專利名稱：：基因vii型新城疫病毒致弱株a-ndv-vii及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及應(yīng)用反向遺傳技術(shù)，產(chǎn)生一種基因VII型新城疫病毒致弱株A-NDV-VII，用于制造疫苗。
背景技術(shù)：
：反向遺傳操作技術(shù)(Reversegeneticsmanipulationtechnique)是指在體夕卜通過構(gòu)建RNA病毒的感染性分子克隆，將病毒基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在DNA分子水平上對其進(jìn)行各種體外人工操作，由病毒基因組cDNA和各種輔助蛋白來組裝新的RNA病毒的一項(xiàng)研究技術(shù)[NeumannQWhittMA，KawaokaY.Adecadeafterthegenerationofanegative-senseRNAvirusfromclonedcDNA—whathavewelearnedJournalofGeneralVirology,2002,83(ll):2635-2662.]，也叫全長感染性cDNA克隆技術(shù)，又常被稱為"病毒拯救"。由于最終"拯救"出的RNA病毒來源于cDNA克隆，因此，可通過中間過程中人為加入的DNA環(huán)節(jié)，在DNA水平上對RNA病毒基因組進(jìn)行各種體外人工操作，如進(jìn)行基因突變、基因敲除(缺失)、基因插入、基因置換和基因互補(bǔ)(即構(gòu)建嵌合病毒)等改造，解決了對RNA病毒基因組難以操作這一難題，極大地方便了人們進(jìn)行病毒各基因的功能、致病機(jī)理和病毒病防制策略的研究，同時(shí)為新型疫苗的研制和開發(fā)提供了新的思路[HuangZ，ElankumaranS，Pandaa/.RecombinantNewcastlediseasevirusasavaccinevector.PoultryScience,2003,82:899-906,]。新城疫病毒(NDV)的基因組結(jié)構(gòu)模式為3'-NP-P-M-F-HN-L-5'，依次編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白核衣殼蛋白(Nucleocapsidprotein，NP)、磷蛋白(Phosphoprotein，P)、基質(zhì)蛋白(Matrixprotein,M)、融合蛋白(Fusionprotein,F)、血凝素隱神經(jīng)氨酸酶蛋白(Heamagglutinin-Neuraminidaseprotein,HN)和大分子蛋白(Largeprotein,L)，此外，P基因轉(zhuǎn)錄過程中在484位特定的編輯位點(diǎn)(AAAAAGGiG)插入一或兩個(gè)額外的非模板鳥嘌呤核苷酸(G堿基)發(fā)生RNA編輯現(xiàn)象而產(chǎn)生具有相同N末端不同C末端的V和W蛋白[StewardM,VipondIB，Millar,<a/.RNAeditinginNewcastlediseasevirus.JournalofGeneralVirology,1993，74:2539-2547.]。不同新城疫病毒分離株之間的毒力差異很大，根據(jù)對雞和雞胚的致病性及毒力不同，可將NDV分成三類即強(qiáng)毒型(速發(fā)型)、中等毒力型(中發(fā)型)和弱毒型(緩發(fā)型)。也可根據(jù)人工感染雞的臨診癥狀，將NDV分為嗜內(nèi)臟速發(fā)型、嗜神經(jīng)速發(fā)型、中發(fā)型、緩發(fā)型和無癥狀嗜腸型五種。在感染過程中，NDV吸附蛋白HN首先與敏感細(xì)胞表面的唾液酸受體結(jié)合，這種結(jié)合作用可以引起吸附蛋白HN和融合蛋白F構(gòu)象發(fā)生變化；于是后者的融合肽被釋放出來，使病毒的包膜與細(xì)胞膜發(fā)生融合[McGinnesLW,SergeiT,ChenH，MutationalAnalysisoftheMembraneProximalHeptadRepeatoftheNewcastleDiseaseVirusFusionProtein.Virology，2001，289:343-352.],強(qiáng)毒F蛋白的裂解位點(diǎn)為多個(gè)堿性氨基酸連續(xù)排列，可被機(jī)體多個(gè)組織器官的多種蛋白酶裂解，因此，可導(dǎo)致全身性感染。弱毒株在該區(qū)域的堿性氨基酸則被中性氨基酸所代替，使相應(yīng)序列由R/K112-R-Q-K/R115-R-L117變?yōu)镚/Em-R-Q-G/E115-R-Lm，這種F蛋白前體僅能被有限的組織或器官分泌的胰樣蛋白酶裂解，感染性很低或無感染性。因此，F(xiàn)蛋白是NDV毒力和致病性的主要決定因素[PeetersBPH，Olaysoeleeuw，KochG，WRescueofNewcastlediseasevirusfromclonedcDNA:Evidencethatcleavabilityofthefusionproteinisamajordeterminantforvirulence.JournalofVirology,1999，73(6):5001-5009.]。自1926年發(fā)現(xiàn)新城疫(ND)以來，ND已發(fā)生了四次大的流行，而且每一次流行都有不同基因型的毒株出現(xiàn)，尤其是90年代之后出現(xiàn)了新的基因VII型NDV，給我國的養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在控制疫病的過程中，使用疫苗是最有效最經(jīng)濟(jì)的方法，新城疫的疫苗己使用了幾十年，由于ND疫苗的廣泛使用，此病已基本上得到了較好的控制，但是臨床上非典型ND的發(fā)生十分普遍，ND仍然成為威脅養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一，也就是說，常規(guī)的疫苗對于NDV強(qiáng)毒的攻擊并不能提供理想的保護(hù)。從近十年來的ND流行特點(diǎn)來看，臨床上所分離到的NDV毒株大多數(shù)屬于基因VII型[LiuXF,^VanHQ,NiXX,a/.PathotypicalandgenotypicalcharacterizationofstrainofNewcastlediseaseisolatedfromoutbreaksinchickenandgooseflocksinsomeregionsofChinaduring1985-2001.ArchivesofVirology,2003，148(7):1387-1403.]，而常規(guī)的ND疫苗株的基因型主要為I和II型(如V4、LaSota等)，因此，在遺傳距離上當(dāng)前NDV分離株與常規(guī)ND疫苗株相差較遠(yuǎn)。2005年Kapczynski等用基因II型疫苗株NDVBl株作為疫苗，分別免疫2周齡和8周齡的SPF雞，免疫2周后以2002年的一株NDV分離株進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，研究結(jié)果表明雖然免疫雞攻毒后沒有發(fā)生死亡，但是不能抵抗NDV強(qiáng)毒的感染，免疫雞在攻毒后仍能排毒，因此，Kapczynski等認(rèn)為常規(guī)疫苗在防制當(dāng)前NDV感染中，還存在明顯的不足，應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步改善疫苗當(dāng)前的生產(chǎn)工藝或者研制新型的替代疫苗[KapczynskiDR,KingDJ.ProtectionofchickensagainstovertclinicaldiseaseanddeterminationofviralsheddingfollowingvaccinationwithcommerciallyavailableNewcastlediseasevirusvaccinesuponchallengewithhighlyvirulentvirusfromtheCalifornia2002exoticNewcastlediseaseoutbreak.Vaccine,2005,23:3424—3433.]。2000年黃勇等在發(fā)病的鵝群中，成功分離到了基因VII型新城疫強(qiáng)毒ZJl株，并進(jìn)行了全基因組測序，登錄號為AF431744[HuangY，WangHQ，LiuHQ，a/.GenomicsequenceofanisolateofNewcastlediseasevirusisolatedfromanoutbreakingeese:anovelsixnucleotideinsertioninthenon-codingregionofthenucleoproteingene.ArchivesofVirology,2004,149:1445-1457.]。在此基礎(chǔ)上，2005年胡順林等建立了NDV強(qiáng)毒株的反向遺傳操作平臺(tái)，成功拯救出了鵝源強(qiáng)毒ZJ1株，并對該毒株進(jìn)行了致弱，但是獲救病毒的EIDso和HA效價(jià)均較低，不適合于大規(guī)模的生產(chǎn)[胡順林，孫慶，吳艷濤，等.用反向遺傳技術(shù)致弱基因VIId型鵝源新城疫病毒ZJl株.微生物學(xué)報(bào)，2007,47(2):197-200.]。2005年姚春峰等從發(fā)病鵝群中分離到基因VII型NDV毒株JS-5-05-Go，其尿囊液的HA價(jià)為81og2明顯高于ZJl株[姚春峰.我國部分地區(qū)新城疫病毒的部分生物學(xué)特性鑒定及分子流行病學(xué)研究.揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文.揚(yáng)州,2007，6.]，目前已有報(bào)道NDV的HN蛋白與病毒的繁殖和HA等生物學(xué)特性密切相關(guān)[HuangZH,PandaA,ElankumaranS,a/.TheHemagglutinin-NeuraminidaseProteinofNewcastleDiseaseVirusDeterminesTropismandVirulence.JournalofVirology,2004,74(8):4176-4184.]。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個(gè)目的在于發(fā)明一種基因VII型新城疫病毒致弱株，從而解決當(dāng)前所用疫苗株與流行株基因型不一致的問題。本發(fā)明基因VII型新城疫病毒致弱株A-NDV-VII，于2007年8月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所。保藏編號CGMCCN0.2141，分類命名新城疫病毒。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于發(fā)明一種基因VII型新城疫病毒致弱株A-NDV-VII的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明利用已建立的鵝源新城疫病毒ZJ1株的反向遺傳操作平臺(tái)，將具有高繁殖性能的新城疫病毒分離株JS-5-05-Go的兩個(gè)囊膜糖蛋白F和HN基因片段對ZJ1株基因組的對應(yīng)部分進(jìn)行替換，得到重組病毒NDV-VII，對重組病毒NDV-VII的F基因進(jìn)行致弱突變后，拯救出高度致弱的基因VII型新城疫病毒株A-NDV-VII。將重組病毒NDV-VII株F基因的裂解位點(diǎn)突變?yōu)槿醵局晏卣鞯男蛄泻?，成功拯救出了高度致弱的基因VII型毒株A-NDV-VII且其在雞胚中具有較高的繁殖滴度。本發(fā)明利用反向遺傳技術(shù)成功拯救出了囊膜糖蛋白基因發(fā)生替換后的重組致弱病毒A-NDV-VII，該病毒在雞胚上具有較高的繁殖滴度，適合于疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)，另外，該致弱毒株為基因VII型與當(dāng)前我國NDV流行株的基因型相一致，因此，同常規(guī)疫苗(基因I和II型)相比，致弱株A-NDV-VII在控制當(dāng)前新城疫的發(fā)病和流行方面顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明包括以下具體步驟1)新城疫病毒ZJ1株基因組的修飾構(gòu)建陽性質(zhì)粒R1R2R3:分別從ZJ1株基因組的2849nt5223nt、2849nt5223nt、2849nt5223nt位置克隆出基因片段Rl、R2、R3，將基因片段R1、R2、R3在質(zhì)粒pCR2.1載體中相連，獲得陽性質(zhì)粒R1R2R3;以含有ZJ1株基因組全長的克隆pNDV/ZJl作模板，用引物SWI-l和1-2擴(kuò)增分離株ZJ1株基因組36024505nt之間的片段；用引物1-3和1-4擴(kuò)增ZJ1株基因組4501-4861nt之間的片段；再將克隆出的上述兩片段在pCR2.1載體中相連，將相連的片段亞克隆至陽性質(zhì)粒R1R2R3中，獲得質(zhì)粒S-R123;上述用于擴(kuò)增的引物序列如下5^/I隱1:5，-TTCCGCAATGCTCTGCTTAGGGAGTGT-3'1-2:5，-TCGTCGACATGGATCATTGTCTGGTGT-3'I畫3:5，-CGTCGACTGCTTATAGTTAGTTCACC-3'緒腳4:5'-GTAGTCAGTGTTCTGTTATACGCCTC-3';2)以分離株JS-5-05-Go的囊膜糖蛋白基因替換ZJ1株基因組的對應(yīng)部分根據(jù)GenBank中發(fā)表的多株新城疫病毒的F和HN基因序列，利用DNAStar中MegAlign基因比較分析軟件進(jìn)行分析后設(shè)計(jì)sFl、sF2和sHNl、sHN2兩對引物，分別擴(kuò)增分離株JS-5-05-Go的囊膜糖蛋白F和HN基因，利用片段中存在的酶切位點(diǎn)將兩擴(kuò)增片段相連，得到質(zhì)粒pF-HN;再將質(zhì)粒pF-HN中的F和HN基因一起替換到質(zhì)粒S-R123上，獲得中間質(zhì)粒mS-R123;然后將JS-5-05-Go株的F和HN基因從質(zhì)粒mS-R123上導(dǎo)入到轉(zhuǎn)錄載體pNDV/ZJl中，從而獲得新的轉(zhuǎn)錄載體pNDV-VII;所述引物sFl、sF2、sHNl、sHN2序列如下sFl:5'國CGTCGACTGCTTATAGTTAGTTC-3，sF2:5，-TGCTCTTTGGTTGCTTGTTCCCAG畫3'sHNl:5,-GCAGCCTGTGTGTCAATTCCGAT-3'sHN2:5'畫CTACCCGTGTTCTCCCTTGTTG畫3';3)重組病毒NDV-VII株的拯救將pCI-NP、pCI-P和pCI-L三個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄載體pNDV-VII共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞，60h后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞輕輕刮下，與細(xì)胞上清充分混合后接種9~11日齡SPF雞胚，每個(gè)樣品接種3枚，0.4mL/枚，37"C孵育，即獲得重組病毒NDV-VII。4)致弱毒株A-NDV-VII的拯救通過引物經(jīng)OverlapPCR方法，將重組病毒NDV-VII的F基因裂解位點(diǎn)處的核苷酸進(jìn)行突變，從而使相應(yīng)編碼的氨基酸由R^-R-Q-K^R-F^變?yōu)槿醵咎卣鞯陌被嵝蛄蠫112-R-Q-G115-R-L117，突變后的質(zhì)粒命名為pA-NDV-VII;將質(zhì)粒pA-NDV-VII與pCI-NP、pCI-P和pCI-L三個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞，轉(zhuǎn)染18h后加入終濃度為10。/。的SPF雞胚尿囊液，轉(zhuǎn)染60h后將轉(zhuǎn)染樣品接種911日齡SPF雞胚，即獲得基因VII型新城疫病毒致弱株A-NDV-VII;兩對突變引物分別是AF1:5'-GCGTC04CTGCTTATAGTTAGTTCACCTGTCT-3'AF2::5'-GAGGGAGACAAGAACGCCTTATAGGTGCTGTTATTGG畫3'AF3:5'-AAGGCGTTCTTGTCTCCCTCCTCCAGACGTGGAC國3'AF4:5'-GGrT^rA4AGTGCCTGGATGGTCAGATGAGTTAA-3'。另，步驟4)中通過AF1+AF2和AF3+AF4兩對突變引物分別擴(kuò)增片段AFa和AFb兩個(gè)片段，凝膠電泳回收AFa和AFb，用引物AF1和AF4將以上兩個(gè)擴(kuò)增片段通過OverlapPCR方法相連，得到裂解位點(diǎn)產(chǎn)生突變的擴(kuò)增片段AF，利用該片段中含有的&n和i^'I，替換轉(zhuǎn)錄載體pNDV-VII上的對應(yīng)部分從而獲得了突變后的質(zhì)粒pA-NDV-VII。步驟1)中，從ZJ1株基因組中克隆R1片段的引物為.-5，-GGGTGAAATGACGCTCAATAAACTCTC—3，5，國ATGGrCTCATCTGTGGCCCGAATACT-3，從ZJ1株基因組中克隆R2片段的引物為5，隱ATAC(rCTCACAGATCACCTCCCCTGCATTAAC-3，5，畫GTC404rCTCTGCAACCGGATAGTATCACA—3'從ZJ1株基因組中克隆R3片段的引物為5，-TCCGTCTCAGATCACTCACACTCACATCAAT—3'5，-TCACGACCATCATATCGAAATCTACCATC-3"。圖1重組質(zhì)粒pNDV-VII構(gòu)建模式圖。圖2重組質(zhì)粒pNDv-vn的/7z'^nn酶切鑒定。圖3F蛋白裂解位點(diǎn)突變模式圖。圖4致弱株的RT-PCR鑒定。圖5致弱株的細(xì)胞感染試驗(yàn)結(jié)果。具體實(shí)施方式構(gòu)建步驟一ZJ1株基因組的修飾生物材料準(zhǔn)備新城疫病毒ZJ1株由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室分離、保存。pNDV/ZJl:由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，公開對外銷售。pCR2.1載體購自Invitrogen公司。設(shè)計(jì)3對引物用于擴(kuò)增ZJl株基因組2849-9552nt約6700bp大小的片段，引物序列如下引物編號(擴(kuò)增片段的位置)引物序列(內(nèi)切酶)5，-GGGTGAAATGACGCTCAATAAACTCTC—3，5，-ATGGTCTCATCTGTGGCCCGAATACT-3，(SsflD5'-ATACG7rrCACAGATCACCTCCCCTGCATTAAC-3，(5柳BI)5，-GTC4G4rCTCTGCAACCGGATAGTATCACA—3，(5g/H)5'-TCCGTCrCAGATCACTCACACTCACATCAAT-3'(細(xì)BI)5，-TCACGACCATCATATCGAAATCTACCATC-3，根據(jù)引物中所加酶切位點(diǎn)，將擴(kuò)增片段R1、R2和R3在pCR2.1載體中相連，得了陽性質(zhì)粒R1R2R3。以含有NDVZJ1株基因組全長的克隆pNDV/ZJl作模板，用引物&/1-1和1-2擴(kuò)增基因組3602-4505nt之間的片段；用引物Sa/1-3和1-4擴(kuò)增基因組4501-4861nt之間的片段，將兩片段在pCR2.1載體中相連，利用兩端的酶切位點(diǎn)將相連片段亞克隆至質(zhì)粒R1R2R3中，獲得了質(zhì)粒S-R123，從而在全長克隆4502nt的位置引入了1個(gè)1酶切位點(diǎn)。用于擴(kuò)增的引物序列如下1-1:5，國TTCCGCAATGCTCTGCTTAGGGAGTGT-3，3602-3628nt1-2:5，陽TCGTCGACATGGATCATTGTCTGGTGT-3'4438-4462ntI畫3:5，-CGTCGACTGCTTATAGTTAGTTCACC-3'4457-4481nt&/I-4:5，-GTAGTCAGTGTTCTGTTATACGCCTC-3，4836-4861nt步驟二以分離株JS-5-0S-Go的囊膜糖蛋白基因替換ZJ1株基因組的對應(yīng)部分生物材料準(zhǔn)備分離株JS-5-05-Go:揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病實(shí)驗(yàn)室保存。1、JS-5-05-Go株的囊膜糖蛋白基因的擴(kuò)增將分離株JS-5-05-Go毒種接種于SPF雞胚，收集尿囊液300ml，6000rpm(30#轉(zhuǎn)子)離心15min，取上清；18000rpm4'C離心1.5h，用40mlSTE(10mMpH8.0Tris-HCl，100mMNaCl，5mMpH8.0EDTA)懸浮沉淀。用10%蔗糖墊底，小心加入懸浮液，18000rpm4。C離心1.5h去雜蛋白，棄上清，沉淀用30mLSTE懸浮，18000rpm4。C離心lh去蔗糖，沉淀用7mLSTE懸浮，分裝指形管，每管450pL。用上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的RNA抽提試劑盒提取RNA。取300pL上述制備的病毒液，加入400nLTrizol充分混勻，再加入lOO(iL氯仿/異戊醇(24:1)，震搖30秒后，12，000rpm離心5分鐘；移上清至無菌的1.5mLRNase-free離心管中，加入150無水乙醇，混勻；置于MNIQ-10柱中，室溫放置2分鐘，8，000rpm離心1分鐘；棄去廢液，在柱子中加入450pLSolutionRPE，10,000rpm，離心30秒；重復(fù)前步一次；棄去廢液，10，000rpm，離心15秒；移柱子入無菌、RNase-free離心管中，在柱子中央加入50(iLDEPC-H20，55-80。C放置2分鐘，10，000rpm，離心1分鐘，收集管內(nèi)的溶液即為RNA樣品。取以上抽提的病毒基因組RNA17pL，加入六聚體隨機(jī)引物l|iL(50ng)，輕輕混勻后置于70。C恒溫金屬浴中變性5min破壞RNA二級結(jié)構(gòu)，立即冰浴5min，然后依次加入以下試劑5xRTBuffer5nLdNTPs(10mmol/L)1RNasin(40U/|iL)0.5|xLAMVreversetranscriptase(10U/|iL)05[jL用手指輕撥(flipping)混勻，瞬時(shí)低速離心，置于42'C水浴中反轉(zhuǎn)錄1.5h后取出95。C作用5min以滅活殘余的反轉(zhuǎn)錄酶，RT產(chǎn)物冷卻至(C后直接進(jìn)行以下PCR反應(yīng)或暫存于-20'C冰箱備用。PCR擴(kuò)增F和HN基因全長片段(5(VL反應(yīng)體系)上述RT產(chǎn)物(cDNA)5(iL至0.5mLPCR反應(yīng)管中，以引物sHNl和sHN2擴(kuò)增JS-5-05-Go株的HN基因，以引物sFl和sF2擴(kuò)增JS-5-05-Go株的F基因，具體操作方法如下10xReactionBuffer5jjLs艦/sFl(50pmol/nL)1pLsHN2/sF2(50pmol/pL)1pLdNTPs(10mmol/L)1pLExpandLongTemplatePolymerase(3.5U/(aL)1(iL上述RT產(chǎn)物(cDNA)5|iLSW36pLPCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)94°C預(yù)變性2min;94°C20s，56°C30s，72°。延伸，延伸時(shí)間為lmin/kb，20個(gè)循環(huán)后72'C延伸10min，4"C保存。根據(jù)GenBank中發(fā)表的多株新城疫病毒的F和HN基因序列，利用DNAStar中MegAlign基因比較分析軟件進(jìn)行分析后設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增F和HN基因的引物序列如下sF1:5，畫CGTCGACTGCTTATAGTTAGTTC-3'4457-4479ntsF2:5'-TGCTCTTTGGTTGCTTGTTCCCAG-3，6299-6322ntsHNl:5，-GCAGCCTGTGTGTCAATTCCGAT-3'6243-6265ntsHN2:5'畫CTACCCGTGTTCTCCCTTGTTG-3'8362-8383ntPCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后切割含目的大小片段的凝膠，用AgroseGdDNAExtractionKit回收純化后與pCR2.1T載體相連，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)五RI酶切鑒定正確后送上海聯(lián)合基因科技有限公司測序，插入片段F和HN基因的序列測定結(jié)果如下F基因的序列(其長度為1662bp):atgggctccaaaccttctaccaggatcccagcacctctaatgctgatcactcggattatg60ctgatattgagctgtatccgtctgacaagctctcttgacggcaggccccttgcagctgca120ggaattgtagtaacaggagataaggcagtcaatgtatacacctcgtctcagacagggtca180atcatagtcaagttgctcccgaatatgcccagagataaggaggcatgtgcaaaagcccca240ttggaggcatgtaacagaacactgactactctgctcactcctcttggcgactccatccgc300aagatccaagggtctgtgtccacgtccggaggaaggagacaaaaacgctttataggtgct360gttattggcagtgtagctcttggggttgcaacagcggcacagataacagcagctgcggcc420ctaatacaagccaaacagaatgccgccaacatcctccggcttaaggagagcattgctgca480accaatgaagctgtgcatgaagtcaccgacggattatcacaactatcagtggcagttggg540aagatgcagcagtttgtcaatgaccagttaaataatacggcgcgagaattggactgtata600aaaatcacacaacaggtcggtgtagaactcaacctatacctaactgaattgactacagta660ttcgggccacagatcacctcccctgcattaactcagctgaccatccaggcactttataat720ttagctggtggcaatatggattacttattaactaagttaggtataggaaacaatcaactc780agctcattaattggtagcggcctgatcactggttaccctatactgtatgactcacatact840caactcttgggcatacaagtaaatctgccctcagtcgggaacttaaataatatgcgtgcc900acctatttggagaccttatctgtaagtacaaccaaaggatatgcctcagcacttgtcccg960aaagtagtgacacaagtcggttctgtgatagaagagcttgacacctcatactgtatagag1020tccgatctggatttatattgtactagaatagtgacattccccatgtccccaggtatttat1080tcctgtttgagcggcaacacatcagcttgcatgtattcaaagactgaaggcgcactcact1140acgccgtatatggcccttagaggctcagttattgccaattgtaagataacaacatgcaga1200tgtacagaccctcctggtatcatatcgcaaaattacggagaagctgtatccctgatagat1260agacattcatgcaatgtcttatcattagacggaataactctgaggctcagtggggaattt1320gatgcaacttatcaaaagaacatctcaatattagattctcaagtcatcgtgacaggcaat1380cttgatatatcaactgaacttggaaacgtcaacaattcaatcagcaatgccttggatagg1440ttggcagaaagcaacagcaagctagaaaaagtcaatgtcagactaactagcacatctgct1500ctcattacctatattgttctaactgtcatttccctaattttcggtgcacttagtctggtt1560ttagcgtgttacctgatgtacaaacagaaggtacaacagaagaccttgctatggcttggg1620aataataccctcgatcagatgagagccaccacaagagcatgaHN基因測定序列與GenBank中公布的JS-5-05-Go株的HN基因序列(登錄號為EU044816)完全一致。上述序列測定正確的陽性質(zhì)粒分別命名為T-sF和T-sHN。2、囊膜糖蛋白基因的替換利用上述兩質(zhì)粒中所含的酶切位點(diǎn)將兩擴(kuò)增片段相連得到了質(zhì)粒pF-HN。利用該質(zhì)粒中所含有的兩個(gè)單一酶切位點(diǎn)1和I將JS-5-05-Go株的F和HN基因同時(shí)替換到質(zhì)粒S-R123上，構(gòu)建了中間質(zhì)粒mS-R123，中間質(zhì)粒mS-R123經(jīng)爿geI和FspAI酶切后替換轉(zhuǎn)錄載體pNDV/ZJl上的對應(yīng)序列，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pNDV-VII(見圖l)。3、重組質(zhì)粒pNDV-VII的酶切鑒定由于分離株JS-5-05-Go基因組中HN基因序列中含有7f/m/ni酶切位點(diǎn)(相當(dāng)于ZJI全長cDNA8033nt處)，而pNDV/ZJl上HN基因的cDNA序列上卻不含此位點(diǎn)，但NDVZJ1株全長cDNA14056nt和轉(zhuǎn)錄載體的292nt處也存在此酶切位點(diǎn)，因此，HN基因被成功替換的陽性質(zhì)粒，經(jīng)/7/m/ni酶切后會(huì)出現(xiàn)10.8kb、6.0kb和L4kb大小的3條目的片段，而經(jīng)同樣酶切的pNDV/ZJl，電泳后僅出現(xiàn)16.8kb和1.4kb左右的2條帶(見圖2)。步驟三重組病毒NDV-VII株的拯救生物材料準(zhǔn)備pCI-NP、pCI-P、pCI-L真核表達(dá)質(zhì)粒由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存，公開銷售。BSR-T7/5細(xì)胞購自哈爾濱獸醫(yī)研究所。將5xl05BSR-T7/5細(xì)胞接種于35mmdish中，用含lmg/mLG418和10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)過夜，約60%~80%鋪滿時(shí)用于轉(zhuǎn)染。將pCI-NP、pCI-P和pCI-L3個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒與含有NDV基因組cDNA全長的轉(zhuǎn)錄載體(pNDV-VII)共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞，60h后將轉(zhuǎn)染樣品用封口膜(parafilm)封好，轉(zhuǎn)移到-7(TC低溫冰箱反復(fù)凍融2次，然后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞輕輕刮下，與細(xì)胞上清充分混合后接種911日齡SPF雞胚，每個(gè)樣品接種3枚，0.4mL/枚，37t:孵育。定時(shí)照胚，棄去24h內(nèi)死亡胚。取出24h后死亡胚置于4。C充分冷卻，待雞胚血管收縮后收集尿囊液。收集的尿囊液均按OIE標(biāo)準(zhǔn)所測HA效價(jià)為81og2，與親本毒株ZJ1相比上升了4個(gè)滴度，且HA特性能被針對NDVHN蛋白的單克隆抗體(6B1)所抑制。步驟四致弱毒A-NDV-VII株的拯救1、引物設(shè)計(jì)與合成AF1:5'-GCGrC04CTGCTTATAGTTAGTTCACCTGTCT畫3'AF2:5'-GAGGGAGACAAGAACGCCTTATAGGTGCTGTTATTGG-3'AF3:5'-AAGGCGTTCTTGTCTCCCTCCTCCAGACGTGGAC-3'AF4:5'-GGm窗AGTGCCTGGATGGTCAGATGAGTTAA-3'引物外帶1和尸w'I酶切位點(diǎn)用斜體和下劃線標(biāo)注；突變堿基由黑體標(biāo)注。以上引物由上海生物工程有限公司合成。2、F裂解位點(diǎn)的突變PCR反應(yīng)以轉(zhuǎn)錄載體pNDV-VII為模板配制如下PCR反應(yīng)體系10xReactionBuffer5|aL上游Primer(50pmol/pL)1下游Primer(50pmol/pL)1dNTPs(10mmol/L)1ExpandLongTemplatePolymemse(3.5U/|aL)1cDNAlpLSW蜂LPCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)94°C預(yù)變性2min;94°C20s，56°C30s，72。C延伸，延伸時(shí)間為lmin/kb,20循環(huán)后72"C延伸lOmin，4"C保存。用引物AF1和AF2擴(kuò)增病毒基因組的44574917nt區(qū)域，用引物AF3和AF4擴(kuò)增基因組的48645270nt區(qū)域。OverlapPCR反應(yīng)體系及條件10xReactionBuffer5PrimerAF1(50pmol/(jL)1PrimerAF4(50pmol/(iL)1dNTPs(10mmol/L)1|iLExpandLongTemplatePolymerase(3.5U/|iL)1AF1和AF2擴(kuò)增片段(AFa)l|iLAF3和AF4擴(kuò)增片段(AFb)lpLSW39pLPCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)94。C預(yù)變性4min;50。C退火lmin，72。C延伸5min，之后再94°C20s，56。C30s，72。C延伸2min30s,20循環(huán)后72。C延伸10min，4'C保存。用引物AF1和AF4將以上兩個(gè)擴(kuò)增片段通過OverlapPCR方法相連(Overlap部分在上述引物中以下劃線標(biāo)注)，得到裂解位點(diǎn)發(fā)生3個(gè)氨基酸突變的F基因片段AF，突變模式見圖3。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后與pCR2.1載體相連，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，質(zhì)粒提取后送上海聯(lián)眾科技研究院進(jìn)行測序驗(yàn)證，陽性質(zhì)粒命名為T-AF，最后將目的片段AF經(jīng)S"/1和I酶切后替換轉(zhuǎn)錄載體pNDV-VII上的對應(yīng)序列。重組質(zhì)粒用酶切和PCR方法鑒定，陽性克隆命名為pA-NDV-VII。3、共轉(zhuǎn)染與HI鑒定將pCI-NP、pCI-P和pCI-L三個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒與含有NDV基因組cDNA全長的轉(zhuǎn)錄載體pA-NDV-VII共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法參照SuperFecttransfectionReagent說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染樣品于60h后接種9~11日齡SPF雞胚，120h后將所接種雞胚凍死，收取雞胚尿囊液進(jìn)行HA測定，其效價(jià)為91og2，且能被針對NDVHN蛋白的單克隆抗體(6B1)所抑制。4、基因VII型新城疫病毒致弱毒株A-NDV-VII的PCR鑒定將HA和ffl檢測均為陽性的尿囊液在SPF雞胚上傳兩代后，收集尿囊液，抽提RNA用于RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增F基因長度約為1700bp左右大小的片段，回收目的片段進(jìn)行測序鑒定，擴(kuò)增片段的測序結(jié)果顯示F基因的裂解位點(diǎn)已突變成功(圖4)。用于擴(kuò)增新城疫病毒致弱毒株A-NDV-VII中F基因的引物序列為FP1:5，-TCTAGAGATCCCGACCGGCACATTCA畫3'FP2:5，-GTCGACATCCACCTCTTATCTGCATTCAT-3'步驟五、致弱毒株的生物學(xué)特性鑒定1、MDT與ICPI的測定用滅菌生理鹽水分別連續(xù)10倍(10_3、l(T4......10—7)遞增稀釋致弱病毒A-NDV-VII，每個(gè)稀釋度接種5只911日齡SPF雞胚，37'C孵育5d，按OIE標(biāo)準(zhǔn)方法計(jì)算病毒的MDT;致弱病毒的尿囊液以滅菌生理鹽水10倍稀釋后經(jīng)腦內(nèi)接種10只1日齡的SPF雞，按OIE標(biāo)準(zhǔn)方法計(jì)算病毒的ICPI。病毒5個(gè)稀釋度的接種雞胚在120h內(nèi)沒有發(fā)生死亡,說明該毒株的MDT值大于120h;尿囊液經(jīng)腦內(nèi)接種SPF雞后，接種雞沒有發(fā)生死亡，ICPI的測定值僅為0.16，表明獲救病毒的毒力完全符合弱毒株的標(biāo)準(zhǔn)。2、細(xì)胞感染性試驗(yàn)致弱病毒A-NDV-VII株作10'3稀釋后，接種雞胚成纖維細(xì)胞48h后，細(xì)胞沒有出現(xiàn)病變，見圖5中A，而母本病毒感染細(xì)胞則出現(xiàn)了拉網(wǎng)和脫落現(xiàn)象，形成了明顯的空斑，見圖5中B。說明拯救后病毒的F蛋白在CEF上不能有效裂解，進(jìn)一步表明獲救病毒的毒力已明顯減弱。本發(fā)明構(gòu)建的基因VII型新城疫病毒致弱毒株A-NDV-VII于2007年8月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號為CGMCCNO:2141，其長度為15192bp。步驟六致弱毒株的免疫效力試驗(yàn)將l日齡商品蛋雞和SPF雞隨機(jī)分組，10只/組，進(jìn)行隔離飼養(yǎng)，2周齡時(shí)經(jīng)滴鼻點(diǎn)眼分別接種致弱毒株A-NDV-VII和LaSota，106EID50AR;經(jīng)頸部皮下接種A-NDV-VII油苗，同時(shí)設(shè)PBS接種組作為對照。每只試驗(yàn)雞于免疫后4周接種106ELD5()的新城疫VII型強(qiáng)毒YZ株。攻毒后連續(xù)觀察14天，統(tǒng)計(jì)發(fā)病和死亡情況，并于攻毒后第4d采集氣管與泄殖腔棉拭樣品用于病毒的分離。LaSota、A-NDV-VII及A-NDV-VII油苗免疫組雞均未發(fā)病，而攻毒對照組雞在攻毒后5d全部死亡(見表1)。SPF雞的情況大致相同。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>綜上所述，經(jīng)過囊膜糖蛋白基因的替換和F基因裂解位點(diǎn)的突變，成功拯救出一株毒價(jià)高且高度致弱的新城疫病毒A-NDV-VII株。且，經(jīng)試驗(yàn)表明本發(fā)明構(gòu)建的致弱病毒A-NDV-VII免疫試驗(yàn)雞兩周后，弱毒苗免疫組雞血清HI的平均效價(jià)為25，而油苗組的HI平均效價(jià)則達(dá)到了27;攻毒4天后，LaSota免疫組的SPF雞口腔和泄殖腔的棉拭樣品的病毒分離率分別為10%和30%;商品雞口腔和泄殖腔的棉拭樣品的病毒分離率分別為40%和20%，上述病毒的分離率均顯著高于A-NDV-VII活苗及A-NDV-VII油苗免疫組，從而證明與常規(guī)疫苗相比，致弱后的疫苗能夠提供更加堅(jiān)實(shí)的免疫保護(hù)效率。gggtgaaatgacgctcaataaactctcatggtctcatctgtggcccgaatactatecgtctcacagatcacctcccctgcattaacgtcagatctctgcaaccggatagtatcacatccgtctcagatcactcacactcacatcaattcacgaccatcatetcga犯tctaccatcttccgcaatgctctgcttagggagtgttcgtcgacatggatcattgtctggtgtcgtcgactgcttatagttagttcaccgtagtcagtgttctgttatacgcctcatgggctccaaaccttctaccaggatcccagcacctctaatgctgatcactcggattatg60ctgatattgagctgtatccgtctgacaagctctcttgacggcaggccccttgcagctgca120ggaattgtagtaacaggagataaggcagtcaatgtatacacctcgtctcagacagggtcal80atcatagtcaagttgctcccgaatatgcccagagataaggaggcatgtgcaaaagcccca240ttggaggcatgtaacagaacactgactactctgctcactcctcttggcgactccatccgc300aagatccaagggtctgtgtccacgtccggaggaaggagacaaaaacgctttataggtgct360gttattggcagtgtagctcttggggttgcaacagcggcacagataacagcagctgcggcc420ctaatacaagccaaacagaatgccgccaacatcctccggcttaaggagagcattgctgca480accaatgaagctgtgcatgaagtcaccgacggattatcacaactatcagtggcagttggg540aagatgcagcagtttgtcaatgaccagttaaataatacggcgcgagaattggactgtata600aaaatcacacaacaggtcggtgtagaactcaacctatacctaactgaattgactacagta660ttcgggccacagatcacctcccctgcattaactcagctgaccatccaggcactttataat720ttagctggtggcaatatggattacttattaactaagttaggtataggaaacaatcaactc780agctcattaattggtagcggcctgatcactggttaccctatactgtatgacteacatact840caactcttgggcatacaagtaaatctgccctcagtcgggaacttaaataatatgcgtgcc900acctatttggagaccttatctgtaagtacaaccaaaggatatgcctcagcacttgtcccg960aaagtagtgacacaagtcggttctgtgatagaagagcttgacacctcatactgtatagag1020tccgatctggatttatattgtactagaatagtgacattccccatgtccccaggtatttat1080tcctgtttgagcggcaacacatcagcttgcatgtattcaaagactgaaggcgcactcact1140acgccgtatatggcccttagaggctcagttattgccaattgtaagataacaacatgcaga1200tgtacagaccctcctggtatcatatcgcaaaattacggagaagctgtatccctgatagat1260agacattcatgcaatgtcttatcattagacggaataactctgaggctcagtggggaattt1320gatgcaacttatcaaaagaacatctcaatattagattctcaagtcatcgtgacaggcaat1380cttgatatatcaactgaacttggaaacgtcaacaattcaatcagcaatgccttggatagg1440ttggcagaaagcaacagcaagctagaaaaagtcaatgtcagactaactagcacatctgct1500ctcattacctatattgttctaactgtcatttccctaattttcggtgcacttagtctggtt1560ttagcgtgttacctgatgtacaaacagaaggtacaacagaagaccttgctatggcttggg1620aataataccctcgatcagatgagagccaccacaagagcatgacgtcgactgcttatagttagttctgctctttggttgcttgttcccaggcagcctgtgtgtcaattccgatctacccgtgttctcccttgttggcgtcgactgcttatagttagttcacctgtct咖gg鄉(xiāng)caagaacgccttataggtgctgttattgga卿cgttcttgtctccctcctcc犯acgtggacggttateaagtgcctggatggtcagatgagttaatctagagatcccgaccggcacattcagtcgacatccacctcttatetgcattcat權(quán)利要求1、基因VII型新城疫病毒致弱株A-NDV-VII，其特征在于保藏號為CGMCCNo2141。2、如權(quán)利要求1所述基因VII型新城疫病毒致弱株A-NDV-VII株的構(gòu)建方法，其特征在于以分離株JS-5-05-Go的兩個(gè)囊膜糖蛋白F基因和HN基因片段對新城疫病毒ZJ1株基因組的對應(yīng)部分進(jìn)行替換，得到重組病毒NDV-VII，對重組病毒NDV-VII的F基因進(jìn)行致弱突變后獲得高度致弱的基因VII型新城疫病毒株A-NDV-VII。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述基因VII型新城疫病毒致弱株A-NDV-VII的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下具體步驟1)新城疫病毒ZJ1株基因組的修飾構(gòu)建陽性質(zhì)粒R1R2R3:分別從ZJ1株基因組的2849nt5223nt、2849nt5223nt、2849nt5223nt位置克隆出基因片段Rl、R2、R3，將基因片段R1、R2、R3在質(zhì)粒pCR2.1載體中相連，獲得陽性質(zhì)粒R1R2R3;以含有ZJ1株基因組全長的克隆pNDV/ZJl作模板，用引物5W/1-1和5WI-2擴(kuò)增分離株ZJ1株基因組3602-4505nt之間的片段；用引物&/1-3和1-4擴(kuò)增ZJ1株基因組4501-4861nt之間的片段；再將克隆出的上述兩片段在pCR2.1載體中相連，將相連的兩片段亞克隆至陽性質(zhì)粒R1R2R3中，獲得質(zhì)粒S-R123;上述用于擴(kuò)增的引物序列如下5"a/I畫1:5，-TTCCGCAATGCTCTGCTTAGGGAGTGT-3'1-2:5'-TCGTCGACATGGATCATTGTCTGGTGT-3，I隱3:5，-CGTCGACTGCTTATAGTTAGTTCACC-3'S"/1-4:5，-GTAGTCAGTGTTCTGTTATACGCCTC畫3';2)以分離株JS-5-05-Go的囊膜糖蛋白基因替換ZJ1株基因組的對應(yīng)部分通過兩對引物sFl、sF2和sHNl、sHN2分別擴(kuò)增分離株JS-5-05-Go的囊膜糖蛋白F和HN基因，利用片段中存在的酶切位點(diǎn)將兩擴(kuò)增片段相連，得到質(zhì)粒pF-HN;再將質(zhì)粒pF-HN中的F和HN基因一起替換到質(zhì)粒S-R123上，獲得中間質(zhì)粒mS-R123;然后將JS-5-05-Go株的F和HN基因從質(zhì)粒mS-R123上導(dǎo)入到轉(zhuǎn)錄載體pNDV/ZJl中，從而獲得新的轉(zhuǎn)錄載體pNDV-VII;用于擴(kuò)增的引物序列如下sF1:5，-CGTCGACTGCTTATAGTTAGTTC-3'sF2:5，-TGCTCTTTGGTTGCTTGTTCCCAG-3'sHNl:5，醫(yī)GCAGCCTGTGTGTCAATTCCGAT畫3'sHN2:5'國CTACCCGTGTTCTCCCTTGTTG-3';3)重組病毒NDV-VII株的拯救將pCI-NP、pCI-P禾卩pCI-L三個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄載體pNDV-VII共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞，60h后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞輕輕刮下，與細(xì)胞上清充分混合后接種9~11日齡SPF雞胚，每個(gè)樣品接種3枚，0.4mL/枚，37'C孵育，即獲得重組病毒NDV-VII。4)致弱毒株A-NDV-VII的拯救通過引物經(jīng)OverlapPCR方法，將重組病毒NDV-VII的F基因裂解位點(diǎn)處的核苷酸進(jìn)行突變，從而使相應(yīng)編碼的氨基酸由R^-R-Q-Kns-R-Fi"變?yōu)槿醵咎卣鞯陌被嵝蛄蠫m-R-Q-G115-R-Lm，突變后的質(zhì)粒命名為pA畫NDV-VII;將質(zhì)粒pA-NDV-VII與pCI-NP、pCI-P和pCI-L三個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞，轉(zhuǎn)染18h后加入終濃度為10。/。的SPF雞胚尿囊液，轉(zhuǎn)染60h后將轉(zhuǎn)染樣品接種911日齡SPF雞胚，即獲得基因VII型新城疫病毒致弱株A-NDV-VII;兩對突變引物分別是AF1:5'-GCGrC04CTGCTTATAGTTAGTTCACCTGTCT-3'AF2::5'-GAGGGAGACAAGAACGCCTTATAGGTGCTGTTATTGG-3'屈5'誦AAGGCGTTCTTGTCTCCCTCCTCCAGACGTGGAC-3'AF4:5'-GG7T4rA4AGTGCCTGGATGGTCAGATGAGTTAA-3'。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述基因VII型新城疫病毒致弱毒株A-NDV-VII的構(gòu)建方法，其特征在于步驟4)中通過AF1+AF2和AF3+AF4兩對突變引物分別擴(kuò)增AFa和AFb兩個(gè)片段，凝膠電泳回收AFa和AFb，用引物AF1和AF4將以上兩個(gè)擴(kuò)增片段通過OverlapPCR方法相連，得到裂解位點(diǎn)產(chǎn)生突變的擴(kuò)增片段AF，利用該片段中含有的^/I和尸w'I，替換轉(zhuǎn)錄載體pNDV-Vn上的對應(yīng)部分從而獲得了突變后的質(zhì)粒pA-NDV-VII。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述基因VII型新城疫病毒致弱毒株A-NDV-VII的構(gòu)建方法，其特征在于步驟l)中，從ZJ1株基因組中克隆R1片段的引物為5，-GGGTGAAATGACGCTCAATAAACTCTC-3'5，-ATG"(7rC7TATCTGTGGCCCGAATACT-3，從ZJ1株基因組中克隆R2片段的引物為5，-ATACGrCTCACAGATCACCTCCCCTGCATTAAC—3'5，-GTC404rCTCTGCAACCGGATAGTATCACA-3，從ZJ1株基因組中克隆R3片段的引物為5，-TCCGrC7TAGATCACTCACACTCACATCAAT-3'5，-TCACGACCATCATATCGAAATCTACCATC-3，。全文摘要基因VII型新城疫病毒致弱株A-NDV-VII及其構(gòu)建方法，涉及應(yīng)用反向遺傳技術(shù)，本發(fā)明利用已建立的鵝源新城疫病毒ZJ1株的反向遺傳操作平臺(tái)，將具有高繁殖性能的新城疫病毒分離株JS-5-05-Go的兩個(gè)囊膜糖蛋白F和HN基因片段對ZJ1株基因組的對應(yīng)部分進(jìn)行替換，得到重組病毒NDV-VII，對重組病毒的F基因進(jìn)行致弱突變后拯救出高度致弱的基因VII型新城疫病毒株A-NDV-VII。同時(shí)該病毒在雞胚上具有較高的繁殖滴度，適合于疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)，可用于制造疫苗。文檔編號C12N7/01GK101182494SQ20071013186公開日2008年5月21日申請日期2007年9月5日優(yōu)先權(quán)日2007年9月5日發(fā)明者劉文博,劉秀梵,吳艷濤,慶孫,胡順林申請人:揚(yáng)州大學(xué)