專利名稱：：用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的lamp擴(kuò)增用核酸引物組的制作方法用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組相關(guān)申請(qǐng)的交互參考本申請(qǐng)基于并要求之前于2006年12月26日申請(qǐng)的日本專利申請(qǐng)?zhí)?000-350363的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容在本申請(qǐng)中引入作為參考。發(fā)明背景1、發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及迅速檢測(cè)戊型肝炎病毒的手段。2、相關(guān)技術(shù)的描述導(dǎo)致戊型肝炎的戊型肝炎病毒(以下也記為"HEV")是于19卯年其基因已被克隆的病毒。HEV在世界局部地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，感染途徑以發(fā)生水系污染的地區(qū)經(jīng)口感染為主。由此可認(rèn)為在日本和歐美那樣的先進(jìn)諸國(guó)被發(fā)現(xiàn)是很稀少的?？墒墙陙?，新的日本固有林的存在變得明朗，認(rèn)為起因于所述病毒林的肝炎患者也在國(guó)內(nèi)開始被確認(rèn)(TakahashiK，IwataK,WatanabeN等人，Viroligy;2001;287;9-12)。由該病毒引起的肝炎病態(tài)也存在著從幾乎沒有癥狀的輕度的肝炎、至急性肝炎、甚至重癥肝炎的癥例。因此，有必要迅速鑒定原因病毒，由它的病毒型推測(cè)預(yù)后，開始恰當(dāng)?shù)闹委?。另外，?jù)最近的凈艮告確認(rèn)輸血也會(huì)感染戊型肝炎病毒(MatsubayashiK，NagaokaY，SakataH等人，Transfusion2004;44(6);934-940;MitsuiT，TsukamotoY，YamazakiC等人，J.Med.Virol.2004;74(4);563-572)。由此，開發(fā)能夠適應(yīng)大規(guī)^莫篩選那樣的戊型肝炎病毒的簡(jiǎn)便且高靈敏度的檢測(cè)法的需求正在增強(qiáng)?，F(xiàn)在，HEV的主要檢測(cè)法是采用測(cè)定患者血清中存在的抗體，或通過PCR擴(kuò)增基因的方法。然而，在抗體檢查中，不僅已治愈的患者被判定為陽性，而且盡管戊型肝炎病毒實(shí)際上為陽性時(shí)期，但由于抗體產(chǎn)生的時(shí)間延遲，往往也被判定為陰性。而通過直接測(cè)定病毒基因組的PCR法存在著要從基因組提取開始經(jīng)歷逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、PCR擴(kuò)增反應(yīng)后電泳的步驟而最終艱難獲得結(jié)果這一煩雜問題。不僅如此，盡管確認(rèn)了HEVRNA由于菌林不同存在很多變異，但是未必能說使用可一次穩(wěn)定地檢測(cè)出它們各種各樣的基因型的擴(kuò)增體系。因此，由于上述原因?qū)е玛栃月实鸵彩莻€(gè)問題?，F(xiàn)在，在檢測(cè)戊型肝炎病毒的檢查方法中，適用于健康保險(xiǎn)的體系還沒有開發(fā)。但現(xiàn)實(shí)是既使在日本人中，隨著年齡增大，抗體陽性率正在上升。鑒于這樣現(xiàn)狀，感染戊型肝炎病毒的人比已掌握的醫(yī)療關(guān)系者還多的可能性大。因此，期盼開發(fā)簡(jiǎn)便、靈敏度高、而且費(fèi)用低的檢查體系。本發(fā)明的課題在于提供用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的迅速且正確的手段。發(fā)明概述為了解決上述課題，本發(fā)明者找到了以下的手段。即(1)用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組，上述LAMP擴(kuò)增用核酸引物組包含F(xiàn)IP引物、F3引物、以及BIP引物和B3引物中的至少一種引物，其中上述FIP引物為包含序列Flc和序列F2的序列Flc-x-F2(其中，x為0以上的整數(shù)個(gè)堿基的核酸，序列Flc為序列Fl的互補(bǔ)序列)；上述F3引物為序列F3;上述BIP引物為包含序列Blc和序列B2的序列Blc-y-B2(其中，y為0以上的整數(shù)個(gè)堿基的核酸，序列Blc為序列Bl的互補(bǔ)序列)；上述B3引物為序列B3;上述序列Fl、序列F2、序列F3、序列Bl、序列B2和序列B3為包含在選自序列編號(hào)1~67或其互補(bǔ)序列的至少一個(gè)序列中的連續(xù)序列所示的15個(gè)堿基以上的核酸。(2)用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的基因型的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組，上述LAMP擴(kuò)增用核酸引物組包含F(xiàn)IP引物、F3引物、BIP引物和B3引物，其中上述FIP引物為包含序列Flc和序列F2的序列Flc-x-F2(其中，x為0以上的整數(shù)個(gè)堿基的核酸，序列Flc為序列Fl的互補(bǔ)序列)；上述F3引物為序列F3;上述BIP引物為包含序列Blc和序列B2的序列Blc-y-B2(其中，y為0以上的整數(shù)個(gè)堿基的核酸，序列Blc為序列Bl的互補(bǔ)序列)；上述B3引物為序列B3;上述引物組中包含的所有序列是為了確定戊型肝炎病毒的基因型，通過使用戊型肝炎病毒基因組的可讀框2的部分序列而設(shè)計(jì)的序列。本發(fā)明提供了用于迅速且正確地檢測(cè)戊型肝炎病毒的手段。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在以下說明書中示出，一部分從說明書中顯然可見，一部分可通過本發(fā)明的實(shí)踐而習(xí)得。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)可通過尤其是下文中指出的手段和組合來實(shí)現(xiàn)和獲得。附圖簡(jiǎn)述所附的附圖整合入說明書中并構(gòu)成說明書的一部分，其闡述了本發(fā)明的實(shí)施方案，其與上文的總體描述和下文給出的實(shí)施方案的詳細(xì)描述一起用于解釋本發(fā)明的原理。圖1是表示LAMP法中使用的引物與被檢核酸的關(guān)系的模式圖。圖2是表示使用LAMP法獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的模式圖。圖3是表示在使用環(huán)引物時(shí)的LAMP法中使用的引物與被檢核酸的關(guān)系的圖。圖4A是表示從HEVRNA中的5，非編碼區(qū)至ORF-1的序列與引物設(shè)定區(qū)的模式圖。圖4B是表示續(xù)圖4A的圖。圖4C是表示續(xù)圖4B的圖。圖5A是表示HEVRNA中的ORF-2區(qū)的一部分序列與引物設(shè)定區(qū)的才莫式圖。圖5B是表示續(xù)圖5A的圖。圖5C是表示續(xù)圖5B的圖。圖6是表示一個(gè)顯示LAMP擴(kuò)增結(jié)果的電泳照片例子的圖。圖7是表示一個(gè)用濁度計(jì)測(cè)定LAMP擴(kuò)增結(jié)果例子的曲線圖。圖8是表示用于顯示在LAMP擴(kuò)增中反應(yīng)溫度影響的結(jié)果的曲線圖。圖9是表示為了確定HEV的LAMP擴(kuò)增的最適區(qū)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的曲線圖。圖10是表示選擇在ORF-2(即區(qū)域編號(hào)4和區(qū)域編號(hào)5)的保守性高的區(qū)域中擴(kuò)增上升最早的引物組的研究結(jié)果的曲線圖。圖11是對(duì)通過^f吏用區(qū)域編號(hào)004與區(qū)域編號(hào)002的引物組，以來自患者樣本的提取產(chǎn)物為模板的LAMP擴(kuò)增上升的速度進(jìn)行比較的曲線圖。
發(fā)明內(nèi)容1、用語說明此處使用的"核酸，，可以是來自天然的DNA和RNA等、一部分或完全人工合成和/或設(shè)計(jì)的人工核酸等以及它們的混合物等。此處使用的"樣本樣品"或"樣本"并不限定于所使用的，可以是例如血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、活組織、口腔內(nèi)粘膜、培養(yǎng)細(xì)胞、喀痰等，或是通過任意本來已知的手段從來自上述任一個(gè)或它們的混合物提取核酸成分的樣本。本發(fā)明提供迅速且正確測(cè)定人、家畜、寵物等動(dòng)物體內(nèi)有無戊型肝炎病毒，以及有關(guān)在對(duì)于治療方針的決定有用的病毒的基因型等戊型肝炎病毒的信息的手段。因此，樣本樣品只要是可用于以上手段的樣品，可以是任意樣品。此處使用的"LAMP法，，是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-MediatedIsothermalAmplification)的簡(jiǎn)稱，是對(duì)于靼基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種引物，即FIP引物、F3引物、B3引物和BIP引物，利用鏈的置換反應(yīng)，在一定溫度反應(yīng)的方法(即等溫基因擴(kuò)增法的一種)。本發(fā)明中使用的LAMP法包括通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，或其部分改變的方法等。后面給出了LAPM法的基本說明，也可參照例如特開2002-186481等文獻(xiàn)。其中被引用的文獻(xiàn)由于參照也包含在本發(fā)明中。另外，此處使用的"RT-LAMP"法是逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增這個(gè)方法是應(yīng)用LAMP法的方法，是當(dāng)靼基因?yàn)镽NA時(shí)，合成cDNA可與擴(kuò)增同時(shí)或根據(jù)要求間隔一定時(shí)差進(jìn)行的可在檢測(cè)中利用的方法。在這個(gè)
技術(shù)領(lǐng)域：
中公知的任意的RT-LAMP和其改變法都可在本發(fā)明中利用。下面，就有關(guān)基本的LAMP法中的引物設(shè)計(jì)和獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物，利用圖1和圖2進(jìn)4亍說明。另外，在本圖、本說明書和本專利申請(qǐng)的范圍內(nèi)，帶有"c"的記號(hào)表示與不帶"c"的同一記號(hào)彼此互補(bǔ)。例如"Flc，，與"F1"就是彼此互補(bǔ)。參照?qǐng)Dl。當(dāng)要檢測(cè)的被檢核酸為雙鏈時(shí)，任一條鏈都可含有耙序列，在此設(shè)定在一條鏈核酸中含有靶序列。要按照能夠?qū)Ⅶ靶蛄袏A在中間那樣設(shè)定用作引物雜交的序列的引物區(qū)域Flc、F2c、F3c、Bl、B2、B3。設(shè)計(jì)用于與這些序列雜交的引物，即FIP引物、F3引物、B3引物、BIP引物。然后，在使上述4種引物與作為模板核酸的被檢核酸能夠獲得適當(dāng)擴(kuò)增的條件下進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。象圖2所示那樣，由此獲得的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物是含有靶序列的擴(kuò)增產(chǎn)物和其互補(bǔ)鏈(參照?qǐng)D2)，靼序列位于擴(kuò)增產(chǎn)物的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的中央。另外，為了提高擴(kuò)增速度，也可使用象圖3所示那樣的環(huán)引物。在被檢核酸中，用于環(huán)引物雜交的位置可以處于引物區(qū)域F2與Flc之間(其中，環(huán)引物的序列也可以包含F(xiàn)2區(qū)域)、引物區(qū)域B1與B2c之間(其中，環(huán)引物的序列也可以包含B2c區(qū)域)的任一位置。如圖3所示那樣，例如，當(dāng)設(shè)定在引物區(qū)域F2與Flc之間時(shí)，適合的環(huán)引物是環(huán)引物FLc。而當(dāng)設(shè)定在引物區(qū)域Bl與B2c之間時(shí)，適合的引物是環(huán)引物BL。環(huán)引物可以同時(shí)使用這兩個(gè)位置，也可以使用其中的至少l個(gè)。置的區(qū)域。實(shí)施LAMP法時(shí)，通過使作為與該單鏈區(qū)的鏈互補(bǔ)的DNA片段的環(huán)引物存在，可保持必要的立體結(jié)構(gòu)，以便目標(biāo)擴(kuò)增可順利進(jìn)行。因此，環(huán)引物的使用在本發(fā)明中是優(yōu)選的。2、戊型肝炎病毒基因組戊型肝炎病毒的基因組為RNA。因此，無論現(xiàn)在的哪一種擴(kuò)增法，利用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA的合成是不可缺的。因此優(yōu)選利用RT-LAMP。在RT-LAMP法中，如果在本身已公知的LAMP反應(yīng)液中添加逆轉(zhuǎn)錄酶，對(duì)含有別的步驟的不進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的被檢核酸的被檢樣品，例如從來自血液的提取產(chǎn)物等直接開始擴(kuò)增目標(biāo)核酸是可能的。但是，也可以在進(jìn)行了cDNA合成后實(shí)施LAMP法，此方法也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。已知在LAMP法中通過DNA合成酶進(jìn)行的延伸反應(yīng)中，作為副產(chǎn)物生成焦磷酸，它與存在于反應(yīng)溶液中的鎂離子結(jié)合。本發(fā)明中使用的LAMP法由于擴(kuò)增產(chǎn)物的生成量多，焦磷酸鎂超過溶解度積，產(chǎn)生白濁。如果用儀器測(cè)定白濁(即濁度)，可更容易地實(shí)時(shí)確認(rèn)有無擴(kuò)增。這樣的方案也是本發(fā)明的l個(gè)優(yōu)選方案。3、LAMP擴(kuò)增用核酸引物根據(jù)本發(fā)明，LAMP擴(kuò)增用核酸引物(也簡(jiǎn)稱為"引物"或"LAMP引物")是FIP引物、F3引物、B3引物、BIP引物，作為它們的構(gòu)成單位，F(xiàn)IP引物中可含有序列Fl與序列F2，F(xiàn)3引物中可含有序列F3，BIP引物中可含有序列Bl與序列B2，而B3引物中可含有序列B3。另外，根據(jù)本發(fā)明的LAMP擴(kuò)增用核酸引物除了含有FIP引物、F3引物、B3引物、BIP引物之外，還可以含有環(huán)引物。根據(jù)本發(fā)明，通過檢測(cè)患者體內(nèi)有無HEV時(shí)，可以判定病毒的基因型。因此，一方面當(dāng)判定有無病毒時(shí)，需要在所有的林間選擇保守性高的區(qū)域。另一方面，當(dāng)判定病毒的基因型時(shí)，優(yōu)選是選擇在基因型中的保守性高、基因型間差異較大的序列。作為滿足這些要求的區(qū)域，本發(fā)明者選擇了上述的2個(gè)區(qū)域。圖4A、圖4B和圖4C的區(qū)域主要在提供用于檢測(cè)病毒有無的通用引物時(shí)有用。另外，圖5A、圖5B和圖5C的區(qū)域在提供用于判定病毒類型的型判定用引物時(shí)有用。其中，有關(guān)圖4A、圖4B和圖4C表示的序列是連續(xù)的序列，并比較了各種林間從HEV基因組的5，末端到可讀框1(也記為"ORF-l")的g序列。同樣有關(guān)圖5A、圖5B和圖5C表示的序列是連續(xù)的序列，并比較了各種林間可讀框2(也記為"ORF-2")的一部分堿基序列?，F(xiàn)在已知根據(jù)HEV基因的特征，HEV被分為4種基因型。將各個(gè)區(qū)域中可作為與擴(kuò)增有關(guān)的單位序列使用的序列設(shè)定在區(qū)域編號(hào)OOl、002、004、005這4個(gè)部位，按照對(duì)應(yīng)于序列F3、序列F2、序列Fl、序列Bl、序列B2、序列B3那樣用實(shí)線或虛線框架表示。以這些序列為基礎(chǔ)，i殳計(jì)必需的4種引物，即FIP引物、F3引物、B3引物和BIP引物。雖然任一個(gè)在圖4中均沒有顯示，但作為區(qū)域編號(hào)003使用圖4A所示序列的1位~193位的區(qū)域設(shè)計(jì)了引物。另外，在設(shè)計(jì)上述引物時(shí)，由于菌林不同，或區(qū)域不同，有時(shí)在序列中會(huì)看到細(xì)微的變異。因此，根據(jù)需要有時(shí)使用混合堿基，有時(shí)需要將選擇的序列的一部分序列組合后設(shè)計(jì)引物。這里所謂"使用混合堿基"指的是將用對(duì)應(yīng)變異或可能對(duì)應(yīng)變異的堿基置換的多個(gè)序列混合使用、或不混合使用。作為這樣的研究結(jié)果，設(shè)計(jì)了對(duì)構(gòu)成用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組有效的序列。其結(jié)果如表1-1~表1-2所示。表1-2是續(xù)表1一1。這里將表1-1和表1-2合起來稱為表1。HEV用LAMP引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>;<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表l中的區(qū)域編號(hào)相當(dāng)于圖4A~圖5C表示的區(qū)域001005。例如，表l的區(qū)域編號(hào)1的序列編號(hào)14對(duì)應(yīng)于圖4A的區(qū)域編號(hào)001-F3，作為F3引物的F3序列使用。同樣表1的001-F3-1表示區(qū)域編號(hào)001的序列，也可以作為F3引物的F3序列4吏用，或?qū)⑿蛄芯幪?hào)14的連續(xù)序列與序列編號(hào)15連續(xù)的序列組合為包含合計(jì)15個(gè)堿基以上的核酸的F3引物使用。在這種情況下，來自于序列編號(hào)14的序列和來自于序列編號(hào)15的序列中的任一個(gè)序列處于5，端都可以。可將同樣的使用方式運(yùn)用到表l中"HEV用LAMP引物序列，，欄記載的末尾編號(hào)~"-13"。就是"i兌，可以將這些末尾編號(hào)~"-13"中每一個(gè)序列單獨(dú)含有的連續(xù)的15個(gè)堿基以上的序列作為構(gòu)成單位，也可以將它們中的至少2個(gè)序列中分別含有的連續(xù)的序列(無論那一個(gè)為5，側(cè))結(jié)合，做成15個(gè)威基以上的序列，作為構(gòu)成單位。另外，也可以將末尾編號(hào)的任一個(gè)序列、或其中的連續(xù)的15個(gè)#以上的序列作為目的引物使用。因此，根據(jù)本發(fā)明的一種方案可提供用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的LAMP擴(kuò)增用核酸引物，上述LAMP擴(kuò)增用核酸引物包含F(xiàn)IP引物、F3引物、BIP引物或B3引物，從由序列編號(hào)14~67或它們的互補(bǔ)序列組成的序列組中至少選擇一個(gè)，使用所選擇序列中的15個(gè)威基以上的連續(xù)序列作為包含序列Fl、序列F2、序列F3、序列Bl、序列B2和序列B3的任一個(gè)LAMP引物的構(gòu)成單位。另外，當(dāng)以表1記載的序列編號(hào)14~67或它們的互補(bǔ)序列作為構(gòu)成單位時(shí)，由此設(shè)計(jì)的核酸引物只要是不妨礙作為引物的功能，至少存在l個(gè)變異、缺失、添加也可以。含有那樣的變異、缺失、添加的序列的LAMP擴(kuò)增用核酸引物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，為了鑒定作為戊型肝炎病毒的基因型存在的亞種(即亞型)，也有必要在表現(xiàn)亞型差別的特征部位設(shè)計(jì)引物。這樣的引物可作為分型用引物使用。詳細(xì)的如下面所述，表2給出了可在這樣的引物中利用的序列的例子。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>(1)通用引物表1給出的序列中的任一個(gè)作為通用引物用于檢測(cè)有無HEV都是有效的區(qū)域。這里所謂的通用引物是不管HEV的基因型如何都可檢測(cè)HEV的引物。由于提供這樣的通用引物，有可能做到對(duì)對(duì)象中的HEV無遺漏地進(jìn)行檢測(cè)。這樣的通用引物中使用的區(qū)域優(yōu)選表l給出的序列。本發(fā)明者獲得與任何引物、特別是保守性高的HEV基因組的其它區(qū)域相比，這些區(qū)域擴(kuò)增效率顯著高的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。然而，能夠說明有關(guān)為什么本發(fā)明的引物非常優(yōu)越的任何機(jī)制還完全不清楚。關(guān)于機(jī)制的這樣的見識(shí)，不限于HEV，在LAMP法中使用的任一個(gè)引物也是同樣的，現(xiàn)狀是任一個(gè)引物是否顯著有效，只有通過實(shí)驗(yàn)研究才能知道。如上所述，已確認(rèn)表1中給出的各引物區(qū)域用于檢測(cè)HEV的有無是有效的區(qū)域。其中，擴(kuò)增速度最快，效率好的引物區(qū)域是區(qū)域002(這里也記為"區(qū)域編號(hào)002")。區(qū)域002是從HEV基因組的5，末端開始的可讀框1的2位延伸至l卯位的區(qū)域。這個(gè)區(qū)域不僅在上述的區(qū)域OOl、002、003、004、005這5個(gè)區(qū)域中是效率最好的區(qū)域，而且即使與對(duì)應(yīng)于HEV基因組整體設(shè)計(jì)的任一個(gè)引物比較，也是最好的LAMP用引物區(qū)域(實(shí)施例3中詳細(xì)敘述)。因此，避開該區(qū)域中的變異部位，對(duì)根據(jù)本發(fā)明的引物的各構(gòu)成單位進(jìn)行設(shè)計(jì)，結(jié)果可得到以下的序列。序列編號(hào)l:GGCAGACCACNTATGTGG序列編號(hào)2:TCGANGCCATGGAGGCCCA序列編號(hào)3:CAGTTNATNAAGGCTCCTG序列編號(hào)4:GCATTACTACTGCCATTGAG序列編號(hào)5:GCGTCACNACTGCTATTGAG序列編號(hào)6:AGGCTGCTCTGGCTGCGGC序列編號(hào)7:AGGCAGCTCTAGCAGCGGC序列編號(hào)8:GCCTTGGCGAATGCTGTGG序列編號(hào)9:CTGTGGTGGTTCGGCCNTT序列編號(hào)10:CAAACCGAGATCCTTATTAAT序列編號(hào)ll:CAGACAGAGATACTTATTAAC序列編號(hào)12:TTGATGCAACCCCGGCAGTTG序列編號(hào)13:NTGATGCAGCCCCGGCAGCTT其中，序列編號(hào)1的11位的"N"表示"A"或"G"中的任一個(gè)堿基。序列編號(hào)2的5位的"N"表示"C"或"T"中的任一個(gè)堿基。序列編號(hào)3的6位的"N"表示"C"或"T"中的任一個(gè)堿基，序列編號(hào)3的9位的"N"表示"A"或"T"中的任一個(gè)堿基。序列編號(hào)5的8位的"N"表示A或T中的任一個(gè)堿基。序列編號(hào)9的17位的"N"表示G或T中的任一個(gè)堿基。序列編號(hào)13的1位的"N"表示"C"或"T"中的任一個(gè)堿基。其中，序列編號(hào)4與序列編號(hào)5、序列編號(hào)6與序列編號(hào)7、序列編號(hào)10與序列編號(hào)11、以及序列編號(hào)12與序列編號(hào)13分別是在同樣部位設(shè)定的引物，優(yōu)選這2種混在以便于能夠?qū)?yīng)于存在于那個(gè)區(qū)域的種種變異。序列編號(hào)1~序列編號(hào)13中的這些序列按照能夠即使在保守性高的區(qū)域中也能避開散布的變異那樣設(shè)定，或按照不能避開的變異位于對(duì)擴(kuò)增的影響小的部位那樣分區(qū)域設(shè)定。另外，在使混合堿基的使用控制在最小需要水平等方面也想了些辦法。在本發(fā)明中，通過反復(fù)進(jìn)行各種各樣的引物設(shè)定的研究，將這些區(qū)域分開是可能的。根據(jù)本發(fā)明的1個(gè)方案的用于檢測(cè)HEV的LAMP擴(kuò)增用核酸引物可以從由序列編號(hào)1~13或它們的互補(bǔ)序列組成的序列組中至少選擇1個(gè)序列，使用選擇序列中的15個(gè)威基以上的連續(xù)序列作為包含序列Fl、序列F2、序列F3、序列Bl、序列B2和序列B3的任一個(gè)LAMP引物的構(gòu)成單位的核酸引物。另外，根據(jù)本發(fā)明的引物在不妨礙作為目的引物發(fā)揮功能的P艮度內(nèi)，在序列編號(hào)1~13中任一個(gè)序列中至少再進(jìn)行一次變異、缺失、添加也可以。含有這樣的變異、缺失、添加的序列的LAMP擴(kuò)增用核酸引物也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。組的使用方式可以是例如以下那樣的方式。首先當(dāng)用于檢測(cè)HEV的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組按照包含F(xiàn)IP引物、F3引物、BIP引物和B3引物設(shè)計(jì)時(shí)，上述FIP引物是含有序列Flc和序列F2的序列Flc-x-F2。其中x為0以上的整數(shù)個(gè)堿基的核酸，優(yōu)選0~3個(gè)堿基的任意威基，例如優(yōu)選的例子"TTT"、"AAA"、"CCC"和"GGG"等序列，更優(yōu)選x為0個(gè)堿基。即，不存在x的引物由于可防止自身分子內(nèi)高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，是最優(yōu)選的。另外，上述F3引物;Uf列F3。上述BIP引物是含有序列Bl和序列B2c的序歹'JBl-y-B2c。其中，y為0以上的整數(shù)個(gè)堿基的核酸，優(yōu)選0~3個(gè)>^的4壬意堿基，例如，優(yōu)選的例子"TTT"、"AAA"、"CCC"和"GGG"等序列，更優(yōu)選y為0個(gè)威基。根據(jù)與x同樣的理由，優(yōu)選不存在y。另外，上述B3引物M列B3。序列Flc、序歹'JF2、序列F3、序列Bl、序列B2c和序列B3是用從由序列編號(hào)1~序列編號(hào)13和它們的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，而且按照序列F3、序列F2、序列Flc、序列Blc、序列B2和序列B3的順序選擇以上位的序列編號(hào)表示序列或它們的互補(bǔ)序列。例如，當(dāng)序列F3為序列編號(hào)1時(shí)，序列F2可以M列編號(hào)2、序列Flc可以是序列編號(hào)3、序列Blc可以是序列編號(hào)4、序列B2可以是序列編號(hào)5、序列B3可以是序列編號(hào)6等。例如，其中當(dāng)序列F3是用從由序列編號(hào)1~5組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸時(shí)，序列F2是用從由序列編號(hào)2~7組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，序列Flc是用從由序列編號(hào)38的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，序列Bl是用從由序列4~9組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，序列B2c是用從由序列6~11的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，以及序列B3是用從由序列7~13的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸?；蛘?，在同上的情況下，當(dāng)序列F3是用從由序列編號(hào)18的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)g以上的核酸時(shí)，序列F2是用從由序列編號(hào)29的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，序列Flc是用從由序列編號(hào)310組成的序列組中選擇的至少l個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，序列Blc是用從由序列4~11的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，序列B2是用從由序列5~12組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及序列B3是用從由序列6~13組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸。另外，有關(guān)含有變異位點(diǎn)"N"的序列，可以使用上述的含有任一堿基的序列，也可以將用分別含有作為混合堿基(即，也稱為mix威基)的兩方g那樣的序列制作的多個(gè)引物同時(shí)加入到1個(gè)反應(yīng)體系中。另外，根據(jù)本發(fā)明的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組可以包含F(xiàn)IP引物、F3引物、BIP引物和B3引物，在這些引物中還可組合環(huán)引物，也可稱為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增用核酸引物組。環(huán)引物的合成可以使用上述那樣的已公知的任方法和HEV檢測(cè)方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。以下就使用表l的各區(qū)域時(shí)的引物組進(jìn)行說明。另外，對(duì)于表l的各區(qū)域使用中有利的環(huán)引物的例子如表3所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>(a)當(dāng)使用表l的區(qū)域編號(hào)l時(shí)當(dāng)使用表l的區(qū)域編號(hào)1的序列時(shí)的引物組如下所示。如上所述，當(dāng)用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組包含F(xiàn)IP引物、F3引物、BIP引物和B3引物時(shí)，上述FIP引物是包含序列Flc和序列F2的序歹'JFlc-x-F2，(其中x為0以上的整數(shù)個(gè)4^的核酸、優(yōu)選03個(gè)堿基的任意堿基，例如，"TTT"、"AAA"、"CCC，，和"GGG"等序列是優(yōu)選的例子，更優(yōu)選x為O堿基。即，不存在x的引物由于防止自身分子內(nèi)高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成而最優(yōu)選)；另外上述F3引物M列F3，而上述BIP引物是含有序列Blc和序列B2的序列Blc-y-B2，(其中，y為O以上的整數(shù)個(gè)堿基的核酸、優(yōu)選0~3個(gè)堿基的任意堿基。例如"TTT"、"AAA"、"CCC"和"GGG"等序列是優(yōu)選的例子，更優(yōu)選y為O個(gè)堿基。根據(jù)與x同樣的理由，不存在y的更好)；另外當(dāng)在上述B3引物為序列B3，使用表l的區(qū)域編號(hào)l時(shí)，引物組如下所示。即，上述F3引物是用從由序列編號(hào)14和序列編號(hào)15組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)^以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號(hào)16和序列編號(hào)17組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號(hào)18~20組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號(hào)21和序列編號(hào)22組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸?；蛘?，同上的情況下，上述F3引物是用從由序列編號(hào)14和序列編號(hào)15的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號(hào)16和序列編號(hào)17的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號(hào)1820的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少l個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號(hào)21和序列編號(hào)22的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少l個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸。另夕卜當(dāng)利用表1的區(qū)域編號(hào)1時(shí)，在LAMP擴(kuò)增用核酸引物組中還可具備利用了表3所述的序列的環(huán)引物。例如，優(yōu)選使用包含序列編號(hào)102和/或103的序列的環(huán)引物。含有這樣的環(huán)引物的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，使用含有或不含有環(huán)引物的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組的核酸擴(kuò)增方法和HEV檢測(cè)方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。(b)使用表1的區(qū)域編號(hào)2時(shí)在4象上迷那樣的情況下，使用表1的區(qū)域編號(hào)2時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組可以是如下那樣。上述F3引物是用序列編號(hào)23中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號(hào)24~26組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號(hào)2730組成的序列組中選擇的至少l個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號(hào)31和序列編號(hào)32組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)g以上的核酸。或者，上述F3引物是用序列編號(hào)23的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號(hào)2426的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號(hào)27~30的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號(hào)31和序列編號(hào)32的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸。另外，當(dāng)利用表l的區(qū)域編號(hào)2時(shí)，作為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增用核酸引物組，還可具備利用了表3所述的序列的環(huán)引物。例如，優(yōu)選使用包含序列編號(hào)104和/或105的序列的環(huán)引物。含有這樣的環(huán)引物的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，使用含有或不含有環(huán)引物的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組的核酸擴(kuò)增方法和HEV檢測(cè)方法也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。(c)使用表1的區(qū)域編號(hào)3時(shí)另外，在同上的情況下，當(dāng)使用表l的區(qū)域編號(hào)3時(shí)，才艮據(jù)本發(fā)明的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組可以是如下那樣。上述F3引物是用序列編號(hào)23中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)33中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)34中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號(hào)35中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸?；蛘?，上述F3引物是用序列編號(hào)23的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)33的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)34的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號(hào)35的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸。(d)使用表l的區(qū)域編號(hào)4時(shí)另外，在同上那樣的情況下，當(dāng)使用表1的區(qū)域編號(hào)4時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組可以是如下那樣。上述F3引物是用從由序列編號(hào)36~38組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號(hào)3951組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號(hào)5254組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號(hào)55和序列編號(hào)56組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)減基以上的核酸?；蛘?，上述F3引物是用從由序列編號(hào)3638的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號(hào)39~51的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號(hào)52~54的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號(hào)55和序列編號(hào)56的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸。另外，當(dāng)利用表l的區(qū)域編號(hào)4時(shí)，LAMP擴(kuò)增用核酸引物組中還可以具備利用了表3所述的序列的環(huán)引物。例如，優(yōu)選使用包含由序列編號(hào)106~114的序列組成的序列組中選擇的至少一個(gè)序列的環(huán)引物。含有這樣的環(huán)引物的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，使用含有或不也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。(e)當(dāng)使用表1的區(qū)域編號(hào)5時(shí)另外，在同上那樣的情況下，當(dāng)使用表1的區(qū)域編號(hào)5時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組可以是如下那樣。上述F3引物是用從由序列編號(hào)5759組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號(hào)60~63組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號(hào)64和序列編號(hào)65組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號(hào)66和序列編號(hào)67組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸?；蛘?，上述F3引物是用從由序列編號(hào)57~59的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號(hào)60~63的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少l個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號(hào)64和65的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號(hào)66和序列編號(hào)67的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸。另外，當(dāng)利用表1的區(qū)域編號(hào)5時(shí)，在LAMP擴(kuò)增用核酸引物組中還可具備利用了表3所示序列的環(huán)引物。例如，優(yōu)選使用包含從序列編號(hào)116~117的序列組成的序列組中選擇的至少一個(gè)序列的環(huán)引物。含有這樣的環(huán)引物的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，使用含有或不也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，根據(jù)本發(fā)明的擴(kuò)增反應(yīng)可以按照每l管l種引物組進(jìn)行，或者也可以使多種引物組混在1管中進(jìn)行。也可將后述的分型用引物組同時(shí)混在1管中進(jìn)行，也可以象后述那樣只將多種分型用引物組混在1管中進(jìn)行。另外，也可在l管中只存在單獨(dú)的一種分型用引物組進(jìn)行反應(yīng)。在需要一次鑒定戊型肝炎病毒的多種亞型時(shí)，通過使多個(gè)分型用引物組同時(shí)存在于1管中的方法進(jìn)4t更有效。利用這樣的擴(kuò)增反應(yīng)的HEV檢測(cè)方法和擴(kuò)增方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。(2)分型用引物作為本發(fā)明的另一方案，為了對(duì)作為HEV的基因型存在的亞種、即亞型進(jìn)行鑒定，在表現(xiàn)亞型差別的特征部位設(shè)計(jì)引物、即設(shè)計(jì)分型用引物。如上所述那樣，為了對(duì)作為HEV的基因型存在的亞種、即亞型進(jìn)行鑒定，有必要在表現(xiàn)亞型差別的特征部位設(shè)計(jì)引物。用于該目的的分型用引物使用圖5A~C所述的可讀框2的一部分序列制作。在制作的引物中含有的優(yōu)選的各序列如表2所示。利用這些序列制備的引物可以準(zhǔn)備各型用的反應(yīng)管，在各個(gè)管中使用各自分型用引物，進(jìn)行各自的反應(yīng)。依靠添加到可獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的管中的引物的類型，即依靠對(duì)引物組的類型的特異性，判定供試驗(yàn)的樣4^羊品的HEV基因型成為可能。另外，利用帶有可檢測(cè)每一類型的標(biāo)記物也可以檢測(cè)每一類型。這樣的方法可利用本身已公知的任一現(xiàn)有技術(shù)的手段。另外，由于才艮據(jù)HEV的亞型還可以更細(xì)地分組。對(duì)于需要更嚴(yán)密的分型時(shí)，認(rèn)為圖5AC的可讀框2的區(qū)域也是有效的。這種場(chǎng)合下，可以選捧對(duì)各個(gè)型特異的序列設(shè)計(jì)各自的引物。這樣的詳細(xì)的分型用的引物組也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這樣的詳細(xì)的分型用的引物組用于檢測(cè)混有較少量的型也有效，在反應(yīng)特異性高的LAMP法中可有效使用。另外，如上所述，作為分型用引物組，除了FIP引物、F3引物、BIP引物和B3引物之外，還可以再組合環(huán)引物使用。具備這樣的FIP引物、F3引物、BIP引物、B3引物和環(huán)引物的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另夕卜，使用含有或不含有環(huán)引物的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組的核酸擴(kuò)增方法和HEV檢測(cè)方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。以下就使用表2的各區(qū)時(shí)的引物組進(jìn)行說明。(a)使用表2的區(qū)域編號(hào)4時(shí)(i)I型用的引物組使用表2的區(qū)域編號(hào)4的序列可提供的HEVI型用的引物組如下。當(dāng)用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組包含F(xiàn)IP引物、F3引物、BIP引物和B3引物時(shí)，上述FIP引物是包含序列Flc和序列F2的序歹'jFlc-x-F2，(其中，x為0以上的整數(shù)個(gè)4^Jl的核酸、優(yōu)選0~3個(gè)堿基的任意堿基，例如"TTT"、"AAA"、"CCC"和"GGG"等序列是優(yōu)選的例子，更優(yōu)選x不存在)，另外上述F3引物是序列F3，而上述BIP引物是含有序列Blc和序列B2的序列Blc-y-B2，(其中y為0以上的整數(shù)個(gè)堿基的核酸、優(yōu)選0~3個(gè)堿基的任意堿基。例如"TTT"、"AAA"、"CCC"和"GGG"等序列是優(yōu)選的例子，更優(yōu)選y不存在)，另外當(dāng)上述B3引物為序列B3時(shí)，使用表2的區(qū)域編號(hào)2，用于檢測(cè)I型HEV的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組如下。例如，上述F3引物可以是用序列編號(hào)68中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物可以是用序列編號(hào)72中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)減基以上的核酸，上述BIP引物可以是用序列編號(hào)76中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號(hào)81中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸。或者，上迷F3引物可以是用序列編號(hào)68的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物可以是用序列編號(hào)72的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物可以是用序列編號(hào)76的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號(hào)81的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸。(ii)II型用引物組在與I型用引物組同樣的場(chǎng)合下，使用表2的區(qū)域編號(hào)4，用于檢測(cè)II型HEV的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組可以是如下那樣。即，上述F3引物可以是用序列編號(hào)69中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物可以是用序列編號(hào)73中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物可以是用序列編號(hào)77中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號(hào)82中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸。或者，上述F3引物可以是用序列編號(hào)69的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物可以是用序列編號(hào)73的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物可以是用序列編號(hào)77的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號(hào)82的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸。(iii)III型用的引物組在與I型用引物組同樣的場(chǎng)合下，使用表2的區(qū)域編號(hào)4，用于檢測(cè)III型HEV的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組可以是如下那樣。上述F3引物可以是用序列編號(hào)87中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物可以是用從由序列編號(hào)91和序列編號(hào)92組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，上述BIP引物可以是用序列編號(hào)96中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號(hào)100中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸?；蛘撸鲜鯢3引物可以是用序列編號(hào)87的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物可以是用序列編號(hào)91的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物可以是用序列編號(hào)96的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號(hào)100的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸。(iV)IV型的引物組在與I型用引物組同樣的場(chǎng)合下，使用表2的區(qū)域編號(hào)4，用于檢測(cè)IV型HEV的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組可以是如下那樣。即，上述F3引物可以是用序列編號(hào)71中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，上述FIP引物可以是用序列編號(hào)75中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)4^&以上的核酸，上述BIP引物可以是用序列編號(hào)80中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號(hào)84中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸。或者，上述F3引物可以是用序列編號(hào)71的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物可以是用序列編號(hào)75的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物可以是用序列編號(hào)80的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號(hào)84的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸。(b)當(dāng)使用表2的區(qū)域編號(hào)5時(shí)(i)I型用的引物組使用表2的區(qū)域編號(hào)5的序列可提供的HEVI型用的引物組如下。當(dāng)用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組包含F(xiàn)IP引物、F3引物、BIP引物和B3引物時(shí)，上述FIP引物為包含序列Flc和序列F2的序列Flc-x-F2，(其中，x為O以上的整數(shù)個(gè)堿基的核酸、優(yōu)選0~3個(gè)堿基的任意堿基，例如"TTT"、"AAA"、"CCC"和"GGG"等序列是優(yōu)選的例子，更優(yōu)選x不存在)，另外上述F3引物是序列F3,而上述BIP引物是含有序列Blc和序列B2的序列Blc-y-B2，(其中，y為0以上的整數(shù)個(gè)堿基的核酸，優(yōu)選0~3個(gè)堿基的任意堿基。例如"TTT"、"AAA"、"CCC"和"GGG"等序列是優(yōu)選的例子，更優(yōu)選y不存在)，另外在上述B3引物為序列B3時(shí)，使用表2的區(qū)域編號(hào)2，用于檢測(cè)I型HEV的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組如下。例如，上述F3引物是用序列編號(hào)85中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)89中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)94中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號(hào)98中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸。或者，上述F3引物是用序列編號(hào)85的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)89的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)94的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號(hào)98的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸。(ii)II型用引物組在與I型用引物組同樣的情況下，使用表2的區(qū)域編號(hào)5，用于檢測(cè)II型HEV的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組如下。例如，上迷F3引物是用序列編號(hào)86中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)卯中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)95中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號(hào)99中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸?；蛘?，上述F3引物是用序列編號(hào)85的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)89的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)減基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)94的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號(hào)98的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸。(iii)III型用引物組在與I型用引物組同樣的情況下，使用表2的區(qū)域編號(hào)5，用于檢測(cè)III型HEV的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組如下。例如，上述F3引物是用序列編號(hào)87中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號(hào)91和序列編號(hào)92組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)96中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號(hào)100中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸?；蛘撸鲜鯢3引物是用序列編號(hào)87的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)91的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)96的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，以及上述B3引物可以是用序列編號(hào)100的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸。(iV)IV型用的引物組在與I型用引物組同樣的情況下，使用表2的區(qū)域編號(hào)5，用于檢測(cè)IV型HEV的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組如下。例如，上述F3引物是用序列編號(hào)88中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)92中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)97中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號(hào)101中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸?；蛘?，上述F3引物是用序列編號(hào)88的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)92的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)97的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號(hào)101的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸。另外，如上所述，作為分型用引物組，除了FIP引物、F3引物、BIP引物和B3引物之外，還可以再組合環(huán)引物使用。具備這樣的FIP引物、F3引物、BIP引物、B3引物和環(huán)引物的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另夕卜，使用含有或不含有環(huán)引物的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組的核酸擴(kuò)增方法和HEV檢測(cè)方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。通過以上這樣的根據(jù)本發(fā)明的引物組，可提供迅速且正確地檢測(cè)HEV和/或確定感染的HEV的基因型的可能的手段。其中可在任一引物組中使用的構(gòu)成單位的序列中，在只要不妨礙作為目的的引物的功能，也可以進(jìn)行至少一次的變異、缺失、添加。含有這樣的變異、缺失、添加的序列的LAMP擴(kuò)增用核酸引物和/或引物組也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外利用這樣的引物或引物組的核酸擴(kuò)增方法和HEV檢測(cè)方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。4、HEV檢測(cè)方法通過使用從由上述那樣的根據(jù)本發(fā)明的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組組成的引物組中選擇的至少一個(gè)引物組，可以提供用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的方法。另外，通過^f吏用分型引物組可在檢測(cè)HEV的同時(shí)或與檢測(cè)分開地進(jìn)行HEV的分型。引物組通過LAMP反應(yīng)進(jìn)行樣本樣品的核酸擴(kuò)增反應(yīng)，以及在上述擴(kuò)增反應(yīng)后或反應(yīng)過程中對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。樣本樣品如果需要，也可以在進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)前通過本身公知的提取手段j故成核酸成分。例如，這樣的提取手段的例子可以使用酚-氯仿法等液-液提取法、使用了單一物體的固-液提取法等，但并不限定于這些。另外，也可以利用市售的核酸提取試劑盒QIAamp(QIAGEN社制)、SmitestEX-R&D(醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所社制)等。而當(dāng)樣本樣品是核酸成分時(shí)，不需要提取過程。當(dāng)對(duì)核酸成分的樣本樣品進(jìn)行LAMP擴(kuò)增時(shí)，優(yōu)選在例如下面那樣的條件下進(jìn)行。LAMP擴(kuò)增的溫度優(yōu)選開發(fā)LAMP法的榮研化學(xué)社推薦的約60°C~約65。C之間的溫度，優(yōu)選例如58°C~59。C的反應(yīng)溫度。進(jìn)行HEV的分型時(shí)，在可獲得恰當(dāng)擴(kuò)增的條件下通過LAMP反應(yīng)進(jìn)行樣本樣品的核酸擴(kuò)增反應(yīng)，可在上述擴(kuò)增反應(yīng)后或反應(yīng)過程中對(duì)引物組特異的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，以及根據(jù)上述引物組特異性確定戊型肝炎病毒的基因型。例如，用于對(duì)引物組特異的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)的手段可以在用于鑒定l管l種基因型的引物組存在下進(jìn)行反應(yīng)，確認(rèn)有無擴(kuò)增。由此可以進(jìn)行引物組特異性、即取決于引物組的型特異性的檢測(cè)。另外，擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)可以在例如擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)或擴(kuò)增反應(yīng)后檢測(cè)反應(yīng)液的濁度，或者利用可見光、熒光、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、化學(xué)熒光、熒光能量轉(zhuǎn)移法、ESR等各種光學(xué)的手段。這些手段對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。另外，也可以通過測(cè)定濁度判斷有無擴(kuò)增。例如，當(dāng)測(cè)定濁度時(shí)，并不限定于可以4吏用例如TERAMECS林式會(huì)社制的Loopamp實(shí)時(shí)濁度測(cè)定儀器LA-200或MORITEX公司制的Realoop-30等。另外，也可以使用整合到雙鏈DNA后發(fā)熒光那樣的溴化乙錠、CyberGreenI等進(jìn)行監(jiān)測(cè)。通過這些方法可以實(shí)時(shí)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的合成量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。確定感染的HEV的基因型。5、測(cè)定試劑盒根據(jù)本發(fā)明，提供了用于實(shí)行本發(fā)明的方法的測(cè)定試劑盒。這樣的測(cè)定試劑盒的例子至少具備上述那樣的根據(jù)本發(fā)明的引物組，此外還可以具備核酸擴(kuò)增酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、擴(kuò)增酶的底物、逆轉(zhuǎn)錄酶的底物、反應(yīng)用緩沖液、反應(yīng)用緩沖劑和/或反應(yīng)容器等。通過提供這樣的測(cè)定試劑盒，可以進(jìn)行更簡(jiǎn)便地迅速且正確的HEV的檢測(cè)和/或確定感染的HEV的基因型。[例]例1對(duì)應(yīng)于引物區(qū)域的序列使用了表l和表2給出的序列表示的核酸組。另外，作為環(huán)引物使用表3給出的序列表示的核酸。以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的核酸檢測(cè)方法進(jìn)行更具體的說明。(1)合成寡核苷酸使用表l、表2給出的序列，制備用于HEV的檢測(cè)和基因型分類的核酸引物。這樣的引物的合成也可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法。(2)LAMP反應(yīng)液本例中，作為L(zhǎng)AMP法使用了RT-LAMP法。LAMP反應(yīng)液的組成如下。RT-LAMP法的反應(yīng)液組成20mMTris-HCL(pH8.8)10mMKCL8mMMgS04lOmM(NH4)2S040.1%吐溫200.8M甜菜堿1.4mMdNTPs。當(dāng)用這樣組成的總量為25iL的反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，按照下述濃度加入各個(gè)引物。引物添加量FIP引物40pmoLBIP引物40pmoLF3引物5pmoLB3引物5pmoL。實(shí)施例中使用的引物使用區(qū)域編號(hào)002的序列。FIP引物使用序列編號(hào)24、BIP引物使用序列編號(hào)27、F3引物使用序列編號(hào)23、B3引物使用序列編號(hào)31。另外，在總量25fiL進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，向各反應(yīng)體系添加lfiL作為酶混合物的將BstDNA聚合酶(NewEnglandBioLabs社制)和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(TakaraBio公司制)按照同比或任何比率混合的酶液、或添加在榮研化學(xué)社制的RNA擴(kuò)增試劑盒中帶有的酶混合物。被檢樣品使用從感染HEV的患者l、患者2和患者3分別釆集的血清中用SmitestEX-R&D(醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所社制)提取得到的HEVRNA。(3)利用LAMP法進(jìn)行核酸擴(kuò)增溫度設(shè)定為63°C、時(shí)間設(shè)定為1.5小時(shí)進(jìn)行核酸擴(kuò)增。此時(shí)取代來自血清的提取產(chǎn)物，將添加滅菌水的樣品作為陰性對(duì)照。通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增的LAMP產(chǎn)物。其結(jié)果，從含有來自患者的被檢樣品的反應(yīng)體系得到的樣品在LAMP產(chǎn)物中出現(xiàn)典型的梯狀的圖形(圖6)。而不含有才莫板DNA的陰性對(duì)照，則完全看不到擴(kuò)增(圖6中的n泳道)。以上結(jié)果表明使用選擇的引物組，可以序列特異地進(jìn)行HEV基因組的擴(kuò)增。(4)利用LAMP法進(jìn)行濁度測(cè)定通過濁度測(cè)定檢測(cè)利用LAMP法進(jìn)行的擴(kuò)增。濁度測(cè)定使用TERAMECS公司制的濁度測(cè)定儀器LA-200，對(duì)使用作為構(gòu)成單位使用了區(qū)域編號(hào)002序列的引物組實(shí)施了LAMP法的擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)。其結(jié)果如圖7所示。在圖中的解釋性記號(hào)中，對(duì)于區(qū)域編號(hào)002中標(biāo)記"L"的例子中，在該反應(yīng)體系中添加表3的序列編號(hào)104的環(huán)引物。另外，解釋性記號(hào)中的末尾的編號(hào)分別表示如下的模板濃度。1:103個(gè)拷貝/反應(yīng)體系2:102個(gè)拷貝/反應(yīng)體系3:1(^個(gè)拷貝/反應(yīng)體系4:1()C個(gè)拷貝/反應(yīng)體系。根據(jù)這些結(jié)果可確認(rèn)添加了環(huán)引物的反應(yīng)體系要比沒有添加的更早開始擴(kuò)增，模板濃度高的反應(yīng)體系比低的更早開始擴(kuò)增。例2進(jìn)行了用于求在通過LAMP法進(jìn)行HEV檢測(cè)時(shí)指出反應(yīng)溫度的研究。使用的引物如下。實(shí)施例中使用的引物使用了區(qū)域編號(hào)002的序列。FIP引物4吏用了序列編號(hào)24，BIP引物使用了序列編號(hào)27,F3引物使用了序列編號(hào)23，B3引物使用了序列編號(hào)31，環(huán)引物使用了序列編號(hào)104。FIP引物、BIP引物、F3引物和B3引物在與例l相同的濃度下使用，環(huán)引物按照20pmoL/25nL加到反應(yīng)體系中。反應(yīng)溫度設(shè)定為63'C和59。C，測(cè)定了擴(kuò)增開始的時(shí)間。其結(jié)果如圖8所示。在圖中的解釋性記號(hào)中，標(biāo)記為63的是在63'C下進(jìn)行反應(yīng)的情況，標(biāo)記為59的是在59。C下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)的結(jié)果。另外，解釋性記號(hào)中的末尾的編號(hào)分別為以下這樣的才莫板濃度。2:102個(gè)拷貝/反應(yīng)體系1:1(^個(gè)拷貝/反應(yīng)體系0:1()Q個(gè)拷貝/反應(yīng)體系n:作為陰性對(duì)照添加水。從這些結(jié)果可看出當(dāng)存在充分的模板濃度的情況下，于63。C進(jìn)行反應(yīng)的場(chǎng)合下擴(kuò)增開始得早。但如果模板濃度低下，會(huì)看到不擴(kuò)增的現(xiàn)象。另外，對(duì)于在59。C進(jìn)行反應(yīng)的場(chǎng)合下，模板濃度即使差100倍，擴(kuò)增開始的時(shí)間也不會(huì)差別IO分鐘。因此，在使用區(qū)域編號(hào)002的上述引物組合的體系中，認(rèn)為與63。C相比，59。C反應(yīng)更適合。例3在利用LAMP法進(jìn)行的戊型肝炎病毒的檢測(cè)法中，進(jìn)行了用于表示使面更優(yōu)越的實(shí)驗(yàn)。以下，在表4-1~表4-3中表示的第4序列組中給出了本研究使用的引物區(qū)域和在各區(qū)域設(shè)定的引物序列。表4-2和表4-3是依次續(xù)在表4一1后的表，其中表4_1~表4一3合起來記為表4。<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>另外，作為使用從序列編號(hào)1至13的區(qū)域編號(hào)002的引物，使用了下面的序列編號(hào)。F3:序列編號(hào)lFIP:序列編號(hào)2和序列編號(hào)4BIP:序列編號(hào)6和序列編號(hào)9B3:序列編號(hào)12沒有環(huán)引物。(1)LAMP反應(yīng)溶液在本實(shí)驗(yàn)中，作為L(zhǎng)AMP法使用了RT-LAMP法。LAMP反應(yīng)溶液組成如下。RT-LAMP法的反應(yīng)溶液組成20mMTris-HC1(pH8.8)10mMKC18mMMgS04lOmM(NH4)2S040，1%吐溫200.8M甜菜堿1.4mMdNTPs。當(dāng)用該組成的總量為25jiL的反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，按照以下濃度加入表4中的各個(gè)引物。引物添加量FIP引物40pmolBIP引物40pmolF3引物5pmo1B3引物5pmo1沒有添加環(huán)引物。另外，當(dāng)在總量25jiL中進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，作為酶混合液，添加ljiL的BstDNA聚合酶與AMV逆轉(zhuǎn)錄酶混合的酶液，即添加lpL榮研化學(xué)社制的RNA擴(kuò)增試劑盒附帶的酶混合物。模板使用HEVRNA，該RNA是使用SmitestEX-R&D(醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所社制)從感染了戊型肝炎病毒的患者l(III型，JRA-1)、患者2(111型，JKN-1)的血清提取的。(2)使用LAMP法進(jìn)行核酸擴(kuò)增將溫度設(shè)定為60。C、時(shí)間為100分鐘，進(jìn)行核酸擴(kuò)增。此時(shí)，取代來自血清的提取產(chǎn)物，將添加滅菌水的反應(yīng)作為陰性對(duì)照。(3)使用LAMP法進(jìn)行濁度測(cè)定作為濁度測(cè)定結(jié)果的例子，使用TERAMECS公司制的濁度測(cè)定儀器LA-200，對(duì)使用了用從區(qū)域編號(hào)101至115的序列設(shè)計(jì)的引物和設(shè)定在區(qū)域002內(nèi)的引物(組成與上述的例3(1)所述的同樣)時(shí)的擴(kuò)增開始進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)定。其結(jié)果如圖9所示。在圖中的解釋性記號(hào)中，JRA表示來自患者1的結(jié)果，JKN是來自患者2的結(jié)果。附在解釋性記號(hào)的末尾的101至115和002的編號(hào)表示使用的引物的區(qū)域編號(hào)。(4)研究中使用的引物區(qū)域的保守性與擴(kuò)增開始時(shí)間的比較表5中匯總了本研究中使用的引物的區(qū)域與各個(gè)患者樣本的擴(kuò)增開始時(shí)間以及該區(qū)域的序列保守性。根據(jù)表5給出的結(jié)果，與本發(fā)明中效率最好的區(qū)域編號(hào)002相比，區(qū)域編號(hào)114一方擴(kuò)增開始時(shí)間更早，顯示出了良好的結(jié)果。然而，這個(gè)區(qū)域編號(hào)114與區(qū)域編號(hào)002相比，是變異集積的區(qū)域，不僅在型間，即使在同一型的內(nèi)部也是出現(xiàn)不同序列多的區(qū)域。因此，當(dāng)增加除了此次使用的JRA-1林和JKN-1林以外的型時(shí)，擴(kuò)增效率降低的可能性大。與此相比，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明區(qū)域編號(hào)002附近無論型間還是型內(nèi)都是變異少的區(qū)[表5]<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>域。因此區(qū)域編號(hào)002不僅型間、型內(nèi)的變異少，而且從通過"^殳計(jì)在該區(qū)域的引物進(jìn)^f亍的擴(kuò)增開始早這一點(diǎn)也可證明是最適于HEV的LAMP擴(kuò)增的引物設(shè)定區(qū)域。例4通過使用HEV基因組中的其它保守性高的區(qū)域，進(jìn)行了使用圖4給出的區(qū)域編號(hào)002區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增顯示擴(kuò)增開始的時(shí)間更早的研究。在HEV基因組中，在從圖4所示的5，末端開始至可讀框1的區(qū)域中存在保存性高的區(qū)域。然而，除此之外，在可讀框2區(qū)域的一部分也存在著同等程度的保守性高的區(qū)域(圖5)。當(dāng)分別用這2個(gè)區(qū)域組成LAMP擴(kuò)增體系時(shí)，研究了有關(guān)作為擴(kuò)增效率的擴(kuò)增開始究竟有怎樣不同。(1)可讀框2區(qū)域中的2種引物組的研究在可讀框2中，設(shè)計(jì)區(qū)域編號(hào)004和區(qū)域編號(hào)0052種引物組，比較擴(kuò)增開始。LAMP反應(yīng)溶液組成如下。RT-LAMP法的反應(yīng)溶液組成20mMTris-HC1(pH8.8)lOmMKC18mMMgS0410mM(NH4)2S040.1%吐溫200.8M甜菜堿1.4mMdNTPs。另外，在總反應(yīng)液25jiL中添加1jiL作為酶混合液的BstDNA聚合酶與AMV逆轉(zhuǎn)錄酶混合的酶液，即添加ljiL的榮研化學(xué)社制的RNA擴(kuò)增試劑盒附帶的酶混合液。另外在用同樣總量25jiL進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，按照下面濃度添加各個(gè)引物。引物添加量FIP40pmo1BIP40pmolF35pmo1B35pmo1。另外，在各個(gè)區(qū)域中，加入到反應(yīng)中的引物如下。區(qū)&戈編號(hào)004:序列編號(hào)36、序列編號(hào)37、序列編號(hào)38、序列編號(hào)41、序列編號(hào)42、序列編號(hào)52、序列編號(hào)53、序列編號(hào)55、序列編號(hào)56區(qū)域編號(hào)005:序列編號(hào)57、序列編號(hào)58、序列編號(hào)59、序列編號(hào)60、序列編號(hào)61、序列編號(hào)62、序列編號(hào)63、序列編號(hào)64、序列編號(hào)65、序列編號(hào)66、序列編號(hào)67。為了對(duì)應(yīng)于在保守性高的區(qū)域中也存在少量變異，將不同型引物混合后使用。沒有使用環(huán)引物。至于模板，將使用SmitestEX-R&D(醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所社制)從預(yù)先已知病毒濃度的戊型肝炎病毒陽性患者20例的血清中提取的HEVRNA經(jīng)階段稀釋后使用。反應(yīng)溫度定為60。C，測(cè)定擴(kuò)增開始的時(shí)間。結(jié)果如圖10所示。圖IO的解釋性記號(hào)中的末尾編號(hào)分別表示下面的模板濃度。1:102個(gè)拷貝/反應(yīng)體系2:101個(gè)拷貝/反應(yīng)體系3:10Q個(gè)拷貝/反應(yīng)體系4:作為陰性對(duì)照，添加水。根據(jù)這些結(jié)果確認(rèn)當(dāng)存在的模板的濃度充足時(shí)，區(qū)域編號(hào)005的引物一方雖然擴(kuò)增開始稍早些，但存在著隨著模板減少，區(qū)域005引物的開始大幅度延遲的傾向。而區(qū)域編號(hào)004即使模板濃度減少，但只要存在模板，在l小時(shí)以內(nèi)擴(kuò)增開始，認(rèn)為與區(qū)域005的引物組相比更好。根據(jù)以上結(jié)果，獲得了在可讀框2中用區(qū)域編號(hào)004設(shè)計(jì)的引物組優(yōu)越的結(jié)果。(2)比較使用分別用區(qū)域編號(hào)004與區(qū)域編號(hào)002設(shè)計(jì)的引物組的擴(kuò)增開始。LAMP反應(yīng)溶液組成做成例4的(1)那樣。加入的引物對(duì)于區(qū)域編號(hào)004做成例4(1)那樣。區(qū)域編號(hào)002使用序列編號(hào)23、序列編號(hào)24、序列編號(hào)27、序列編號(hào)31。而作為環(huán)引物，對(duì)于區(qū)域編號(hào)004的反應(yīng)使用序列編號(hào)107、108、109，對(duì)于區(qū)域編號(hào)002的反應(yīng)使用序列編號(hào)104。使用的量做成20pmoL/25nL反應(yīng)體系。作為擴(kuò)增反應(yīng)中的模板，使用用SmitestEX-R&D(醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所社制)從感染了HEV的患者21、患者22、患者24的血清提取的HEVRNA.反應(yīng)溫度設(shè)定為60°C，測(cè)定擴(kuò)增開始的時(shí)間。得到的結(jié)果如圖11所示。圖11中，解釋性記號(hào)中的末尾編號(hào)表示患者編號(hào)。從圖11給出的結(jié)果看到在由各3例患者樣^取的樣品的擴(kuò)增中，如果使用區(qū)域編號(hào)004的引物組，即使引入環(huán)引物，擴(kuò)增開始也需要48分至l個(gè)多小時(shí)的時(shí)間。明白了如果使用另外的區(qū)域編號(hào)002，在20分鐘至30分鐘的短時(shí)間內(nèi)可確認(rèn)擴(kuò)增開始。也就是說，即使是同樣的保守性高的這2個(gè)區(qū)域，擴(kuò)增開始需要的時(shí)間有很大差異，設(shè)計(jì)在區(qū)域編號(hào)002的引物組一方在較早的時(shí)間就能夠開始擴(kuò)增。因此，為了設(shè)計(jì)用于HEV檢測(cè)體系的更好的引物，在LAMP擴(kuò)增中使用從5，末端到可讀框1的區(qū)域可以說是重要的一點(diǎn)。實(shí)際上，在這2個(gè)保守性高的區(qū)域中，在GC含量中確實(shí)看到了大的差別。GC含量越多，看到模板更容易呈現(xiàn)高級(jí)結(jié)構(gòu)，而且高級(jí)結(jié)構(gòu)難以解除的現(xiàn)象。此時(shí)與模板沒有呈現(xiàn)高級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)相比，用于解離成擴(kuò)增需要的單鏈形狀的能量需要的更多。如果使用此次LAMP擴(kuò)增那樣的等溫?cái)U(kuò)增法，由于一旦形成的高級(jí)結(jié)構(gòu)存在原本難以解除的傾向，才莫板為難以呈現(xiàn)高級(jí)結(jié)構(gòu)的序列成了在進(jìn)行好的引物設(shè)計(jì)上的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。因此，可以說即使是同樣程度的高保守性的區(qū)域，選擇區(qū)域編號(hào)002的5，末端區(qū)是個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解有其它優(yōu)點(diǎn)和改進(jìn)。因此，本發(fā)明在廣義的方面不限于本說明書中顯示并描述的特定的詳細(xì)說明和代表性實(shí)施方案。所以，在不偏離后附的權(quán)利要求書和它們的等同物所定義的總的發(fā)明性概念的精神和范圍下可進(jìn)行多種改變。<110>株式會(huì)社東芝<120>用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組<130>〈140〉CN〈141〉〈150〉JP2006-350363<151〉2006-12-26<160>177〈210〉1<211〉18<212>纖<213>引物<220><221>misc—feature<222>(ll)..(ll)<223>n代表a或g.〈400〉1ggcagaccacntatgtgg18<210>2<211>19〈212>DNA<213>引物<220><221>misc—feature〈222>(5)..(5)<223>n代表c或t.<400>2tcgangccatggaggccca19<210>3<211>19〈212>DNA<213〉引物<220><221>misc—feature<222>(6)..(6)<223>n代表c或t.<220><221>misc—feature<222>(9)..(9)<223>n代表a或t.<400>3cagttnatnaaggctcctg19<210>4<211>20<212>DNA〈213>引物<400>4gcattactactgccattgag20〈210>5<211>20<212>腿<213〉引物<220〉<221>misc—feature<222>(8)..(8)<223>n代表a或t.<400>5gcgtcacnactgctattgag20<210〉6<211>19<212>DNA〈213>引物<400>6aggctgctctggctgcggc19<210>7<211>19<212>腿<213>引物<400>7aggcagctctagcagcggc19<210>8〈211〉19<212〉腿<213>引物<400>8gccttggcgaatgctgtgg19<210>9<211>19<212>腿<213>引物<220><221>misc—feature<222>(17)..(17)<223〉n代表g或t.<400>9ctgtggtggttcggccntt19<210>10<211>21<212〉腿<213>引物<400>10caaaccgagatccttattaat21<210>11<211>21<212〉腿〈213〉引物<400>11cagacagagatacttattaac21<210>12<211>21<212>廳<213>引物〈400〉12ttgatgcaaccccggcagttg<210>13<211>21<212>腿<213>引物<220><221>misc—feature<222>(l)..(l)<223>n代表c或t.〈400>13ntgatgcagccccggcagctt<210>14<211>19<212>腿<213>引物FME-0(n-F3〈400〉14tcgatgccatggaggccca<210>15<211>20<212〉靈<213>引物FME-001-F3-l〈400>15gcagaccacgtatgtggtcg21211920<210>16<211〉39<212>DNA〈213>引物FME-001-FIP<400>16ttggccgcagccagagcagttyattaaggctcctggcat<210>17<211〉37<212>DNA<213>引物FME-001-FIP-2<400>17ggccgcagccagagcagttyattaaggctcctggcat37<210>18<211>40<212>DNA<213>引物FME-001-BIP<400〉18aatgctgtggtggttcggccaactgccggggttgcatcaa40<210>19〈211〉40〈212>DNA<213>引物FME-001-BIP-1<400〉19aatgctgtggtggtycggccaactgccggggttgcatcaa40<210>20〈211>40<212>DNA<213>引物FME-001-BIP-2〈400〉20aatgctgtggtggtccggccaactgccggggttgcatcaa40<210>21<211〉20<212>DNA〈213>引物FME-001-B3<400〉21caaagcacctcagggcggaa20<210〉22<211>19〈212>DNA<213>引物FME-001-B3-1〈400〉22ccaaagcacctcagggcgg19<210>23<211><212><213>18DNA引物FME-002-F3<400>23ggcagaccacgtatgtgg<210〉24<211>37<212>DNA<213>引物FME-002-FIP<400〉24caatggcagtagtaatgctcgatgccatggaggccca37〈210〉25<211〉37<212〉DNA<213〉引物FME-002-FIP-l<400>25ctatggcagtagtaatgctcgatgccatggaggccca37<210>26<211>38〈212〉腿〈213>引物FME-002-FIP-2<400>26gctcaatggcagtagtaattcgatgccatggaggccca38<210〉27<211〉38<212>DNA<213>引物FME-002-BIP<400>27aggctgctctggctgcggcaacggccgraccaccacag38<210>28<211>38<212>DNA<213>引物FME-002-BIP-1<400〉28ggctgctctggctgcggccaacggccgraccaccacag38<210〉29<211>38<212>DNA<213>引物FME-002-BIP-2<400>29aggctgctctggctgcggcaacggccgaaccaccacag38<210>30<211>38<212>DNA<213>引物FME-002-BIP-3<400>30aggctgctctggctgcggcaacggccggaccaccacag38<210>31<211>20<212〉腿<213>引物FME-002-B3<400〉31aactgccggggttgcatcaa20<210>32<211>19〈212>職<213〉引物F細(xì)-002-B3-1<400>32caactgccggggttgcatc19<210>33<211>36<212〉DNA<213>引物FME-003-FIP〈400>33tggcagtagtaatgccagtcgatgccatggaggccc36<210>34<211>32<212〉<213>醒引物FME-003-BIP■〉34agcaggctgctctggraccaccacagcatteg<210>35<211〉20<212〉DNA<213〉引物FME-003-B3<400>35accaactgccggggttgcat20<210>36<211>20<212〉醒<213〉引物FME-004-F3<400〉36accggccggycagccgtctg20<210>37<211〉18<212>DNA<213>引物FME-004-F3-1<400〉37cggccggycagccgtctg18<210>38<211>18<212>DNA<213>引物FME-004-F3-2<400>38tcgtgggcggcgcagcgg18<210>39<211>38<212>DNA<213>引物FME-004-FIP-1<400>39taggggattgcgaagggctgtcgtgggcggcgcagcgg38<210>40〈211〉39<212>DNA<213>引物FME-004-FIP-2<400>40taggggattgcgaagggctgggtgccggcrgtggtttct39<210>41<211〉36<212>DNA<213>引物FME-004-FIP-3<400>41ggggagggcgaagggctgtcgtgggcggcgcagcgg36<210>42<211>37<212>醒<213>引物FME-004-FIP-4<400>42ggggagggcgaagggctgggtgccggcrgtggtttct37<210>43<211〉38<212>DNA〈213〉引物FME-004-FIP-5<400>43taggggattgcgaagggctggggcggcgcagcggcggt38<210〉44<211>36〈212>薩<213〉引物FME-004-FIP-6<400〉44ggggagggcgaagggctggggcggcgcagcggcagt36<210〉45<211>36<212〉腿<213>引物FME-004-FIP-7<400>45gggg鄉(xiāng)gcgaagggctggggcggcgcagcggcggt36<210>46〈211>38<212>DNA<213>引物FME-004-FIP-8<400〉46ctgagaatcaacccggtcactcgtgggcggcgcagcgg38<210〉47<211>38<212〉DNA<213>引物FME-004-FIP-9<400>47ctgagaatcaaccctgtcactcgtgggcggcgcagcgg38<210>48<211>38〈212>醒<213>引物FME-004-FIP-10<400>48gaagggctgagaatcaaccctcgtgggcggcgcagcgg38<210>49〈211>37〈212>DNA<213>引物FME-004-FIP-11〈400〉49atataggggagggcgaaggccggcggtggtttctggg37〈210〉50<211>37<212>謹(jǐn)<213〉引物FME-004-FIP-12<400>50atataggggagggcgaaggccggcagtggtttctggg37<210〉51<211>37<212〉歸〈213>引物FME-004-FIP-13<400>51caatagcagtwgtgacgctcgacgccatggaggccca37<210>52<211>39<212>腿<213>引物FME-004-BIP〈400〉52catccaaccaaccccttcgcacacgaggtccagccccgg39<210〉53<211>38〈212>DNA<213〉引物FME-004-BIP-1<400>53catccaaccaaccccttcgcggcgagctccagccccgg38<210>54<211>38<212〉腿<213>引物FME-004-BIP-2<400>54aggcagctctagcagcggcarcggccgaaccaccacag38<210>55〈211〉19<212>DNA<213>引物FME-004-B3〈55tgggactggtcacgccaag19〈210〉56〈211>19<212>DNA<213>引物FME-004-B3-l<400>56tggtcacgccaagcggagc19<210>57〈211〉20<212>腿〈213>引物FME-O05-F3<400〉5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cagggc18<210>130<211>20<212>廳<213>引物HEV104-F3<400>130tgctgctcacggctyatgac20<210>131<211>40〈212〉醒<213>引物HEV104-FIP<400>131gaggcattccacccctcattccgtggcattagytacaagg40〈210〉132<211>38<212>腿<213>引物HEV104-BIP<400〉132gatgcccttacygcagtaatggaggtagcgctggtggc38<210>133<211>20<212〉腿<213〉引物冊(cè)V104-B3<400>133cccttggatatcgcctgggt20<210>134<211>19<212>〈213>脆引物HEV105-F3〈400〉134ttyatgcggtggttagggc<210>135〈211>40<212>腿<213>引物HEV105-FIP〈400>135gcctcattatcatggccwtgggagtgcacctgcttcttgg40<210>136〈211〉40〈212〉腿<213〉引物HEV105-BIP<400〉136gagggytctgaggtcgacccacggcataggtccccgacac40<210〉137<211>18<212>腿<213>引物HEV105-B3〈400〉137ggcctcaagctggcgccc18<210>138<211>19<212>DNA<213〉引物HEV106-F3<400>138cctcccgccagtctatggg19<210>139<211>42<212〉DNA<213>引物HEV106-FIP<400>139cattagatgaaatcctaacctggtcrcatagcctcacttatg42<210>140<211>38<212>DNA<213>引物HEV106-BIP〈400〉140gcgcccctagcgcagcgcgggtgaatctgttatacctg38<210>141<211〉18<212〉DNA〈213〉引物HEV106-B3<400>141gccggtcagcgaatgccg18<210〉142〈211>20〈212〉DNA<213>引物HEV107-F3〈400〉142ggrtcattgtttgagtcaga20<210〉143〈211>39<212>腿<213>引物HEV107-FIP<400>143axgcatgacagaggggaccgactggctggtgaatgcctc39<210>144<211>38<212>DNA<213>引物HEV107-BIP〈400〉144tttccctgaggcgttctacctratagggcgcggggtca38〈210〉145〈211〉18<212>DNA<213>引物HEV107-B3<400>145tagtcgggggccactgca18〈210>146〈211〉20<212>■<213>引物HEV108-F3<400>146gggattgtgcaytatcagtt20<210>147<211>38<212>腿<213〉引物冊(cè)V108-FIP<400>147cacaacatcracatccccctactgccggggtcccgggc38〈210>148〈211>40<212>DNA<213>引物HEV108-BIP<400>148cccacccgggagcttcgcaatggggtgtaaaggccgcaaa40〈210〉149〈211〉18<212>DNA〈213〉引物HEV108-B3〈400〉149tatagtgacacgggccgc18<210>150<211〉20〈212〉腿<213>引物HEV109-F3<400>150accacaattatagcyacggc20<210>151<211>39<212>腿<213>引物HEV109-FIP<400>151gtgtggcgggtragtgcaacccaggggtctcatccagtc39<210〉152<211>41<212>DNA<213>引物HEV109-BIP<400〉152gaagtgtgttattttagatgccaatcacatcwgatatgccg41<210>153〈211〉20<212>腿<213>引物HEV109-B3<400>153ccaccagcgaggaaaaagtt20<210>154<211〉19<212〉腿<213>引物HEV110-F3<400>154ggaaggccgtcctctcaac19<210〉155<211〉39<212〉腿<213>引物HEV110-FIP<400>155cgaacatctgaatgmgctgcttgtggggaggtatggccg39<210〉156<211〉41〈212>DNA<213>引物HEV110-BIP<400>156gtccctagctaggttcatccatataactcacaygtggtggc41<210〉157<211〉20<212〉DNA<213>引物HEV110-B3<400>157accatagcctcaaccagttg20<210>158<211〉20<212〉DNA<213>引物HEV111-F3<400>158tgcatggtatttgaaaatga20<210>159<211>42<212>腿<213>引物HEV111-FIP<400>159cactcctccataaccacacactgaatttgacagtactcagaa42<210>160<211>42<212>DNA<213>引物HEV111-BIP<400>160gtatcayctggttcggtcagcaaaaacctttaagagactcca42<210>161〈211>20<212>DNA〈213>引物HEV111-B3161caggctcaccagaatgcttg20<210>162<211>20<212>DNA〈213>引物HEV112-F3<400>162ggttgattaccgccctattg20〈210〉163〈211〉39<212>DNA<213>引物HEV112-FIP<400〉163gcaaawcgcaccacatcagggctgtatgccggtgtggtg39<210>164<211〉39<212>DNA<213>引物HEV112-BIP<400>164gaactggggccccggccctcgaagraaatcacaaacagc39<210>165〈211〉20<212>DNA<213>引物HEV112-B3<400>165caracctgcgcaacattcgt20<210>166<211〉20<212〉DNA<213>引物HEV113-F3<400>166ccactgaacccwctcttacc20<210>167〈211>40<212>腿〈213〉引物HEV113-FIP〈400>167cccggtactgggcgtaattacttcaggatggcaccaacac40<210>168<211>43<212>腿<213>引物HEV113-BIP<400>168atccgttatcgcccgctggtggccaaaargaaatagaaatage43<210>169<211〉20<212〉腿<213>引物HEV113-B3<400>169catatcaacagargtagggg20〈210>170<211>19<212>DNA<213>引物HEV114-F3<400>170tgcatttcacyggcacgaa19<210〉171〈211>39〈212〉腿<213〉引物HEV114-FIP<400>171ccgagaagcgtatcagcaagttggtgaggtgggycgagg39<210>172<211>41〈212>DNA<213>引物HEV114-BIP<400>172ccgacagaattgatttcgtcgggctgagacgacagggcggg41<210>173〈211〉<212>〈213〉20DNA引物服V114-B3〈400>173agctttacagtcggctcgcc<210>174<211>20〈212>腿〈213>引物HEV115-F3<400>174ttgcccgytcccttgattgg20〈210〉175〈211〉39<212>腿<213>引物HEV115-FIP<400〉175gcgggaggacatagaatgtctactttggacggccgcccc39<210>176〈211>42<212>DNA<213>引物HEV115-BIP<400>176cgcggtaagctgtctttctgtataattataagggtagccagc42<210>177<211>20<212>DNA<213〉引物HEV115-B3〈400>177atttgrtcactagcagttgt20權(quán)利要求1、用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組，其包含F(xiàn)IP引物、F3引物、以及BIP引物和B3引物中的至少一種引物，其中上述FIP引物為包含序列F1c和序列F2的序列F1c-x-F2(其中，x為0以上的整數(shù)個(gè)堿基的核酸，序列F1c為序列F1的互補(bǔ)序列)；上述F3引物為序列F3；上述BIP引物為包含序列B1c和序列B2的序列B1c-y-B2(其中，y為0以上的整數(shù)個(gè)堿基的核酸，序列B1c為序列B1的互補(bǔ)序列)；上述B3引物為序列B3；上述序列F1、序列F2、序列F3、序列B1、序列B2和序列B3為包含在選自序列編號(hào)1～67或其互補(bǔ)序列的至少一個(gè)序列中的連續(xù)序列所示的15個(gè)堿基以上的核酸。2、權(quán)利要求l的核酸引物組，其中上述引物組包含F(xiàn)IP引物、F3引物、BIP引物、B3引物，其中序列F3是用從由序列編號(hào)1~5組成的序列組中選擇的至少l個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，序列F2是用從由序列編號(hào)27組成的序列組中選擇的至少l個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，序列Flc是用從由序列編號(hào)38的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少l個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸、序列Blc是用從由序列4~9組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，序列B2是用從由序列6~11的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，以及序列B3是用從由序列7~13的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，或者當(dāng)序列F3是用從由序列編號(hào)1~5的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中舍有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸時(shí)，序列F2是用從由序列編號(hào)27的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸、序列Flc是用從由序列編號(hào)3~8組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，序列Blc是用從由序列4~9的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，序列B2是用從由序列6~11組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及序列B3是用從由序列7~13組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，其中按照序列F3、序列F2、序列Flc、序列Blc、序列B2和序列B3的順序選擇以上位的序列編號(hào)表示的序列或它們的互補(bǔ)序列。3、權(quán)利要求2的核酸引物組，其還含有環(huán)引物。4、權(quán)利要求l的核酸引物組，其中上述引物組包含F(xiàn)IP引物、F3引物、BIP引物、B3引物，上述F3引物是用從由序列編號(hào)14和序列編號(hào)15組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號(hào)16和序列編號(hào)17組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號(hào)18~20組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號(hào)21和序列編號(hào)22組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，或者上述F3引物是用從由序列編號(hào)14和序列編號(hào)15的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號(hào)16和序列編號(hào)17的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號(hào)18~20的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號(hào)21和序列編號(hào)22的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸。5、LAMP擴(kuò)增用核酸引物組，其中在權(quán)利要求4的核酸引物組中，還包含含有由序列編號(hào)102、103的序列和它們的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少l個(gè)序列的環(huán)引物。6、權(quán)利要求2的核酸引物組，其中上述F3引物是用序列編號(hào)23中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，上迷FIP引物是用從由序列編號(hào)24~26組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號(hào)27~30組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號(hào)31和序列編號(hào)32組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，或者上述F3引物是用序列編號(hào)23的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號(hào)24~26的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號(hào)27~30的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號(hào)31和序列編號(hào)32的互補(bǔ)序列組成的酸。7、權(quán)利要求6的核酸引物組，其還包含含有由序列編號(hào)104、序列編號(hào)105和它們的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列的環(huán)引物。8、權(quán)利要求l的核酸引物組，其中上述F3引物是用序列編號(hào)23中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)4^以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)33中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)34中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)g以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號(hào)35中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，或者上述F3引物是用序列編號(hào)23的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)戚基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)33的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)34的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號(hào)35的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸。9、權(quán)利要求l的核酸引物組，其中上述F3引物是用從由序列編號(hào)36~38組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)戚基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號(hào)3951組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號(hào)52~54組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號(hào)55和序列編號(hào)56組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，或者上述F3引物是用從由序列編號(hào)3638的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)戚基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號(hào)39~51的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號(hào)52~54的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，以及上迷B3引物是用從由從由序列編號(hào)55和序列編號(hào)56的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸。10、LAMP擴(kuò)增用核酸引物組，其中在權(quán)利要求9所述的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組中，還包含含有從由序列編號(hào)106~114的序列和它們的互補(bǔ)序列組成的序列組選擇的至少1個(gè)序列的環(huán)引物。11、權(quán)利要求l的核酸引物組，其中上述F3引物是用從由序列編號(hào)57~59組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號(hào)60~63組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號(hào)64和序列編號(hào)65組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號(hào)66和序列編號(hào)67組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，或者上述F3引物是用從由序列編號(hào)57~59的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號(hào)60~63的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用從由序列編號(hào)64和65的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，以及上述B3引物是用從由序列編號(hào)66和序列編號(hào)67的互補(bǔ)序列組成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核12、LAMP擴(kuò)增用核酸引物組，其中在權(quán)利要求11所述的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組中，還包含含有由從序列編號(hào)115~117的序列和它們的互補(bǔ)序列中選擇的至少l個(gè)序列的環(huán)引物。13、用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的基因型的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組，其包含F(xiàn)IP引物、F3引物、BIP引物和B3引物，其中上述FIP引物是包含序列Flc和序列F2的序列Flc-X-F2，(其中x為0以上的整數(shù)個(gè)堿基的核酸，序列Flc是序列Fl的互補(bǔ)序列)，上述F3引物M列F3，上述BIP引物是含有序列Blc和序列B2的序列Blc-y-B2(其中y是0以上的整數(shù)個(gè)堿基的核酸，序列Blc是序列Bl的互補(bǔ)序列)，上述B3引物M列B3，上述LAMP擴(kuò)增用核酸引物組中含有的全部序列是為了確定戊型肝炎病毒的基因型，使用戊型肝炎病毒基因組的可讀框2的一部分序列設(shè)計(jì)的序列。14、權(quán)利要求13的核酸引物組，其中上述核酸引物組為用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的I型而使用的，上述F3引物是用序列編號(hào)68中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)72中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)g以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)76中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號(hào)81中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)g以上的核酸，或者上述F3引物是用序列編號(hào)68的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)72的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)76的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號(hào)81的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸。15、權(quán)利要求13的核酸引物組，其中上述核酸引物組是用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的II型而使用的，上述F3引物是用序列編號(hào)69中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)73中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)77中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)#以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號(hào)82中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，或者上述F3引物是用序列編號(hào)69的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)戚基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)73的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)77的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號(hào)82的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)戚基以上的核酸。16、權(quán)利要求13的核酸引物組，其中上述核酸引物組是用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的III型而使用的，上述F3引物是用序列編號(hào)70中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸、上述FIP引物是用序列編號(hào)74中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)g以上的核酸、上述BIP引物是用從由序列編號(hào)78和序列編號(hào)79構(gòu)成的序列組中選擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)減基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號(hào)83中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)g以上的核酸，或者上述F3引物是用序列編號(hào)70的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)74的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)戚基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)78和序列編號(hào)79的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號(hào)83的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)戚基以上的核酸。17、權(quán)利要求13所述的用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的IV型的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組，其中上述F3引物是用序列編號(hào)71中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)g以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)75中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)80中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號(hào)84中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)戚基以上的核酸，或者上述F3引物是用序列編號(hào)71的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)75的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)80的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號(hào)84的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸。18、權(quán)利要求13的核酸引物組，其中上述引物組是用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的I型而使用的，上述F3引物是用序列編號(hào)85中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)89中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)94中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)戚基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號(hào)98中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，或者上述F3引物是用序列編號(hào)85的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)89的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)94的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號(hào)98的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸。19、權(quán)利要求13的核酸引物組，其中上述引物組是用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的II型而使用的，上述F3引物是用序列編號(hào)86中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)90中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)4^以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)95中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號(hào)99中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，或者上述F3引物是用序列編號(hào)86的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)卯的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)95的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號(hào)99的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸。20、權(quán)利要求13的核酸引物組，其中上述引物組是用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的III型而使用的，上述F3引物是用序列編號(hào)87中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用從由序列編號(hào)91和序列編號(hào)92組成的序列組中逸擇的至少1個(gè)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)96中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號(hào)100中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，或者上述F3引物是用序列編號(hào)87的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)91和序列編號(hào)92的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)96的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號(hào)100的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸。21、權(quán)利要求13所述的用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的IV型的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組，其中上述F3引物是用序列編號(hào)88中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)93中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)97中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號(hào)101中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，或者上述F3引物是用序列編號(hào)88的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，上述FIP引物是用序列編號(hào)93的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸，上述BIP引物是用序列編號(hào)97的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)堿基以上的核酸，以及上述B3引物是用序列編號(hào)101的互補(bǔ)序列中含有的連續(xù)序列表示的15個(gè)威基以上的核酸。22、用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的方法，其包括使用從由權(quán)利要求1所迷的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組組成的引物組中選擇的至少1個(gè)引物組，在可獲得適當(dāng)擴(kuò)增的條件下進(jìn)行LAMP反應(yīng)，實(shí)施樣本樣品的核酸擴(kuò)增反應(yīng)；以及在上述擴(kuò)增反應(yīng)后或反應(yīng)過程中檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。23、權(quán)利要求22所述的方法，其中對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)是通過測(cè)定LAMP反應(yīng)溶液的法度而進(jìn)行的。24、用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的基因型的方法，其包括使用從由權(quán)利要求13所述的LAMP擴(kuò)增用核酸引物組組成的引物組中選擇的至少1個(gè)引物組，在可獲得適當(dāng)擴(kuò)增的條件下進(jìn)行LAMP反應(yīng)，實(shí)施樣本樣品的核酸擴(kuò)增反應(yīng)；在上述擴(kuò)增反應(yīng)后或反應(yīng)過程中檢測(cè)引物組特異的擴(kuò)增產(chǎn)物；以及根據(jù)上述引物組特異性確定戊型肝炎病毒的基因型。25、權(quán)利要求24所述的檢測(cè)戊型肝炎病毒的方法，其中對(duì)所迷擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)是通過測(cè)定LAMP反應(yīng)溶液的濁度而進(jìn)行的。全文摘要用于檢測(cè)戊型肝炎病毒的LAMP擴(kuò)增用核酸引物，上述LAMP擴(kuò)增用核酸引物包含F(xiàn)IP引物、F3引物、BIP引物或B3引物，從由序列編號(hào)1～67或其互補(bǔ)序列構(gòu)成的序列組中至少選擇一個(gè)，使用選擇序列中的15個(gè)堿基以上的連續(xù)序列，作為包含序列F1、序列F2、序列F3、序列B1、序列B2和序列B3的任一個(gè)LAMP引物的構(gòu)成單位的核酸引物。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101210269SQ200710301190公開日2008年7月2日申請(qǐng)日期2007年12月26日優(yōu)先權(quán)日2006年12月26日發(fā)明者三代俊治,太田裕彥,安倍夏生,橋本美智惠,高橋和明申請(qǐng)人:株式會(huì)社東芝