本發(fā)明涉及一種核酸提取、擴增及檢測集成裝置及其制造方法和檢測方法。

背景技術(shù)：

核酸作為一種分子標(biāo)志物已被廣泛的用于疾病診斷，食品安全檢測和環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域?；诤怂岬脑\斷一般包括核酸的提取、擴增和檢測三個部分。傳統(tǒng)的方法主要在實驗室依賴于大型儀器和專業(yè)的技術(shù)人員，存在成本昂貴，耗時耗力等缺點。而在傳染性疾病頻發(fā)、食品安全問題突出、環(huán)境污染嚴(yán)重的偏遠地區(qū)，這些傳統(tǒng)的方法并不適用，因此嚴(yán)重耽誤了該地區(qū)人們對疾病的診斷與治療、食品的檢測和環(huán)境的監(jiān)控與治理。

近年來，隨著紙基微流體技術(shù)的發(fā)展，低成本、微型化、攜帶方便、操作簡單的紙基即時檢測裝置日漸受到人們的關(guān)注。目前，市面上已有紙基的提取方法(如：Whatman公司發(fā)明的紙上提取核酸的方法(如：FTA卡等))和紙基的核酸擴增與試紙檢測方法(如：BioHelix發(fā)明的the BESt cassette產(chǎn)品，包括擴增槽和檢測室)。它們都需要進行復(fù)雜的提取和擴增操作，還要依賴于實驗室的大型儀器(如：熱循環(huán)儀，冰箱)，仍然存在不便于攜帶、操作復(fù)雜、成本昂貴等缺陷。不能實現(xiàn)快速、簡單、便攜的核酸檢測。仍然不適用于資源匱乏地區(qū)進行分子診斷。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有紙基核酸提取、擴增和檢測方法存在的缺陷，提供一種核酸提取、擴增及檢測集成裝置及其制造方法和檢測方法，該裝置成本低廉、操作簡單，攜帶方便，且檢測時間短，無需專業(yè)技術(shù)人員進行操作，效率高，適用范圍廣。

為達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

核酸提取、擴增及檢測集成裝置，包括上下扣合的上蓋和基座，基座上設(shè)置有紙基核酸提取模塊、紙基核酸等溫擴增模塊和試紙檢測模塊；上蓋上開設(shè)有用于滴加樣品的進樣孔、控制按鈕以及試紙結(jié)果觀察窗；紙基核酸等溫擴增模塊上設(shè)置有能夠移動的U型夾，上蓋的側(cè)面開設(shè)有用于固定U型夾的固定孔；U型夾包括上下兩層緊密疊加在一起的能夠?qū)岬慕饘倨?，其中一端為拖動端，另一端為紙片區(qū)；紙片區(qū)的上層鑲嵌有凍干的依賴解旋酶的等溫擴增試劑的紙片，下層的相應(yīng)位置上鑲嵌有核酸吸附紙，拖動端由固定孔伸出；

核酸提取時，紙基核酸提取模塊上的紙基裂解通道的末端與核酸吸附紙相接觸，且紙片不與核酸吸附紙相接觸；

等溫擴增時，紙基核酸等溫擴增模塊上的加熱片與核酸吸附紙和紙片相接觸，核酸吸附紙和紙片上設(shè)置有起密封作用避免核酸擴增時氣溶膠污染的PMMA板；

檢測時，核酸吸附紙位于試紙檢測模塊上的試紙條和層析液存儲槽之間，并與二者相接觸。

本發(fā)明進一步的改進在于：

所述紙基核酸提取模塊包括清洗液儲液池和裂解液儲液池，清洗液儲液池的下端與紙基清洗通道的入口相連，裂解液儲液池的下端與紙基裂解通道的入口相連；紙基裂解通道的下方設(shè)置吸水墊；紙基清洗通道的末端設(shè)置紙基閥門，在清洗時，紙基閥門與紙基裂解通道相接觸，將紙基清洗通道和紙基裂解通道相連通。

所述清洗液儲液池和裂解液儲液池內(nèi)均設(shè)置有密封橡膠和海綿，海綿位于密封橡膠的下方。

所述紙基核酸等溫擴增模塊還包括與加熱片相連的電源，加熱片采用陶瓷加熱片。

所述試紙檢測模塊包括側(cè)流層析試紙條和層析液存儲槽，層析液存儲槽位于側(cè)流層析紙條的末端下方；側(cè)流層析紙條與上蓋上的試紙結(jié)果觀察窗的位置相對應(yīng)。

所述側(cè)流層析紙條包括依次層疊設(shè)置的背膠板、樣品墊、結(jié)合墊以及醋酸纖維素膜；層析液存儲槽內(nèi)放置有用于存儲層析液的海綿。

一種核酸提取、擴增及檢測集成裝置的制備方法，包括以下步驟：

1)采用3D打印技術(shù)制備上蓋和基座；

2)用激光切割機制備海綿、橡膠密封墊、PMMA板和絕緣疏水紙；

3)將儲液海綿分別浸泡于相對應(yīng)的液體中使海綿充滿液體；

4)根據(jù)紙基模塊的尺寸，用激光切割機制備相應(yīng)尺寸的紙基通道，用打孔器制備紙基通道和核酸吸附紙；

5)用線切割機床制備U型夾的銅片；

6)用冷凍干燥的方法制備依賴解旋酶的等溫擴增試劑紙片；

7)用納米金標(biāo)記檢測探針，組裝粘貼試紙，用切割機制備側(cè)流程析試紙條；

8)將組成紙基核酸提取模塊、紙基核酸等溫擴增模塊和試紙檢測模塊的儲液海綿、密封橡膠、紙基通道、陶瓷加熱片、鈕扣電池、絕緣疏水紙、PMMA板、U型夾、側(cè)流程析試紙條和層析液儲存海綿分別安裝于基座上；

9)將上蓋和基座扣合組裝形成紙基核酸提取、擴增及檢測集成裝置。

一種核酸提取、擴增及檢測方法，包括以下步驟：

1)將樣品滴加在進樣孔處；

2)按下上蓋的控制按鈕，等待2分鐘后，提取完成；

3)用手拖動U型夾到擴增指示線位置處，此時U型夾上的紙片區(qū)與加熱片緊密接觸，緊接著抽掉電池槽處的絕緣紙，開始核酸擴增，等待60分鐘后，擴增完成；

4)再次拖動U型夾到檢測指示線位置處，此時U型夾上的紙片區(qū)使分隔的層析液存儲槽中的海綿和試紙條的樣品墊相連接，樣品靠毛細作用力層析到試紙條上，等待15分鐘后，檢測完成；

5)通過試紙結(jié)果觀察窗觀察檢測結(jié)果，對照區(qū)域和檢測區(qū)域均為紅色時，判定為陽性結(jié)果，對照區(qū)域為紅色時，判定結(jié)果為陰性。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明具有無需額外儀器、成本低廉、攜帶方便、操作簡單、快速等優(yōu)點。1)利用計算機軟件設(shè)計裝置結(jié)構(gòu)，將核酸提取、擴增及檢測集成于一個裝置內(nèi)，實現(xiàn)了樣品進到結(jié)果出的一體化檢測；2)此裝置只需簡單的四部操作：加樣→按壓提取控制按鈕→拖動U型夾到擴增指示線→拖動U型夾到試紙指示線，整個檢測只需要77分鐘(傳統(tǒng)實驗室檢測需要4-5小時)，無需專業(yè)技術(shù)人員進行操作，解決了操作簡單、快速的問題。3)紙基提取模塊和試紙檢測模塊與海綿結(jié)合解決了提取液和層析液的存儲問題。同時，采用凍干技術(shù)將tHDA擴增試劑存儲在紙上，無需低溫冰箱。另外，擴增加熱采用陶瓷加熱片依靠紐扣電池提供電源，無需大型的加熱裝置。而紙基模塊中，液體靠毛細作用力往前流動，無需外接泵，因此以上方法解決了攜帶方便的問題。4)此裝置所選用的部件和化學(xué)反應(yīng)試劑成本低廉，解決了降低成本的問題。

【附圖說明】

圖1為本發(fā)明所述紙基核酸提取、擴增及檢測集成裝置上蓋結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明所述紙基核酸提取、擴增及檢測集成裝置基座結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3為本發(fā)明所述紙基核酸提取、擴增及檢測集成裝置集成模塊(紙基提取模塊、紙基核酸擴增模塊和試紙檢測模塊)結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4為本發(fā)明所述紙基核酸提取、擴增及檢測集成裝置基座及其集成模塊的示意圖；

圖5為利用本發(fā)明檢測不同濃度沙門氏菌的檢測結(jié)果。

其中，1-進樣孔；2-控制按鈕；3-固定孔；4-試紙結(jié)果觀察窗；5-清洗液儲液池；6-裂解液儲液池；7-儲液孔；8-紙基裂解通道；9-紙基清洗通道；10-吸水墊；11-核酸吸附紙；12-紙片；13-加熱片；14-電源；15-PMMA板；16-U型夾；17-層析液存儲槽；18-試紙條。

【具體實施方式】

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步詳細描述：

參見圖1-4，本發(fā)明紙基核酸提取、擴增和檢測集成裝置，包括采用3D打印技術(shù)打印的光固化樹脂材質(zhì)的上蓋、基座和基座上的集成模塊，上蓋是扣壓在基座上。上蓋包括進樣孔1、固定在上蓋上的控制按鈕2、固定“U”型夾的孔3和試紙結(jié)果觀察窗4?；霞赡K包括紙基核酸提取模塊、紙基核酸等溫擴增模塊和測試紙檢測模塊。

紙基核酸提取模塊包括直徑為12mm的清洗液儲液池5和直徑為9mm的裂解液儲液池6，清洗液儲液池5和裂解液儲液池6均由海綿和密封橡膠組成，海綿在下，密封橡膠在上；其中每個儲液池與紙通道相連的位置開有尺寸為5mm×2mm的儲液孔7，儲液孔7分別與紙基裂解通道和紙基清洗通道相聯(lián)；裂解通道8一端與裂解液儲液池6相連，一端與核酸吸附紙相連，清洗通道9一端與清洗液儲液池5相連，另一端由紙基閥門組成，與紙基裂解通道相連實現(xiàn)多步操作；核酸吸附紙11被固定在U型夾的下層與紙基裂解通道的一端相連，而U型夾的上層通過一個小梁被隔在上面，在核酸提取過程中不與核酸吸附紙相接處；吸水墊10在核酸吸附紙下面。

紙基裂解通道8和紙基清洗通道9的材質(zhì)選用普通的濾紙，其進樣區(qū)采用直徑為5mm～8mm的濾紙，紙基裂解通道8的尺寸為25mm×5mm，紙基清洗通道9的尺寸為10mm×5mm。核酸吸附紙選用玻璃纖維，其尺寸為5mm×7mm，吸水墊選用吸水紙，其尺寸為30mm×20mm。

紙基核酸等溫擴增模塊包括超薄的陶瓷加熱片、鑲嵌有紙的可移動U型夾16、提供電源14的電池和覆蓋在加熱片上的塑料板。其中U型夾材質(zhì)為二層可導(dǎo)熱的金屬片緊密疊加在一起，其尺寸為8mm×100mm。其中距離U型夾10mm處開有5mm×7mm的小口，上層鑲嵌有凍干的依賴解旋酶的等溫擴增tHDA試劑的紙片12尺寸為5mm×7mm，下層相應(yīng)位置鑲嵌有核酸吸附紙11尺寸為5mm×7mm，同時，上層金屬片上有兩條黑色的指示線，分別為距離拖動端47mm的擴增指示線和距離拖動端62mm的檢測指示線；提供電源的電池選用直徑為12mm的3V鈕扣電池，在未進行擴增時，在基座上安放電池槽底部開有一5mm×2mm的小口用于放置絕緣紙來阻斷電源與電線之間的導(dǎo)通，覆蓋在加熱片上的塑料板選用尺寸為25mm×30mm的PMMA板15，此板是為了避免核酸擴增時的氣溶膠污染。

試紙檢測模塊包括側(cè)流程析試紙條18和層析液儲存槽17。其側(cè)流程析試紙由有尺寸為60mm×3mm的背膠板、15mm×3mm的樣品墊、10mm×3mm的結(jié)合墊及20mm×3mm的醋酸纖維素膜層疊構(gòu)成，吸水紙為尺寸為6mm×14mm的“T”型，層析液存儲槽放置了尺寸為10mm×5mm×5mm的海綿用來存儲層析液。

本發(fā)明還提供了一種紙基核酸提取、擴增及檢測的集成裝置的制備方法，包括以下步驟：

(1)利用計算機軟件設(shè)計上蓋和基座的結(jié)構(gòu)，將設(shè)計好的上蓋和基座結(jié)構(gòu)導(dǎo)入3D打印軟件中，用3D打印機分別打印。

(2)用激光切割機制備相應(yīng)尺寸的海綿、橡膠密封墊、PMMA板和絕緣疏水紙；

(3)將儲液海綿分別浸泡于相對應(yīng)的液體中使海綿充滿液體；

(4)根據(jù)紙基模塊的尺寸，用激光切割機制備相應(yīng)尺寸的紙基通道，用打孔器制備進樣區(qū)濾紙片和核酸吸附區(qū)玻璃纖維片。

(5)用線切割機床制備U型夾的銅片。

(6)用冷凍干燥的方法制備依賴解旋酶的等溫擴增tHDA試劑紙片。

(7)用納米金標(biāo)記檢測探針，組裝粘貼試紙相關(guān)成分，用切割機制備側(cè)流程析試紙條。

(8)將紙基核酸提取模塊中的相應(yīng)部件儲液海綿，密封橡膠，紙基通道，紙基核酸擴增模塊的相應(yīng)部件陶瓷加熱片，鈕扣電池，絕緣疏水紙，PMMA板，鑲嵌有核酸吸附紙和凍干的依賴解旋酶的等溫擴增tHDA試劑的紙片的U型夾和試紙檢測模塊的相應(yīng)部件側(cè)流程析試紙條和層析液儲存海綿分別放置于相應(yīng)的位置。

(9)將集成裝置中的每個部件分別粘貼于基座的相應(yīng)位置；

(10)將上蓋和基座組裝形成紙基核酸提取、擴增及檢測集成裝置。

本發(fā)明還提供了一種采用上述集成裝置進行檢測的方法，包括以下步驟：

(1)將樣品滴加在進樣孔1處。

(2)按下上蓋的控制按鈕2，等待2分鐘后，提取完成。

(3)用手拖動U型夾到擴增指示線位置處，此時U型夾上的紙片與加熱片緊密接觸，緊接著抽掉電池槽處的絕緣紙，開始核酸擴增，等待60分鐘后，擴增完成。

(4)再次拖動U型夾到檢測指示線位置處，此時U型夾上的紙片區(qū)使分隔的層析液海綿和試紙條的樣品墊相連接，樣品靠毛細作用力層析到試紙條上，等待15分鐘后，檢測完成。

(5)通過試紙結(jié)果觀察窗觀察檢測結(jié)果，對照區(qū)域和檢測區(qū)域均為紅色時，判定為陽性結(jié)果，對照區(qū)域為紅色時，判定結(jié)果為陰性。

本發(fā)明樣本的提取流程：把樣品從進樣孔滴加進去，按下控制按鈕，這樣控制按鈕會和密封圈一起擠壓海綿，使海綿中的液體從與紙通道相連的小孔處流出，通過毛細作用力一直到達核酸捕獲區(qū)再到吸水墊上。等待2分鐘后，提取工作完成。然后，用手拖動U型夾到擴增指示線，同時，抽掉電池槽背后的絕緣紙，等待60分鐘后，擴增完成。緊接著，再次拖動U型夾到檢測指示線，靠毛細作用力進行檢測，15分鐘后在試紙結(jié)果觀察窗觀察檢測結(jié)果。

為了驗證此裝置的可行性，采用不同濃度的沙門氏菌樣品進行提取、擴增和檢測，結(jié)果見圖5，濃度為10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10¹(CFU/ml)的樣本對照區(qū)域和檢測區(qū)域均為紅色，判定為陽性結(jié)果，10⁰和NC對照區(qū)域為紅色時，檢測區(qū)域無顏色，判定結(jié)果為陰性。

綜上所述，本發(fā)明裝置在使用時整個過程需要大約70min、操作簡單僅需4步(加樣→按壓提取控制按鈕→拖動U型夾到擴增指示線→拖動U型夾到試紙指示線)、便于攜帶。與現(xiàn)有檢測方法相比，此裝置解決了儲液問題，降低了成本和減少復(fù)雜多步操作，不需要使用大型的儀器和專業(yè)的技術(shù)人員就可以完成。本發(fā)明在未來可用于資源匱乏地區(qū)以實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測。

以上內(nèi)容僅為說明本發(fā)明的技術(shù)思想，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍，凡是按照本發(fā)明提出的技術(shù)思想，在技術(shù)方案基礎(chǔ)上所做的任何改動，均落入本發(fā)明權(quán)利要求書的保護范圍之內(nèi)。