專利名稱：米根霉菌球體單罐半連續(xù)高強度發(fā)酵高光學純度l-乳酸新工藝方法
技術領域：
本發(fā)明涉及霉菌發(fā)酵L-乳酸的新工藝，更具體地說是利用米根霉細胞在攪拌培養(yǎng)體 系中具有聚集、凝絮形成菌絲球的傾向形成菌球體，進而通過菌球體反復發(fā)酵，從而實 現米根霉菌球體單罐半連續(xù)高強度發(fā)酵高光學純度L-乳酸的新工藝，屬于微生物與發(fā)酵 工程領域。
背景技術：
乳酸是世界上公認的三大有機酸之一，它的用途極為廣泛。乳酸、乳酸鹽及其衍生 物廣泛應用于食品、醫(yī)藥、飼料、化工等領域。人體中只含有L-乳酸脫氫酶，只能代 謝L-乳酸。L-乳酸在食品工業(yè)中的使用是絕對安全的，因此世界衛(wèi)生組織提倡在食品及 醫(yī)藥行業(yè)使用L-乳酸取代目前廣泛使用的DL-乳酸。L-乳酸的聚合物——聚L-乳酸(PLA) 是無毒高分子化合物，具有生物相容性，聚L-乳酸是良好的綠色材料，對消除"白色污 染"具有極其重要的意義。在眾多的產乳酸微生物中，米根霉(朋hopus 0JT幼e/AS 3.819)由于具有產物光 學純度高、營養(yǎng)消耗簡單、產物易于分離等特點而成為生產高光學純度L-乳酸的理想菌 株，但是由于發(fā)酵工藝控制方面技術不成熟，工業(yè)生產受阻。菌球體連續(xù)發(fā)酵與傳統(tǒng)分批游離發(fā)酵相比，利用菌球體自固定技術具有細胞負荷 高、生物催化高效、細胞可反復使用等優(yōu)點，并可得到高的目標產量和原料轉化率，易 于實現細胞與產物分離，有利于實現工藝過程的自動化、連續(xù)化，降低生產成本，具體 表現在(l)生物反應器中可以獲得極高的菌體濃度，因而發(fā)酵速率可以大大提高，反 應器設備的生產強度得以強化；(2)產物分離純化過程中菌體從發(fā)酵液中的分離十分容 易；(3)菌球體細胞可以重復或長期使用，這樣既能夠簡化游離細胞過程需要不斷培養(yǎng) 菌體的操作，又減少了營養(yǎng)物質的浪費，提高了生產率。在連續(xù)或半連續(xù)發(fā)酵工藝中，產物和菌體的分離常常是發(fā)酵成敗的關鍵和難點，通 過控制菌球粒徑大小，減輕菌液分離負擔，有利于成功實現連續(xù)或半連續(xù)發(fā)酵。米根霉 深層發(fā)酵生產L-乳酸過程中，菌體形態(tài)復雜，多以絲狀、片狀、球體、團狀、絮狀、結 塊等形態(tài)生長。米根霉菌體形態(tài)強烈的影響著發(fā)酵過程中傳質、溶氧等性能，對其有效 的控制是發(fā)酵成功的關鍵因素之一。因此在控制菌球形態(tài)基礎上成功實現半連續(xù)高強度 發(fā)酵對L-乳酸產業(yè)意義重大。 發(fā)明內容本發(fā)明旨在提供一種運行成本低、發(fā)酵強度高、適于工業(yè)化生產的米根霉菌球體單 罐半連續(xù)高強度發(fā)酵高光學純度L-乳酸新工藝方法。實現上述目的具體工藝步驟如下米根霉菌球體單罐半連續(xù)高強度發(fā)酵高光學純度L-乳酸新工藝方法包括如下工藝 步驟A、 制備高密度高活性米根霉孢子乳懸液將米根霉孢子接種于10 L機械攪拌發(fā)酵罐的液體培養(yǎng)基中，溫度為32°C，通氣流 量2.0L/ (L.min)，攪拌線速度2.4m/s,培養(yǎng)24小時，得到形態(tài)規(guī)則、顆粒均勻的 高密度高活性米根霉菌球體細胞；其液體培養(yǎng)基由下列重量配比的物質組成葡萄糖120 g/L，硫酸銨4 g/L，磷酸 二氫鉀0. 3 g/L，磷酸二氫鈉0. 3 g/L ，硫酸鋅0. 44 g/U硫酸鎂0. 25 g/L，硫酸亞 鐵O.Ol g/L;液體培養(yǎng)基體積為7.5 L;B、 米根霉菌球體細胞的擴培將10L高密度高活性米根霉菌球體細胞無菌轉接至500 L機械攪拌罐的液體培養(yǎng)基 中，溫度為32°C，增大通氣流量至3. 0 L/ (L min)，增大攪拌線速度至3. 6 m/s， 24 小時實現菌球體細胞的更新與擴培，菌球體密度超過104個/L，制得500L罐的米根霉菌 球體細胞；其液體培養(yǎng)基同A步驟中的液體培養(yǎng)基；C、 500L罐單罐首批發(fā)酵將上述制得的500L罐米根霉菌球體細胞，在溫度為32°C、控制通氣2. 0 L/(L *min) 條件下，培養(yǎng)24小時至44小時，通過流加中和劑氫氧化鈣控制發(fā)酵液pH為5.5，發(fā)酵 結束后正壓放料375 L，截流米根霉菌球體，首批罐發(fā)酵得產物L-乳酸，濃度112g/L;D、 500L罐單罐重復發(fā)酵向含有截流米根霉菌球體的500 L罐體內正壓補入新培養(yǎng)基375 L，在0小時至4
小時內，通氣和線速度分別為3.0 L/ (L*min)和3.6 m/s，在其后的20小時內，通 氣和線速度分別為2.0 L/ (L'min)和2. 4 m/s，發(fā)酵結束后無菌正壓放料375 L，截 流米根霉菌球體，得發(fā)酵產物L-乳酸，濃度113g/L;新培養(yǎng)基由下列重量配比的物質組成葡萄糖120g/L，硫酸銨0.5g/L，磷酸二氫 鉀0. 05g/L，磷酸二氫鈉0. 05 g/L ，硫酸鋅0. 04 g/L，硫酸鎂0. Q2 g/L，硫酸亞鐵 0. 01 g/L，新培養(yǎng)基體積為375 L;E、 500L罐單罐連續(xù)進行15批次的半連續(xù)高強度發(fā)酵連續(xù)進行15批次的與D步驟相同單罐半連續(xù)發(fā)酵，每次重復發(fā)酵的裝液系數為 0.75，每次無菌正壓放料排出發(fā)酵液375L，再向罐內正壓補入新培養(yǎng)基375 L; 15批次 的重復發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件均同步驟D;發(fā)酵結束后得發(fā)酵產物L-乳酸，其 濃度為113g/L;每批次產酸穩(wěn)定在110g/L以上，發(fā)酵強度穩(wěn)定在4. 50 g/ (h L)以上，細胞活力 保持在90%以上，得到光學純度在99. 5%以上的L-乳酸。本發(fā)明發(fā)酵工藝與常規(guī)米根霉間歇式分批發(fā)酵工藝相比，有益技術效果體現在以下 幾個方面(1) 、本發(fā)酵工藝方法中懸浮培養(yǎng)體系所形成菌球體的形狀規(guī)則、大小較均一，菌 球體的平均粒徑控制在0. 5mm至3. Omm的范圍內；細胞集聚成菌球體的條件溫和、可控。(2) 、米根霉無載體固定化細胞培養(yǎng)可以在生物反應器中逐級擴大培養(yǎng)，^產生細 胞固定化過程的附加成本。(3) 、能夠成功實現反復發(fā)酵，節(jié)約菌體消耗的N源，降低發(fā)酵成本。(4) 、在反復發(fā)酵過程中，在24小時內產物乳酸濃度超過110g/L，發(fā)酵周期短， 發(fā)酵強度大，適于工業(yè)生產。(5) 、所形成的產物卜乳酸光學純度均在99.5%以上，滿足食品醫(yī)藥要求，完全適 于制備高質量聚L-乳酸。


圖1為米根霉半連續(xù)發(fā)酵菌球體細胞。通過圖中可以看出菌球體呈現形狀規(guī)則、大 小均一的特征。圖2為米根霉菌球體從第11批次到第15批次的半連續(xù)重復發(fā)酵產L-乳酸情況。
具體實施方式
下面結合實施例，對本發(fā)明作進一步地說明。 實施例米根霉菌球體單罐半連續(xù)高強度發(fā)酵高光學純度L-乳酸新工藝方法包括如下工藝 步驟(1) 米根霉孢子的準備將米根霉菌株(^ ko; "s or/幼e /AS 3.819)劃線接種于馬鈴薯葡萄糖(PDA)平 板，第一天設置培養(yǎng)溫度為32'C，相對培養(yǎng)濕度70%，利于菌絲生長，第二天設置培養(yǎng) 溫度為34'C，相對培養(yǎng)濕度為30%，利于孢子生成，待黑色濃密孢子完全覆蓋白色菌絲 后即可準備收集，制得成熟米根霉孢子。(2) 制備高密度高活性米根霉孢子乳懸液 將米根霉孢子刮洗至無菌水中，之后接種于帶有直板式攪拌槳的10L發(fā)酵罐中，溫度為32'C，罐內培養(yǎng)基采用葡萄糖120g/L，硫酸銨((NH4)2S04) 4.g/L，磷酸二氫鉀 (K,) 0. 3g/L，磷酸二氫鈉(NaH2P04) 0. 3 g/L ，硫酸鋅(ZnS04 7H20 ) 0 . 44 g/L， 硫酸鎂(MgS(WH20 ) 0 . 25 g/L，硫酸亞鐵(FeS04) 0.01 g/L。利用血球計數板計數確 保接種后的發(fā)酵罐中的孢子乳懸液濃度超過1()6個/rnL?？刂仆饬髁?. 0 L/ (L *min)， 攪拌線速度2.4m/s，培養(yǎng)24小時得到形態(tài)規(guī)則、顆粒均勻的米根霉菌球體。制得10L 罐的高密度高活性米根霉菌球體細胞，見圖l。(3) 米根霉菌球體細胞的擴培 將10L罐內的培養(yǎng)基全部無菌轉接至500 L機械攪拌罐，培養(yǎng)基同歩驟(2)，溫度為32。C，增大通氣流量至3.0L/ (L'min)，增大攪拌線速度至3. 6 m/s，約24小時實 現菌球體細胞的更新與擴培，菌球體密度超過104個/L。制得500L罐的米根霉菌球體細 胞。(4) 500L罐單罐首批發(fā)酵針對500L罐的米根霉菌球體細胞進行繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24小時至44小時范圍，控 制通氣2. 0 L/ (L min)，通過流加中和劑氫氧化鈣控制發(fā)酵液pH為5. 5，發(fā)酵結束后 通過罐體內置的旋轉濾器無菌正壓放料375L，截流米根霉菌球體。首批罐發(fā)酵得產物 L-乳酸112g/L。(5) 500L罐單罐重復發(fā)酵通過無菌補料管連接，將另一罐內375L無菌新培養(yǎng)基采用正壓方式，向含有上述 截流米根霉菌球體的罐體進行無菌補料。溫度為32i:，在0小時至4小時內，分別調節(jié) 通氣和線速度為3. 0 L/ (L min)和3. 6 m/s，在其后的20小時內，分別調節(jié)通氣和 線速度為2. 0 L/(L 'min)和2. 4 m/s，新培養(yǎng)基采用葡萄糖120 g/L，硫酸銨((NH4)2S04) 0.5 g/L，磷酸二氫鉀(KH2P04) 0.05g/L，磷酸二氫鈉(NaH2P04) 0.05 g/L ，硫酸鋅 (ZnS04 7H20 ) 0, 04 g/L，硫酸鎂(MgS04 7H20 ) 0 . 02 g/L，硫酸亞鐵(FeSO》0. 01 g/L， 發(fā)酵結束后通過罐體內置旋漿過濾器無菌正壓放料375L，截流米根霉菌球體。得發(fā)酵產 物L乳酸濃度113g/L。 '(6) 500L罐單罐連續(xù)進行15批次半連續(xù)高強度發(fā)酵連續(xù)進行15批次的單罐半連續(xù)重復發(fā)酵，S卩每批次發(fā)酵結束后，采用無菌正壓 將375 L的液體發(fā)酵培養(yǎng)基排出，之后通過無菌補料管連接，將另一罐內新培養(yǎng)基采用 正壓，向含有截流米根霉菌球體的罐體進行無菌補料375U在0小時至4小時內，分別調節(jié)通氣和線速度為3. 0 L/ (L min)和3. 6 m/s，在 其后的20小時內，分別調節(jié)通氣和線速度為2. 0 L/ (L'min)和2. 4 m/s，發(fā)酵結束 后通過罐體內置旋漿過濾器無菌正壓放料，得發(fā)酵產物L乳酸。在15批次的重復發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件均同步驟(5)，裝液系數為0.75， 每次排出發(fā)酵液約370L。對每次排出的370 L發(fā)酵培養(yǎng)基檢測表明，L-乳酸的濃度穩(wěn)定在110g/L以上，殘 糖低于0.2%，發(fā)酵液中游離菌體及蛋白濃度低于0.2%，發(fā)酵強度穩(wěn)定在4.50 g/(h*L) 以上，細胞活力保持在90%以上，完全實現了米根霉菌球體單罐半連續(xù)高強度發(fā)酵，所 得卜乳酸轉化率90%以上，光學純度在99.5%以上。從圖2中可以看出在最后持續(xù)5個批次發(fā)酵過程中，米根霉菌球體仍能保持較高發(fā) 酵強度。
權利要求
1、米根霉菌球體單罐半連續(xù)高強度發(fā)酵高光學純度L-乳酸新工藝方法，其特征在于包括如下工藝步驟A、制備高密度高活性米根霉孢子乳懸液將米根霉孢子接種于10L機械攪拌發(fā)酵罐的液體培養(yǎng)基中，溫度為32℃，通氣流量2.0L/(L·min)，攪拌線速度2.4m/s，培養(yǎng)24小時，得到形態(tài)規(guī)則、顆粒均勻的高密度高活性米根霉菌球體細胞；其液體培養(yǎng)基由下列重量配比的物質組成葡萄糖120g/L，硫酸銨4g/L，磷酸二氫鉀0.3g/L，磷酸二氫鈉0.3g/L，硫酸鋅0.44g/L，硫酸鎂0.25g/L，硫酸亞鐵0.01g/L；液體培養(yǎng)基體積為7.5L；B、米根霉菌球體細胞的擴培將10L高密度高活性米根霉菌球體細胞無菌轉接至500L機械攪拌罐的液體培養(yǎng)基中，溫度為32℃，增大通氣流量至3.0L/(L·min)，增大攪拌線速度至3.6m/s，24小時實現菌球體細胞的更新與擴培，菌球體密度超過104個/L，制得500L罐的米根霉菌球體細胞；其液體培養(yǎng)基同A步驟中的液體培養(yǎng)基；C、500L罐單罐首批發(fā)酵將上述制得的500L罐米根霉菌球體細胞，在溫度為32℃、控制通氣2.0L/(L·min)條件下，培養(yǎng)24小時至44小時，通過流加中和劑氫氧化鈣控制發(fā)酵液pH為5.5，發(fā)酵結束后正壓放料375L，截流米根霉菌球體，首批罐發(fā)酵得產物L-乳酸，濃度112g/L；D、500L罐單罐重復發(fā)酵向含有截流米根霉菌球體的500L罐體內正壓補入新培養(yǎng)基375L，在0小時至4小時內，通氣和線速度分別為3.0L/(L·min)和3.6m/s，在其后的20小時內，通氣和線速度分別為2.0L/(L·min)和2.4m/s，發(fā)酵結束后無菌正壓放料375L，截流米根霉菌球體，得發(fā)酵產物L-乳酸，濃度113g/L；新培養(yǎng)基由下列重量配比的物質組成葡萄糖120g/L，硫酸銨0.5g/L，磷酸二氫鉀0.05g/L，磷酸二氫鈉0.05g/L，硫酸鋅0.04g/L，硫酸鎂0.02g/L，硫酸亞鐵0.01g/L，新培養(yǎng)基體積為375L；E、500L罐單罐連續(xù)進行15批次的半連續(xù)高強度發(fā)酵連續(xù)進行15批次的與D步驟相同單罐半連續(xù)發(fā)酵，每次重復發(fā)酵的裝液系數為0.75，每次無菌正壓放料排出發(fā)酵液375L，再向罐內正壓補入新培養(yǎng)基375L；15批次的重復發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件均同步驟D；發(fā)酵結束后得發(fā)酵產物L-乳酸，其濃度為113g/L；每批次產酸穩(wěn)定在110g/L以上，發(fā)酵強度穩(wěn)定在4.50g/(h·L)以上，細胞活力保持在90％以上，得到光學純度在99.5％以上的L-乳酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了米根霉菌球體單罐半連續(xù)高強度發(fā)酵高光學純度L-乳酸新工藝方法，涉及如下步驟(1)制備高密度高活性米根霉孢子乳懸液，(2)米根霉菌球體細胞無菌轉接至500L機械攪拌罐的擴培，(3)500L罐單罐首批發(fā)酵，(4)500L罐單罐重復發(fā)酵，(5)500L罐單罐連續(xù)進行15批次半連續(xù)高強度發(fā)酵。本發(fā)酵工藝方法中懸浮培養(yǎng)體系所形成菌球體的形狀規(guī)則、大小較均一；能夠成功實現反復發(fā)酵，節(jié)約菌體消耗的N源及其它無機鹽，降低發(fā)酵成本；其發(fā)酵周期短，發(fā)酵強度大，適于工業(yè)生產；所形成的產物L-乳酸光學純度均在99.5％以上，滿足食品醫(yī)藥要求，完全適于制備高質量聚L-乳酸。
文檔編號C12P7/56GK101153297SQ20071013151
公開日2008年4月2日 申請日期2007年8月30日 優(yōu)先權日2007年8月30日
發(fā)明者姜紹通, 羽 朱, 李興江, 潘麗軍, 羅水忠, 志 鄭 申請人:合肥工業(yè)大學