本發(fā)明涉及基因測序領(lǐng)域，尤其是涉及一種基因測序芯片、基因測序設(shè)備及基因測序方法。

背景技術(shù)：

基因測序技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中最常用的技術(shù)，從1977第一代基因測序發(fā)展至今，基因測序技術(shù)已經(jīng)取得了相當(dāng)大的發(fā)展，主要包括第一代sanger測序技術(shù)、第二代高通量測序技術(shù)、第三代單分子測序技術(shù)和第四代納米孔測序技術(shù)。而目前市場主流的測序技術(shù)仍以第二代高通量測序?yàn)橹鳌?/p>

第二代高通量測序技術(shù)主要包括Illumina的邊合成邊測序技術(shù)、Thermo Fisher的離子半導(dǎo)體測序技術(shù)、連接法測序技術(shù)和Roche的焦磷酸測序技術(shù)等。其中，離子半導(dǎo)體基因測序方法包括以下步驟：首先進(jìn)行文庫制備，利用噴霧法將待測DNA打斷成小鏈，并在小鏈的兩端加上不同的接頭，構(gòu)建單鏈DNA文庫；其次進(jìn)行乳液擴(kuò)增，將這些單鏈DNA結(jié)合在水油包被的直徑約20um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。經(jīng)過擴(kuò)增，每個(gè)小鏈都將被擴(kuò)增約100萬倍，從而達(dá)到下一步測序所要求的DNA量。最后進(jìn)行測序，將磁珠放入微孔中，測序時(shí)一個(gè)個(gè)核苷酸分子連續(xù)流過芯片微孔，如果脫氧核苷酸與特定微孔中的DNA分子互補(bǔ)，則該脫氧核苷酸被合成到DNA分子中，并且釋放氫離子，該孔溶液的PH值發(fā)生變化。離子傳感器檢測到PH值變化后，即刻便從化學(xué)信息轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)字電子信息。

然而，上述檢測方法需要在微孔下方制作離子傳感器，離子傳感器采用CMOS工藝，包括2個(gè)金屬-氧化物半導(dǎo)體場效應(yīng)晶體管(Metal-Oxide-Semiconductor Field-Effect Transistor，MOSFET)和1個(gè)離子敏場效晶體管(Ion-Sensitive Field-Effect Transistor，ISFET)?，F(xiàn)有的基因測序芯片在制造過程中需要進(jìn)行多次掩膜、曝光、顯影和刻蝕，制造工藝復(fù)雜，成本較高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的技術(shù)問題

為了解決現(xiàn)有技術(shù)的上述問題，本發(fā)明提供一種基因測序芯片，該基因測序芯片不需要任何場效應(yīng)管，制造工藝簡單，能夠大大降低制造難度和成本。本發(fā)明還涉及包括該基因測序芯片的基因測序設(shè)備。

此外，本發(fā)明還提供一種基因測序方法，該基因測序方法應(yīng)用本發(fā)明的基因測序芯片，能夠簡單方便地進(jìn)行基因測序。

發(fā)明的技術(shù)方案

本發(fā)明提供一種基因測序芯片，包括基板，形成在所述基板上的電極，與所述電極連接的信號引線，所述信號引線用于向所述電極發(fā)送信號并將所述電極感測的信號輸出至信號發(fā)送端，設(shè)置在形成有所述電極和所述信號引線的所述基板上的第一絕緣層，在所述第一絕緣層上與所述電極對應(yīng)的位置設(shè)置有微孔，所述微孔設(shè)置在所述電極的遠(yuǎn)離所述基板的一側(cè)，所述微孔與所述電極之間通過第二絕緣層間隔開。

優(yōu)選地，所述微孔中設(shè)置有與所述第二絕緣層接觸的離子敏感膜，所述離子敏感膜可使所述電極感測的信號變化更加明顯。

優(yōu)選地，所述離子敏感膜由四氮化三硅制成，由四氮化三硅制成的離子敏感膜對氫離子更加敏感。

優(yōu)選地，所述第二絕緣層形成為整層，所述第一絕緣層設(shè)置于所述第二絕緣層上。

優(yōu)選地，所述第二絕緣層設(shè)置在所述微孔內(nèi)，所述第二絕緣層的厚度小于所述第一絕緣層的厚度。

優(yōu)選地，所述第二絕緣層和第一絕緣層由相同材料一體化制成，有助于進(jìn)一步降低制造難度和成本。

優(yōu)選地，所述微孔在所述基板上的投影與所述電極在所述基板上的投影相互重合。

優(yōu)選地，所述信號引線與所述電極同層設(shè)置，有助于進(jìn)一步降低制造難度和成本。

優(yōu)選地，所述信號引線與所述電極之間設(shè)置有第三絕緣層，所述信號引線與所述電極通過所述第三絕緣層上的過孔連接。

優(yōu)選地，所述電極和所述信號引線由鉬、鋁、銅等金屬制成，所述第一絕緣層、所述第二絕緣層和所述第三絕緣層由氮化硅或氧化硅制成。所述信號引線可以在所述基板的一側(cè)或者兩側(cè)排布，當(dāng)在所述基板的兩側(cè)排布時(shí)，可以進(jìn)一步減小信號引線所占的空間。

本發(fā)明還提供一種基因測序設(shè)備，包括一種基因測序芯片，所述基因測序芯片包括：基板；電極，所述電極形成在所述基板上；信號引線，所述信號引線與所述電極連接，用于向所述電極發(fā)送信號并將所述電極感測的信號輸出至信號發(fā)送端；第一絕緣層，所述第一絕緣層設(shè)置在形成有所述電極和所述信號引線的所述基板上，在所述第一絕緣層上與所述電極對應(yīng)的位置設(shè)置有微孔，所述微孔設(shè)置在所述電極的遠(yuǎn)離所述基板的一側(cè)；所述微孔與所述電極之間通過第二絕緣層間隔開。

本發(fā)明還提供一種基因測序方法，所述基因測序方法包括以下步驟：

將包含DNA鏈的DNA微珠加入所述微孔中進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

依次向所述微孔中加入四種脫氧核糖核苷三磷酸，通過所述信號引線向所述電極施加信號，并檢測所述電極感測的信號值是否發(fā)生變化；

根據(jù)所述信號值發(fā)生變化時(shí)加入的脫氧核糖核苷三磷酸確定DNA鏈上的堿基類型。

優(yōu)選地，所述脫氧核糖核苷三磷酸為可逆終止脫氧核糖核苷三磷酸，所述基因測序方法還包括：清洗掉向所述微孔中加入的可逆終止脫氧核糖核苷三磷酸，并加入疏基試劑。

發(fā)明的有益效果

本發(fā)明中的基因測序芯片不需要任何場效應(yīng)管，制造工藝簡單，能夠大大降低制造難度和成本。本發(fā)明還涉及包括該基因測序芯片的基因測序設(shè)備。

本發(fā)明中的基因測序方法應(yīng)用本發(fā)明的基因測序芯片，能夠簡單方便地進(jìn)行基因測序。

附圖說明

圖1示出實(shí)施例1的基因測序芯片的俯視圖；

圖2是實(shí)施例1的基因測序芯片的沿圖1中A-A’線截取的剖視圖；

圖3是根據(jù)實(shí)施例1一變型實(shí)施例的沿圖1中A-A’線截取的剖視圖；

圖4是根據(jù)實(shí)施例1又一變型實(shí)施例的沿圖1中A-A’線截取的剖視圖；

圖5示出實(shí)施例2的基因測序芯片的俯視圖；

圖6是實(shí)施例2的基因測序芯片的沿圖5中A-A’線截取的剖視圖；

圖7是根據(jù)實(shí)施例2一變型實(shí)施例的沿圖5中A-A’線截取的剖視圖；

圖8是根據(jù)實(shí)施例2又一變型實(shí)施例的沿圖5中A-A’線截取的剖視圖。

附圖標(biāo)記說明

1 基板，2 第一絕緣層，3 第二絕緣層，4 第三絕緣層，5 微孔，6 離子敏感膜，7 電極，8 信號引線，9 過孔，10 偵測芯片(信號發(fā)送端)

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；谒枋龅谋景l(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

除非另作定義，此處使用的技術(shù)術(shù)語或者科學(xué)術(shù)語應(yīng)當(dāng)為本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)具有一般技能的人士所理解的通常意義。本發(fā)明專利申請說明書以及權(quán)利要求書中使用的“第一”、“第二”以及類似的詞語并不表示任何順序、數(shù)量或者重要性，而只是用來區(qū)分不同的組成部分。同樣，“一個(gè)”或者“一”等類似詞語也不表示數(shù)量限制，而是表示存在至少一個(gè)?！斑B接”或者“相連”等類似的詞語并非限定于物理的或者機(jī)械的連接，而是可以包括電性的連接，不管是直接的還是間接的?！吧稀薄ⅰ跋隆?、“左”、“右”等僅用于表示相對位置關(guān)系，當(dāng)被描述對象的絕對位置改變后，則該相對位置關(guān)系也相應(yīng)地改變。

實(shí)施例1

圖1示出實(shí)施例1的基因測序芯片的俯視圖。圖2是實(shí)施例1的基因測序芯片的沿圖1中A-A’線截取的剖視圖。

如圖1所示，基因測序芯片包括基板1，基板1上設(shè)置有電極7和信號引線8，信號引線8的一端與電極7連接，另一端與作為信號發(fā)送端的偵測芯片10連接，偵測芯片10設(shè)置在由測序單元組成的陣列的一側(cè)或兩側(cè)，該偵測芯片10通過信號引線8向電極7發(fā)送電壓脈沖信號，并檢測電極7感測的信號值是否發(fā)生變化。在圖1中，電極7與信號引線8不同層設(shè)置，并通過第三絕緣層4上的過孔9連接。電極7與信號引線8由鉬、鋁、銅等金屬制成。

如圖2所示，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例包括基板1，信號引線8設(shè)置與基板1上，電極7通過第三絕緣層4上的過孔與信號引線8連接，第二絕緣層3形成為整層，第一絕緣層2設(shè)置于第二絕緣層3上，并且與電極7相對應(yīng)的位置設(shè)置有微孔5，微孔5在基板方向上的投影和電極7在基板方向上的投影相互重合。微孔5中還設(shè)置有離子敏感膜6，離子敏感膜6與第二絕緣層3相接觸，離子敏感膜6在基板方向上的投影和電極7在基板方向上的投影相互重合。優(yōu)選地，離子敏感膜6由四氮化三硅制成。當(dāng)微孔5中發(fā)生堿基互補(bǔ)配對時(shí)，會(huì)釋放氫離子，這樣就會(huì)在離子敏感膜表面感應(yīng)出能斯特電位，進(jìn)而對電極7上的電壓脈沖信號產(chǎn)生影響。第一絕緣層2、第二絕緣層3和第三絕緣層4由氮化硅或氧化硅制成。

下面說明使用實(shí)施例1的基因測序芯片的基因測序方法。該基因測序方法包括以下步驟：

將包含DNA鏈的DNA微珠加入微孔5中進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

依次向微孔5中加入四種脫氧核糖核苷三磷酸，通過信號引線8向電極7施加信號，并檢測電極7感測的信號值是否發(fā)生變化；

根據(jù)信號值發(fā)生變化時(shí)加入的脫氧核糖核苷三磷酸確定DNA鏈上的堿基類型。

優(yōu)選地，上述脫氧核糖核苷三磷酸為可逆終止脫氧核糖核苷三磷酸，具體包括可逆終止三磷酸腺嘌呤脫氧核糖核苷酸、可逆終止三磷酸胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸、可逆終止三磷酸胞嘧啶脫氧核糖核苷酸和可逆終止三磷酸鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸。

通過偵測芯片10分時(shí)地向電極7發(fā)送電壓脈沖信號和接收電極感測的信號，即先通過信號引線8向電極7發(fā)送電壓脈沖信號，然后同樣通過信號引線8接收電極7感測的信號。當(dāng)微孔5中的脫氧核糖核苷三磷酸被合成到DNA分子中時(shí)，會(huì)釋放氫離子，氫離子會(huì)對電壓脈沖信號產(chǎn)生影響，根據(jù)信號值發(fā)生變化時(shí)加入的脫氧核糖核苷三磷酸可以確定DNA鏈上的堿基類型。

如果微孔5中設(shè)置有離子敏感膜6，那么氫離子會(huì)在離子敏感膜6的表面感應(yīng)出能斯特電位，該電位同樣會(huì)對電壓脈沖信號產(chǎn)生影響，根據(jù)信號值發(fā)生變化時(shí)加入的脫氧核糖核苷三磷酸可以確定DNA鏈上的堿基類型。

具體的，當(dāng)電極7感測的信號值發(fā)生變化時(shí)，如果向微孔5中加入的脫氧核糖核苷三磷酸為三磷酸腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，則此時(shí)待測DNA鏈上的堿基為胸腺嘧啶；如果向微孔5中加入的脫氧核糖核苷三磷酸為三磷酸胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸，則此時(shí)待測DNA鏈上的堿基為腺嘌呤；如果向微孔5中加入的脫氧核糖核苷三磷酸為三磷酸胞嘧啶脫氧核糖核苷酸，則此時(shí)待測DNA鏈上的堿基為鳥嘌呤；如果向微孔5中加入的脫氧核糖核苷三磷酸為三磷酸鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸，則此時(shí)待測DNA鏈上的堿基為胞嘧啶。

在完成DNA一個(gè)位置的堿基類型檢測后，需要清洗掉向微孔5中加入的可逆終止脫氧核糖核苷三磷酸，并加入疏基試劑。與普通的脫氧核糖核苷三磷酸不同，可逆終止脫氧核糖核苷三磷酸的3′端連接一個(gè)疊氮基團(tuán)，在DNA合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因而會(huì)中斷DNA的合成，如果加入疏基試劑，疊氮基團(tuán)就會(huì)斷裂，并在原來位置形成一個(gè)羥基。在加入疏基試劑后可繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)位置的堿基類型檢測，檢測方法與上述方法相同，在此不再贅述。

當(dāng)然，第一絕緣層2、第二絕緣層3的設(shè)置方式不限于實(shí)施例1中的設(shè)置方式。

例如，圖3是根據(jù)實(shí)施例1一變型實(shí)施例的沿圖1中A-A’線截取的剖視圖。如圖3所示，第二絕緣層3設(shè)置在微孔5內(nèi)并且完全覆蓋電極7，第二絕緣層3的厚度小于第一絕緣層4的厚度。

圖4是根據(jù)實(shí)施例1又一變型實(shí)施例的沿圖1中A-A’線截取的剖視圖。如圖4所示，第一絕緣層2和第二絕緣層3由相同的材料一體成型，有助于進(jìn)一步降低制造難度和成本。

另外需要說明的是，圖2至圖4中的離子敏感膜6并不是必需的。在不包含離子敏感膜的情況下，當(dāng)微孔5中發(fā)生堿基互補(bǔ)配對時(shí)，會(huì)釋放氫離子，釋放出的氫離子會(huì)對電極7上的電壓脈沖信號產(chǎn)生影響，根據(jù)信號值發(fā)生變化時(shí)加入的脫氧核糖核苷三磷酸可以確定DNA鏈上的堿基類型。

實(shí)施例2

下面主要說明本實(shí)施例的基因測序芯片與實(shí)施例1中的基因測序芯片的不同之處，為簡潔起見將略去對相同之處的說明，其中相同的附圖標(biāo)記表示相同的部件。

圖5示出實(shí)施例2的基因測序芯片的俯視圖。圖6是實(shí)施例2的基因測序芯片的沿圖5中A-A’線截取的剖視圖。

如圖5所示，信號引線8和電極7同層設(shè)置。如圖6所示，電極7直接形成于基板1上，并與同層的信號引線8連接。

當(dāng)然，第一絕緣層2、第二絕緣層3的設(shè)置方式不限于實(shí)施例1中的設(shè)置方式。

例如，圖7是根據(jù)實(shí)施例2一變型實(shí)施例的沿圖5中A-A’線截取的剖視圖。如圖7所示，第二絕緣層3設(shè)置在微孔5內(nèi)并且完全覆蓋電極7，第二絕緣層3的厚度小于第一絕緣層4的厚度。

圖8是根據(jù)實(shí)施例2又一變型實(shí)施例的沿圖5中A-A’線截取的剖視圖。如圖8所示，第一絕緣層2和第二絕緣層3由相同的材料一體成型，有助于進(jìn)一步降低制造難度和成本。

另外需要說明的是，圖6至圖8中的離子敏感膜6并不是必需的。在不包含離子敏感膜的情況下，當(dāng)微孔5中發(fā)生堿基互補(bǔ)配對時(shí)，會(huì)釋放氫離子，釋放出的氫離子會(huì)對電極7上的電壓脈沖信號產(chǎn)生影響，根據(jù)信號值發(fā)生變化時(shí)加入的脫氧核糖核苷三磷酸可以確定DNA鏈上的堿基類型。

使用實(shí)施例2的基因測序芯片的基因測序方法與實(shí)施例1中相同，在此不再贅述。

以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明所述原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤飾。本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。