且不需使用抗體或任何其它化學操作的可能性。因此，該非黏附SVF包括顯現(xiàn)出與骨髓來源的HSCs相當?shù)拿庖弑硇图胺只瘽撃艿募毎＜湫纬蓡挝粶y定使用有限稀釋法以定量特定譜系祖細胞的頻率。標示為"脂肪吸取物洗后沉淀"(APWP)"未分離的SVF"及"非黏附SVF"的單獨細胞群在Methocult⑧培養(yǎng)基(干細胞技術(StemCellTechnologies),溫哥華，加拿大)中接種，以研究造血集落形成祖細胞的存在。各種細胞成分以兩種細胞濃度接種，25,000細胞/ml及50,000細胞/ml。將l.lmlMethocult培養(yǎng)基細胞懸浮液的等分試樣添加至一式兩份的35mm培養(yǎng)皿中。在培養(yǎng)14天后，計數(shù)及分析每板的CFUs數(shù)目以決定BFU-E、CFU-GM32及CFU-GEMM集落的頻率。一個實驗的結果示于表l。盡管在所分析的該三個細胞群的每一個中觀察到所有三種類型的集落，包括BFU-E、CFU-GM及CFU-GEMM，但是在所述"非黏附SVF"群中觀察到最高頻率。圖4-7顯示在非黏附SVF細胞觀察到的代表性集落。圖4禾B5顯示在40X放大率下的BFU-E集落。圖6顯示CFU-GM集落及圖7顯示CFU-GEMM集落。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>注意APWP:脂肪吸取物洗后沉淀；BFU-E:爆發(fā)集落形成單位紅細胞；GJVN粒細胞，巨噬細胞；GEMM-粒細胞，紅細胞，巨噬細胞，巨核細胞醛脫氫酶(ALDH)的表達也已用于鑒定造血亞群。進行ALDH活性及PCR陣列分析，以鑒定在脂肪吸取物的基質血管成分的非黏附群內的潛在的造血亞群。初期數(shù)據顯示ALDHbrSSC1。群包括約17%的該非黏附SVF細胞群。實施例2:使用脂肪來源的HSCs的骨髓再增殖測定得自實施例1的人脂肪組織來源的造血干細胞基于骨髓再增殖測定進行關于造血分化的檢測。將免疫缺陷SCID或是裸/米色鼠以11Gy的Y-照射以分多次劑量的致死量照射，并保持為酸化水及高壓蒸汽處理滅菌的飲食。當為鼠來源時，造血細胞以約107細胞/移植體造血細胞的量(107骨髓來源的細胞)分離，或當為人類來源時，是約106細胞/移植體的量(106脂肪來源的HSCs或106SVF細胞)分離，并且在以致死量照射16小時后經由尾靜脈或后眼窩靜脈或腹膜內注射引入小鼠。備選地，在移植進入經亞致死量照射的宿主動物之前，將人細胞與鼠造血細胞以約1:10的比例混合，以研究競爭性的再增殖。動物在甲氧氟垸麻醉下輸液。在移植后六至十二周，從受體動物收集血液，并使用對人造血細胞標記包括，但不限于，Thyl(T細胞標記)、B220(B細胞標記)、Macl(巨噬細胞標記)、及HLA(H-2K，人標記)特異的單克隆抗體進行流式細胞技術分析。確定相對于鼠來源的人總外周造血細胞的百分率。在類似研究中，從受體小鼠收集骨髓及脾臟，并且進行針對特定造血譜系的體外產克隆測定。這些研究利用基于甲基纖維素集落的研究。使用針對特定譜系決定的可比較的免疫熒光法分析細胞。實施例3:使用脂肪來源的HSCs的骨髓再增殖測定得自個體人供體的人脂肪組織通過吸脂分離，并且根據上文所敘述方法體外分離脂肪來源的HSCs。在包含10%胎牛血清、5%雞胚提取物、干細胞因子、flt-3配體及抗生素的Iscove's培養(yǎng)基中在37°C初始接種之后，這些細胞以原代培養(yǎng)物培養(yǎng)多至約5天的時間。如在高劑量化療之后，將細胞立即用于患有造血疾病的患者，或是冷凍保存以在供體或組織相容的受體有緊急醫(yī)療需求的情況下將來使用。在嚴重危及骨髓功能及免疫反應能力的任何事件之后，例如化療或輻射之后，脂肪來源的HSCs以自體移植或同種異體移植的方式輸注到受體。脂肪來源的HSCs以熒光標記標示，以允許醫(yī)生在移植后可追蹤其結局。加速骨髓恢復的證據使用流式細胞技術方法基于外周血流中新合成的造血細胞(淋巴細胞、脊髓細胞、紅細胞、及血小板)的檢測而進行監(jiān)側。本文所引用的每一個專利、專利申請案、及公布的內容以其全文并入本文作為參考。盡管本發(fā)明己參考特定實施方案進行了公開，但是，顯然本發(fā)明其它實施方案及變化可由本領域技術人員作出且不偏離本發(fā)明真實意旨及范圍。所附權利要求意欲解釋為包含所有此種實施方案及其等價的變化。權利要求1.一種自脂肪組織分離造血干細胞的方法，所述方法包含取得脂肪組織，自所述脂肪組織制備基質血管成分(SVF)；及分離在所述SVF中的非黏附細胞，其中所述非黏附細胞包含造血干細胞。2.權利要求1的方法，其中所述取得步驟包括吸脂。3.權利要求l的方法，其中所述脂肪組織為人類的。4.權利要求1的方法，其中所述造血干細胞選自由下列各項所組成的組ALDHb""SSC'。細胞、CD34+細胞、CD34+SSC1。細胞、CD34+CD45+細胞、CD34+CD38—CD41—細胞、CD34+CD45'細胞、CD34+CD38—CD41—SSC1。細胞及ABCG2-表達細胞。5.權利要求1的方法，其進一步包括自所述非黏附細胞分離CD34hi細胞的步驟。6.權利要求1的方法，其進一步包括自所述非黏附細胞分離ALDHbf細胞的步驟。7.權利要求6的方法，其中所述ALDHbr細胞為ALDHbfSSC'°。8.權利要求1的方法，其中所述造血干細胞選自由下列各項組成的組集落形成單位粒細胞巨噬細胞(CFU-GM)、爆發(fā)集落形成單位紅細胞(BFU-E)和集落形成單位粒細胞紅細胞巨噬細胞巨核細胞(CFU-GEMM)。9.一種分離CD34+細胞的方法，所述方法包括取得脂肪組織；自所述脂肪組織制備基質血管成分(SVF);分離在所述SVF中的非黏附細胞與黏附細胞，及自所述非黏附細胞分離CD34+細胞，由此分離CD34+細胞。10.權利要求9的方法，其中所述SVF包含至少約40。/。CD34+細胞。11.權利要求10的方法，其中該CD34+細胞以每約100毫升脂肪組織分離至少約1x1(^CD34+細胞的比率分離。12.權利要求9的方法，其中所述取得步驟包括吸脂。13.權利要求9的方法，其中所述脂肪組織為人類的。14.權利要求9的方法，其中該CD34+細胞選自由下列各項組成的組CD34+SSC1。細胞、CD34+CD45+細胞、CD34hiCD38-CD4r細胞、CD34+CD38.CD4rSSC1。、CD34'。CD45-細胞、CD341()CD45+細胞、CD34+ALDHbr細胞和CD34+ALDHbrsSC'°細胞。15.權利要求9的方法，其進一步包括分離CD34hi細胞或CD34'。細胞的步驟。16.—種包含CD34+細胞的組合物，所述CD34+細胞按照權利要求9的方法分離，其中所述CD34+細胞以每約1毫升脂肪組織分離至少約1x105CD34+細胞的比率分離。17.權利要求16的組合物，其中所述脂肪組織為人類的。18.—種將造血干細胞提供給受試者的方法，所述方法包括，自供體受試者取得脂肪組織，自所述脂肪組織制備基質血管成分(SVF)，分離在所述SVF中的非黏附細胞，自所述非黏附細胞分離造血干細胞，及將治療有效量的造血干細胞施用至需要所述造血干細胞的受體受試者。19.權利要求18的方法，其中所述供體受試者及所述受體受試者為人。20.權利要求19的方法，其中所述供體受試者及所述受體受試者為相同的人。21.權利要求19的方法，其中所述供體受試者及所述受體受試者不是相同的人。22.權利要求18的方法，其中所述造血干細胞為CD34+且以每約100ml脂肪組織分離至少約1x1(^CD34+細胞的比率分離。23.權利要求20的方法，其中所述取得步驟包括吸脂。24.權利要求18的方法，其中所述分離步驟包括分離ALDHb「SSC1。細胞或CD34+CD38—CD4rSSC"細胞。25.—種分離的細胞的組合物，其包含至少約40%非黏附、基質血管成分(SVF)CD34+細胞。26.權利要求25的組合物，其中所述分離的細胞包含至少約20%CD34+CD45—細胞。27.權利要求25的組合物，其中所述基質血管成分得自人脂肪組織。28.權利要求25的組合物，其中所述CD34+細胞包含CD34+CD38-CD41-ALDHbr細胞。29.權利要求25的組合物，其中所述CD34+細胞包含CD34+CD38.CD41'SSC1。細胞。30.權利要求25的組合物，其中所述CD34+細胞包含集落形成單位粒細胞巨噬細胞(CFU-GM)、爆發(fā)集落形成單位紅細胞(BFU-E)及集落形成單位粒細胞紅細胞巨噬細胞巨核細胞(CFU-GEMM)。31.權利要求25的組合物，其中所述細胞是基因修飾的。32.—種分離的細胞的組合物，其包含至少約10%非黏附、基質血管成分(SVF)ALDHbr細胞。33.權利要求32的組合物，其包含至少約15y。非黏附SVFALDHbr細胞。34.權利要求32的組合物，其中所述ALDHbr細胞為ALDHbrsSC'。細胞。35.權利要求32的組合物，其中所述SVF得自人脂肪組織。36.—種藥物組合物，其包含權利要求16的組合物及藥用載體。37.—種藥物組合物，其包含權利要求25的組合物及藥用載體。38.—種藥物組合物，其包含權利要求32的組合物及藥用載體。全文摘要本發(fā)明是關于一種自脂肪組織分離造血干細胞的方法。該方法產生顯著高量的CD34⁺、ALDH^br和/或ABCG2-表達細胞，其包含造血干細胞，允許不使用任何擴增或最少擴增地使用該細胞。文檔編號C12N5/0789GK101490246SQ200780027248公開日2009年7月22日申請日期2007年1月8日優(yōu)先權日2006年5月17日發(fā)明者詹姆斯·B·米切爾二世申請人:同源治療公司