本發(fā)明屬于分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于恒溫核酸擴(kuò)增快速可視化檢測的裝置。

背景技術(shù)：

隨著人們對健康、環(huán)境的重視程度越來越高，與生命健康相密切相關(guān)各項的病原體檢測、產(chǎn)前診斷、遺傳病診斷、食品安全檢測變得越來越重要，而目前廣泛應(yīng)用的PCR等技術(shù)雖然可以實現(xiàn)高靈敏度檢測，但是他們往往需要精密昂貴的儀器，復(fù)雜的操作以及特殊的實驗室條件。這些限制使他們在現(xiàn)場、實時監(jiān)測、社區(qū)應(yīng)用方面受到限制，而核酸可視化診斷方法恰可以克服以上問題，一時成為分子診斷技術(shù)研究熱點。恒溫核酸擴(kuò)增結(jié)合測流層析試紙條檢測技術(shù)可以實現(xiàn)快速、靈敏、高效、可視化核酸檢測，一度被視作替代PCR的極佳選擇。但是，至今他們也未能被臨床廣泛接納應(yīng)用，其中最重要的原因就是他為非密閉體系，當(dāng)對核酸進(jìn)行數(shù)量級擴(kuò)增后，會對空氣造成非常嚴(yán)重的核酸污染，導(dǎo)致后續(xù)樣本檢驗的假陽性問題。對此，研究者也提出了部分解決方案，例如向LAMP檢測體系中加入鈣黃綠素等封閉劑，但是經(jīng)驗證仍然無法徹底解決污染問題。因此建立一種更加有效的方法，實現(xiàn)恒溫核酸擴(kuò)增可視化診斷技術(shù)的應(yīng)用，成為了亟待解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于核酸擴(kuò)增快速可視化檢測的便攜式裝置。

一種用于恒溫核酸快速可視化檢測的裝置，包括內(nèi)部恒溫核酸擴(kuò)增-側(cè)流層析檢測體系1和外部密閉體系2；

所述恒溫核酸擴(kuò)增-側(cè)流層析檢測體系1包括兩個樣品容器3、載物膠塞4、側(cè)流層析試紙條5和匯流斜面6；樣品容器3為常規(guī)應(yīng)用的加樣槍尖，固定在載物膠塞4內(nèi)，側(cè)流層析試紙條5位于載物膠塞4下方，樣品容器3內(nèi)的擴(kuò)增液滴于匯流斜面6后，在匯流斜面6的匯集作用下擴(kuò)增液與側(cè)流層析試紙條5接觸顯色；

所述外部密閉體系2包括透明外殼7、封閉膠塞8和封閉開關(guān)9，整個恒溫核酸擴(kuò)增-側(cè)流層析檢測體系1位于透明外殼7內(nèi)，并由封閉膠塞8和封閉開關(guān)9進(jìn)行裝置的封閉，封閉開關(guān)9可按需要打開或關(guān)閉。

所述樣品容器3內(nèi)進(jìn)行的樣品擴(kuò)增采用恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，此技術(shù)可以在恒定溫度下對核酸實現(xiàn)數(shù)量級擴(kuò)增，因此它不需要依賴電源和昂貴的溫度控制儀器，可以根據(jù)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)需求，利用蓄電池加熱裝置、簡易化學(xué)發(fā)熱裝置等維持反應(yīng)，甚至能于常溫下進(jìn)行。

所述側(cè)流層析試紙條5快速定性檢測和鑒定核酸擴(kuò)增產(chǎn)物，可檢測不低于10ng的DNA，并且可以直接通過肉眼觀察檢測結(jié)果，如果質(zhì)控線和檢測線均出現(xiàn)則結(jié)果為陽性，如果只出現(xiàn)質(zhì)控帶則結(jié)果為陰性。

所述透明外殼7為PC2805材料，厚2.5cm，透明度好，強(qiáng)度高，重量輕，耐高溫；載物膠塞4及封閉膠塞8為硅膠silicone材料。

上述用于恒溫核酸快速可視化檢測的裝置的使用方法，將樣品擴(kuò)增液及檢測稀釋液分別加入兩個樣品容器3內(nèi)，塞緊封閉膠塞8，關(guān)閉封閉開關(guān)9，使裝置保持密閉，然后放入相應(yīng)恒溫環(huán)境內(nèi)孵育，使樣品擴(kuò)增液進(jìn)行反應(yīng)，擴(kuò)增結(jié)束后下壓封閉膠塞，使裝置內(nèi)部氣壓增加，在空氣壓力下樣品擴(kuò)增液及檢測稀釋液同時從樣品容器3流出，落于下方的匯流斜面6，樣品擴(kuò)增液及檢測稀釋液混合匯聚于匯流斜面6底端，并與側(cè)流層析試紙條5接觸反應(yīng)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明用于恒溫核酸快速可視化檢測的裝置，能夠在不產(chǎn)生核酸污染的前提下，實現(xiàn)高靈敏度恒溫核酸擴(kuò)增可視化檢測，核酸的快速、準(zhǔn)確、高效、可視化檢測，將在疾病診斷、流行病學(xué)監(jiān)測、產(chǎn)前篩查及食品安全檢測等方面發(fā)揮重要作用；該檢測裝備先應(yīng)用恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)用對靶核酸進(jìn)行數(shù)量級擴(kuò)增，再應(yīng)用側(cè)流層析試紙條進(jìn)行檢測，目前恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)已有多種方法，他們中凡是可以與側(cè)流層析試紙檢測結(jié)合應(yīng)用的均可以用于此檢測設(shè)備，例如LAMP、重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)及解旋酶依賴性擴(kuò)增(HDA)等；該檢測裝備將整個檢測體系封閉于一個9cm×3.4cm的透明小盒內(nèi)，不需要依賴電源和昂貴的溫度控制儀器，可以根據(jù)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)需求，利用蓄電池加熱裝置、簡易化學(xué)發(fā)熱裝置等維持反應(yīng)，甚至能于常溫下進(jìn)行，因此任何規(guī)模的實驗室、社區(qū)門診、野外環(huán)境均可應(yīng)用；該裝備可以實現(xiàn)核酸擴(kuò)增與試紙條檢測的一體化、密閉操作，我們只需在前期加樣時打開設(shè)備，之后全程密閉，避免了核酸污染導(dǎo)致的假陽性問題，克服了目前核酸可視化檢測應(yīng)用中面臨的最大阻礙；該裝備將恒溫核酸擴(kuò)增與試紙條檢測過程結(jié)合為一體，使操作簡化快速，結(jié)果識別簡單，只需對操作人員進(jìn)行簡單的培訓(xùn)即可，而無需經(jīng)驗豐富的工作人員；由于恒溫擴(kuò)增與側(cè)流層析試紙條檢測都具有快速、高效、準(zhǔn)確的特點，因此整個操作過程耗時短；這樣一種檢測體系，對于社區(qū)應(yīng)用、疫情篩查及軍隊外訓(xùn)等都將有重要的應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例的裝置整體示意圖；

圖2為本發(fā)明實施例的裝置內(nèi)部恒溫核酸擴(kuò)增-側(cè)流層析檢測體系示意圖；

圖3為本發(fā)明實施例的裝置外部密閉體系示意圖；

圖4為用本發(fā)明結(jié)合重組酶聚合酶恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測結(jié)核桿菌的結(jié)果示意圖；

圖中，1-恒溫核酸擴(kuò)增-側(cè)流層析檢測體系，2-外部密閉體系，3-樣品容器，4-載物膠塞，5-側(cè)流層析試紙條，6-匯流斜面，7-透明外殼，8-封閉膠塞，9-封閉開關(guān)。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明的具體實施方式進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實施方式的限制。

本實施例提供了一種用于恒溫核酸擴(kuò)增快速可視化檢測的便攜式裝置，如圖1所示，包括內(nèi)部恒溫核酸擴(kuò)增-側(cè)流層析檢測體系1和外部密閉體系2。

外部密閉體系2如圖3所示，整個恒溫核酸擴(kuò)增-側(cè)流層析檢測體系1位于透明外殼7內(nèi)，并由封閉膠塞8和封閉開關(guān)9進(jìn)行裝置的封閉，封閉開關(guān)9可按需要打開或關(guān)閉。

恒溫核酸擴(kuò)增-側(cè)流層析檢測體系1如圖2所示，樣品容器3固定在載物膠塞4內(nèi)，側(cè)流層析試紙條5位于載物膠塞4下方，將恒溫核酸擴(kuò)增體系(酶、引物、探針、樣本等)及側(cè)流層析檢測稀釋液分別加入兩個樣品容器3中。下壓封閉膠塞8使裝置內(nèi)氣壓升高，樣品容器3中的兩種液體滴于匯流斜面6后，在斜面的作用下進(jìn)行匯集混合，并與側(cè)流層析試紙條5接觸檢測。

樣品容器3中加入相應(yīng)液體試劑后，在內(nèi)部氣壓不變的情況下能夠保持液體穩(wěn)定不滴漏。在樣品容器3、載物膠塞4及反應(yīng)試劑的封閉作用下，使設(shè)備的上下兩端空氣隔離。然后塞緊封閉膠塞8，關(guān)閉封閉開關(guān)9，使裝置整體保持密閉。將密閉好的裝置放入相應(yīng)溫度環(huán)境內(nèi)，維持恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)，適當(dāng)時間后取出。下壓封閉膠塞8，使裝置上端氣壓快速增加，在空氣壓力作用下，樣品擴(kuò)增液及檢測稀釋液同時從樣品容器3流出，落于下方的匯流斜面6，并與側(cè)流層析試紙條5接觸反應(yīng)。

目前恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)已有多種方法，凡是可以與側(cè)流層析試紙檢測結(jié)合應(yīng)用的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)均可以應(yīng)用于此檢測設(shè)備，例如LAMP、重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)及解旋酶依賴性擴(kuò)增(HDA)等。此處，我們采用重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA)結(jié)合此發(fā)明裝置對結(jié)核桿菌進(jìn)行檢測：

1.引物及探針設(shè)計：

Primer A:GTAAAACGAACTCTGGAATTGATCGACGGC；

Primer B:5’-/biotion/-CTATACGTGTTCCCCATCGAGCAAATTTTA；

Probe:5’-/FAM/-CATTCCCATGCTGCTGTGGATCAACGGGGT/THF/TACGACACGGTCCGC/C3-spacer/-3’

2.加樣：將50ulRPA反應(yīng)體系(酶、引物、探針、樣本等)加入一個樣品容器3中，另一容器中加入側(cè)流層析檢測稀釋液50ul,塞緊封閉膠塞8，關(guān)閉封閉開關(guān)9，使裝置整體保持密閉，并放入39℃水浴箱中，孵育10-15分鐘后取出。下壓封閉膠塞8，在空氣壓力作用下，RPA擴(kuò)增液與側(cè)流層析分析稀釋液同時從兩個樣品容器3中流出，落于下方的匯流斜面6，并與側(cè)流層析試紙條5接觸反應(yīng)、顯色。五分鐘后，觀察試紙條條帶，判斷檢測結(jié)果。

3.結(jié)果判讀：結(jié)果為陽性，試紙條可見兩條線；結(jié)果為陰性，試紙條上只可見一條質(zhì)控線。

4.從圖4的結(jié)果分析中可得出，運(yùn)用重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA)結(jié)合此發(fā)明裝置方法對含結(jié)核桿菌核酸樣本及陰性對照樣本進(jìn)行檢測，3個陽性標(biāo)本均顯示陽性結(jié)果(同時出現(xiàn)質(zhì)控線和檢測線)，而陰性對照標(biāo)本為陰性結(jié)果(僅出現(xiàn)質(zhì)控線)。

以上公開的僅為本發(fā)明的具體實施例，但是，本發(fā)明并非局限于此，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員能思之的變化都應(yīng)落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。