專利名稱：Phi BT1-TAT-NLS-HIS6整合酶及其制備方法與應(yīng)用,其多克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)和基因治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于定點整合的蛋白酶Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶及其制備方法和應(yīng)用，其多克隆抗體及其應(yīng)用。
技術(shù)背景噬菌體Phi BT1整合酶作為絲氨酸重組酶家族的一員，具有在生物體外和體內(nèi)識別特 異性核酸序列，進行不可逆的DNA重組反應(yīng)的能力。在哺乳動物細胞中，噬菌體Phi BT1整合酶可將外源核苷酸序列定點整合到基因組的 特異性位點上，近年來已成為在哺乳動物細胞中進行轉(zhuǎn)基因位點特異性重組操作和基因治 療的有用工具。在生物體外的基因操作中，噬菌體Phi BT1整合酶可以將帶有特定核酸序列(attB，attP) 的大片段核酸分子，進行分子間和分子內(nèi)的重組，構(gòu)建出新的核酸分子，從而成為DNA 重組的工具。本發(fā)明以原核表達系統(tǒng)表達純化了毫克級的Phi BTl-TAT-NLS -HIS6整合酶，在體內(nèi) 外建立了應(yīng)用重組Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶的方法。并以純化的Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶蛋白為抗原，制備了動物抗Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶的多克隆抗體， 抗體特異性檢測證明其可以特異性識別Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶，可以用于檢測Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶蛋白和封閉Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶的作用。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶蛋白的功能性表達和多克 隆抗體制備方法與應(yīng)用。1.本發(fā)明提出的表達重組Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶蛋白的方法如下 使用大腸桿菌表達Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶蛋白并用NTA樹脂純化Phi BT1-TAT-NLS-HIS6整合酶蛋白。利用基于PCR引物末端修飾的技術(shù)，通過多輪PCR操 作在Phi BT1整合酶表達框架3、附加表達編碼-TAT -NLS -HIS6的序列，從而形成Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶標(biāo)大框架，將其克隆到原核表達載體pET22b(+) (Novagen, USA) 上，經(jīng)測序鑒定正確后，轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)菌株(Promega,USA)中，進行大量誘導(dǎo)表達和 純化。為保證其活性，探索到條件為低溫誘導(dǎo)(15-25QC， 12-24小時)，采用含咪唑的 高鹽緩沖液(0.5-2MNaCl)梯度洗脫收集純化蛋白。 2. 表達純化Phi BTl-TAT -NLS -HIS6蛋白的應(yīng)用Phi BTl-TAT -NLS -HIS6蛋白應(yīng)用Phi BTl-TAT -NLS -HIS6蛋白在體外可以用于介 導(dǎo)兩個含有PhiBTl特異性的分子之間的DNA片段之間的互換，實現(xiàn)體外常規(guī)基因操作； Phi BTl-TAT -NLS -HIS6蛋白可以與含有Phi BT1特異性att序列的基因片段共同轉(zhuǎn)染細 胞，并且可以介導(dǎo)該外源基因整合到宿主染色體DNA。3. 制備Phi BTl-TAT -NLS -HIS6蛋白多克隆抗體及抗體應(yīng)用利用原核表達的噬菌體Phi BTl-TAT-NLS -HIS6整合酶蛋白，按常規(guī)方法與福氏佐劑 (Sigma)混合免疫新西蘭大白兔，第一次Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶蛋白與完全福氏佐 劑(Sigma)混合免疫，然后每1-2周用Phi BTl-TAT -NLS .HIS6整合酶蛋白與不完全福氏佐劑 (Sigma)強化免疫，最后常規(guī)放血植被血清，該血清為用蛋白A-S印harose (Amersham Pharmacia Biotech AB)從抗體陽性的家兔血清中分離總IgG即為制備的抗Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶的多克隆抗體，此抗體可以特異性識別真核與原核表達的Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶。并能夠在免疫組織化學(xué)方面定位Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶蛋白 及封閉Phi BTl-TAT -NLS -HIS6整合酶的作用。


圖1表達純化PhiBTl-TAT-NLS-His6。圖片上方序號為泳道，右側(cè)數(shù)值為分子量。1:陰性對照；2:表達Phi BT1-TAT-NLS-His6 細菌全菌裂解液；3:表達PhiBTl-TAT-NLS-His6細菌裂解液可溶部分；4:洗柱液，第一 次；5:洗柱液，第二次；6， 7:含純化Phi BT1-TAT-NLS-His6的洗脫液；8:低分子量蛋 白標(biāo)準品。圖2制備Phi BT1多克隆抗體的滴度與特異性A:連續(xù)稀釋滴定PhiBTl多克隆抗體的滴度；B:用Phi BT1多克隆抗體檢測表達Phi BT1-TAT-NLS-His6細菌全菌裂解液westernblots。圖3 Phi BT1多克隆抗體檢測PhiBTl細胞內(nèi)定位1:表達Phi BT1的細胞用DAPI染色；2:同一視野用Phi BT1多克隆抗體-羅丹名染色。
具體實施方式
1.構(gòu)建表達Phi BTl-TAT -NLS -HIS6的質(zhì)粒(1)使用附加Nde I位點PhiBTl整合酶基因特異性5、引物(SEQ n")和附加TAT 編碼序列的phiBTl整合酶基因特異性3、引物(SEQ Nq2)，采用常規(guī)PCR方法(分子克隆) 從Phi BT1基因組中擴增產(chǎn)生含3'附加TAT編碼序列的Phi BT1整合酶閱讀框。PCR體系(引物(SEQ M"2l;SEQ W2)， PfU DNA polymerase lu(lul, Sagon)， Pfo DNA polymerase buffer 5ul (Sagon), Phi BT基因組DNA lul, H20 39ul), PCR循環(huán)(94。C lmin， 94°C 30sec-55 °C 30sec-72°C lmin循環(huán)25次，72°C 5min)。常規(guī)純化PCR產(chǎn)物(Qiagen PCR purification kit)。采用Qiagen PCR extract kit純化(反應(yīng)物加PB Buffer (Qiagen) 500ul并混勻，混合物 加到PCR extract column (Qiagen) 1200rpm離心lmin,用0.5ml PE buffer (Qiagen) 1200rpm 離心lmin清洗一次，再1200rpm離心lmin —次，PCR extract column力B 50ul Elute buffer (Qiagen), 1200rpm離心lmin洗脫)收集產(chǎn)物。(2) 使用附加Nde I位點phiBTl整合酶基因特異性5'引物(SEQ N")和附加部分 NLS編碼序列，TAT特異性3、引物(SEQ Ns3)，以(1)純化的PCR產(chǎn)物為模板，常規(guī) PCR，條件同上(1)，擴增產(chǎn)生編碼C端附加TAT和部分NLS序列的Phi BT1整合酶閱讀 框，如(1)所描述的常規(guī)方法純化PCR產(chǎn)物(Qiagen PCR purification kit)。(3) 使用附加NdeI位點PhiBTl整合酶基因特異性5'引物(SEQ N21)和附加其余 部分NLS和His6表達標(biāo)簽和Xho I酶切位點的NLS特異性引物(SEQ Ns4)，以(2)純 化PCR產(chǎn)物為模板，常規(guī)PCR擴增產(chǎn)生編碼C端附加TAT - NLS -HIS6序列的Phi BT1 整合酶閱讀框，如(1)所描述的常規(guī)方法純化PCR產(chǎn)物(Qiagen PCR purification kit)。(4) 按分子克隆描述的常規(guī)方法，pET22b和(3)純化PCR產(chǎn)物分別常規(guī)用Nde I 和Xho I雙酶切。酶切體系PCR純化產(chǎn)物44ul或pET22b 44ul (lug), Nde I 5u (Bio lab. lul), Xho I 5 u (Bio lab.), 10X buffer II 5ul(Bio lab.), 37°C 12h。采用切膠回收試劑(Qiagen gel extraction kit)回收，l%argarose gel電泳分離酶切片段，目的片段切膠后用buffer QG 55°C 溶解lOmin,混合物加到PCR extract column (Qiagen) 1200rpm離心lmin，用0.5ml PE buffer (Qiagen) 1200rpm離心lmin清洗一次，再1200rpm離心lmin —次，extract column力B 50ul Elute buffer (Qiagen)， 1200rpm離心lmin洗脫收集產(chǎn)物。用T4連接酶將表達Phi BTl-TAT -NLS -HIS6的框架插入pET22b (連接體系連接pET22b質(zhì)粒骨架4ul，表達Phi BTl-TAT -NLS -HIS6的框架片段4ul， T4 ligase lul (Bio Lab.)， 10X T4 ligase buffer lul, 16°C, 12h)。 常規(guī)轉(zhuǎn)化細菌感受態(tài)細胞，鑒定陽性克隆，抽提質(zhì)粒以及重組質(zhì)粒測序驗證。連接產(chǎn)物用 分子克隆所提供的常規(guī)方法轉(zhuǎn)化DH5 alpha感受態(tài)細胞，篩選陽性(抗氨芐青霉素)克隆 10個，使用分子克隆所描述的常規(guī)方法抽提相應(yīng)的質(zhì)粒。質(zhì)粒測序鑒定采用序列pET22 通用引物作為引物對上述質(zhì)粒在ABI3700上測序分析，所得序列結(jié)果常規(guī)作Blastn分析確 定插入序列。2.表達純化Phi BTl-TAT-NLS-11186蛋白及應(yīng)用 (1 )表達純化Phi BTl-TAT-NLS-HIS6蛋白pET-22b-OC31常規(guī)轉(zhuǎn)化fco乃'BL21
(DE3)。單個克隆接種到含氨芐青霉素(25ug/ml)的LB培養(yǎng)基，250rpm, 37'C培養(yǎng)到 0D6。。=0.8，加0. 1 mM IPTG在250 rpm低溫(如15-25 。C)誘導(dǎo)表達12-24 h。常規(guī)離心 收集細菌，重懸于細菌裂解緩沖液(20 mM Tris-Cl, pH 8， 1 M NaCl, 20 mM imidazole)， 超聲波破菌，12, 000 g離心40 min，收集上清液，上清液通過0. 25um濾膜后加到Ni-NTA agarose親和純化柱，用細菌裂解緩沖液充分洗滌，然后用洗脫緩沖液(20 mM Tris-Cl， pH 8， 0.5-2 M NaCl, 500 mM imidazole)洗脫，收集物為Phi BT1-TAT -NLS -HIS6蛋白。 進一步用超濾方法濃縮到保存緩沖液(5 mM Tris-Cl， pH 8， 1 M NaCl， 10% glycerol)。 -70'C保存。(2 ) Phi BT1-TAT -NLS -HIS6蛋白應(yīng)用① Phi BT1-TAT -NLS -HIS6蛋白體外介導(dǎo)框架互換一在pBCFX+和pBCFX-定向插入 目的DNA片段5、引物合成按常規(guī)方法設(shè)計基因特異性引物，在設(shè)計的基因特異性引物5'附加序列 (SEQW5)，常規(guī)合成引物。3'引物合成按常規(guī)方法設(shè)計基因特異性引物，在設(shè)計的基 因特異性引物3'附加序列(SEQM6， pBCFX+; SEQ pBCFX-)，常規(guī)合成引物。制備 插入目的基因片段使用上述l)/2)所描述的引物和適當(dāng)?shù)哪０?，DNA聚合酶以及PCR條 件常規(guī)擴增插入片段，采用Qiagen PCR extract kit純化?？蚣芙粨Q維持pBCFX+或pBCFX-與插入片段的分子數(shù)約1:1，每種分子質(zhì)量不少于100ng，在50 ul整合酶反應(yīng)物(50 mM glycine-NaOH, pH 8.5, 100 mM KC1, 10 mM DTT， 0.01 % bovine serum albumin, and 0.1 <DC31 integrase和0.1 ①BT1 integase) 22 'C作用30 min -12h。也可以常規(guī)用插入片段與 pBCFX+或pBCFX-以及OC31 integmse和OBTl共轉(zhuǎn)染實現(xiàn)框架交換。陽性克隆篩選10ul 框架交換產(chǎn)物常規(guī)轉(zhuǎn)化DH5 alpha感受態(tài)細胞，涂布含X-gal和氯霉素的LB細菌培養(yǎng)板，37 'C生長12-20h,常規(guī)藍白篩選陽性克隆。含插入片段的克隆由于丟失LacZ而表現(xiàn)為白色克 隆，常規(guī)抽提質(zhì)粒繼序列測定確定重組子的正確性。② Phi BT1-TAT -NLS -HIS6蛋白介導(dǎo)細胞外源基因染色體整合在一對基因特異性引物兩側(cè)附加恰當(dāng)?shù)拿盖形稽c，依據(jù)目的和載體質(zhì)粒的特性在其中 一個引物的酶切位點內(nèi)側(cè)與基因特異性序列之間附加Phi BTl特異性attB序列(SEQ NS6 或SEQ Na7),常規(guī)限制性酶切，連接到含哺乳動物表達NeoR的質(zhì)粒(如pcDNA3. 1 myc-his-, invitrogen),重組質(zhì)粒常規(guī)轉(zhuǎn)染HEK細胞，Phi BT1-TAT -NLS -HIS6蛋白常規(guī)轉(zhuǎn)導(dǎo)HEK細 胞，24h后用G418常規(guī)篩選2-3周。據(jù)有穩(wěn)定表達的細胞為有目的基因染色體插入的細胞， 通過常規(guī)質(zhì)粒拯救試驗確定插入的具體位點。3.制備PhiBTl蛋白多克隆抗體及抗體應(yīng)用(1) 制備PhiBTl多克隆抗體多克隆抗體的生產(chǎn)可用純化的PhiBTl蛋白直接注射免疫動物(如家兔，小鼠，大 鼠等)的方法得到，多種佐劑可用于增強免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等?？筆hi BT1蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)以及免疫學(xué)的試驗中，也可以檢測活檢標(biāo)本中 的PhiBTl蛋白和突變修飾的PhiBTl蛋白及跟蹤其位置和分布。用0. lmg上述PhiBTl蛋白加上完全弗氏佐劑免疫家兔，每隔7-14天后再用PMBTl 蛋白加不完全弗氏佐劑加強免疫四次。采用經(jīng)10ixg/ml的Phi BT1蛋白包被的滴定板做 ELISA測定兔血清中抗體的滴度。用蛋白A-S印harose從抗體陽性的家兔血清中分離總 IgG。將多肽結(jié)合于溴化氰活化的S印harose 4B柱上，用親和層析法從總IgG中分離抗多 肽抗體。ELISA實驗的抗體效價分析表明，抗體達到要求。蛋白免疫印記實驗證明多克隆 抗體可特異性地與Phi BT1結(jié)合(2) PhiBTl多克隆抗體的應(yīng)用---檢測PhiBTl的亞細胞分布特性對經(jīng)Phi BT1整合酶DNA、 RNA轉(zhuǎn)染和蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的哺乳動物細胞，用PBS清洗，多 聚甲醛固定后，用制備的PhiBTl的多克隆抗體包被，羅丹明偶聯(lián)的抗兔第二抗體作用后， DAPI染核。標(biāo)本利用蔡司公司的雙光子激光共聚焦顯微鏡檢測細胞圖像表明PhiBTl多克 隆抗體能夠用免疫細胞組織化學(xué)的方法，很好的定位和跟蹤各種途徑表達的PhiBTl整合 酶。
本發(fā)明所涉及的序列 SEQ. Nq1:5"'-ggaattccatatgtcgcccttcatcgctccc-3 SEQ.Nq2:5、 -aaccttcctcttcttcttagggcggcggcgctggcggcgtttcttgcg-3 、 SEQ.Ns3:5' -gctggcggc gtttcttgcgtccgtacagcgccgcaagctcccgctcag-3 、 SEQ.Na4:5'-ccgctcgagctagtggtggtggtggtggtgaaccttcctcttcttc-3、 SEQ. Na5:5 、 -ccgcggtgcgggtgccagggcgtgcccttgggctccccgggcgcgtactcc-3' SEQ. N26:5'-gcccgctgccgtccttgaccaggtttttgacgaaagtgatccagatgatccagctccacaccccgaacgcgag-3 SEQ. Nq7:5 、 -gagcgcaagccccacacctcgacctagtagacctagtgaaagcagtttttggaccagttcctgcc gtc gccc g-權(quán)利要求
1.一種表達重組Phi BT1-TAT-NLS-HIS6整合酶蛋白的方法，其特征在于具體步驟使用大腸桿菌表達Phi BT1-TAT-NLS-HIS6整合酶蛋白并用NTA樹脂純化PhiBT1-TAT-NLS-HIS6整合酶蛋白，利用基于PCR引物末端修飾的技術(shù)，通過多輪PCR操作在Phi BT1整合酶表達框架3′附加表達編碼-TAT-NLS-HIS6的序列，從而形成PhiBT1-TAT-NLS-HIS6整合酶標(biāo)大框架，將其克隆到原核表達載體pET22b(+)上，經(jīng)測序鑒定正確后，轉(zhuǎn)化到BL21菌株中，進行大量誘導(dǎo)表達和純化；條件為誘導(dǎo)溫度15-25℃，時間12-24小時，采用含咪唑的高鹽緩沖液梯度洗脫收集純化蛋白。
2、 一種重組Phi BT1-TAT -NLS -HIS6整合酶蛋白，由權(quán)利要求1所述方法表達。
3、 一種如權(quán)利要求2所述重組Phi BT1-TAT -NLS -HIS6整合酶蛋白的的應(yīng)用，其特 征在于該項蛋白在體外用于介導(dǎo)兩個含有Phi BT1特異性的分子之間的DNA片段之間的 互換，實現(xiàn)體外常規(guī)基因操作；或者Phi BT1-TAT -NLS -HIS6蛋白與含有Phi BT1特異性 att序列的基因片段共同轉(zhuǎn)染細胞，并且介導(dǎo)該外源基因整合到宿主染色體DNA。
4、 一種PhiBTl-TAT-NLS-HIS6蛋白多克隆抗體，由下述方法獲得 利用原核表達的噬菌體PWBT1-TAT-NLS-HIS6整合酶蛋白，與福氏佐劑混合免疫新西蘭大白兔，第一次Phi BT1-TAT-NLS -HIS6整合酶蛋白與完全福氏佐劑混合免疫，然后每 1-2周用Phi BT1-TAT -NLS -HIS6整合酶蛋白與不完全福氏佐劑強化免疫,最后常規(guī)放血植 被血清，該血清為用蛋白A-S印harose從抗體陽性的家兔血清中分離總IgG即為制備的抗 Phi BT1-TAT -NLS -HIS6整合酶的多克隆抗體。
5、 如權(quán)利要求4所述的多克隆抗體在特異性識別PhiBTl整合酶蛋白質(zhì)的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于定點整合的蛋白酶Phi BT1-TAT-NLS-HIS6整合酶及其制備方法，其多克隆抗體及其應(yīng)用。首先表達純化Phi BT1-TAT-NLS-HIS6整合酶蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)保持PhiBT1整合酶的基本特性，但是其可以通過蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)進入高等生物細胞，并增加蛋白向細胞核轉(zhuǎn)移的能力，同時適用于細胞外體系以及活細胞體系中介導(dǎo)特異性附加在attP與attB上的DNA分子之間的交換與轉(zhuǎn)移等基因操作。用Phi BT1-TAT-NLS-HIS6整合酶蛋白質(zhì)直接與佐劑相混合，注射免疫動物，制得Phi BT1整合酶多克隆抗體。該抗體可以用于特異性識別Phi BT1整合酶蛋白質(zhì)。
文檔編號C12N1/21GK101157906SQ200710046170
公開日2008年4月9日 申請日期2007年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月20日
發(fā)明者丁曉明, 姚紀花, 聆 田, 薛京倫, 趙國屏, 陳金中 申請人:復(fù)旦大學(xué)