專利名稱：用于質(zhì)譜法檢測(cè)的底物和內(nèi)標(biāo)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析試劑和基于質(zhì)譜法的方法，所述方法使用這 些試劑來(lái)同時(shí)量化樣品中的蛋白質(zhì)。更具體而言，本發(fā)明涉及使用質(zhì) 譜法量化溶酶體酶活性的多元分析和試劑。
背景技術(shù)：
溶酶體jJt積病是一組遺傳病癥，其特征為身體內(nèi)特定酶的缺 乏，這導(dǎo)致身體不能分解代謝物質(zhì)。作為一個(gè)實(shí)例，法布里病是每40,000 人之一人中可見的溶酶體貯積病。其是由于a-半乳糖苷酶的缺乏，然后 這導(dǎo)致身體不能分解被稱為球形三酰神經(jīng)酰胺(globotriaosylceramide) 的特定脂質(zhì)。第二個(gè)實(shí)例是高歇病，由于不能分解被稱為葡糖神經(jīng)酰 胺(也稱為葡糖腦苷脂)的脂物質(zhì)(fatty substance)或脂質(zhì)(lipids)弓l起 的溶酶體貯積病?；加懈咝〉膫€(gè)體不能制造葡糖腦苷脂酶， 一種分 解這些脂質(zhì)所需要的酶。然后，這些脂質(zhì)聚集在肝、脾和骨髓的細(xì)胞 內(nèi)。第三個(gè)實(shí)例是蓬珀病，由于被需要用來(lái)分解某些被稱為糖原的糖 的酶——酸性a-葡糖苷酶——的缺乏引起的溶酶體貯積病。當(dāng)酶——酸 性a-葡糖苷酶——缺少時(shí)，糖原在身體內(nèi)的多種組織和器官中聚集。
這些疾病大部分是兒科疾病。在大多數(shù)患者中，患者在出生 時(shí)是正常的，在過(guò)后的一些時(shí)間里漸進(jìn)地開始神經(jīng)學(xué)上惡化。在一些 患者中，該疾病在成年期表現(xiàn)。臨床表型取決于生化缺陷的類型和嚴(yán) 重性。這些溶酶體缺陷癥的一些例如蓬珀病和克臘比病，主要表現(xiàn)在嬰兒期。因此，已經(jīng)正在努力開發(fā)在臨床癥狀開始前檢測(cè)這些病癥的 方法，以便可以開始治療介入。 在過(guò)去的十年內(nèi)，檢測(cè)代謝性疾病的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)將串聯(lián)質(zhì)譜 法引入其新生兒篩查計(jì)劃。串聯(lián)質(zhì)譜法在臨床繼續(xù)得到流行，因?yàn)樵?技術(shù)允許在單一樣品中分析多種代謝物。例如，該技術(shù)己被作為檢測(cè) 在新生兒中遺傳代謝性疾病的常規(guī)臨床實(shí)踐，在該技術(shù)中使用干血斑
樣品(SchulzeA等，Pediatrics 2003; 111:1399-406)。盡管溶酶體酶活性可 使用串聯(lián)質(zhì)譜法量化(Gelb MH等，Clinical Chemistry 50:10, 1785-1796, 2004)，但是發(fā)表的分析方法不容易適用于臨床情況，這是因?yàn)槁闊┑?過(guò)程和苛刻的分析成分例如氯仿。因此，繼續(xù)需要改進(jìn)用于檢測(cè)溶酶體缺陷癥的方法和組合物。
發(fā)明概述 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，提供使用質(zhì)譜法檢測(cè)酶反應(yīng)的改進(jìn) 的組合物和方法。發(fā)明的底物(substrate)具有A—(B'—B"—B"的通式，其中A是
單糖或二糖，B'是CrC2。垸基、具有取代的C6-C20芳基的d-C20、含有N、
0或S雜原子的CVC2o雜環(huán)；BZ是
——^~(XR3)nR4-
(R2)3
其中R'是C廣C2o垸基；CrC2o醚；具有N、 O或S的取代基的Q-C^ 垸基；雜原子C6-C2。芳基、d-C2o羰基、CrC加酰胺基、(^-(:2()醚、C6-C20 芳基、含有N、 0或S雜原子的C6-C2o雜環(huán)；在每一情況中，f獨(dú)立 為H、 d-C2。烷基、具有CrC加烷基的取代基的C2-C2o烷基；在每一情 況中，X獨(dú)立為不存在、氧、硫或氮；在每一情況中，W獨(dú)立為不存 在、C,-C2。烷基、具有取代的C6-C2o芳基的CVC2()、含有N、 O或S雜 原子的C6-C2o雜環(huán)；n是0和30之間的整數(shù)，包括0和30;在每一情
況中，R"獨(dú)立為不存在、C,-C2Q烷基、具有取代的CVC2Q芳基的C,-C20、
C,-C2。羰基、C廣C2o酰胺基、C,-C2o醚、Q-C2。芳基、含有N、 O或S
雜原子的Q-C20雜環(huán)；和BS是不存在或C廣C20垸基、C4-C20醚；具有N、 0或S的取代基的C廣C2o垸基；C廣C2o酯;C廣C2o醇;C廣C2。鏈烯
基；雜原子C6-C2。芳基、含有N、 0或S雜原子的CVC2o雜環(huán)。
提供發(fā)明的方法，其包括用含有發(fā)明的底物和發(fā)明的內(nèi)標(biāo)的 分析溶液溫育樣品，并且對(duì)所形成的樣品進(jìn)行質(zhì)譜法分析。本發(fā)明的 方法消除了現(xiàn)有技術(shù)使用洗滌劑、使用者不友好溶劑如氯仿和液-液和 液-固相提取步驟的需要。因此，本發(fā)明的方法比現(xiàn)有技術(shù)方法所花時(shí) 間更少。
附圖簡(jiǎn)述 圖l是用于檢測(cè)溶酶體貯積病的示例性底物結(jié)構(gòu)。 圖2是使用本發(fā)明底物的一般酶反應(yīng)方案。 圖3是本發(fā)明底物和現(xiàn)有技術(shù)底物之間的主要結(jié)構(gòu)差異。圖4是與現(xiàn)有技術(shù)底物相比，本發(fā)明底物給予的檢測(cè)靈敏性增
加的機(jī)制。 圖5是采用雙重標(biāo)記本發(fā)明底物檢測(cè)酶活性的可選方法。
圖6是使用質(zhì)譜法檢測(cè)酶反應(yīng)的發(fā)明方法，其與現(xiàn)有參照方法 相比具有優(yōu)勢(shì)。 圖7是根據(jù)本發(fā)明以及相應(yīng)空白(blank)的針對(duì)法布里病的底 物樣品的串聯(lián)質(zhì)譜。 圖8是涉及用于蓬珀病的GAA的本發(fā)明底物的串聯(lián)質(zhì)譜，針對(duì) 患病樣品、健康樣品或空白。 圖9是表明在12個(gè)來(lái)自健康新生兒對(duì)象的樣品和3個(gè)來(lái)自蓬珀
病陽(yáng)性的新生兒對(duì)象的樣品中有差別的GAA活性的散點(diǎn)圖。

圖10是一個(gè)實(shí)例，其中，通過(guò)使用含有兩種類型的底物和內(nèi)
標(biāo)的分析溶液處理樣品，本發(fā)明底物和內(nèi)標(biāo)被用于多元方法(multiplex)中。圖11是洗滌劑對(duì)本發(fā)明的內(nèi)標(biāo)的靈敏性的影響。圖12是在存在或不存在洗滌劑以及相應(yīng)空白的情況下針對(duì)蓬
珀病的本發(fā)明底物樣品的有差別的串聯(lián)質(zhì)譜。優(yōu)選實(shí)施方式詳述 本發(fā)明具有作為用于檢測(cè)溶酶體貯積病的分析試劑的效用。
通過(guò)應(yīng)用容易溶解在適于質(zhì)譜法分析的溶液中的底物和內(nèi)標(biāo)，檢測(cè)與 溶酶體貯積病相關(guān)的異常酶活性是更可行的而且較不麻煩的。 本發(fā)明涉及溶酶體酶耙向的底物，所述溶酶體酶包括酸性ot-半乳糖苷酶A (GLA)、酸性(3-葡糖腦苷脂酶(ABG)、半乳糖腦苷脂oc-半乳糖苷酶(GALC)、酸性a-葡糖苷酶(GAA)。這些酶對(duì)底物的作用被 用來(lái)在樣品中測(cè)量相應(yīng)的異常酶活性，因此這些底物被用來(lái)檢測(cè)下列 溶酶體貯積病法布里病(GLA)、高歇病(ABG)、克臘比病(GALC)和 蓬珀病(GAA)。 發(fā)明的底物具有A—(B1—BZ—BS)的通式，其中A是單糖或二
糖，B'是d-C20垸基、具有取代的(VC2()芳基的d-C20、含有N、 O或S
雜原子的QrC2。雜環(huán)；82是
—^~(XR3)nR4-
(R2)3
其中W是C廣C2Q烷基；GrC2。醚；具有N、 O或S的取代基的d-C^ 垸基；雜原子C6-C2o芳基、C,-C2o羰基、C,-C2o酰胺基、CrC2o醚、C6-C20 芳基、含有N、 0或S雜原子的C6-C2Q雜環(huán)；在每一情況中，W獨(dú)立 為H、 CrC加垸基、具有CrC2o烷基的取代基的C2-C2o垸基；在每一情 況中，X獨(dú)立為不存在、氧、硫或氮；在每一情況中，W獨(dú)立為不存
在、C「C20烷基、具有取代的C6-C20芳基的d-C2Q、含有N、 O或S雜
原子的C6-C加雜環(huán)；n是0和30之間的整數(shù)，包括0和30;在每一情 況中，R"獨(dú)立為不存在、C廠C2。垸基、具有取代的Q-C2q芳基的d-C加、 C廣C加羰基、C廣C2o酰胺基、C廣C2o醚、CVC2o芳基、含有N、 O或S
雜原子的C6-C2Q雜環(huán)；和BS是不存在或Q-C2o垸基、CVC2Q醚；具有
N、 0或S的取代基的C,-C2。烷基;C廣C2o酯;Q-C2o醇；C廣C加鏈烯 基；雜原子C6-C2。芳基、含有N、 0或S雜原子的CVC2()雜環(huán)。
部分通過(guò)糖部分A例如A為單糖或二糖中的結(jié)構(gòu)變化，提供底 物對(duì)特定溶酶體酶的特異性。示例性的糖部分包括用于檢測(cè)蓬珀病的 a-D-葡萄糖；用于檢測(cè)高歇病的(3-D-葡萄糖；用于檢測(cè)法布里病的a-D-半乳糖；和用于檢測(cè)克臘比病的(3-D-半乳糖。此外，底物的特異性也 通過(guò)BS的脂肪酰基團(tuán)內(nèi)的碳長(zhǎng)度和飽和程度的變化來(lái)賦予。BS的示例 性化學(xué)結(jié)構(gòu)包括特異性用于檢測(cè)蓬珀病的十二碳脂肪酰基團(tuán)；特異性 用于檢測(cè)高歇病的十四碳脂肪酰基團(tuán)；特異性用于檢測(cè)法布里病的十 六碳脂肪酰基團(tuán)；和特異性用于檢測(cè)克臘比病的十八碳脂肪?；鶊F(tuán)。
81是連接部分，其行使將糖部分A與底物的其余結(jié)構(gòu)結(jié)合的功 能。Bi也作為糖部分A與底物的其余結(jié)構(gòu)之間的間隔區(qū)行使功能，以便 對(duì)耙酶提供靈活的接近。 季銨基團(tuán)是82的關(guān)鍵成分。該基團(tuán)攜帶永久電荷，在大多數(shù) 情況下，為正電荷。在酶反應(yīng)后，由于位于BZ上的季銨基團(tuán)的存在， B'-B、BS的切割產(chǎn)物帶有期望的質(zhì)子親和力和離子化效率(ionization efficiency)。這種特性在串聯(lián)質(zhì)譜法分析中導(dǎo)致高信號(hào)，并且在所有的 分析中導(dǎo)致更少的限制。另外，永久電荷使本發(fā)明底物更溶于含水緩 沖液中，以便避免對(duì)于使用非常非極性溶劑如氯仿的需要。與現(xiàn)有技 術(shù)底物相比，根據(jù)本發(fā)明的底物更加親水，并且更少需要或者不需要 洗滌劑。這是優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)橄袷褂寐确乱粯?，使用洗滌劑要求麻煩的?潔步驟，包括勞動(dòng)強(qiáng)度大的液-液和液-固相提取步驟。
底物的終端結(jié)構(gòu)上為BS基團(tuán)。如上所述，通過(guò)賦予碳鏈不同 的碳長(zhǎng)度和/或飽和度，結(jié)構(gòu)上調(diào)整BS以提供對(duì)各種酶的特異性。因此， 非常相似的底物被合成，它們的分子量發(fā)生質(zhì)譜法分析可區(qū)分的變化。
因此，如在本發(fā)明預(yù)想的，可合成具有四種不同糖的底物， 每一個(gè)對(duì)特定溶酶體酶具有特異性，并且每一個(gè)的亞基團(tuán)(subgroup)B3 具有輕微不同的鏈長(zhǎng)。因此，在底物被用于多元分析一一其中兩種或 多種在同一樣品中或者在微量滴定板的相同管或孔中進(jìn)行分析的情況 下，質(zhì)量上的變化允許通過(guò)質(zhì)譜法鑒別四種底物的每一個(gè)和相應(yīng)的酶 產(chǎn)物。因此，該組合物考慮單一合成方案(single synthesis scheme)。在 現(xiàn)有技術(shù)中，每一底物要求獨(dú)特的合成途徑。具有兩種或更多種這些 底物的共同合成途徑，可意味著生產(chǎn)環(huán)境明顯節(jié)約，這是由于較短和 較不復(fù)雜的生產(chǎn)過(guò)程和應(yīng)用共同的原料。 對(duì)于檢測(cè)蓬珀病，示例性糖部分是a-D-葡萄糖，并且示例性 BLB、BS部分是4-氨基苯基-肉堿基(cartnitinyl)-烷基鏈，其中83的長(zhǎng)度
10為10-20個(gè)碳，優(yōu)選長(zhǎng)度為12個(gè)碳。對(duì)于檢測(cè)高歇病，示例性糖部分是
(3-D-葡萄糖，并且示例性B、B、BS部分是4-氨基苯基-肉堿基-烷基，其 中BS的長(zhǎng)度為10-20個(gè)碳，優(yōu)選長(zhǎng)度為14個(gè)碳。對(duì)于檢測(cè)法布里病，示 例性糖部分是a-D-半乳糖，并且示例性B、B、BS部分是4-氨基苯基-肉堿 基-烷基，其中83的長(zhǎng)度為10-20個(gè)碳，優(yōu)選長(zhǎng)度為16個(gè)碳。對(duì)于檢測(cè)克 臘比病，示例性糖部分是P-D-半乳糖，并且示例性B部分是4-氨基苯基 -肉堿基-烷基，其中BS的長(zhǎng)度為10-20個(gè)碳，優(yōu)選長(zhǎng)度為18個(gè)碳。
本發(fā)明也涉及內(nèi)標(biāo)，其被設(shè)計(jì)用來(lái)測(cè)量在酶反應(yīng)后，從本發(fā) 明底物切割的具有通式B'-B、BS的產(chǎn)物的量。內(nèi)標(biāo)結(jié)構(gòu)上與切割產(chǎn)物相 同，只是由于包括同位素標(biāo)記在內(nèi)的修飾步驟，內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量與電荷之 比(m/z)與切割產(chǎn)物不同。因此，本發(fā)明的內(nèi)標(biāo)是穩(wěn)定的同位素標(biāo)記的 切割產(chǎn)物的類似物，其中一個(gè)或多個(gè)原子被相應(yīng)的原子的同位素取代， 以便產(chǎn)生質(zhì)量的變化。這類標(biāo)記的實(shí)例是用ZD取代BS酰基上的111。結(jié) 果，具有取代的20的"較重的"內(nèi)標(biāo)分子在質(zhì)譜法譜結(jié)果上顯示與切 割產(chǎn)物通常顯示的不同m/z。質(zhì)量的變化被用來(lái)在質(zhì)譜法實(shí)驗(yàn)中識(shí)別切 割產(chǎn)物與內(nèi)標(biāo)。這是可能的，因?yàn)榧褐獫舛鹊膬?nèi)標(biāo)被加入到分析溶液 中。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明底物的B'亞基團(tuán)是取代的
氨基苯基。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，結(jié)合的B、BS亞基團(tuán)是具有帶正
電季銨部分的?；鈮A，并且其?；驳奶奸L(zhǎng)度為12到18。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，用氘標(biāo)記內(nèi)標(biāo)以引起從相應(yīng)切
割產(chǎn)物的3到9道爾頓的質(zhì)量變化。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，特異性用于檢測(cè)克臘比病的本
發(fā)明底物的基團(tuán)A為p-D-半乳糖、基團(tuán)Bi為甲基、基團(tuán)BS為具有季銨末
端的酰胺基以及基團(tuán)BS為具有12到20個(gè)碳長(zhǎng)度的鏈烯醇。在又一個(gè)具體的實(shí)施方式中，特異性用于檢測(cè)高歇病的本發(fā)
明底物的基團(tuán)A為p-D-葡萄糖、基團(tuán)B'為甲基、基團(tuán)BS為具有季銨末端
的酰胺基以及基團(tuán)BS為具有12到20個(gè)碳長(zhǎng)度的鏈烯醇。本發(fā)明也涉及測(cè)量樣品內(nèi)靶向溶酶體酶的活性的方法。該樣
品包括血清、血漿、全血、尿、唾液或其它生物流體或組織溶胞產(chǎn)物的樣品。該樣品在濾紙基質(zhì)上沉積并干燥。然后，切除一部分的濾紙 樣品，并將其沉積在化驗(yàn)管或微量滴定板孔中，向其中加入分析溶液。 分析溶液包括含水緩沖液、底物和內(nèi)標(biāo)，以及需要的蛋白酶抑制劑如 用于競(jìng)爭(zhēng)性糖苷酶的抑制劑。然后，將樣品混合物在30至41攝氏度的
特定溫度下溫育30分鐘至8小時(shí)范圍的確定時(shí)間。溫育完成后，通過(guò)加
入用于沉淀酶的溶液來(lái)中止酶反應(yīng)。示例性的溶液類型包括醇、乙腈 或稀釋的三氟乙酸。將部分溫育混合物轉(zhuǎn)移到新的分析容器中，向該 容器中加入凈溶液如甲醇、乙腈、水-甲醇混合物或水-乙腈。本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員選擇其它類型的凈溶液，以與串聯(lián)質(zhì)譜法分析相容。用等 分凈溶液這樣稀釋的檢測(cè)樣品減少內(nèi)生競(jìng)爭(zhēng)性物質(zhì)的量，以便相對(duì)增 加串聯(lián)質(zhì)譜法分析的靈敏性。將稀釋的樣品直接而沒有進(jìn)一步修飾地 注入串聯(lián)質(zhì)譜儀，這通過(guò)手動(dòng)進(jìn)行或者在自動(dòng)取樣器和液體處理裝置 的幫助下自動(dòng)進(jìn)行。將串聯(lián)質(zhì)譜儀設(shè)定為同時(shí)檢測(cè)加入的底物、相應(yīng) 的所形成的酶產(chǎn)物和相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)。這樣的檢測(cè)通過(guò)母離子掃描、母體 離子掃描或多反應(yīng)監(jiān)控掃描來(lái)實(shí)現(xiàn)。將串聯(lián)質(zhì)譜儀設(shè)定為檢測(cè)一種或 多種底物、產(chǎn)物和相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)。觀察的產(chǎn)物和相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的相對(duì)豐度
(abundance)被用來(lái)測(cè)量相應(yīng)的酶活性。 當(dāng)從新生兒患者和兒童患者中篩查血液時(shí)，通常使用干血斑 形式的樣品。對(duì)于這些患者對(duì)象，收集血液，并且保存在濾紙上的是 可容易收集和容易儲(chǔ)存的實(shí)驗(yàn)室樣品。在用分析溶液溫育前，可以洗 脫濾紙上的樣品。洗脫的步驟是從干濾紙將蛋白質(zhì)釋放入含有水基緩 沖液如磷酸鹽緩沖鹽水和蛋白酶抑制劑的水溶液中。蛋白酶抑制劑可 以例如包括下列的一種或多種終濃度50到400昭/ml的AEBSF鹽酸鹽、 終濃度0.2到25 mg/ml的EDTA二鈉脫水物(EDTA disodium dehydrate)、 終濃度0.5到1 pg/ml的亮抑酶肽半硫酸鹽和終濃度0.5到l iug/ml的抑胃 酶肽A。洗脫可以進(jìn)行20到60分鐘的時(shí)間，這取決于使用的樣品的大小， 并且可以使用立式或臥式振動(dòng)促進(jìn)。然后，將液體洗提物手動(dòng)地或通 過(guò)自動(dòng)化液體控制儀器轉(zhuǎn)移到管或微量滴定板。 從干血樣品溶解的總蛋白通過(guò)方法例如比色二辛可寧酸 (bicinchoninic acid， 2,2'-聯(lián)喹啉-4,4'-二羧酸)(BCA)分析法來(lái)量化。采用 這種方法，使用濃度為2、 1、 0.5、 0.2和0.05 mg/ml的牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)生蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。用lml的混合BCA試劑稀釋樣品，旋轉(zhuǎn)混 合，并且在37。C下溫育60分鐘。使樣品冷卻至室溫，并且對(duì)照水空白 進(jìn)行分析。在聚苯乙烯刮匙(curette)中，通過(guò)監(jiān)控562 nm下的吸光度來(lái) 分析樣品。平均的患者吸光度值經(jīng)由線性回歸被空白修正并且與標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)比。 在具有或不具有如上述首先溶解的情況下，干血樣品在分析 溶液中溫育。特別地，分析溶液是水基的。分析溶液含有適當(dāng)?shù)木彌_ 液如磷酸鹽緩沖鹽水、適當(dāng)?shù)牡鞍酌敢种苿┤绺?jìng)爭(zhēng)糖苷酶的蛋白酶抑 制劑、底物——其用同位素進(jìn)行標(biāo)記、和內(nèi)標(biāo)——其用不同的同位素 進(jìn)行標(biāo)記。蛋白酶抑制劑包括下列的一種或多種糖苷酶抑制劑、終 濃度50到400 lug/ml的AEBSF鹽酸鹽、終濃度0.2到25 mg/ml的EDTA二 鈉脫水物、終濃度0.5到1昭/ml的亮抑酶肽和終濃度0.5到l昭/ml的抑胃 酶肽A。在溫育期間，底物和內(nèi)標(biāo)均被感興趣的酶從干血樣品切割以形 成各自的產(chǎn)物。 在一個(gè)方面，通過(guò)加入純的醇、乙腈或稀釋的三氟乙酸來(lái)終 止溫育反應(yīng)。從酶反應(yīng)形成的產(chǎn)物是相當(dāng)極性的，這主要是由于內(nèi)在 (built-in)的帶正電荷部分例如季銨陽(yáng)離子，因此，不需要使用非極性溶 劑如氯仿來(lái)終止酶促反應(yīng)和保持產(chǎn)物于溶液中。由于MS/MS系統(tǒng)的復(fù) 雜性，最終經(jīng)歷MS/MS系統(tǒng)的蛋白質(zhì)需要處于不"有害于"MS/MS系 統(tǒng)的溶劑中。例如，這些溶解不應(yīng)該是洗滌劑基的，也不應(yīng)該含有腐 蝕劑如氯仿。優(yōu)選純的乙醇或純的甲醇，這僅僅因?yàn)槠湓跈C(jī)械干燥過(guò) 程中容易蒸發(fā)。在氮?dú)饬髦袦睾图訜嵩摪寤虻獨(dú)饣蛘呒訜醿烧?，使?特別設(shè)計(jì)用于該目的的干燥器，干燥包含于液體提取物中的有機(jī)溶劑。
對(duì)于待被檢測(cè)的每個(gè)酶， 一組特異性底物和內(nèi)標(biāo)被包含在分 析溶液中。分析溶液被設(shè)計(jì)為對(duì)于特定酶的檢測(cè)是獨(dú)特的和特異性的； 可選地，其被如此設(shè)計(jì)以對(duì)于同時(shí)檢測(cè)多種酶是適合的和通用的。在 單獨(dú)的管、小瓶中或者用多孔濾板如96-孔或386-孔濾板，實(shí)行溫育。
濾紙上樣品的所需大小和因此可有效用于檢測(cè)的干血的所需 量隨待被檢測(cè)的酶的數(shù)目而變化。實(shí)際上，對(duì)于單一酶的分析，通常 使用的濾紙上干血斑樣品的大小為l-3 mm。當(dāng)待被分析的酶在樣品中 具有相對(duì)低的存在時(shí)，這種類型的樣品是特別有用的，因?yàn)樵趩我环治鑫锓治龅那闆r中，不需要多種酶提取?？蛇x地，相對(duì)高表達(dá)水平和/ 或酶活性的酶從更大尺寸的一個(gè)樣品中同時(shí)分析出。例如，含有干血
斑的3-10 mm的濾紙被水解，并且被用作多種酶檢測(cè)的統(tǒng)一的樣品來(lái) 源。 任選地，將酯化步驟加入到溫育步驟以衍生檢測(cè)樣品。更長(zhǎng) 且更高的溫度條件與較冷的、較短的衍生條件相比傾向產(chǎn)生更強(qiáng)烈的 ?；鈮A水解。通過(guò)應(yīng)用干燥氮除去衍生試劑，停止反應(yīng)。在適合 MS/MS分析的類型的液體基質(zhì)中，重構(gòu)衍生的樣品。使用電霧化離子 化的通用方法需要揮發(fā)性的部分有機(jī)基溶劑，該溶劑任選地輕微酸化。 通常使用的溶劑是相等的乙腈和水的混合物。另外，甲酸可以以小百 分比加入，以酸化溶劑和增強(qiáng)離子化。 用于感興趣的選定蛋白的底物是天然或合成源的。感興趣蛋 白由與疾病狀態(tài)或先天缺陷相關(guān)的酶或者為醫(yī)學(xué)目的而被常規(guī)分析的 酶構(gòu)成。感興趣的酶底物包括酸性a-半乳糖苷酶A、酸性P-葡糖腦苷脂 酶、酸性半乳糖腦苷脂a-半乳糖苷酶、酸性鞘磷脂酶和酸性a-葡糖苷酶。 通式A-B^B、BS的發(fā)明組合物在溶劑例如純的甲醇或純的乙 醇中是親水性的。A是單糖或二糖。Bi是連接臂，82含有永久帶正電的 季銨陽(yáng)離子，BS是長(zhǎng)的碳尾(carbon tail)。 A部分的類型或B、B、BS部分 中烷基鏈的長(zhǎng)度根據(jù)檢測(cè)的靶酶而不同。設(shè)計(jì)連接臂B'以便賦予相對(duì) 親水的特性。特別地，連接臂B'具有氫酚(hydrophenol)結(jié)構(gòu)。B'-B、B3 部分全部是親水性的，以確保底物良好的溶解性，并且它具有堿性基 團(tuán)例如永久帶正電的季銨陽(yáng)離子，其被ESI有效地質(zhì)子化，并且因此確 保通過(guò)質(zhì)譜法靈敏檢測(cè)。 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供式A^31—BZ—BS的試劑，其 中A是單糖或二糖，并且優(yōu)選地為乙醛糖或己酮糖；B是酚、硝基酚或 苯酯如苯甲酸苯酯；BS含有從這樣的結(jié)構(gòu)延伸的側(cè)鏈季銨陽(yáng)離子，在 單獨(dú)縮合到B'或還與BS尾縮合之前該結(jié)構(gòu)是肉堿，<formula>formula see original document page 15</formula>
A是單糖或二糖，B'是d-C2o烷基、具有取代的C6-C2o芳基的d-C2。、含 有N、 0或S雜原子的C6-C2o雜環(huán)；82是
<formula>formula see original document page 15</formula>
其中W是C廣C2o垸基；CrC2o醚；具有N、 O或S的取代基的C廣C20 垸基；雜原子C6-C2Q芳基、含有N、 0或S雜原子的CVC2。雜環(huán)；在 每一情況中，W獨(dú)立為H、 d-C20垸基、具有d-C20烷基的取代基的 C2-C20烷基、C廣C20羰基、C廣C20酰胺基、C廣C20醚、C6-C20芳基、含有N、 0或S雜原子的CVC2o雜環(huán)；在每一情況中，X獨(dú)立為不存在、 氧、硫或氮；在每一情況中，W獨(dú)立為不存在、CpC2。烷基、具有取
代的CVC2o芳基的d-C2()、含有N、 0或S雜原子的C6-C2Q雜環(huán)；n是 0和30之間的整數(shù)，包括0和30;在每一情況中，R"獨(dú)立為不存在、
Q-C20烷基、具有取代的CVC2()芳基的C廣C2()、含有N、 O或S雜原子 的CVC20雜環(huán)；和B3是不存在或d-C加烷基、C4-C2o醚；具有N、 O 或S的取代基的C廣C2o垸基；C廣C2o酯；C廣C2o醇；C廣C2o鏈烯基；雜 原子C6-C20芳基、含有N、 O或S雜原子的C6-C20雜環(huán)。 圖l示出用于檢測(cè)溶酶體貯積病的示例性底物結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)由 葡萄糖或半乳糖形式的銜A)和脂肪族基團(tuán)B構(gòu)成?；鶊F(tuán)B進(jìn)一步由硝基 苯基形式的連接臂(B1)、肉堿基的BZ亞基團(tuán)和具有碳長(zhǎng)度范圍為12、 14、 16或18的烷基形式的BS亞基團(tuán)。位于BS亞基團(tuán)上的季銨陽(yáng)離子提供免 于需要進(jìn)一步離子化的離子，該離子化在別的情況下是質(zhì)譜法檢測(cè)需 要的。 圖2表明使用本發(fā)明底物的一般酶反應(yīng)。在特異性親和結(jié)合和 酶反應(yīng)后，底物被切割成兩個(gè)基團(tuán)，糖部分A和脂肪族基團(tuán)B?；鶊F(tuán)B 由硝基苯基、肉堿基和長(zhǎng)鏈烷基部分構(gòu)成。然后，這兩個(gè)基團(tuán)都用 MS/MS分析。內(nèi)標(biāo)也同時(shí)進(jìn)行MS/MS分析。內(nèi)標(biāo)是同位素標(biāo)記的B的 類似物，其中用氘取代甲基基團(tuán)上的氫原子(一個(gè)或多個(gè))。
圖3闡明本發(fā)明底物和本領(lǐng)域已知的現(xiàn)有技術(shù)參照底物之間 的主要結(jié)構(gòu)差異。主要在長(zhǎng)鏈?；糠执嬖诓町?，其中與現(xiàn)有技術(shù)底 物相比，本發(fā)明底物中存在的永久帶正電的季銨陽(yáng)離子為了下游質(zhì)譜 法分析的目的，使其本身成為"現(xiàn)成的"離子。因此，不需要進(jìn)一步 的離子化，并且因此沒有信號(hào)強(qiáng)度的損失。此外，與現(xiàn)有技術(shù)底物相 比，本發(fā)明底物化學(xué)非極性更小。因此，溶解本發(fā)明底物的溶劑既不 須是極端非極性的，也不需要加入洗滌劑。極端非極性溶劑例如氯仿 不是使用者友好的，并且不被推薦用于ESI-MS/MS。洗滌劑的應(yīng)用也 降低了質(zhì)譜儀的功能性，因?yàn)橄礈靹┓浅？焖俚匚廴举|(zhì)譜儀的內(nèi)部部 件，以致引起性能明顯降低。當(dāng)使用這樣的試劑時(shí)，在樣品進(jìn)行MS/MS 分析之前，需要增加額外的步驟來(lái)除去這些試劑。為了回收待被分析 的產(chǎn)物，現(xiàn)有技術(shù)在液-液提取步驟中，使用氯仿或乙酸乙酯。為了除去洗滌劑，現(xiàn)有技術(shù)使用固相提取。因此，盡管可能在臨床實(shí)驗(yàn)室中 改變這些過(guò)程，但是如果不是不可行的，現(xiàn)有技術(shù)底物使它們的應(yīng)用 極端麻煩。 圖4闡明本發(fā)明底物和現(xiàn)有技術(shù)底物之間的結(jié)構(gòu)差異。在親 和識(shí)別和酶反應(yīng)之后，部分本發(fā)明底物——被稱為"酶產(chǎn)物"，被切割。 不像從現(xiàn)有技術(shù)底物制造的產(chǎn)物，本發(fā)明的酶產(chǎn)物具有固有的"現(xiàn)成 的"離子(下半部分圖)——其是永久帶正電的。被引入質(zhì)譜儀的任何分 析物必須被賦予作為待檢測(cè)的離子。影響靈敏性的最重要因素之一是 離子化效率，即暴露于離子源后，分析物離子化的容易程度。暴露于 離子源后，分子彼此競(jìng)爭(zhēng)質(zhì)子。具有高質(zhì)子親和力的分子對(duì)于質(zhì)子結(jié) 合的競(jìng)爭(zhēng)更有效，并且被更有效地離子化。在已經(jīng)擁有了永久正電荷 的本發(fā)明分子的情況中，分子被質(zhì)子化；結(jié)果是，本發(fā)明的酶產(chǎn)物發(fā) 出更大數(shù)量級(jí)的信號(hào)強(qiáng)度。 圖5示出使用根據(jù)本發(fā)明的發(fā)明方法測(cè)量酶表達(dá)和活性的過(guò) 程中的差異。發(fā)明方法允許同時(shí)測(cè)量底物水平的減少和產(chǎn)物水平的增 加。這相比于僅僅測(cè)量酶反應(yīng)產(chǎn)物的本領(lǐng)域其它方法是有利的。因此， 發(fā)明方法提供更高的靈敏性和特異性。對(duì)于本發(fā)明底物，A部分和B部 分都用第一信號(hào)標(biāo)記物標(biāo)記。示例性信號(hào)標(biāo)記物是同位素標(biāo)記。對(duì)于 用于底物的發(fā)明的內(nèi)標(biāo)，A部分和B部分都用與第一信號(hào)標(biāo)記物不同的 第二信號(hào)標(biāo)記物標(biāo)記。信號(hào)標(biāo)記物第一號(hào)和信號(hào)標(biāo)記物第二號(hào)每一個(gè) 獨(dú)立地是下列之一碳-12、碳-13、氕、氘、碘-131、氮-15、磷-31、 氦-3和鈾-238。 圖6闡述示例性的發(fā)明方法，其中下部分圖表描述使用質(zhì)譜法 檢測(cè)酶反應(yīng)，與在該圖上部示出的現(xiàn)有技術(shù)參照方法相比，該方法具 有優(yōu)勢(shì)。與現(xiàn)有技術(shù)方法相比，發(fā)明的方法消除了應(yīng)用非極性底物和 它們的相對(duì)內(nèi)標(biāo)固有的許多步驟。更具體而言，發(fā)明的方法不再需要 用于清除非極性溶劑和/或洗滌劑的步驟——包含它們對(duì)質(zhì)譜儀器是有 害的。這些步驟包括通過(guò)液-液提取步驟除去氯仿，通過(guò)硅膠分離步驟 除去洗滌劑，和固相提取(SPE)方法的步驟。這些額外的步驟也增加了 添加到下游分析的統(tǒng)計(jì)誤差。因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明的底物相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)
17非極性更低，所以更小非極性的溶劑例如純的甲醇或純的乙醇在本文 是有效的。任選地，A部分和B、B、BS部分每一個(gè)均用信號(hào)標(biāo)記物標(biāo)記。 信號(hào)標(biāo)記物位于包括C、 H、 P、 N或S的一個(gè)或多個(gè)原子上。信號(hào)標(biāo)記 物包括但不限于熒光標(biāo)記物和同位素標(biāo)記物。在同位素標(biāo)記的情況下， 底物結(jié)構(gòu)中的至少一個(gè)原子用穩(wěn)定的同位素取代。例如，用D取代氫， 或者用^C取代12。 當(dāng)通過(guò)結(jié)合針對(duì)各自酶的多種底物而同時(shí)檢測(cè)一種以上疾病 時(shí)，底物不但在賦予酶特異性的糖部分類型上不同，也在83尾部分的 長(zhǎng)度上不同。在使用MS/MS作為檢測(cè)工具時(shí)，這是特別重要的，因?yàn)?具有相應(yīng)的有差別的質(zhì)量指數(shù)(mass index)的有差別的本發(fā)明底物分子 與被檢測(cè)的不同酶相應(yīng)。 使用內(nèi)標(biāo)測(cè)量樣品中蛋白質(zhì)的絕對(duì)數(shù)量的量(absolute quantitative amounts)。內(nèi)標(biāo)被同位素標(biāo)記，以量化酶反應(yīng)的親和標(biāo)記產(chǎn) 物。內(nèi)標(biāo)與通過(guò)酶對(duì)親和標(biāo)記的酶底物作用產(chǎn)生的標(biāo)記的酶產(chǎn)物化學(xué) 上相同，但是內(nèi)標(biāo)攜帶同位素標(biāo)記——其可以包括D、 13C、 15N、 170、 180或345，這樣允許通過(guò)MS技術(shù)獨(dú)立檢測(cè)同位素標(biāo)記的類似物。內(nèi)標(biāo) 與從消化親和標(biāo)記蛋白產(chǎn)生的相應(yīng)的親和標(biāo)記肽化學(xué)上基本相同，除 了它們被不同地同位素標(biāo)記，以使它們被MS技術(shù)獨(dú)立檢測(cè)。內(nèi)標(biāo)被不 同地標(biāo)記在其糖部分A和連接部分B、B、BS上。使用質(zhì)譜法，提供同時(shí) 的測(cè)量，以便底物信號(hào)的減小和產(chǎn)物A以及B'-B、BS的增加被同時(shí)記錄。 這種設(shè)計(jì)增加分析的靈敏性和特異性。 應(yīng)用通用底物混合緩沖液提取每個(gè)患者的單一干血樣品，隨 后分配入多個(gè)分析反應(yīng)中，對(duì)于自動(dòng)和高產(chǎn)量篩選是有優(yōu)勢(shì)的，因?yàn)?其避免需要從同一干血樣品獲得數(shù)個(gè)樣品穿孔(sample punch)。這也減 少濾紙上的血液不均勻分布引起的變化。應(yīng)用通用底物混合緩沖液也 減少濾紙上血液不均勻分布引起的變化。提取效率可以隨著被分析的 不同酶而變化。特別地，選擇發(fā)明的通用底物混合緩沖液的組合物以 確保酶的最高性能，這使得所有酶的最低特異活性被檢測(cè)到。
任選地，包括底物、切割產(chǎn)物和內(nèi)標(biāo)的所有試劑被反相HPLC 純化至均勻，并且被高磁場(chǎng)ESI-MS表征。分析成分例如酶底物、分析產(chǎn)物和內(nèi)標(biāo)被通過(guò)介質(zhì)處理以便除去過(guò)量的緩沖液成分。除去緩沖液 成分特別適合用于串聯(lián)質(zhì)譜法，因?yàn)檎J(rèn)為分析物的電霧化離子化被過(guò) 量緩沖液成分的存在所抑制。 就使用根據(jù)本發(fā)明的底物試劑和ESI-MS測(cè)定酶所描述的方 法可以被廣泛應(yīng)用。多種技術(shù)可被擴(kuò)展以在單一反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)許多 或多種酶，這排除了多個(gè)分析的需要，有助于證實(shí)罕見疾病的診斷。 當(dāng)評(píng)估通過(guò)特定生物化學(xué)通路的化學(xué)通量的級(jí)別或者用于監(jiān)控生物化 學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)通路時(shí)，該方法可被用來(lái)同時(shí)測(cè)量多種酶。因?yàn)槭褂玫?ESI-MS檢測(cè)的高靈敏性——每個(gè)分析僅需要亞微克量的底物試劑，在 低-克規(guī)模上數(shù)百種底物試劑的合成變得實(shí)際和經(jīng)濟(jì)。因?yàn)榇蠖鄶?shù)酶活 性位點(diǎn)暴露于溶劑，所以將親和標(biāo)記的連接子結(jié)合到大多數(shù)酶底物而 同時(shí)保持酶活性是可能的。
實(shí)施例 實(shí)施例1 對(duì)于每種樣品，將3mm直徑的圓片從濾紙上的干血區(qū)域打孔 入微量離心管或96-孔微量滴定板的孔中。然后，將該血圓片(blood disk) 用含有終濃度為3 mmol/L的針對(duì)法布里病的底物和終濃度為0.05 mmol/L的內(nèi)標(biāo)的分析溶液直接溫育。對(duì)于該分析溶液，也加入終濃度 0.5 mol/L的乙酸鈉緩沖液。含有血圓片的分析混合物在37。C下、在恒 溫空氣搖床中的軌道搖動(dòng)(150rpm)下溫育15到24小時(shí)。在溫育時(shí)期后，
將等分的純甲醇(沒有使用氯仿)加入到每個(gè)管或孔中，以終止酶反應(yīng)。 在進(jìn)入質(zhì)譜儀之前，該溫育的反應(yīng)混合物被除去溶劑并且借助真空干 燥器干燥徹底(dry down)。對(duì)于質(zhì)譜法分析，電噴霧源以正模式(positive mode)操作，離子以母離子和中性損失掃描模式(parent-ion and neutral-loss scan mode)檢測(cè)。通過(guò)使用注射器驅(qū)動(dòng)，流動(dòng)注入通過(guò)熔融 硅石毛細(xì)管，將干燥的樣品以3W/min的流速引入。從產(chǎn)物與內(nèi)標(biāo)的離 子豐度比率減去空白值，計(jì)算酶產(chǎn)物的量。如在圖7中所示，內(nèi)標(biāo)在m/z為494.5處被檢測(cè)；針對(duì)法布里病 的底物的酶產(chǎn)物在m/z為491.5處被檢測(cè)，在水空白中為最小量(上圖)， 在存在干血樣品下(下圖)為顯著量。實(shí)施例2 使用針對(duì)蓬珀病的底物的酶反應(yīng)和隨后的質(zhì)譜法分析用在實(shí) 施例1中詳細(xì)說(shuō)明的方法實(shí)行。 圖8示出如此實(shí)施例，其中使用a-D-葡萄糖作為糖部分，合成 本發(fā)明底物，例如在圖l中描述的那些，因此對(duì)溶酶體酶GAA(蓬珀病) 具有特異性。選擇對(duì)于該具體實(shí)施例的垸基鏈含10個(gè)碳，并且因此在 底物的合成中使用癸?；?肉堿。相似地，使用癸?；?肉堿合成相應(yīng)的 內(nèi)標(biāo)，在肉堿基部分的3個(gè)甲基中的一個(gè)上將3個(gè)氫取代為気。使用這
種底物和內(nèi)標(biāo)，來(lái)自兩個(gè)新生兒--個(gè)健康的個(gè)體和另一個(gè)證實(shí)為
蓬珀病陽(yáng)性的個(gè)體的干血斑樣品被用如圖5中描述的本發(fā)明方法處理。 另外，不含有血液的空白濾紙樣品按照與干血斑相同的步驟進(jìn)行處理。 含有緩沖液、底物、抑制劑和內(nèi)標(biāo)的相同的分析溶液被用于所有三個(gè) 樣品。因此，所有樣品接受相同濃度的試劑。在Waters Quattro Micro ESI-triple四極串聯(lián)質(zhì)譜儀上，使用176的母離子掃描，分析最終的樣 品溶液。在光譜中示出的主峰是與完整底物、內(nèi)標(biāo)和相應(yīng)的酶產(chǎn)物相 應(yīng)的。因?yàn)樗械臉悠酚猛瑯訚舛鹊脑噭┨幚?，產(chǎn)物和內(nèi)標(biāo)之間的相 對(duì)豐度表明了樣品之間的相對(duì)酶活性。 這些譜清楚表明，在健康的個(gè)體中有豐富的GAA活性，因?yàn)?根據(jù)產(chǎn)物的豐度相對(duì)于內(nèi)標(biāo)的豐度，底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物是非常明顯的。 與之相反，相應(yīng)于蓬珀病陽(yáng)性新生兒的樣品顯示可忽略不計(jì)的GAA酶 活性，因?yàn)闆]有明顯的底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。在蓬珀病陽(yáng)性新生兒的譜 中明顯的對(duì)應(yīng)于產(chǎn)物的小峰被描述為背景。對(duì)處理空白樣品所形成的 譜的檢査也顯示對(duì)應(yīng)于產(chǎn)物的小峰。在這種情況中，由于該樣品中不 存在血，明顯的是樣品處理引起底物低程度的非酶水解。在蓬珀病和 空白的譜中的產(chǎn)物/內(nèi)標(biāo)峰的相對(duì)豐度的比較表明，在蓬珀病陽(yáng)性樣品 中的小的產(chǎn)物峰主要是由于非酶水解。有小量的非酶底物水解的事實(shí) 并不令人吃驚，因?yàn)樘擒真I是相當(dāng)不穩(wěn)定的。然而，從該實(shí)施例明顯 可見，在與健康個(gè)體中產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的量相比，非酶底物水解的程度是可 以忽略不計(jì)的。因此，這種背景不應(yīng)該對(duì)該方法有任何限制。這些譜 清楚表明本發(fā)明底物的效用，因?yàn)樗鼈兠黠@表明其是臨床特異性的、靈敏的并且穩(wěn)定的。進(jìn)一步，這些試劑保留它們的效用，同時(shí)允許顯 著簡(jiǎn)化的分析。
實(shí)施例3 圖9示出處理12個(gè)來(lái)自健康新生兒的和3個(gè)來(lái)自蓬珀病陽(yáng)性的 新生兒的干血斑樣品的結(jié)果。使用的試劑和方法與圖6中描述的那些相 同。因?yàn)橐约褐獫舛纫雰?nèi)標(biāo)，所以通過(guò)將產(chǎn)物和內(nèi)標(biāo)的相對(duì)豐度和 內(nèi)標(biāo)的濃度相關(guān)聯(lián)，量化酶活性是可能的。該圖示出對(duì)于15個(gè)研究的 對(duì)象以微摩爾/小時(shí)/升的血液?jiǎn)挝槐硎镜拇_定的酶活性的散點(diǎn)圖。從該 圖，明顯可見，在健康新生兒的GAA活性和受侵襲的新生兒的活性之 間存在明顯不同。三個(gè)蓬珀病患者記錄的活性與那些健康的個(gè)體相比 忽略不計(jì)。注意，如在圖6中所描述的，非酶水解產(chǎn)生小程度的背景。 這里提供的數(shù)據(jù)沒有對(duì)背景修正。健康和患病之間的差異仍然是顯著 的。
實(shí)施例4 圖10示出如此實(shí)施例，其中通過(guò)使用含有兩種類型的底物和 內(nèi)標(biāo)的分析溶液處理樣品，在圖l中描述的本發(fā)明底物和內(nèi)標(biāo)被用于多 元方法中。在底物靶向蓬珀病和其它克臘比病時(shí)，使用的方法與在圖8 中描述的方法相同，唯一的差別在于現(xiàn)在分析兩種酶的底物。蓬珀病 底物是用癸?；?肉堿制備的圖l的底物，克臘比病底物是用四癸酰基-肉堿(tetredecanoyl-camitine)制備的圖1的底物。在該實(shí)施例中使用的樣 品是來(lái)自健康新生兒的干血斑樣品。另外，不含血液的空白溶液樣品 按照相同的過(guò)程處理。與在圖8中描述的單一酶分析相比，在圖10的譜 中示出的主峰與加入到溶液中的完整的兩個(gè)底物、加入到溶液中的兩 個(gè)內(nèi)標(biāo)和兩個(gè)相應(yīng)的酶產(chǎn)物相應(yīng)。 在該實(shí)施例中，可見兩種或多種酶的活性可同時(shí)檢測(cè)，同時(shí) 保持足夠好的靈敏性。該實(shí)施例通過(guò)提供對(duì)該方法的附加簡(jiǎn)化進(jìn)一步 表明本發(fā)明的效用，因?yàn)槠淇赡莒柟虡悠分苽?。?shí)施例5圖ll示出洗滌劑對(duì)本發(fā)明的內(nèi)標(biāo)的靈敏性的影響。這些數(shù)據(jù)
被用來(lái)例證洗滌劑對(duì)分析的總體靈敏性的影響。盡管在質(zhì)譜法分析之 前內(nèi)標(biāo)已經(jīng)帶電的事實(shí)，離子抑制可仍舊在它們的靈敏性中起作用。 已知洗滌劑引起重要的離子抑制。在這種情況中，具有和不具有洗滌 劑的凈溶液(純甲醇)中的內(nèi)標(biāo)的靈敏性得以顯示。另外，在具有和不具 有洗滌劑的、含有提取的干血斑的溶液中內(nèi)標(biāo)的靈敏性也被顯示。在
該實(shí)施例中，含有a-和p-葡萄糖和半乳糖的數(shù)種垸基鏈長(zhǎng)度的內(nèi)標(biāo)被溶 解在凈溶液中，或者溶解在分析溶液中，使用這些溶液，如圖8和10中 描述的提取和處理干血斑。在該實(shí)施例中，等分的每種溶液類型不含 洗滌劑，另一種溶液含有洗滌劑。因此，在這些成對(duì)樣品中，唯一的 差異是存在或不存在洗滌劑。通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜法分析該成對(duì)樣品。在每 一樣品中，內(nèi)標(biāo)的信號(hào)強(qiáng)度被記錄并被用來(lái)產(chǎn)生平均相對(duì)靈敏性。該 圖示出使用和不使用洗滌劑處理的樣品的歸一化的平均強(qiáng)度。明顯地， 洗滌劑引起離子抑制，這通過(guò)含有洗滌劑的樣品中的較低強(qiáng)度可見。 該圖也表明洗滌劑的影響在含有復(fù)合基質(zhì)如血液的樣品中顯著得多， 因此更加需要在串聯(lián)質(zhì)譜法分析中避免使用這類物質(zhì)。
實(shí)施例7 圖12示出如此實(shí)施例，其中分析洗滌劑對(duì)酶活性的影響。在 該實(shí)施例中，含有ot-D-葡萄糖和16-碳脂肪酸鏈的本發(fā)明的底物(圖l)被 用來(lái)根據(jù)圖6中描述的過(guò)程處理干血斑。為了檢測(cè)洗滌劑的影響，同一 患者的平行樣品根據(jù)上述方法在具有和不具有洗漆劑情況下進(jìn)行制 備。圖ll表明洗滌劑降低分析的靈敏性。然而，問(wèn)題是洗滌劑是否對(duì) 酶活性有影響。在圖12中示出的譜明確表明洗滌劑的確對(duì)評(píng)估的酶活 性具有影響。在這種情況下，分析溶液中缺乏洗滌劑增強(qiáng)酶活性的速 率，如對(duì)于在沒有洗滌劑的情況下處理的樣品，與相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)相比產(chǎn) 物豐度更多升高所表明的。通過(guò)表明通過(guò)減小離子抑制和增強(qiáng)靶酶的 活性，不但方法可以被簡(jiǎn)化，而且在這樣進(jìn)行時(shí)增強(qiáng)了分析的靈敏性， 該實(shí)施例進(jìn)一步再次證實(shí)本發(fā)明的效用。
在說(shuō)明書中提到的專利文獻(xiàn)和出版物表明本發(fā)明涉及領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員的水平。這些文獻(xiàn)和出版物被引入本文作為參考，引入 程度如同每一獨(dú)立文獻(xiàn)或出版物被明確和單獨(dú)引入本文作為參考的程度。前述說(shuō)明書是說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，但是不意欲限制其 實(shí)踐。所附權(quán)利要求書包括其所有的等同物意圖限定本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1. 用于酶的質(zhì)譜分析的底物，具有下式A—(B1—B2—B3) (I)其中A是單糖或二糖，B1是C1-C20烷基、具有取代的C6-C20芳基的C1-C20、含有N、O或S雜原子的C6-C20雜環(huán)；B2是其中R1是C1-C20烷基；C4-C20醚；具有N、O或S的取代基的C1-C20烷基；雜原子C6-C20芳基、C1-C20羰基、C1-C20酰胺基、C1-C20醚、C6-C20芳基、含有N、O或S雜原子的C6-C20雜環(huán)；在每一情況中，R2獨(dú)立為H、C1-C20烷基、具有C1-C20烷基的取代基的C2-C20烷基；在每一情況中，X獨(dú)立為不存在、氧、硫或氮；在每一情況中，R3獨(dú)立為不存在、C1-C20烷基、具有取代的C6-C20芳基的C1-C20、含有N、O或S雜原子的C6-C20雜環(huán)；n是0和30之間的整數(shù)，包括0和30；在每一情況中，R4獨(dú)立為不存在、C1-C20烷基、具有取代的C6-C20芳基的C1-C20、C1-C20羰基、C1-C20酰胺基、C1-C20醚、C6-C20芳基、含有N、O或S雜原子的C6-C20雜環(huán)；和B3是不存在或C1-C20烷基、C4-C20醚；具有N、O或S的取代基的C1-C20烷基；C1-C20酯；C1-C20醇；C1-C20鏈烯基；雜原子C6-C20芳基、含有N、O或S雜原子的C6-C20雜環(huán)。
2. 權(quán)利要求l所述的底物，其中A和(B'—B2—B勺由于所述酶的 作用分開。
3. 權(quán)利要求l所述的底物，其中A是乙醛糖或己酮糖。
4. 權(quán)利要求l所述的底物，其中A是D-葡萄糖或D-半乳糖。
5. 權(quán)利要求1所述的底物，其中B'是具有從環(huán)延伸的取代基的。6芳基。
6. 權(quán)利要求l所述的底物，其中B!是苯基、硝基苯基或苯酯。
7. 權(quán)利要求6所述的底物，其中BZ是肉堿基。
8. 權(quán)利要求7所述的底物，其中BS是具有以羰基存在的0的取代基的C2-C2。烷基。
9. 權(quán)利要求l所述的底物，其中A和(B1^62—B"部分每一個(gè)包 括元素的穩(wěn)定二級(jí)流行同位素。
10. 權(quán)利要求9所述的底物，其中在每一情況中，所述穩(wěn)定二級(jí) 流行同位素選自2D、 13c、 15n、 170、 180、 "p和34s。
11. 用于酶的質(zhì)譜分析的方法，包括將所述酶與根據(jù)權(quán)利要求1的式I A—(Bi—B2—B"的所述底物接 觸，以在酶反應(yīng)后產(chǎn)生具有切割產(chǎn)物分子量的式(B'—BZ—B"的切割產(chǎn) 物；提供所述底物的式(B'—BZ—BS)，的內(nèi)標(biāo)，其中(B'—BZ—B3)，具有與所述切割產(chǎn)物分子量不同的分子量的至少一種穩(wěn)定二級(jí)流行同位 素，并且(Bi—B2—B3)'的B1、 82和BS如在根據(jù)權(quán)利要求1的式I中所詳述；和使用質(zhì)譜分析，量化所述切割產(chǎn)物和所述內(nèi)標(biāo)之間的質(zhì)量/電荷比。
12. 權(quán)利要求ll所述的方法，其中所述酶選自酸性a-半乳糖苷酶 A、酸性P-葡糖腦苷脂酶、半乳糖腦苷脂a-半乳糖苷酶、酸性鞘磷脂酶 和酸性a-葡糖苷酶。
13. 權(quán)利要求11所述的方法，其中所述^一BZ—B"的切割產(chǎn)物 與所述(Bi—BZ—BS)'的內(nèi)標(biāo)結(jié)構(gòu)上相同。
14. 一種商業(yè)包裝，其包括根據(jù)權(quán)利要求1的式I A—(B'—BZ—B3)的底物作為活性成分；具有與(B1—BZ—B,不同的穩(wěn)定二級(jí)流行同位素 分子量的(B'—BZ—B3)，的內(nèi)標(biāo)；和用于通過(guò)質(zhì)譜分析檢測(cè)樣品中的酶 活性的說(shuō)明。
15. 用于酶的質(zhì)譜分析的方法，包括用同位素標(biāo)記物L(fēng)l標(biāo)記根據(jù)權(quán)利要求1的式I A—(B'—BZ—B3) 的底物，以形成第一底物l乂A) — u(B'—B2—B3);用同位素標(biāo)記物L(fēng)2標(biāo)記根據(jù)權(quán)利要求1的式I A—(Bi—B2—83) 的試劑，以形成第二底物、A) — "(Bi—B2—B3)，其中所述同位素標(biāo) 記物L(fēng)2不同于所述同位素標(biāo)記物L(fēng)l;在容器中使所述第一底物U(A) — u(B'—BZ—B^和所述第二底物U(A) — "(B^B2—B"與所述酶結(jié)合，其中所述第一底物U(A) — li(b1一^一bS)被所述酵切割形成lia和u(b1一^一b3)，其中所述第二底物U(A) — l2(bi__b2_b3)被所述酶切割形成"A和 "(B1—B2—B3);和量化所述第一底物U(A) — u(B'—B2—B"和所述第二底物、A)— l2(b'一b2一b3)的減少，和所述L1A 、 "(b'—B2—b3) 、 L2A和L2(b1一b2一b3)的増加。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述容器是檢測(cè)試管、檢 測(cè)小瓶或多孔微量培養(yǎng)板。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述測(cè)量通過(guò)質(zhì)譜法完成。
18. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述酶選自酸性ct-半乳糖 苷酶A、酸性f3-葡糖腦苷脂酶、半乳糖腦苷脂a-半乳糖苷酶、酸性鞘 磷脂酶和酸性a-葡糖苷酶。
19. 一種使用根據(jù)權(quán)利要求1所述的底物檢測(cè)在從個(gè)體收集的樣 品中的第一種溶酶體貯積病的方法。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，進(jìn)一步包括同時(shí)檢測(cè)第二種溶酶體貯積病。
21. 檢測(cè)溶酶體貯積病的方法，基本上如本文關(guān)于所附實(shí)施例的 任何一個(gè)所描述。
22. 用于克臘比病的質(zhì)譜檢測(cè)的底物，其具有根據(jù)權(quán)利要求1的式A一(Bi—B2—B3)，其中基團(tuán)A為(3-D-半乳糖、81為甲基、82為具 有季銨末端的酰胺基和B3為具有12到20個(gè)碳長(zhǎng)度的鏈烯醇。
23. 用于高歇病的質(zhì)譜檢測(cè)的底物，其具有根據(jù)權(quán)利要求1的式 A一(Bi一^一B3)，其中基團(tuán)A為(3-D-半乳糖、B'為甲基、82為具有季 銨末端的酰胺基和B3為具有12到20個(gè)碳長(zhǎng)度的鏈烯醇。
全文摘要
本發(fā)明的名稱是用于質(zhì)譜法檢測(cè)的底物和內(nèi)標(biāo)。提供發(fā)明的底物，其包括式A-B¹-B²-B³的底物化合物其中A是糖部分；B¹是使部分A和底物的剩余結(jié)構(gòu)連接的連接部分；B²含有永久帶電元素例如季銨基團(tuán)，以便為質(zhì)譜分析增加質(zhì)子親和力和離子化效率；和B³具有賦予靶酶特異性的不同碳長(zhǎng)度。也提供的是檢測(cè)溶酶體缺陷癥的方法，這通過(guò)將樣品與發(fā)明的底物連同內(nèi)標(biāo)接觸來(lái)完成，所述內(nèi)標(biāo)是被該底物的靶酶切割的產(chǎn)物的同位素標(biāo)記類似物。
文檔編號(hào)C12Q1/34GK101426926SQ200780014149
公開日2009年5月6日 申請(qǐng)日期2007年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月13日
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