專利名稱：凝血酶底物和測定樣本中生物活性凝血酶水平的測定法的制作方法
凝血酶底物和測定樣本中生物活性凝血酶水平的測定法本發(fā)明涉及新穎的凝血酶底物和測定樣本中生物活性凝血酶水平的測定法。凝血酶由活化的因子X(Xa)酶切凝血酶原上的兩個位點產生。凝血酶將纖維蛋白原轉化為活化形式，其組裝為纖維蛋白。凝血酶還激活因子XI、 因子V和因子VIII。該正反饋加速凝血酶的產生。因子XIII也可由凝血酶激活。因子XIIIa為轉谷氨酰胺酶，其催化纖維蛋白中的 賴氨酸和谷氨酰胺殘基之間形成共價鍵。該共價鍵增加纖維蛋白凝塊的穩(wěn)定性。除了其在凝血級聯中的活性，凝血酶還經過激活血小板上蛋白酶活化的受體促進 血小板的激活。在臨床實踐中，凝血酶原時間(PT)的測量，即血液變?yōu)槟龎K所花的時間，以活化 部分凝血激酶時間(APTT)和活化凝血時間(ACT)的方式，廣泛用于篩選凝血途徑的缺陷以 及監(jiān)測抗凝血治療。為了標準化凝血測試的結果，設計了國際標準化比率(INR)的概念。各組織 因子(tissue factor)的生產商為其生產的任何組織因子給出ISI(國際敏感指數， International Sensitivity hdex)。所述ISI值指示特定批次的組織因子與國際標準化 樣本之間的比較。INR為患者的凝血酶原時間與對照樣本的凝血酶原時間的比值，再運算所 用促凝血酶原激酶試劑的ISI值的乘方。INR= (PT 測試/PT )ISI對于PT的測量現有兩種可用的測定法。一種測定法為凝血計量法(coagulometric)，其根據由纖維蛋白原至纖維蛋白轉 化的凝塊形成的終點。然而，該測定的結果是可變的，并特別地受患者中纖維蛋白原/纖維 蛋白轉化的干擾所影響。另一種測定為非凝血計量法(non-coagulometric)，其根據使用合 成的、適合凝血酶裂解的底物。第二種測定的結果可變性較小并且不受纖維蛋白原水平的影響。US 4，061，625公開了以下通式的發(fā)色凝血酶底物D-Phe-環(huán)狀亞氨基酸-Arg-pNA其中環(huán)狀亞氨基酸選自2-氮雜環(huán)丁烷羧酸、脯氨酸、2-哌啶羧酸，且pNA為ρ-硝 基?；桨?p-nitroanilide)。所述底物描述為適合定量測定凝血酶或適合其中凝血酶形 成、抑制或消耗的反應的研究，或適合測定發(fā)揮影響的或參與該反應的因子，例如適合測定 抗-凝血酶、凝血酶原和肝素。當使用發(fā)色底物時，在大約405nm檢測反應。在該波長下不可分析全血，因為全血 自身有吸收。因此當所用樣本類型為全血時發(fā)色底物不適用。使用螯合物如鑭系元素螯合物的時間分辨發(fā)光光譜已經在免疫測定和DNA雜交 測定中應用多年。由于全血的吸收性質，與發(fā)色底物相比，該螯合物檢測技術適用于當樣本 為全血時，因為該技術可在615nm測量吸光度，而在該波長，全血吸收較低。該螯合物描述在US 7，018，851 Bl中，其公開了適合時間分辨熒光計(TRF)應用 的改進的熒光鑭系元素螯合物。所述螯合物用于基于特異性生物親和性的結合測定，例如免疫測定。TRF為非常適合要求高靈敏度和廣泛動力學范圍的測定的檢測技術。在使用常規(guī) 熒光檢測的免疫測定技術中，由光散射導致的高強度非-特異性背景例如來自樣本的生物 成分嚴重限制了測定的靈敏度。所述熒光鑭系元素螯合物傳統上已經用于其中檢測原理為基于捕捉和檢測該螯 合物的免疫測定中。相反，其尚未用于其中檢測原理為基于裂解螯合物底物和檢測測定中 剩余的捕捉底物(未裂解的底物)的酶測定中。該系統的主要特征為提供一方面穩(wěn)定的、另一方面可特異性地被凝血酶裂解的底 物。因此，尚存在對酶底物的需求，其可特異性地被凝血酶裂解并包括具有長壽命的 內在的穩(wěn)定發(fā)光成分，因此便于檢測全血并產生較少干擾。另外，尚存在對測定法的需求，其快速、簡便并容易進行，可變性低，容易自動化且 成本低。已經驚人地發(fā)現通過使用一些連接基將可特異性地被凝血酶裂解的肽與發(fā)光螯 合物連接起來，提供了當樣本類型為全血時可以使用的具有長壽命的穩(wěn)定的底物。在第一方面中，本發(fā)明為具有以下通式的凝血酶底物A-X-Z-A，其中A或A’之一包括發(fā)光螯合物，以及A或A’的另一個包括結合配對(binding pair)的第一配偶體(partner)，任選包 括間隔基，并經肽鍵連接至底物的剩余部分，X 形成三-或四-肽，其選自 X，-Phe-Aze-Arg, X，-Phe-Pip-Arg 和 X，-Phe-Pro-ArgjJt^X，不存在或選自 Lys、Ahx、Ile 和 Val，Z 為 NH-R-Z，，其中 R 選自 CV6 亞烷基、亞烷基氧基、-S-Cp6 亞烷基(Uhioalkylene)、-S-C1^6 亞 烷基氧基(C^thioalkylenoxy)、羰基-(^6亞烷基、羰基-(^6亞烷基氧基、C1^6亞烷基-羰 基、CV6亞烷基氧基-羰基、Cp6亞烷基-亞芳基、Cp6亞烷基氧基-亞芳基、C^6亞烷基-NH、 C1^6亞烷基氧基-NH、C1^6亞烷基-NHC0、CV6亞烷基氧基-NHC0、C1^6亞烷基-C0NH、C1^6亞烷 基氧基-C0NH、C1^6亞烷基-COS、C1^6亞烷基氧基-COS、C1^6亞烷基-CONH-C^亞烷基-亞芳 基、亞芳基、亞芳基-CV6亞烷基、亞芳基-Cp6亞烷基氧基、R1a-亞芳基-(NHC0-R2)b、R3。-亞芳 基-(CONH-R4)d、(R5-CONH)e-亞芳基-R6f 和(R7-NHCO)g-亞芳基-R8h,其中各個 R1、! 2、! 3、! 4、 R5、R6、R7和R8在每次出現時獨立地選自(卜6亞烷基、(卜6亞烷基氧基、-S-Cp6亞烷基、-S-CV6 亞烷基氧基、羰基-Cp6亞烷基、羰基-Cp6亞烷基氧基、CV6亞烷基-羰基、亞芳基或亞芳 基-Cp6亞烷基，且各個a、b、c、d、e、f、g和h獨立地選自0至6的整數，其中亞芳基為亞苯基、亞聯苯基或亞萘基，其中亞苯基、亞聯苯基或亞萘基任選被 一個或多個取代基單_、二-或三-取代，所述取代基選自鹵素、OH、SH、CN、NO2, C1^6烷基、 CV6烷氧基或CV6烷氧基羰基，Z，包括N、S和羰基之一，其中，
當Z’包括N時，Z’選自硫脲(-NH-CS-NH-)、氨基乙酰胺(-NH-CO-CH2-NH-)、酰胺 (-NH-C0-)、甲基酰胺(-NCH3-CO-)或取代的-三嗪-二胺(-NH-(R9C3N3)-NH-),當Z，包括S時，Z，選自硫醚(-S-)、硫基乙酰胺(-S-CH2-CO-NH-)、二硫化物 (-S-S-)、(-S-CO-CH2-NH-)或(-S- (R9C3N3) -NH-)，或當V 包括羰基時，V 選自酰胺(-C0-NH-，-CO-NCH3-)或酯(-C0-0-)，其中R9選自氫、鹵素、CV6烷基、CV6烷硫基、Cp6烷氧基、Cp6硫代烷氧基、芳基氧基 和氨基，其中烷基、烷硫基、烷氧基、硫代烷氧基或芳基氧基任選被單_、二-或三-取代，且 其中氨基任選被一個或多個取代基單_或二-取代，所述取代基選自鹵素、OH、SH、CN、NO2,
CV6烷基、C1^6烷氧基或Cp6烷氧基羰基。在本發(fā)明上下文中，CV6烷基是指具有1-6個碳原子的直鏈或支鏈基團，包括但不 局限于，甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基和己基。甲基、乙基、丙基和異 丙基為優(yōu)選基團。在本發(fā)明的上下文中，Cp6亞烷基是指具有1-6個碳原子的直鏈或支鏈二價 基團，包括但不局限于，亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞異丙基、亞丁基、亞異丁基、亞叔丁基 (t-butylene)、亞戊基和亞己基。亞甲基、亞乙基、亞丙基和亞異丙基為優(yōu)選二價基團。在本發(fā)明上下文中，Cp6烷氧基是指連接至氧原子的具有1-6個碳原子的直鏈或 支鏈基團，包括但不局限于，甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、叔丁氧 基、戊氧基和己氧基。甲氧基、乙氧基和丙氧基為優(yōu)選基團。在本發(fā)明上下文中，Cp6亞烷基氧基是指連接至氧原子的具有1-6個碳原子的直 鏈或支鏈二價基團、包括但不局限于、亞甲基氧基、亞乙基氧基、亞丙基氧基、亞異丙基氧 基、亞丁基氧基、亞異丁基氧基、亞叔丁基氧基(t-butylenoxy)、亞戊基氧基和亞己基氧基。 亞甲基氧基、亞乙基氧基和亞丙基氧基為優(yōu)選二價基團。在本發(fā)明上下文中，氨基酸殘基具有其常規(guī)的三字母縮寫。因此Ahx表示2-氨基 己酸(正亮氨酸)、Ala表示丙氨酸、Arg表示精氨酸、Asn表示天冬酰胺、Asp表示天冬氨 酸、Aze表示氮雜環(huán)丁烷-2-羧酸、Cys表示半胱氨酸、Gln表示谷氨酰胺、Glu表示谷氨酸、 Gly表示甘氨酸、His表示組氨酸、Ile表示異亮氨酸、Leu表示亮氨酸、Lys表示賴氨酸、Met 表示蛋氨酸、Phe表示苯丙氨酸、Pip表示哌啶-2-羧酸、Pro表示脯氨酸、Ser表示絲氨酸、 Thr表示蘇氨酸、Trp表示色氨酸、Tyr表示酪氨酸和Val表示纈氨酸。在本發(fā)明上下文中，鹵素表示氟、氯、溴或碘。為了分離裂解的和未裂解的/完整的底物，根據本發(fā)明的底物必須能夠附著在固 定基質上。因此根據本發(fā)明的底物一端以結合配對的第一配偶體為末端，其可進一步與結 合配對的第二配偶體結合。所述結合配對的第二配偶體固定在固定基質上。根據本發(fā)明的底物可被凝血酶迅速裂解，且具有優(yōu)良的特異性。其中心部分為小 肽，即三-或四-肽，其在位于Arg-部分和Z-部分之間的易裂鍵(scissile bond)處被凝 血酶裂解。當樣本為血漿時可使用根據本發(fā)明的底物，且由于其適用于樣本為全血的情況因 此其特別有利，因為所述底物由于使用了螯合物技術而可在615nm檢測。在根據本發(fā)明的一個實施方式中，所述底物中X’不存在，Phe為D-Phe和Arg為 L-Arg0
而且，該螯合物可包括例如穩(wěn)定的螯合物(包括吡啶的衍生物；聯吡啶類、三聯批
15在本發(fā)明的一個實施方式中，X為D-Phe-L-2-Aze-L-Arg或 D-Phe-L-2-Pip-L-Arg。這些底物已經顯示提供快速裂解動力學和/或其對凝血酶的高度特異性。在本發(fā)明的一個實施方式中，Z’為N且R為亞芳基、CV6亞烷基_亞芳基或R1a-亞 芳基-(NHCO-R2)b,其中R1和R2如上文定義且a和b為O、1或2。因此其中Z在易裂鍵處包括芳香部分的底物已經顯示提供了優(yōu)良的和快速裂解 動力學。在本發(fā)明的一個實施方式中，Z，為6-取代的-1，3，5-三嗪_2，4_ 二胺 (NH-(R9C3N3)-NH)或(S-(R9C3N3)-NH)鍵，其中R9選自氯、氟、乙氧基、2-甲氧基乙氧基、 2_氰基乙氧基、2，2，2_三氟乙氧基、硫苯氧基(thiophenoxy)和乙氧基羰基硫甲氧基 (ethoxycarbonylthiomethoxy)。根據本發(fā)明的該實施方式的底物尤其對凝血酶特異。在根據本發(fā)明的一個實施方式中，所述發(fā)光螯合物為熒光鑭系元素螯合物。例如 如US 7,018,851 B2所公開，該發(fā)光鑭系元素螯合物提供了以下特點因此非常適合本發(fā)明 在合適的波長處的強吸收率、在相同配體結構中的幾個分開的UV吸收部分、從UV吸收部分 向鑭系元素離子的有效能量轉移、產生熱力學穩(wěn)定性和高動力學穩(wěn)定性的強螯合部分、以 及允許有效偶聯螯合物以用作結合試劑、卻不破壞其結合性質的功能基。在根據本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，所述鑭系元素螯合物A或A’選自
權利要求
1.具有以下通式的凝血酶的底物 A-X-Z-A，其中A或A’之一包括發(fā)光螯合物，以及A或A’的另一個包括結合配對的第一配偶體，任選包括間隔基，并經肽鍵連接至底物 的剩余部分，X 形成三 _ 或四-肽，其選自 X，-Phe-Aze-Arg,X‘ -Phe-Pip-Arg 和 X，-Phe-Pro-Arg,其中X，不存在或選自Lys、Ahx、Ile和Val, Z為NH-R-Z，，其中R選自CV6亞烷基、C1^6亞烷基氧基、-S-Cp6亞烷基、-S-Cp6亞烷基氧基、羰基-C^亞 烷基、羰基-Cu亞烷基氧基、CV6亞烷基-羰基、C1^6亞烷基氧基-羰基、C1^6亞烷基-亞芳 基、C1^6亞烷基氧基-亞芳基、C1^6亞烷基-NH、C1^6亞烷基氧基-NH、CV6亞烷基-NHC0、C1^6 亞烷基氧基-NHC0、CV6亞烷基-C0NH、CV6亞烷基氧基-C0NH、C1^6亞烷基-COS、C1^6亞烷基 氧基-COSXh亞烷基-CONH-CV6亞烷基-亞芳基、亞芳基、亞芳基-Cp6亞烷基、亞芳基-CV6 亞烷基氧基、R1a-亞芳基-(NHC0-R2) b、R3c-亞芳基-(C0NH-R4) d、(R5-CONH) e-亞芳基-R6f 和 (R7-NHCO)g-亞芳基-R8h,其中各個R1HHH和R8在每次出現時獨立地選自C^6 亞烷基、CV6亞烷基氧基、-S-Cp6亞烷基、-S-CV6亞烷基氧基、羰基-Ch6亞烷基、羰基-CV6 亞烷基氧基、Cp6亞烷基-羰基、亞芳基或亞芳基-Cu亞烷基，且各個a、b、C、d、e、f、g和h 獨立地選自O至6的整數，其中亞芳基為亞苯基、亞聯苯基或亞萘基，其中亞苯基、亞聯苯基或亞萘基任選被一個 或多個取代基單_、二-或三-取代，所述取代基選自鹵素、OH、SH、CN、NO2, C1^6烷基、C1^6烷 氧基或Cp6烷氧基羰基，Z’包括N、S和羰基之一，其中，當Z’包括N時，Z’選自硫脲(-NH-CS-NH-)、氨基乙酰胺(-NH-CO-CH2-NH-)、酰胺 (-NH-C0-)、甲基酰胺(-NCH3-CO-)或取代的-三嗪-二胺(-NH-(R9CJ3)-NH-),當V包括S時，Z’選自硫醚(-S-)、硫基乙酰胺(-S-CH2-CO-NH-)、二硫化物(-S-S-)、 (-S-CO-CH2-NH-)或(-S- (R9C3N3) -NH-)，或當V包括羰基時，V選自酰胺(-C0-NH-，-CO-NCH3-)或酯(-C0-0-)， 其中R9選自氫、鹵素、CV6烷基、Cp6烷硫基、CV6烷氧基、Cp6硫代烷氧基、芳基氧基 和氨基，其中烷基、烷硫基、烷氧基、硫代烷氧基或芳基氧基任選被一個或多個取代基單_、 二-或三-取代，且氨基基團任選被一個或多個取代基單-或二-取代，所述取代基選自鹵 素、OH、SH、CN、NO2、CV6烷基、C1^6烷氧基或C^6烷氧基羰基。
2.根據權利要求1 的底物,其中 X 為 D-Phe-L-2-Aze-L-Arg 或 D_Phe-L-2-Pip-L_Arg。
3.根據權利要求1或2的底物，其中Z’為N且R為亞芳基、C1^6亞烷基-亞芳基或 R1a-亞芳基-(NHCO-R2)b,其中a和b為0、1或2。
4.根據上述權利要求中任一項的底物，其中所述的發(fā)光螯合物為熒光鑭系元素螯合物。
5.根據權利要求4的底物，其中所述的鑭系元素螯合物選自
6.
7.根據上述權利要求中任一項的底物，其特征在于所述結合配對的第一配偶體經式 NH-Rici-CONH-Rll-CO-(NH-R12-NH)i的間隔基與底物的剩余部分連接，其中各個R1(l、R11和R12 獨立地選自CV6亞烷基、Cp6亞烷基氧基、-S-CV6亞烷基、-S-Cp6亞烷基氧基、羰基-(V6亞燒 基、羰基-CV6亞烷基氧基、CV6亞烷基-羰基、亞芳基或亞芳基-Cu亞烷基，其中亞芳基為 亞苯基、亞聯苯基或亞萘基，其中亞苯基、亞聯苯基或亞萘基任選被一個或多個取代基單-、 二-或三-取代，所述取代基選自鹵素、OH、SH、CN、NO2、C1^6烷基、Cp6烷氧基或C^6烷氧基 羰基，且i為O至6的整數，或所述間隔基為W-個氨基酸組成的肽，其中W為1至40的整 數。
8.根據權利要求7的底物，其中RlR11和R12為相同的或不同的直鏈CV6亞烷基、亞芳 基或亞芳基-Cp6亞烷基，且i為O或1。
9.根據上述權利要求中任一項的底物，其選自SlV6(a，b，c)、S1V8、S1V9(a, b)和 SlV12(a, b, c)
10.
11.根據權利要求10的測定方法，其中所述樣本和活化劑的加入與底物向固定基質中 的加入同時或基本同時進行。
12.根據權利要求10的測定方法，其中所述樣本和活化劑的加入在將底物固定在固定 基質后進行。
13.用于測定測試樣本中生物活性凝血酶的濃度的兩步測定方法，其包括以下步驟a)在液相中將所述樣本和活化劑加入根據權利要求1-9中任一項的底物中，b)孵育所得的反應混合物以釋放凝血酶-裂解的、含螯合物的底物片段，c)將反應混合物加入固定基質中，d)洗掉任何存在的未固定的、凝血酶-裂解的、含螯合物的底物片段和未固定的、凝血酶-未裂解的底物，e)測量來自固定的完整底物的發(fā)射光水平，和f)與不含凝血酶的標準品相比，從發(fā)射光強度的降低計算凝血酶活性。
14.根據權利要求10-13中任一項的測定方法，其中所述的活化劑選自促凝血酶原激 酶、部分促凝血酶原激酶試劑和接觸活化劑。
15.根據權利要求14的測定方法，其中所述的部分促凝血酶原激酶試劑包括磷脂，且 所述接觸活化劑包括二氧化硅、高嶺土、硅藻土、鞣花酸。
16.根據權利要求1-9中任一項的底物在測定樣本中生物活性凝血酶的濃度的用途。
17.用于測定樣本中生物活性凝血酶的濃度的試劑盒，其包括a)根據權利要求1-9中任一項的發(fā)光底物，b)固體固定基質。
18.具有以下通式的酶的底物 A-X-Z-A，其中A或A’之一包括發(fā)光螯合物，和A或A’的另一個包括結合配對的第一配偶體，其任選包括間隔基，并經肽鍵連接至底 物的剩余部分，X形成三-或四-肽， Z為NH-R-Z，，其中R選自CV6亞烷基、C1^6亞烷基氧基、-S-Cp6亞烷基、-S-Cp6亞烷基氧基、羰基-C^亞 烷基、羰基-Cu亞烷基氧基、CV6亞烷基-羰基、C1^6亞烷基氧基-羰基、C1^6亞烷基-亞芳 基、C1^6亞烷基氧基-亞芳基、C1^6亞烷基-NH、C1^6亞烷基氧基-NH、CV6亞烷基-NHC0、C1^6 亞烷基氧基-NHC0、CV6亞烷基-C0NH、CV6亞烷基氧基-C0NH、C1^6亞烷基-COS、C1^6亞烷基 氧基-COSXh亞烷基-CONH-CV6亞烷基-亞芳基、亞芳基、亞芳基-Cp6亞烷基、亞芳基-CV6 亞烷基氧基、R1a-亞芳基-(NHC0-R2) b、R3c-亞芳基-(C0NH-R4) d、(R5-CONH) e-亞芳基-R6f 和 (R7-NHCO)g-亞芳基-R8h,其中各個R1HHH和R8在每次出現時獨立地選自C^6 亞烷基、CV6亞烷基氧基、-S-Cp6亞烷基、-S-CV6亞烷基氧基、羰基-Ch6亞烷基、羰基-CV6 亞烷基氧基、Cp6亞烷基-羰基、亞芳基或亞芳基-Cu亞烷基，且各個a、b、C、d、e、f、g和h 獨立地選自0至6的整數，其中亞芳基為亞苯基、亞聯苯基或亞萘基，其亞苯基、亞聯苯基或亞萘基任選被一個或 多個取代基單-、二-或三-取代，所述取代基選自鹵素、OH、SH、CN、NO2, C1^6烷基、C1^6烷氧 基或Cp6烷氧基羰基，Z’包括N、S和羰基之一，其中，當Z’包括N時，Z’選自硫脲(-NH-CS-NH-)、氨基乙酰胺(-NH-CO-CH2-NH-)、酰胺 (-NH-C0-)、甲基酰胺(-NCH3-CO-)或取代的-三嗪-二胺(-NH-(R9CJ3)-NH-),當V包括S時，Z’選自硫醚(-S-)、硫基乙酰胺(-S-CH2-CO-NH-)、二硫化物(-S-S-)、 (-S-CO-CH2-NH-)或(-S- (R9C3N3) -NH-)，或當V包括羰基時，V選自酰胺(-C0-NH-，-CO-NCH3-)或酯(-C0-0-)，其中R9選自氫、鹵素、CV6烷基、CV6烷硫基、CV6烷氧基、CV6硫代烷氧基、芳基氧基和氨基，其烷基、烷硫基、烷氧基、硫代烷氧基或芳基氧基基團任選被一個或多個取代基單_、 二-或三-取代，且其氨基基團任選被一個或多個取代基單-或二-取代，所述取代基選自 鹵素、OH、SH、CN、NO2、CV6烷基、C1^6烷氧基或C^6烷氧基羰基。
全文摘要
本發(fā)明涉及凝血酶底物和測定樣本中生物活性凝血酶水平的測定法。所述底物具有以下通式A-X-Z-A’，其中A或A’之一包括發(fā)光螯合物，例如鑭系元素螯合物。A或A’的另一個包括結合配對的第一配偶體，例如生物素和任選間隔基。X形成三或四肽，例如X’-Phe-Aze-Arg、X’-Phe-Pip-Arg和X’-Phe-Pro-Arg，其中X不存在或選自Lys、Ahx、Ile和Val。Z包括連接基，例如二胺連接基。
文檔編號G01N33/86GK102124346SQ200980131917
公開日2011年7月13日 申請日期2009年7月10日 優(yōu)先權日2008年7月16日
發(fā)明者哈里·塔卡洛, 柯爾斯滕·M·雅各布森, 秦秋平, 阿倫·M·伯納德 申請人:雷迪奧米特醫(yī)學公司