專利名稱：一種物理場(chǎng)強(qiáng)化金屬配位殼聚糖定位酶解方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種殼聚糖酶解方法，特別是一種物理場(chǎng)強(qiáng)化金屬配位殼聚糖定位酶解方法。
背景技術(shù)：
殼聚糖(Chitosan)是天然高好甲殼素脫乙酰化后的產(chǎn)物，是由p-(l， 4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖單元和(3-(l，4)-2-乙繊基-2-脫氧-D-葡萄糖單元組成的共聚體。與其他高分子材料相比，殼 聚糖具有可生物降解、無毒性、具有良好生物相容性等特點(diǎn)，近年來在食品、醫(yī)藥、化妝品、化 工、環(huán)保等方面得到,越廣泛的應(yīng)用。但是，殼聚糖是高分子化合物，分子量通常很大，并且 分子結(jié)構(gòu)緊密，溶解性差，難以被吸收利用，大大限制了其應(yīng)用。將殼聚糖,后得到的低聚殼 聚糖，水溶性、生理活性都比殼聚糖更為優(yōu)越。低聚殼聚糖能活化人體淋巴細(xì)胞，促進(jìn)脾臟抗體 生成，抑制癌細(xì)胞的繁殖和擴(kuò)散；強(qiáng)化肝臟功能，防止胃潰瘍；降低血壓、血糖、膽固醇等；具 有較強(qiáng)的抗菌作用和顯著的保濕能力；有利于人體益生菌生長(zhǎng)同時(shí)抑制致病菌。當(dāng)?shù)途蹥ぞ厶菫?6 8糖時(shí)，生物利用度最好，在抑制腫瘤方面的作用令人鼓舞，是當(dāng)今國(guó)內(nèi)外研究開發(fā)的熱點(diǎn)。 因此，如何獲得窄分子量分布的低聚殼聚糖是提高殼聚糖應(yīng)用價(jià)值的關(guān)鍵。
制備低聚殼聚糖的方法，大致可分為酸降解法、氧化降解法、酶降解法和物理降解法。其中 的物理,牟法多是用于配合其它方法，強(qiáng)化降解效果。酸水解法價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)單，缺點(diǎn)是反 應(yīng)過程和得到的低聚殼聚糖的分子量分布難以控制，并且對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重。氧化降解法具有反應(yīng) 速度快、產(chǎn)率高、反應(yīng)物無毒等優(yōu)點(diǎn)，但是控制產(chǎn)物分子量分布的效果不理想。酶降解法可在較 溫和的條件下進(jìn)行，能選擇性地切斷殼聚糖的P- (1， 4) 糖苷鍵，對(duì)降解產(chǎn)物的舒量分布有一 定的控制作用，反應(yīng)過程容易掌控。其中所用的酶可分為專一性酶和非專一性酶。專一性酶不易 獲得，價(jià)格昂貴，難以商業(yè)化。在降解殼聚糖的非專一性酶中，蛋白酶作用明顯，其降解能力甚 至超過了殼聚糖酶和溶菌酶。而且，蛋白酶價(jià)格便宜，穩(wěn)定性好，具有良好的工業(yè)化前景，所以 日益受到重視。雖然酶降解法與其它方法相比具有較大優(yōu)勢(shì)，但對(duì)產(chǎn)物的分子量控制作用仍不夠 理想，不能滿足市場(chǎng)的高要求。因此，如何更有效控制低聚殼聚糖分子量分布范圍，是提高其應(yīng) 用的關(guān)鍵。
殼聚糖糖元的2位為-NHCOCH3或游離的-NH2， 3位為仲-OH和6位為伯-OH，可借助氫鍵 和鹽鍵形皿似網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的籠形分子，因而殼聚糖對(duì)過渡金屬及稀土金屬離子有極好的配合能力， 可帝格殼聚糖-金屬配合物。近幾年，人們對(duì)不同的金屬離子與殼聚糖配她行了較為具體的研究， 揭示了殼聚糖對(duì)金屬離子的吸附動(dòng)力學(xué)規(guī)律和殼聚糖-金屬配合物的結(jié)構(gòu)。金屬離子與殼聚糖起配 合反應(yīng)后，殼聚糖鏈發(fā)生折疊，使得高分子殼聚糖鏈在特定部位的斷裂更容易發(fā)生。殼聚糖金屬
配合物中配位鍵的存在可能使得殼聚糖的分子間作用力和分子內(nèi)某些鍵發(fā)生改變，形成有利于殼 聚糖肝鏈斷裂的弱勢(shì)結(jié)構(gòu)。以上研究，為金屬配位殼聚糖定位,的可行性Mi共了佐證。
另一方面，引入超聲、磁場(chǎng)、微波場(chǎng)等物理作用，會(huì)對(duì)殼聚糖的相關(guān)反應(yīng)過程產(chǎn)生不可忽視 的影響，已有微波皿Cu(II)、 Ca(II)、 Zn(II)離子與殼聚糖配合，以超聲波作用于殼聚糖，可提高 了殼聚糖對(duì)Fe(II)的吸附量， 一定強(qiáng)度的磁場(chǎng)對(duì)木瓜蛋白酶,殼聚糖的反應(yīng)有皿作用等研究 報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)上述技術(shù)缺點(diǎn)，提出一種物理場(chǎng)強(qiáng)化金屬配位殼聚糖定位酶解方法，制備出分子 量分布均勻的低聚殼聚糖-金屬配合物和低聚殼聚糖。
本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)該目的
本發(fā)明的物理場(chǎng)強(qiáng)化金屬配位殼聚糖定位酶解方法，包括如下步驟
(1) 將殼聚糖溶于3°/0 5%pH為1.0 3.5的醋酸溶液中，使殼聚糖的終濃度為2 5 mg/ml， 再加入金屬鹽，其中，殼聚糖:金屬鹽的摩爾比為1:4 10，攪拌至完全溶解后，置于90 150 W/cm2 的超聲場(chǎng)或50 100 mT的磁場(chǎng)或100 600W的微波場(chǎng)下，作用10min 2h，最后靜置9 18h; 過濾，以0.5-2%甲酸溶液、丙酮-乙醇的混合溶液以及60°/(^75%乙醇溶液依次洗滌沉淀，至洗出 液中檢測(cè)不到金屬離子，得到高配位的殼聚糖-金屬配合物；
(2) 在pH3.(^5.0、濃度為0.1^a3mol/L的乙酸-乙酸鈉溶液中，加入步驟(1)得到的殼聚糖 -金屬配合物，使殼聚糖-金屬配合物的終濃度為10 20g/L，再加A7fc瓜蛋白酶，使酶的質(zhì)量占溶 液總質(zhì)量的1 8%，在溫度為35 50°C， 50 100raT磁場(chǎng)中攪拌反應(yīng)0. 5 1. 5 h，再于磁場(chǎng)外攪 拌反應(yīng)6 12h;
(3) 將步驟(2)得到的酶解反應(yīng)產(chǎn)物用超濾裝置脫除酶及未反應(yīng)完全的大分子殼聚糖-金屬 配合物，得到窄針量分布的低聚殼聚糖-金屬配合物，再通過離子交換柱脫除金屬離子，得到低 聚殼聚糖溶液，將其噴霧干燥，得到成品低聚殼聚糖。
所述步驟(1)的金屬鹽包括銅鹽、鋅鹽、二價(jià)鐵鹽、三價(jià)鐵鹽、錳鹽或鎳鹽。 所述步驟(1)的丙酮-乙醇的混合溶液中的丙酮乙醇^IR比為1: 1。 所述步驟(3)的窄M量分布為4 16糖。 本發(fā)明具有如下有益效果
通過以蛋白酶,殼聚糖-金屬配^t/制備低聚殼聚糖，引入磁場(chǎng)強(qiáng)化蛋白酶對(duì)殼聚糖的, 作用，提高降解效率，實(shí)現(xiàn)高效定位降解，制備出低聚殼聚糖一金屬配合物，該配合物具有良好 的tK溶性，并同時(shí)具備殼聚糖和金屬離子的應(yīng)用特性，在醫(yī)藥、保健、食品等多個(gè)領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
4
下面提供具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的技術(shù)應(yīng)用不僅限于實(shí)施例。
實(shí)施例l:
步驟一在弱酸性的斜牛下，制備殼聚糖-金屬離子配合物并以磁場(chǎng)強(qiáng)化該過程。
1. 將殼聚糖溶于5%醋酸溶液(pH2. 5)，配成2mg/ml殼聚糖溶液，力口入一定量的鹽酸羥胺 和硫酸亞鐵銨鹽，攪拌至完全溶解，使鹽^^繊終濃度為5%，硫酸亞鐵銨終濃度為15mg/ml (殼 聚糖硫酸亞鐵銨鹽的摩爾比為l: 6.4)。
2. 將以上反應(yīng)體系置于90mT的磁場(chǎng)下，作用30min，再靜置15h。
3. 過濾，以1%甲酸溶液、1: 1 (V/V)丙酮乙醇溶液、75%乙醇溶液依次洗滌沉淀，至洗出 液中檢測(cè)不到亞鐵離子。即得到高配位的殼聚糖-亞鐵配合物。
步驟二在磁場(chǎng)作用下，,殼聚糖-亞鐵配合物。
1. 在pH二4.5、濃度為02mol/L的乙酸-乙,緩沖液中，加入一定量的殼聚糖-亞鐵配合物， 配制成20 mgtal的殼聚糖-亞鐵配合物溶液。
2. 在溶液中加入一定量的木瓜蛋白酶，使酶的質(zhì)量濃度為2%,溫度45 'C，置于80mT磁場(chǎng) 中攪拌反應(yīng)30 min,再于磁場(chǎng)夕卜攪拌反應(yīng)6h。使殼聚糖-亞鐵配，,。
步驟三分離、純化低聚殼聚糖-亞鐵配合物和低聚殼聚糖。
1. 酶解反應(yīng)產(chǎn)物以超濾裝置脫除酶及未反應(yīng)完全的大^f殼聚糖-亞鐵配合物，得到窄分子量 分布的低聚殼聚糖-亞鐵配合物。
2. 將低聚殼聚糖-亞鐵配合物溶M31離子交換柱脫除亞鐵離子，即得到低聚殼聚糖溶液，將 其噴霧千燥，得到成品低聚殼聚糖，分布為446糖。
實(shí)施例2:
步驟一在弱酸性的^f牛下，帝恪殼聚糖-金屬離子配合物并以磁場(chǎng)強(qiáng)化該過程。
1. 將殼聚糖溶于5%醋酸溶液(pH2. 5)，配成2mg/ml殼聚糖溶液，加入一定量的銅鹽，攪 拌至完全溶解，，殼聚糖銅鹽的摩爾比為l.. 4。
2. 將以上反應(yīng)體系置于50mT的磁場(chǎng)下，作用30min，再靜置15h。
3. 過濾，以1%甲酸溶液、1: 1 (V/V)丙酮乙,液、75%乙醇溶液依次洗滌沉淀，至洗出 液中檢測(cè)不到亞鐵離子。即得到高配位的殼聚糖-亞鐵配合物。
步驟二在磁場(chǎng)作用下，糊早殼聚糖-銅鹽配合物。
1. 在pH二4.5、濃度為0.2moI/L的乙酸-乙,緩沖液中，力口入一定量的殼聚糖-銅鹽配合物， 配制成20 mg/ml的殼聚糖-銅鹽配合物溶液。
2. 在溶液中加入一定量的木瓜蛋白酶，使酶的質(zhì)量濃度為2%，驢45 °C，置于80mT磁場(chǎng) 中攪拌反應(yīng)30min，再于磁場(chǎng)外攪拌反應(yīng)6h。使殼聚糖-銅鹽配合物降解。
步驟三分離、純化低聚殼聚糖-銅鹽配合物和低聚殼聚糖。
1. 酶解反應(yīng)產(chǎn)物以超濾裝置脫除酶及未反應(yīng)完全的大0殼聚糖-銅鹽配合物，得到窄分子量 分布的低聚殼聚糖-銅鹽配合物。
2. 將低聚殼聚糖-銅鹽配合物溶^13i離子交換柱脫除銅離子，即得到低聚殼聚糖溶液，將其
噴霧千燥，得到成品低聚殼聚糖，分布為4-16糖。
實(shí)施例3:
步驟一在弱酸性的剝牛下，制備殼聚糖-金屬離子配合物并以磁場(chǎng)強(qiáng)化該過程。
1. 將殼聚糖溶于5%醋酸溶液(pH2. 5)，配成2mg/ml殼聚糖溶液，加入一定量的鋅鹽，攪
拌至完全溶解，殼聚糖硫酸亞鐵銨鹽的摩爾比為l: 8。
2. 將以上反應(yīng)體系置于100mT的磁場(chǎng)下，作用30min，再靜置15h。
3. 過濾，以1%甲酸溶液、1: 1 (V/V)丙酮乙醇溶液、75%乙醇溶液依次洗滌沉淀，至洗出 液中檢測(cè)不到亞鐵離子。即得到高配位的殼聚糖-亞鐵配合物。
步驟二在磁場(chǎng)作用下，降解殼聚糖-鋅鹽配合物。
1. 在pH-4.5、濃度為0.211101/1>的乙酸-乙,緩沖液中，加入一定量的殼聚糖-鋅鹽配合物， 配制成20mg/ml的殼聚糖-鋅鹽配合物溶液。
2. 在溶液中加入一定量的木瓜蛋白酶，使酶的質(zhì)量濃度為2%，溫度45 'C，置于80mT磁場(chǎng) 中攪拌反應(yīng)30min，再于磁場(chǎng)外攪拌反應(yīng)6h。使殼聚糖-鋅鹽配合物,。
步驟三分離、純化低聚殼聚糖-鋅鹽配合物和低聚殼聚糖。
1. 酶解反應(yīng)產(chǎn)物以超濾裝置脫除酶及未反應(yīng)完全的大W殼聚糖-鋅鹽配合物，得到窄分子量 分布的低聚殼聚糖-鋅鹽配合物。
2. 將低聚殼聚糖-鋅鹽配合物溶液通過離子交換柱脫除鋅離子，即得到低聚殼聚糖溶液，將其 噴霧千燥，得歪喊品低聚殼聚糖，分布為4-16糖。
實(shí)施例4:
步驟一在弱酸性的剝牛下，制備殼聚糖-金屬離子配合物并以超聲場(chǎng)強(qiáng)化該過程。
1. 將殼聚糖溶于4%醋酸溶液(pH3.5)，配成4mg/ml殼聚糖溶液，加入一定量的三價(jià)鐵鹽， 攪拌至完全溶解，使殼聚糖三價(jià)鐵鹽的摩爾比為l: 7。
2. 將以上反應(yīng)體系置于90W/cn^的超聲場(chǎng)中，作用2h，再攪拌5h，靜置18h。
3. 過濾，以2%甲酸溶液、1: 1 (V/V)丙酮乙醇溶液、70%乙醇溶液依次洗滌沉淀，至洗出 液中檢測(cè)不到亞鐵離子。即得到高配位的殼聚糖-亞鐵配合物。
步驟二在磁場(chǎng)作用下，,殼聚糖-三價(jià)皿配合物。
1. 在pH-5.0、濃度為0.3 mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液中，加入一定量的殼聚糖-三纖鹽配 合物，配制成15mg/ml的殼聚糖-三價(jià)鐵鹽配，溶液。
2. 在溶液中加入一定量的木瓜蛋白酶，使酶的質(zhì)量濃度為8%， ？鵬5(TC，置于100mT磁場(chǎng)中攪拌反應(yīng)1.5h，再于磁場(chǎng)夕卜攪拌反應(yīng)10h。使殼聚糖-三價(jià)鐵鹽配合物,。
步驟三分離、純化低聚殼聚糖-三價(jià)鐵鹽配合物和低聚殼聚糖。
1. 酶解反應(yīng)產(chǎn)物以超濾裝置脫除酶及未反應(yīng)完全的大分子殼聚糖-三鐵鹽配合物，得到窄分
子量分布的低聚殼聚糖-三價(jià)鐵鹽配合物。
2. 將低聚殼聚糖-三價(jià)鐵鹽配合物溶液通過離子交換柱脫除鐵鹽離子，即得到低聚殼聚糖溶
液，將其噴霧干燥，就可以得到成品低聚殼聚糖，分布為4-16糖。 實(shí)施例5:
步驟一在弱酸性的餅下，制備殼聚糖-金屬離子配合物并以超聲場(chǎng)強(qiáng)化該過程。
1. 將殼聚糖溶于3%醋酸溶液(pHl.O)，配成5mg/ml殼聚糖溶液，加入一定量的錳鹽，攪拌 至完全溶解，使殼聚糖錳鹽的摩爾比為1: 4.3。
2. 將以上反應(yīng)體系置于150W/cn^的超聲場(chǎng)中，作用10min，再攪拌5h，靜置9h。
3. 過濾，以0.5%甲酸溶液、1: 1 (V/V)丙酮乙醇溶液、60%乙醇溶液依次洗滌沉淀，至洗
出液中檢測(cè)不到亞鐵離子。即得到離位的殼聚膝亞鐵配合物。
步驟二在磁場(chǎng)作用下，,殼聚糖-錳鹽配合物。
1. 在pH:3.0、濃度為O.lmoVL的乙酸-乙,緩沖液中，加入一定量的殼聚糖-錳鹽配合物，配制成10mg/ml的殼聚糖-錳鹽配合物溶液。
2. 在溶液中加入一定量的木瓜蛋白酶，使酶的質(zhì)量濃度為1%，離35'C，置于50mT磁場(chǎng)中 攪拌反應(yīng)50min，再于mt湯外攪拌反應(yīng)12h。使殼聚糖-錳鹽配^tJ,。
步驟三分離、純化低聚殼聚糖-錳鹽配合物和低聚殼聚糖。
1. 酶解反應(yīng)產(chǎn)物以超濾裝置脫除酶及未反應(yīng)完全的大^^殼聚糖-錳鹽配合物，得到窄M量 分布的低聚殼聚糖-錳鹽配合物。
2. 將低聚殼聚糖-錳鹽配合物溶液皿離子交換柱脫除錳離子，即得到低聚殼聚糖溶液，將其 噴霧干燥，就可以得到成品低聚殼聚糖，分布為4-16糖。
實(shí)施例6:
步驟一在弱酸性的條件下，制備殼聚糖-金屬離子配合物并以超聲場(chǎng)強(qiáng)化該過程。
1. 將殼聚糖溶于3%醋酸溶液(pHl.O)，配成5mg/ml殼聚糖溶液，加入一定量的鎳鹽，攪拌 至完全溶解，使殼聚糖鎳鹽的摩爾比為l: 4。
2. 將以上反應(yīng)體系置于100W/cn^的超聲場(chǎng)中，作用10min,再攪拌5h，靜置9h。
3. 過濾，以0.5%甲酸溶液、1: 1 (V/V)丙酮乙醇溶液、60%乙醇溶液依次洗滌沉淀，至洗 出液中檢測(cè)不到亞鐵離子。即得到iftlS位的殼聚糖-亞鐵配合物。
步驟二在磁場(chǎng)作用下，,殼聚糖-鎳鹽配合物。
1.在pH二3.0、濃度為0.1mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液中，加入一定量的殼聚糖-鎳鹽配合物，配制成lOmg/ml的殼聚糖-鎳鹽配合物溶液。
2.在溶液中加入一定量的木瓜蛋白酶，使酶的質(zhì)量濃度為1%，溫度35'C，置于50mT磁場(chǎng)中 攪拌反應(yīng)50min，再于磁場(chǎng)外攪拌反應(yīng)12h。使殼聚糖-鎳鹽配合物降解。
步驟三分離、純化低聚殼聚糖-鎳鹽配合物和低聚殼聚糖。
1. 酶解反應(yīng)產(chǎn)物以超濾裝置脫除酶及未反應(yīng)完全的大分子殼聚糖-鎳鹽配合物，得到窄分子量 分布的低聚殼聚糖-鎳鹽配合物。
2. 將低聚殼聚糖-鎳鹽配合物溶液艦離子交換柱脫除鎳離子，即得至IJ低聚殼聚糖溶液，將其 噴霧干燥，就可以得到成品低聚殼聚糖，分布為4-16糖。
實(shí)施例7:
步驟一在弱酸性的剝牛下，審恪殼聚糖-金屬離子配合物并以微波場(chǎng)強(qiáng)化該過程。
1. 將殼聚糖溶于3%醋酸溶液(pHl.O)，配成5mg/ml殼聚糖溶液，加入一定量的鹽酸羥胺和 硫酸亞鐵銨鹽，攪拌至完全溶解，使鹽酸羥胺終濃度為5%，硫M鐵銨終濃度為10m^ml (殼聚 糖硫酸亞鐵銨鹽的摩爾比為l: 4.3。
2. 將以上反應(yīng)體系置于100W的超聲場(chǎng)中，作用10min,離拌5h，靜置9h。
3. 過濾，以0.5%甲酸溶液、1: 1 (V/V)丙酮乙醇溶液、60。/。乙醇溶液依次洗滌沉淀，至洗 出液中檢測(cè)不到亞鐵離子。即得到高配位的殼聚糖-亞鐵配合物。
步驟二在磁場(chǎng)作用下，,殼聚糖-亞鐵配合物。
1. 在pH二3.0、濃度為0.1mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液中，加入一定量的殼聚糖-亞鐵配合物， 配制成10mg/ml的殼聚糖-亞鐵配合物溶液。
2. 在溶液中加入一定量的木瓜蛋白酶，使酶的質(zhì)量濃度為1%，溫度35'C，置于50mT磁場(chǎng)中 攪拌反應(yīng)50min，再于磁場(chǎng)外攪拌反應(yīng)12h。使殼聚糖-亞鐵配，卿率。
步驟三分離、純化低聚殼聚糖-亞鐵配合物和低聚殼聚糖。
1. 酶解反應(yīng)產(chǎn)物以超濾裝置脫除酶及未反應(yīng)完全的大分子殼聚糖-亞鐵配合物，得到窄分子量 分布的低聚殼聚糖-亞鐵配合物。
2. 將低聚殼聚糖-亞鐵配合物溶液通過離子交換柱脫除亞鐵離子，即得至艦聚殼聚糖溶液，將 其噴霧千燥，就可以得到成品低聚殼聚糖，分布為4-16糖。
實(shí)施例8:
步驟一在弱酸性的條件下，制備殼聚糖-金屬離子配合物并以微波場(chǎng)強(qiáng)化該逝呈。
1. 將殼聚糖溶于3X醋酸溶液(pH1.0)，配成5mg/ml殼聚糖溶液，加入一定量的鹽酸羥胺和 硫酸亞鐵銨鹽，攪拌至完全溶解，使鹽酸羥胺終濃度為5%，硫酸亞鐵銨終濃度為10mg/ml (殼聚 糖硫酸亞鐵銨鹽的摩爾比為l: 4.3)。
2. 將以上反應(yīng)體系置于600W的超聲場(chǎng)中，作用10min，離拌5h，靜置9h。
3.過濾，以0.5%甲酸溶液、1: 1 (V/V)丙酮乙醇溶液、60%乙醇溶液依次洗滌沉淀，至洗
出液中檢測(cè)不到亞鐵離子。即得到敲fi位的殼聚糖-亞鐵配合物。
步驟二在磁場(chǎng)作用下，降解殼聚糖-亞鐵配合物。
1. 在pH-3.0、濃度為0.1mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液中，加入一定量的殼聚糖-亞鐵配合物， 配制成10mg/ml的殼聚糖-亞鐵配合物溶液。
2. 在溶液中加入一定量的木瓜蛋白酶，使酶的質(zhì)量濃度為1%，溫度35℃，置于50mT磁場(chǎng)中 攪拌反應(yīng)50min，再于磁場(chǎng)外攪拌反應(yīng)12h。使殼聚糖-亞鐵配合物降解。
步驟三分離、純化低聚殼聚糖-亞鐵配合物和低聚殼聚糖。
1. 酶解反應(yīng)產(chǎn)物以超濾裝置脫除酶及未反應(yīng)完全的大M殼聚糖-亞鐵配合物，得到窄分子量 分布的低聚殼聚糖-亞鐵配合物。
2. 將低聚殼聚糖-亞鐵配合物溶液ilii離子交換柱脫除亞鐵離子，即得到低聚殼聚糖溶液，將 其噴霧干燥，就可以得到成品低聚殼聚糖，分布為4-16糖。
實(shí)施例9:
步驟一在弱酸性的^#下，制備殼聚糖-金屬離子配合物并以微波場(chǎng)強(qiáng)化該過程。
1. 將殼聚糖溶于3X醋酸溶液(pH1.0)，配成5mg/ml殼聚糖溶液，加入一定量的鹽^l勁安和 硫酸亞鐵銨鹽，攪拌至完全溶解，使鹽^^胺終濃度為5%，硫酸亞鐵銨終濃度為10mg/ml (殼聚 糖硫酸亞鐵銨鹽的摩爾比為l: 4.3)。
2. 將以上反應(yīng)體系置于150W的超聲場(chǎng)中，作用10min,再攪拌5h，靜置9h。
3. 過濾，以0.5%甲酸溶液、1: 1 (V/V)丙酮乙醇溶液、60%乙醇溶液依次洗滌沉淀，至洗 出液中檢測(cè)不到亞鐵離子。即得到離位的殼聚糖-亞鐵配合物。
步驟二在磁場(chǎng)作用下，,殼聚糖-亞鐵配合物。
1. 在pH-3.0、濃度為0.1mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液中，加入一定量的殼聚糖-亞鐵配合物， 配制成10 mg/ml的殼聚糖-亞鐵配合物溶液。
2. 在溶液中加入一定量的木瓜蛋白酶，使酶的質(zhì)量濃度為1%，溫度35℃，置于50mT磁場(chǎng)中 攪拌反應(yīng)50min，再于磁場(chǎng)夕卜攪拌反應(yīng)12h。使殼聚糖-亞鐵配 。
步驟三分離、純化低聚殼聚糖-亞鐵配合物和低聚殼聚糖。
1. 酶解反應(yīng)產(chǎn)物以超濾裝置脫除酶及未反應(yīng)完全的大^T殼聚糖-亞鐵配合物，得到窄分子量 分布的低聚殼聚糖-亞鐵配合物。
2. 將低聚殼聚糖-亞鐵配合物錄M3l離子交換鵬除亞鐵離子，即得至艦聚殼聚糖溶液，將 其噴霧干燥，就可以得到成品低聚殼聚糖，分布為4-16糖。
權(quán)利要求
1、一種物理場(chǎng)強(qiáng)化金屬配位殼聚糖定位酶解方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將殼聚糖溶于3％～5％pH為1.0～3.5的醋酸溶液中，使殼聚糖的終濃度為2～5mg/ml，再加入金屬鹽，其中，殼聚糖∶金屬鹽的摩爾比為1∶4～10，攪拌至完全溶解后，置于90～150W/cm2 的超聲場(chǎng)或50～100mT的磁場(chǎng)或100～600W的微波場(chǎng)下，作用10min～2h，最后靜置9～18h；過濾，以0.5～2％甲酸溶液、丙酮-乙醇的混合溶液以及60％～75％乙醇溶液依次洗滌沉淀，至洗出液中檢測(cè)不到金屬離子，得到殼聚糖-金屬配合物；(2)在pH3.0～5.0、濃度為0.1～0.3mol/L的乙酸-乙酸鈉溶液中，加入步驟(1)得到的殼聚糖-金屬配合物，使殼聚糖-金屬配合物的為10～20g/L，再加入木瓜蛋白酶，使酶的質(zhì)量占溶液總質(zhì)量的為1～8％，在35～50℃，50～100mT磁場(chǎng)中攪拌反應(yīng)0.5～1.5h，再于磁場(chǎng)外攪拌反應(yīng)6～12h；(3)將步驟(2)得到的酶解反應(yīng)產(chǎn)物用超濾裝置脫除酶及未反應(yīng)完全的大分子殼聚糖-金屬配合物，得到窄分子量分布的低聚殼聚糖-金屬配合物，再通過離子交換柱脫除金屬離子，得到低聚殼聚糖溶液，將其噴霧干燥，得到成品低聚殼聚糖。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶解方法，其特征在于所述步驟(1)的金屬鹽包括銅鹽、鋅鹽、 二價(jià)鐵鹽、三價(jià)鐵鹽、錳鹽或鎳鹽。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1阮述的酶解方法，期寺征在于所述步驟(1)的丙酮-乙醇的混合溶液中的 丙酮乙醇體積比為l: 1。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1艦的酶解方法，其特征在于所述步驟(3)的窄分子量分布為4 16糖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種物理場(chǎng)強(qiáng)化金屬配位殼聚糖定位酶解方法，該方法包括如下步驟將殼聚糖溶于醋酸溶液中，再加入金屬鹽，反應(yīng)得到高配位的殼聚糖-金屬配合物；再加入乙酸-乙酸鈉溶液及木瓜蛋白酶，在磁場(chǎng)中攪拌反應(yīng)，再于磁場(chǎng)外攪拌反應(yīng)；得到酶解反應(yīng)產(chǎn)物，用超濾裝置脫除酶及未反應(yīng)完全的大分子殼聚糖-金屬配合物，再脫除金屬離子，得到低聚殼聚糖溶液，將其噴霧干燥，得到成品低聚殼聚糖。本發(fā)明引入磁場(chǎng)強(qiáng)化蛋白酶對(duì)殼聚糖的降解作用，提高降解效率，實(shí)現(xiàn)高效定位降解，制備出低聚殼聚糖—金屬配合物，該配合物具有良好的水溶性，并同時(shí)具備殼聚糖和金屬離子的應(yīng)用特性，在醫(yī)藥、保健、食品等多個(gè)領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12P19/04GK101200747SQ200710032518
公開日2008年6月18日 申請(qǐng)日期2007年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月14日
發(fā)明者葉盛權(quán), 段麗紅, 王兆梅, 肖凱軍, 寅 蔣, 蔡妙顏, 鄭必勝, 郭祀遠(yuǎn), 玲 陳 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)