專利名稱：低變態(tài)反應(yīng)性蜂王漿的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種低變態(tài)反應(yīng)性蜂王漿的制造方法。
背景技術(shù)：
已知蜂王漿是有用的天然原材料，另一方面，有時引起變態(tài)反應(yīng)。
作為低變態(tài)反應(yīng)性蜂王漿，已知有通過對蜂王漿施行糖酵解處理及蛋白分解酶處理，使變態(tài)反應(yīng)性減低至基本上不能顯示的程度的低變態(tài)反應(yīng)性蜂王漿(參照特開2002-112715號公報)。在特開2005-287411號公報中，公開有使用中性肽鏈內(nèi)切酶降低蜂王漿的變態(tài)反應(yīng)性。但是，由于用這些方法進(jìn)行過酶處理的蜂王漿依然具有變態(tài)反應(yīng)性，故謀求進(jìn)一步減低了變態(tài)反應(yīng)性的蜂王漿。
特開2001-333794號公報記載有了用肽鏈內(nèi)切酶和肽鏈外切酶兩者對引起食物變態(tài)反應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行處理。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種低變態(tài)反應(yīng)性蜂王漿的制造方法，該方法一方面抑制蜂王漿具有的有用的生理活性的降低，另一方面減低變態(tài)反應(yīng)性。
為了完成上述目的反復(fù)進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過利用肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩方面作用對蜂王漿進(jìn)行處理，意外地得到一方面維持蜂王漿的有用的生理活性，另一方面使變態(tài)反應(yīng)性進(jìn)一步減低的低變態(tài)反應(yīng)性蜂王漿。
即，本發(fā)明是提供以下的低變態(tài)反應(yīng)性蜂王漿的制造方法。
1.一種降低變態(tài)反應(yīng)性的蜂王漿的制造方法，其特征在于，利用肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用，同時或依次對蜂王漿進(jìn)行處理。
2.如1所述的方法，其特征在于，用具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的至少1種酶，對蜂王漿進(jìn)行處理。
3.如1所述的方法，其特征在于，用具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的至少1種酶及肽鏈外切酶，同時或依次對蜂王漿進(jìn)行處理。
4.如1所述的方法，其特征在于，用具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的至少1種酶及肽鏈內(nèi)切酶，同時或依次對蜂王漿進(jìn)行處理。
發(fā)明效果依據(jù)本發(fā)明，可以解決維持蜂王漿的有用性和減低變態(tài)反應(yīng)性兩者難以均衡的課題。
在對蛋白質(zhì)進(jìn)行肽酶處理時，如果同時使用肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用，則在肽鏈的內(nèi)部和末端這兩者被徹底切斷。通常認(rèn)為，在像專利文獻(xiàn)3那樣想要消除引起食物變態(tài)反應(yīng)的蛋白質(zhì)的抗原性時，即使用這種方法處理蛋白質(zhì)也沒問題，但如果對蜂王漿之類的有用物質(zhì)同時使用肽鏈內(nèi)切酶和肽鏈外切酶，則其生理活性會大幅度降低或消失。
但是，依據(jù)本發(fā)明，可以得到無法預(yù)料的結(jié)果通過肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用的同時使用，不僅其抗原性可以降低，而且維持有用的生理活性。
即，如后述實驗例所示，本發(fā)明的蜂王漿處理物具有發(fā)揮如下優(yōu)良作用效果的特征在看不出被稱為主要生理活性成分的癸烯酸含量損失的基礎(chǔ)上，顯示出降壓作用及抗抑郁作用，而且顯著地抑制抗原性。
特別是用具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的酶對蜂王漿進(jìn)行處理后，再用肽鏈外切酶進(jìn)行處理，可以得到抗原性進(jìn)一步降低、有用的生理活性得以維持的蜂王漿處理物。


圖1經(jīng)酶處理的RJ游離組胺的試驗結(jié)果圖2經(jīng)酶處理的RJ的抗抑郁作用評價圖3經(jīng)酶處理的RJ的ACE抑制作用的比較具體實施方式
下面，將蜂王漿略記為“RJ”。
RJ是將蜜蜂中日齡3～12日的工蜂從下咽頭腺及大顎腺分泌的分泌物混合而成的乳白色膠狀物質(zhì)。作為RJ中的主要生理活性成分，可以列舉例如以RJ中特有的10-羥基癸烯酸(下面，記載為癸烯酸)等為代表的有機酸類；蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類、維生素B類或葉酸、煙酸、泛酸等維生素類；各種礦物質(zhì)類等。作為該RJ的生理活性及藥理作用，已知有抗菌作用、增強免疫作用、抗抑郁作用、抗腫瘤作用、抗炎作用、促進(jìn)血液循環(huán)作用等。另外，也有報告稱有減低抗癌劑的副作用及放射線傷害時的延長壽命效果。
作為用于制造低變態(tài)反應(yīng)性RJ的原料，可以使用生RJ或使用生RJ進(jìn)行干燥、粉末化的RJ粉末。RJ的產(chǎn)地可以是日本、中國、巴西、歐洲各國、大洋洲各國、美國等任意一國。
在本發(fā)明中，利用肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用，同時或依次對RJ原料進(jìn)行處理。
作為本發(fā)明中使用的肽鏈內(nèi)切酶，只要是至少具有肽鏈內(nèi)切酶活性的蛋白分解酶，任何物質(zhì)都可以，可以廣泛例示來源于動物(例如胰蛋白酶、肝胰蛋白酶等)、來源于植物(例如木瓜蛋白酶等)或來源于微生物(例如乳酸菌、酵母、真菌、枯草桿菌、放線菌等)的肽鏈內(nèi)切酶。
作為肽鏈外切酶，只要是至少具有肽鏈外切酶活性的蛋白分解酶都可以，可以例示羧基肽酶、氨基肽酶或來源于微生物(例如乳酸菌、曲霉屬菌、根霉屬菌)的肽鏈外切酶、或同時還具有肽鏈內(nèi)切酶活性的胰酶、胃蛋白酶等。
肽酶包括實質(zhì)上僅具有肽鏈外切酶作用的酶、實質(zhì)上僅具有肽鏈內(nèi)切酶作用的酶、具有肽鏈外切酶作用和肽鏈內(nèi)切酶作用這兩種作用的酶。其中，具有肽鏈外切酶作用和肽鏈內(nèi)切酶作用這兩種作用的酶當(dāng)肽鏈內(nèi)切酶作用較強時，可以作為“肽鏈內(nèi)切外切酶”使用，而當(dāng)其肽鏈外切酶活性強時，可以作為“肽鏈外切酶”使用，當(dāng)肽鏈外切酶作用和肽鏈內(nèi)切酶作用等同或幾乎等同時，可以作為同時具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用的酶使用。
在這樣的各種酶內(nèi)，作為具有肽鏈外切酶活性和肽鏈內(nèi)切酶活性這兩者的酶優(yōu)選的實例，可以列舉灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)產(chǎn)生的肽酶(商品名アクチナ一ゼAS)、米曲霉(ASpergillus oryzae)產(chǎn)生的肽酶(商品名プロテア一ゼA、フレ一バ一ザイム)、蜂蜜曲霉(ASpergillus melleus)產(chǎn)生的肽酶(商品名プロテア一ゼP)，另外，作為具有肽鏈外切酶作用的酶優(yōu)選的實例，可以列舉米曲霉(ASpergillusoryzae)產(chǎn)生的肽酶(商品名ウマミザイムG、Promod 192P、Promod194P、スミチ一ムFLAP)、醬油曲霉(ASpergillus sojae)產(chǎn)生的肽酶(商品名Sternzyme BP15024)、曲霉屬產(chǎn)生的肽酶(商品名コクラ一ゼP)、米根霉(Rhizopus oryzae)產(chǎn)生的肽酶(商品名ペプチダ一ゼR)。而且，具有肽鏈內(nèi)切酶作用的酶優(yōu)選的實例，可以列舉枯草桿菌(Bacillussubtilis)產(chǎn)生的肽酶(商品名ォリエンタ一ゼ22BF、ヌクレイシン)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)產(chǎn)生的肽酶(商品名アルカラ一ゼ)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermopHilus)產(chǎn)生的肽酶(商品名プロテア一ゼS)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)產(chǎn)生的肽酶(商品名ニユ一トラ一ゼ)、桿菌屬產(chǎn)生的肽酶(商品名プロタメツクス)。
依據(jù)本發(fā)明的RJ原料的酶處理是將肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩者進(jìn)行組合。作為其實施方式，例如如下方法(1)利用肽鏈內(nèi)切酶作用處理后，利用肽鏈外切酶作用進(jìn)行處理；(2)利用肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶這兩者的作用同時進(jìn)行處理；(3)利用肽鏈內(nèi)切酶作用處理后，利用肽鏈內(nèi)切酶和肽鏈外切酶這兩者的作用進(jìn)行處理；(4)利用肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶這兩者的作用處理后，利用肽鏈外切酶作用進(jìn)行處理；(5)利用具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶這兩者作用的酶和肽鏈內(nèi)切酶這兩者同時進(jìn)行處理。
即，本發(fā)明中的酶處理可以以一階段酶反應(yīng)及二階段酶反應(yīng)中的任意一種實施，從低變態(tài)反應(yīng)性效果及操作簡便性方面來考慮，優(yōu)選以一階段酶反應(yīng)實施。但是，在以2階段進(jìn)行酶處理時，在第1階段用具有肽鏈內(nèi)切酶作用的酶(可以進(jìn)一步具有肽鏈外切酶作用)進(jìn)行處理，在第2階段用具有肽鏈外切酶作用的酶(可以進(jìn)一步具有肽鏈內(nèi)切酶作用)進(jìn)行處理。當(dāng)利用肽鏈內(nèi)切酶和肽鏈外切酶這兩者的作用進(jìn)行的處理為第1階段時，優(yōu)選肽鏈內(nèi)切酶作用足夠強，當(dāng)其為第2階段時，優(yōu)選肽鏈外切酶作用足夠強。
肽鏈內(nèi)切酶作用可以是一種酶的肽鏈內(nèi)切酶作用，也可以是兩種以上酶的肽鏈內(nèi)切酶作用的總和。同樣，肽鏈外切酶作用可以是一種酶的肽鏈外切酶作用，也可以是兩種以上酶的肽鏈外切酶作用的總和。
需要說明的是，所謂“利用肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶的這兩者的作用的處理”，包含同時使用肽鏈內(nèi)切酶和肽鏈外切酶進(jìn)行處理的情況和用含有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的一種酶進(jìn)行處理的情況。
肽鏈內(nèi)切酶/肽鏈外切酶的使用量，相對于RJ原料，因RJ原料濃度、酶效價、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時間而異，但一般來講，通過添加單獨或組合多個能充分分解RJ原料蛋白質(zhì)的量的酶，進(jìn)行水解。另外，酶的添加可以是一次性添加，也可以是少量多次添加。
進(jìn)行肽酶處理的RJ原料的pH值，可以與使用酶的最佳pH相對應(yīng)，從pH2～10的范圍中選擇。具體而言，在前述肽酶溶液中添加酶之前，根據(jù)使用酶的種類不同，實施在pH2～10的范圍內(nèi)通過添加酸或堿液、或緩沖劑以調(diào)整為所希望的pH。此時，酸可以例示鹽酸、檸檬酸、磷酸等；堿液可以例示氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鉀等；緩沖劑可以例示磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液等。
肽酶處理的溫度沒有特別限制，可以從包含顯現(xiàn)酶作用的最佳溫度范圍的可供實用的范圍，即通常在30～70℃的范圍中選擇。通過將溫度維持在比肽酶的最佳溫度高一些或低一些，例如50～60℃的范圍，還可以防止在酶處理工序中的腐敗。
肽酶處理的時間依賴于所用酶的種類以及組合、反應(yīng)溫度、pH等反應(yīng)條件，沒有特別限定。
通過將酶失活或除去來終止酶處理?？梢酝ㄟ^加熱處理(例如在80℃，15分鐘等)進(jìn)行失活操作。
實施例下面，根據(jù)實施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但不用說本發(fā)明不限定于這些實施例。
實施例1在500ml燒杯中量取生RJ200g，加入離子交換水100ml攪拌至均勻，配制成RJ稀釋液。加入2N NaOH水溶液，將RJ稀釋液的pH調(diào)整為8.7～8.9。然后，將在20ml離子交換水中溶解有具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的アクチナ一ゼAS(科研制藥)2g、作為肽鏈外切酶的ウマミザイムG(天野エンザイム)1g的溶液加入到RJ稀釋液中，再加入離子交換水，以使離子交換水的總量為200ml。將反應(yīng)混合物一邊用螺旋槳式攪拌器進(jìn)行攪拌，一邊在50℃(恒溫水槽)下使其反應(yīng)4小時進(jìn)行水解。將恒溫水槽的溫度上升至80℃使酶失活后，進(jìn)行水冷。
實施例2取代アクチナ一ゼAS和ウマミザイムG，使用具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的アクチナ一ゼAS(科研制藥)作為酶，除此之外，與實施例1同樣操作，得到RJ酶分解物。
實施例3在50ml三角燒瓶中量取生RJ 3g，加入離子交換水1ml攪拌至均勻，配制成RJ稀釋液。加入10N NaOH水溶液，將RJ稀釋液的pH調(diào)整為7.8～8.0。然后，將具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的アクチナ一ゼAS(科研制藥)30mg和同樣具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的フレ一バ一ザイム(ノボザイムズ)15mg分別加入到RJ稀釋液中，再加入離子交換水，使離子交換水的總量為3ml。將反應(yīng)混合物一邊在恒溫水槽振蕩，一邊在40℃下使其反應(yīng)16小時，進(jìn)行水解。將恒溫水槽的溫度上升至80℃使酶失活后，進(jìn)行水冷。
實施例4使用具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的アクチナ一ゼAS(科研制藥)30mg、具有肽鏈內(nèi)切酶作用的プロタメツクス(ノボザイムズ)30mg、以及具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的フレ一バ一ザイム(ノボザイムズ)30mg作為酶，除此之外，與實施例1同樣操作，得到RJ酶分解物。
實施例5取代アクチナ一ゼAS和フレ一バ一ザイム，使用具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的プロテア一ゼP(天野エンザイム)作為酶，除此之外，與實施例3同樣操作，得到RJ酶分解物。
實施例6取代アクチナ一ゼAS和フレ一バ一ザイム，使用具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的プロテア一ゼA(天野エンザイム)作為酶，除此之外，與實施例3同樣操作，得到RJ酶分解物。
實施例7取代アクチナ一ゼAS和フレ一バ一ザイム，使用具有肽鏈內(nèi)切酶作用的ォリエンタ一ゼ22BF(エイチビイアイ)和具有肽鏈外切酶作用的ウマミザイムG(天野エンザイム)作為酶，除此之外，與實施例3同樣操作，得到RJ酶分解物。
實施例8使用具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的アクチナ一ゼAS(科研制藥)和同樣具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的プロテア一ゼA(天野エンザイム)作為酶，除此之外，與實施例3同樣操作，得到RJ酶分解物。
實施例9使用具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的アクチナ一ゼAS(科研制藥)和具有肽鏈外切酶作用的SternzymeBP15024(SternEnzyme)作為酶，除此之外，與實施例3同樣操作，得到RJ酶分解物。
實施例10使用具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的アクチナ一ゼAS(科研制藥)和具有肽鏈內(nèi)切酶作用的プロタメツクス(ノボザイムズ)作為酶，除此之外，與實施例3同樣地操作，得到RJ酶分解物。
實施例11使用具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的アクチナ一ゼAS(科研制藥)和具有肽鏈內(nèi)切酶作用的ォリエンタ一ゼ22BF(エイチビイアイ)作為酶，除此之外，與實施例3同樣操作，得到RJ酶分解物。
實施例12使用具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的フレ一バ一ザイム(ノボザイムズ)和具有肽鏈內(nèi)切酶作用的アルカラ一ゼ(ノボザイムズ)作為酶，除此之外，與實施例3同樣操作，得到RJ酶分解物。
實施例13使用具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的フレ一バ一ザイム(ノボザイムズ)和具有肽鏈內(nèi)切酶作用的プロタメツクス(ノボザイムズ)作為酶，除此之外，與實施例3同樣操作，得到RJ酶分解物。
實施例14
使用具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的アクチナ一ゼAS(科研制藥)、具有肽鏈內(nèi)切酶作用的アルカラ一ゼ(ノボザイムズ)、以及具有肽鏈外切酶作用的Promod194P(Biocatalysts)作為酶，除此之外，與實施例1同樣操作，得到RJ酶分解物。
實施例15使用具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的アクチナ一ゼAS(科研制藥)、具有肽鏈內(nèi)切酶作用的プロタメツクス(ノボザイムズ)、以及具有肽鏈外切酶作用的Promod192P(Biocatalysts)作為酶，除此之外，與實施例1同樣操作，得到RJ酶分解物。
實施例16使用具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的アクチナ一ゼAS(科研制藥)、具有肽鏈內(nèi)切酶作用的プロタメツクス(ノボザイムズ)、以及具有肽鏈外切酶作用的Promod194P(Biocatalysts)作為酶，除此之外，與實施例1同樣操作，得到RJ酶分解物。
實施例17使用具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的アクチナ一ゼAS(科研制藥)、具有肽鏈內(nèi)切酶作用的プロタメツクス(ノボザイムズ)，以及具有肽鏈外切酶作用的ウマミザイムG(天野エンザイム)作為酶，除此之外，與實施例1同樣操作，得到RJ酶分解物。
實施例18使用具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的アクチナ一ゼAS(科研制藥)、具有肽鏈內(nèi)切酶作用的プロタメツクス(ノボザイムズ)，以及具有肽鏈內(nèi)切酶作用的アルカラ一ゼ(ノボザイムズ)作為酶，除此之外，與實施例1同樣操作，得到RJ酶分解物。
實施例19
使用具有肽鏈內(nèi)切酶作用的ニユ一トラ一ゼ(ノボザイムズ)和具有肽鏈外切酶作用的コクラ一ゼP(三京ライフテツク)作為酶，除此之外，與實施例3同樣操作，得到RJ酶分解物。
實施例20使用具有肽鏈內(nèi)切酶作用的ヌクレイシン(エイチビイアイ)和具有肽鏈外切酶作用的ペプチダ一ゼR(天野エンザイム)作為酶，除此之外，與實施例3同樣操作，得到RJ酶分解物。
實施例21使用具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的アクチナ一ゼAS(科研制藥)和具有肽鏈外切酶作用的スミチ一ムFLAP(新日本化學(xué)工業(yè))作為酶，除此之外，與實施例3同樣操作，得到RJ酶分解物。
比較例使用作為肽鏈內(nèi)切酶的プロテア一ゼN(天野エンザイム)和β-甘露糖苷酶(新日本化學(xué)工業(yè)社製スミチ一ムACH)作為酶，除此之外，與實施例1同樣操作，得到RJ酶分解物。
實驗例1<對蜂王漿的肽酶處理物的抗原蛋白消失的確認(rèn)>
對由實施例1～21得到的分解物進(jìn)行免疫印跡，確認(rèn)抗原蛋白質(zhì)的消失。將各樣本用3×樣本緩沖液(187.5mMTris-鹽酸pH6.8、6％SDS、75％甘油、0.03％溴酚藍(lán)、1.5M 2-巰基乙醇)稀釋3倍，在95℃下加熱5分鐘。然后，使用15％丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE。使用SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)品，Low Range(BIO RAD社)作為分子量標(biāo)記。將在凝膠上展開的蛋白質(zhì)用半干燥式印跡裝置轉(zhuǎn)印在PVDF薄膜(BIO RAD社)上，浸入封閉緩沖液(2％脫脂奶粉、10mM Tris-鹽酸pH7.5、100mM氯化鈉、0.05％吐溫(tween)20)中，在室溫下振蕩1小時。然后，將薄膜浸入用封閉緩沖液稀釋的患者血清中，在4℃靜置過夜。而且，浸入用封閉緩沖液稀釋的抗人IgE抗體(KPL社)中，在37℃靜置1小時。最后，使用ECLplus試劑盒(GEバイォサイエンス社)，將薄膜浸入按照附屬的實驗方案配制而成的發(fā)光液中，用ECL Mini-Camera(GEバイォサイエンス社)檢測。
對試驗過的全部樣本，目測確認(rèn)與患者血清發(fā)生反應(yīng)的抗原蛋白質(zhì)是否消失。
需要說明的是，對血清提供者發(fā)放記載有本試驗內(nèi)容的說明書，在充分說明了試驗的旨意及內(nèi)容的基礎(chǔ)上，僅將根據(jù)本人意愿參加、簽訂意向同意書的人所得到的血清用于本試驗。
實驗例2<游離組胺試驗>
對未處理RJ、由實施例1～4、比較例得到的RJ酶分解物、變態(tài)反應(yīng)原mix(陽性對照)、抗IgE受體抗體(陽性對照)，利用CAST法(cellularantigen stimulation test)測定游離的組胺量。
具體來講，相對于生RJ，對經(jīng)歷過變態(tài)反應(yīng)的某受試者的血液樣本，使生RJ或該酶水解物或陽性對照發(fā)揮作用，測定游離的組胺量。對受試者發(fā)放記載有本試驗內(nèi)容的說明書，充分說明試驗的旨意及內(nèi)容，僅對根據(jù)受試者本人意愿參加、簽訂意向同意書的人進(jìn)行了本試驗。
使用市售的ELISA試劑盒(Histamine ELISA(由IMMUNO-BIOLOGICAL LABORATORIES社制造))進(jìn)行游離組胺的測定。需要說明的是，變態(tài)反應(yīng)原mix含有下述變態(tài)反應(yīng)原。
變態(tài)反應(yīng)原mix鴨茅、寬葉牛毛草(ヒロハウシノケグサ)、黑麥草、梯牧草、肯塔基藍(lán)草、絨毛草、黑麥、樺樹、榛樹、艾蒿、長葉車前草、鏈格孢、屋塵螨、粉塵螨、貓的毛皮、狗的毛皮、卵白蛋白、牛奶、鱈魚、花生、大豆。
將結(jié)果示于表1及圖1。
表1經(jīng)酶處理的RJ的游離組胺

表1及圖1中的EC50(50％有效濃度)是指使最大值的50％的組胺游離的試驗物質(zhì)的濃度。
由上述結(jié)果表明，通過同時使用肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用，能有效降低RJ的抗原性。
實驗例3<酶處理RJ的癸烯酸量>
對實施例1的樣本，用使用有反相柱的HPLC進(jìn)行癸烯酸量的測定。HPLC的條件為柱，YMC-Pack ODS-AM(內(nèi)徑4.6mm、長150mm)；移動相，10mM磷酸緩沖液和甲醇的混合液(56∶44，pH2.6)；流速，1ml/分鐘；檢測波長，210nm。將結(jié)果示于表2。
表2

沒有看到經(jīng)酶處理(實施例1)的癸烯酸量的降低。
實驗例4<酶處理RJ的抗抑郁作用評價>
為了確認(rèn)未處理的RJ及由實施例2得到的RJ酶分解物的抗抑郁效果，測定小鼠恐怖條件誘發(fā)不動時間。
方法在フエア一ドコンデイション計測裝置(Acti Metrics社)中對小鼠施行電刺激負(fù)荷后，對試驗檢體給藥7天。給藥后，再放入フエア一ドコンデイシヨン計測裝置中，在無電刺激的條件下測定4分鐘的不動時間。將結(jié)果示于表3及圖2。
表3

觀察到介質(zhì)對照組相對于介質(zhì)對照(無電刺激)組，在0～240秒的所有時間中的不動時間的有意延長。另外，觀察到未處理及實施例2處理RJ相對于介質(zhì)對照組，有效縮短不動時間。而且，沒有看到經(jīng)酶處理后作用的降低。
實驗例5<經(jīng)酶處理的RJ的ACE抑制>
對由實施例1、實施例2及比較例得到的RJ分解物測定ACE抑制作用。
○試劑的配制硼酸緩沖液(pH8.3)200mM硼酸(H3BO3)、50mM四硼酸鈉(Na2B4O7)基質(zhì)溶解液200mM硼酸(H3BO3)、50mM四硼酸鈉(Na2B4O7)、1M氯化鈉(NaCl)基質(zhì)溶液將Bz-Gly-His-Leu·H2O(ペプチド研究所)溶解于基質(zhì)溶解液，作成12.5mM。
酶溶液將來源于兔肺的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Sigma)溶解于硼酸緩沖液，作成25mU/ml。
○實驗操作在25μL試樣溶液中加入酶溶液50μL進(jìn)行攪拌，且在37℃下靜置5分鐘。進(jìn)一步加入50μL基質(zhì)溶液進(jìn)行攪拌，且在37℃下靜置1小時。在該溶液中加入0.5N鹽酸溶液125μL進(jìn)行攪拌，使反應(yīng)停止，將由此而成的溶液作為試驗液。另一方面，將試樣溶液25μL、酶溶液50μL、0.5N鹽酸溶液125μL混合，在37℃下靜置5分鐘后，加入50μL基質(zhì)溶液進(jìn)行攪拌，且在37℃下靜置1小時，將由此而成的溶液作為空白溶液。然后，在試驗液及空白溶液中分別加入750μL醋酸乙酯，使用渦流劇烈攪拌15秒后，進(jìn)行離心分離(在室溫、2,000rpm下10分鐘)，分別分取上層液250μL(醋酸乙酯層)。利用減壓加熱干燥法完全除去醋酸乙酯后，將析出物溶解于1M氯化鈉溶液500μL中。此外，使用對純化水進(jìn)行同樣操作而成的液體取代試樣溶液作為對照液。對這些液體用紫外可見吸光光度測定法測定波長為228nm下的吸光度。
○ACE抑制率的計算抑制率(％)＝100-100×(As-Abs)/(Ac-Abc)Ac加入水進(jìn)行操作而成的液體取代試樣溶液的吸光度As試樣溶液的吸光度
Abc加入水進(jìn)行操作而成的液體的空白液取代試樣溶液的吸光度Abs試樣溶液的空白液的吸光度將結(jié)果示于表4及圖3。
表4

可以看出實施例1及實施例2處理RJ比比較例處理RJ的ACE抑制作用高。
權(quán)利要求
1.一種降低變態(tài)反應(yīng)性的蜂王漿的制造方法，其特征在于，利用肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用，同時或依次對蜂王漿進(jìn)行處理。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，用具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的至少1種酶，對蜂王漿進(jìn)行處理。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，用具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的至少1種酶及肽鏈外切酶，同時或依次對蜂王漿進(jìn)行處理。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，用具有肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用這兩種作用的至少1種酶及肽鏈內(nèi)切酶，同時或依次對蜂王漿進(jìn)行處理。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可以減低變態(tài)反應(yīng)性的蜂王漿的制造方法，其特征在于，利用肽鏈內(nèi)切酶作用和肽鏈外切酶作用，同時或依次對蜂王漿進(jìn)行處理。
文檔編號A23L1/076GK101061835SQ20071009670
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月6日 公開號200710096706.發(fā)明者山田英生, 菅野智子, 柳原美彌子, 橋本健, 松浦幸永, 沖原清司, 雪吉晃子 申請人:株式會社山田養(yǎng)蜂場 被以下專利引用 (2),