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人無限增殖神經前體細胞系的制作方法

文檔序號:432140閱讀:1306來源:國知局

專利名稱::人無限增殖神經前體細胞系的制作方法人無限增殖神經前體細胞系本發(fā)明涉及無限增殖(immortalised)人類神經前體細胞系NGC-407。此細胞系已經從人胎兒組織建立。
背景技術
:通過移植人胎兒組織治療神經變性疾病的有效性已經在動物模型中顯示[Brundin等,BehaviouraleffectsofhumanfetaldopamineneuronsgraftedinaratmodelofParkinson'sdisease,£jcpSra/"Wes,65(1986)235-40.;Wictorin等,Reformationoflongaxonpathwaysinadultratcentralnervoussystembyhumanforebrainneuroblasts,A^wn,347(1990)556-8.],并在患帕金森氏病(PD)和亨廷頓氏病的患者中顯示[Bachoud-Levi等,MotorandcognitiveimprovementsinpatientswithHuntington'sdiseaseafterneuraltransplantation,356(2000)1975-9.;Freed等,TransplantationofembryonicdopamineneuronsforsevereParkinson'sdisease,TV五"g/JvWed,344(2001)710-9.;Hagell等,SequentialbilateraltransplantationinParkinson'sdisease:effectsofthesecondgraft,Sra/",122(Pt6)(1999)1121-32.;Kordower等,NeuropathologicalevidenceofgraftsurvivalandstriatalreinnervationafterthetransplantationoffetalmesencephalictissueinapatientwithParkinson'sdisease,W/Med,332(1995)1118-24.;Lindvall等,GraftsoffetaldopamineneuronssurviveandimprovemotorfunctioninParkinson'sdisease,247(1990)574-7;Olanow等,FetalnigraltransplantationasatherapyforParkinson'sdisease,7>e"^sTVewraw/,19(l"6)102-9.]。然而,人源胎兒供體細胞帶來倫理和操作上的難題,因此必須開發(fā)用于未來移植的替代細胞來源。已經提議將經過遺傳修飾表達治療性基因的細胞植入到腦部,作為對神經變性疾病有潛力的治療[Villa,A.,Navarro,B.andMartinez-Serrano,A.,Geneticperpetuationofinvitroexpandedhumanneuralstemcells:cellularpropertiesandtherapeuticpotential,i^Sw〃,57(2002)789-94.]。因此,當將遺傳改造和細胞移植結合時,重要的問題是發(fā)現合適的細胞載體。經過修飾表達胸苷激酶(TK)基因的腫瘤細胞獲得將無毒核苷類似物更昔洛韋(ganciclovir,GCV)轉變?yōu)槠浼毎拘源x物更昔洛韋-三磷酸鹽的能力。經過遺傳改造表達此種"自殺"基因的細胞如果接觸到更昔洛韋會被去除。腫瘤細胞的實驗室組織培養(yǎng)物,和由表達TK的細胞和未經修飾的"天然"肺瘤細胞的混合物組成的腦部腫瘤植入物,在更昔洛韋處理后也減退,而不對鄰近的正常組織造成傷害。此種現象被稱為"旁觀者效應(bystandereffect)",其中少數表達TK的細胞會使不表達TK的鄰近天然腫瘤細胞死亡并被去除。惡性腦部腫瘤是自殺基因遞送的有吸引力的目標,因為整個惡性腫瘤都局限于腦部并且易被旁觀者效應根除。此策略成功的關鍵成分是表達自殺基因的遺傳載體及其傳遞載體。因為不可能分別注射基因治療載體來靶向例如在多形性成膠質細胞瘤(glioblastomamultiforme)中所有的個別腫瘤,所以需要另一種遞送策略。能追蹤神經膠質瘤細胞并已經被改造來遞送治療分子的遷移細胞代表一種解決侵入正常腦組織的神經膠質瘤細胞問題的理想解決辦法。已經證明神經干細胞(NSC)的遷移能力極為適合需要整個腦范圍內的細胞替代及基因表達的神經變性疾病模型的治療。已經假設NSC可特異性地歸巢至腦內的疾病部位。也有研究得到有趣的觀察結果移植的NSC在距腫瘤自身一定距離注射時能夠歸巢到原發(fā)腫瘤團塊;另外,觀察到NSC將自身分散到整個瘤床,甚至并列遷移到進展的單個腫瘤細胞中(Dunn&Black,A^wrawrgeo;2003,52:1411-1424;Aboody等,2000,97:12846-12851)。這些作者顯示NSC能夠追蹤腦組織中腫瘤團塊周圍的浸潤神經"交質瘤細胞,并"追蹤(piggyback)"單個腫瘤細胞來進行細胞與細胞的接觸。本發(fā)明針對了在治療神經變性疾病和治療癌癥領域的幾個問題。因此,本發(fā)明一個目標是提供用于替代細胞療法的充足材料,而避免需要大量胎兒組織。另一個目標是提供在植入CNS后能穩(wěn)定表達轉基因的細胞。另一個目標是提供能與癌細胞形成縫隙連接的細胞。另一個目標是提供能追蹤CNS中的癌細胞的細胞。最終,這些細胞應能夠增殖,從而它們能被足夠多次地被傳代,以被擴增、用治療性基因轉染并庫存。發(fā)明概述本發(fā)明一方面涉及可從NGC-407細胞獲得的、或從NGC-407細胞衍生的、或由NGC-407細胞組成的人類細胞系。此細月包系已經才艮據布達佩斯條約用登錄號DSMACC2718于2005年3月31日保藏在德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH),MascheroderWeglb,D-38124Braunschweig,Germany。本發(fā)明細胞系有多個優(yōu)點。它是穩(wěn)定、無限增殖細胞系,它已經在130次以上的群體倍增過程中被擴增并保持穩(wěn)定。該細胞系是神經先祖細胞系,取決于分化條件,它可以分化為神經元、星形膠質細胞和多巴胺能神經元。NGC-407細胞系可用于移植。已經顯示該細胞系能夠在移植入大鼠后存活至少3周。因此,希望NGC-407細胞系能夠在人腦存活更長時間。在移植的過程中,此細胞系能穩(wěn)定表達異源基因。NGC-407細胞系從而既能用作替代療法(替代神經系統中喪失的或受損的細胞)又能用于保護性療法(作為載體來傳遞生物功能,如分泌型生長因子、神經營養(yǎng)因子或神經遞質)。該細胞系已經過轉導來表達異源胸苷激酶。已經選出表達高水平的此種異源激酶的單克隆細胞系。這些細胞系可用作將胸苷激酶遞送到神經系統中的肺瘤細胞的載體。還顯示NGC-407細胞系能夠朝中樞神經系統中的癌細胞遷移,并且NGC-407細胞系能夠與癌細胞形成縫隙連接并從細胞系轉移低分子量化合物到癌細胞。因此,在NGC-407細胞系已遷移到癌細胞并與這些癌細胞形成縫隙連接之后,此細胞系能用作遞送載體來活化前藥物(prodrug)(例如AZT,更昔洛韋)。然后活化的前藥將會轉移到癌細胞并殺死它們及遞送細胞系。這是一種治療多形性成膠質細胞瘤的可行且有希望的方法。另一個方面,本發(fā)明涉及NGC-407細胞系的試驗用途,如用于體外藥物篩選和表征。例如,該用途可能是安全性和毒性研究的一部分。與中腦來源的已知細胞系(MES-II(I)-C2,見WO00/09669所述;也稱作MESC2.10,見Lotharius等,JBiolChem2002,277:38884-38894所述)相比,NGC-407表達干細胞標記物巢蛋白(nestin),并且能夠分化成神經元和星形膠質細胞。另一方面,MESC2.10不表達巢蛋白并僅被誘導分化成神經元。因此,NGC-407代表較早的發(fā)育階段,比MESC2.10潛力更廣闊。星形膠質細胞分泌若千對維持神經元功能性有重要意義的生長因子(包括GDNF)和激素。在鑒定可能的用于治療(例如帕金森氏病)的生物制品藥物方面,含顯著比例星形膠質細胞的細胞系是比神經元細胞系好的模型系統。另一方面,本發(fā)明涉及NGC-407細胞系用于治療應用,以及在另一方面用于替代療法的用途。在特別優(yōu)選的實施方案中,所述細胞系用于癌癥治療。又一方面,本發(fā)明涉及生物適合的(biocompatible)膠嚢,其包含核心(core)和半透膜,所述核心含有衍生自NGC-407細胞系的細胞組合物(acompositionofcells),所述細胞能分泌將生物功能傳遞給個體的化合物,所述半透膜包繞細胞組合物并允許細胞組合物所分泌的化合物通透。在本發(fā)明一個實施方案中,"治療"、"療法"和"醫(yī)療用途"應包括預防。"治療"、"療法"和"醫(yī)療用途"也可以(但不絕對)包括對疾病或紊亂的抑制、防護和/或預防。"治療,,、"療法"和"醫(yī)療用途"也可包括治愈性(curative)、改善性(ameliorative)和/或對癥性(symptomatic)治療、療法和醫(yī)療用途。附圖簡述圖1是分化的免疫標記的NGC-407細胞的照片。圖1A中,TH標記的神經元用箭頭標記。圖B中,P-III-微管蛋白標記的細胞用箭頭標記,而GFAP標記的細胞用箭頭的尖端標記。圖2顯示了用不同標記物標記的分化的NGC-407細胞的百分比圖表。TH神經元是用TH抗體標記的細胞,神經元是用(3-III-微管蛋白抗體標記的細胞,而星形膠質細胞是用GFAP抗體標記的細胞。此圖表顯示四個不同組增殖細胞(Prolif)和三個根據Riaz等(Bradforddiff),Sah等(Sahdiff)和Storch等(Storchdiff)的三種分化方案分化的組。圖3顯示了在移植到大鼠紋狀體(striatum)后1和3周,表達hNuc-和GFP-的NGC-407細胞的免疫組化可視圖。在1周,發(fā)現大部分hNuc-陽性細胞在注射位置周圍,但一些細胞遷移開(B)。GFP-染色顯示,大約50%的hNuc-陽性細胞共表達GFP并且表現出星形膠質細胞形態(tài)(A,C和A',C')。A'-C'是A-C中白色方框中表示的細胞群的特寫。在3周后,高百分比(〉35%)的hNuc-陽性細胞仍表達轉基因(箭頭的尖端)并展示分化程度更高的形態(tài)(D-F)。D-F中的箭頭指示GFP陰性的hNuc-陽性細胞。C、C'和F中的比例尺為50jim。圖4.A.對照細胞縫隙連接介導的鈣熒光素(calcein)轉移。在接受來自黃色(點狀箭頭)雙標記(紅色親脂類碳花青(redDil)和綠色鈣熒光素)的NGC-407細胞的可轉移鉤熒光素染料后,未標記的U343MGa-cl2:6細胞已經變?yōu)榫G色(直線箭頭)。兩種細胞彼此都通過延伸的突起來物理接觸。B.PB處理的細胞。突起由于PB處理已經變得更突出(三重箭頭),并且此組中綠色受體細胞的數目也顯著變多。圖5.用于使NGC-407細胞系無限增殖的TD1-2無限增殖載體的載體圖譜。圖6:NGC-407細胞系(圖6A)和表達番茄胸苷激酶的NGC-407細胞系(圖6B)對于AZT的ICs。值。具體參見實施例6。發(fā)明詳述NGC-407細胞系的轉染或轉導在優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明衍生自NGC-407細胞系的細胞包含異源DNA元件,其整合到基因組并與其整合進入的染色體一起復制,并可操作地組合真核啟動子、異源治療性基因、多聚腺苷酸化信號(pA)。異源DNA元件可以來自任何合適來源,但優(yōu)選選自本文所述的那些。在優(yōu)選的實施方案中,異源治療性基因可受人泛蛋白(ubiquitin)(UbC)啟動子轉錄控制來表達。對表達的可能下調可以通過指導轉基因及其隨同啟動子的位點特異性整合的方法實現。根據本發(fā)明一個實施方案,啟動子是組成型啟動子,其選自下組泛蛋白啟動子、CMV啟動子、JeT啟動子(US6,555,674)、SV40啟動子、延伸因子lot啟動子(EF1-alpha)、RSV、和Mo-MLV-LTR。誘導型/阻遏型啟動子的例子包括Tet-On,Tet-Off,納巴霉素(rapamycin)-誘導型啟動子,Mxl。合適的表達控制序列包括啟動子、增強子、轉錄終止子、起始密碼、內含子的剪接信號、和終止密碼,它們都保持在本發(fā)明多核苷酸的準確閱讀框內,從而允許適當地翻i奪mRNA。表達控制序列也可包括其它組分,如前導序列和融合配偶體序列。合適的表達載體可以是病毒載體,其衍生自單純皰滲病毒(Herpessimplex),曱病毒屬(alphavirus),腺病毒屬,腺伴隨病毒屬,桿狀病毒屬,HSV,冠狀病毒屬,牛乳頭瘤病毒(Bovinepapillomavirus),Mo-MLV,優(yōu)選腺伴隨病毒屬,或來自多種從細菌制備的質粒。其他轉染方法包括但不限于脂質體轉染,電穿孔,和用含核或其他定位信號的載體肽轉染。其他合適的表達載體包括一般目的的哺乳動物載體,其也能從商業(yè)途徑(InvitrogenInc.,Clontech,Promega,BDBiosecences等)購得,還包括對遺傳霉素(Geneticin)/新霉素(neomycin)(G418),潮霉素B(hygromycinB),噪呤霉素(puromycin),Zeocin/博來霉素(bleomycin),殺稻痘素(blasticidin)SI,霉酚酸(mycophenolicacid)或組氨醇(histidinol)的選4奪。所述載體包括如下種類的載體一般真核表達載體,用作穩(wěn)定和瞬時表達的載體,和用于迅速克隆所需插入片段的印itag載體以及它們的TOPO衍生物(見下面非限制目的的載體舉例的列表)。蛻皮激素(ecdysone)-誘導型表達pIND(SPl)載體;pIND/V5-His標簽載體組;pIND(SPl)/V5-His標簽載體組;EcR細胞系;MuristeroneA。穩(wěn)定表達pcDNA3.1/Hygro;PCI;PSI;pSecTagA,B&C;pcDNA3.1(-)/MycHisA,B&C;pcDNA3.1+/-;pcDNA3.1/Zeo(+)和pcDNA3.1/Zeo(-);pcDNA3.1/HisA,B,&C;pRc/CMV2;pZeoSV2(+)和pZeoSV2(-);pRc/RSV;pTracerTM-CMV;pTracerTM-SV40。瞬時表達pCDM8;pcDNA1.1;pcDNA1.1/Amp。Epitag載體pcDNA3.1/MycHisA,B和C;pcDNA3.1/V5-HisA,B和C。異源治療性基因異源治療性基因是編碼治療活性多肽或蛋白(也稱為治療因子)的基因。優(yōu)選的治療活性多肽或蛋白是能改善或治療神經學紊亂的多肽或蛋白。在優(yōu)選的實施方案中,異源治療性基因編碼神經營養(yǎng)因子。在更優(yōu)選的實施方案中,神經營養(yǎng)因子是神經生長因子(NGF);胰島素樣生長因子(IGF),尤其是IGFI或IGFII;轉化生長因子(TGF)超家族成員,包括轉化生長因子-a和轉化生長因子-(3(TGFa和TGFI3),轉化生長因子-卩2(TGF-卩2),Neurturin(NTN),Persephin(PSP);神經月交質細胞系來源的(glialcell-linederived)神經營養(yǎng)因子(GDNF);Neublastin(NBN);睫狀神經營養(yǎng)因子(CNTF);腦源(brainderived)神經營養(yǎng)因子(BDNF);神經營養(yǎng)蛋白(Neurotrophin,NT),尤其是NT3到9;腫瘤壞死因子(TNF),尤其是TNF-a。在另一個優(yōu)選實施方案中,異源治療性基因編碼神經元存活因子(neuronalsurvivalfactor)。在更優(yōu)選的實施方案中,神經元存活因子是可溶性或分泌型超氧化物歧化酶(SuperOxideDismutase,SOD),Bcl2,BCIXL或Hedgehog蛋白。在第三個優(yōu)選實施方案中,異源治療性基因編碼神經生長因子。在更優(yōu)選的實施方案中,神經生長因子是成纖維細胞生長因子(FGF),尤其是酸性或堿性成纖維細胞生長因子(aFGF或bFGF);內皮生長因子(EGF),尤其是血管內皮細胞生長及通透因子(VEGPF);干擾素,尤其是千擾素-a、干擾素-卩或干擾素—y;白介素(IL)l,尤其是IL-1、IL-1卩、GMCSF和IL-2到IL-14。在第四個優(yōu)選實施方案中,異源治療性基因編碼參與神經遞質物質合成的生物活性分子。在更優(yōu)選的實施方案中,神經遞質物質是乙酰膽堿、去曱腎上腺素、腎上腺素、3,4-二羥苯丙氨酸(3,4-dihydroxyphenyAlanine,L-DOPA)、多巴胺、章魚涎胺(octopamine)、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、月肅氨酸、y-氨基丁酸(GABA)、酪氨酸、牛磺酸(taurine)、丙氨酸、胱硫醚(cystathione)、組胺、5-羥色胺(serotonine,5-hydroxytryptamine)、P物質、神經肽(Neuropeptid)Y(NPY)、縮膽嚢素(Cholecystokinin)、神經降壓肽(neurotensin)、月鹵啡月太(enkephalin)、或1"足生長素氺卩制素(somatostatin)。在另一乙?;D移酶;酪氨酸羥化酶(TH);酪氨酸脫羧酶;胸苷激酶,胞嘧啶脫酰胺酶(cytosinedeamidase),單胺氧化酶,L-DOPA脫羧酶,組氨酸脫羧酶,谷氨酸脫羧酶,鳥氨酸轉氨甲酰酶(OTC)。在第五個優(yōu)選實施方案中,異源治療性基因編碼受體。在更優(yōu)選的實施方案中,受體是結合乙酰膽堿、去曱腎上腺素、腎上腺素、3,4-二羥苯丙氨酸(L-DOPA)、多巴胺、章魚涎胺、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、y-氨基丁酸(GABA)、酪氨酸、?;撬?、丙氨酸、胱硫醚、組胺、5-羥色胺、P物質、神經肽Y(NPY)、縮膽嚢素、神經降壓肽、腦啡肽、或促生長素抑制素的受體。替代療法本發(fā)明細胞系可以經過或不經過操作來包含編碼特定治療因子的其他異源DNA。在本發(fā)明細胞系不包含編碼特定治療因子的其他異源DNA的情況下,它特別適于康復療法(restorativetherapy)。在本文,替代療法的定義涉及源于神經系統內的細胞的移植,在植入移植物之后,所述細胞在CNS和/或PNS的特定位置中或全部替代缺陷的(defective)、缺無的(absent)或喪失的細胞及它們的功能。本發(fā)明另一方面提供了在CNS之內或之外的替代療法中使用的方法和組合物。本發(fā)明替代療法可以特別用于細胞替代,由細胞產生的細胞分泌的內源性物質的遞送,用于造血系統的療法,哺乳動物包括人的神經學疾病。本發(fā)明范圍內的神經學缺損(neurologicaldeficit)包括任何神經變性的疾病、紊亂或狀況。神經缺損可能尤其是與如下有關的神經變性疾病受損害的和受創(chuàng)傷的神經元,尤其是外周神經、髓質、和/或脊髓的創(chuàng)傷損害,大腦缺血性神經損傷,神經病尤其是外周神經病,阿爾茨海默氏病,亨廷頓氏病,帕金森氏病,成月交質細胞瘤,月幾萎縮性側索硬化(amyotrophiclateralsclerosis)或任何其他神經變性疾病,以及與癡呆相關4關的記憶障礙(memoryimpairment)。保護性療法不含編碼特定治療因子的其他異源DNA的本發(fā)明的無限增殖細胞系可能非常適于置換療法,而已經引入了編碼特定治療因子的其他異源DNA的本發(fā)明的無限增殖細胞系可能非常適于保護性療法。在本文,保護性療法的定義涉及源于神經系統內的細胞的移植,在植入移植物之后,所述細胞在CNS和/或PNS的特定位置中或全部產生內源或外源的治療因子,所述因子會預防或防止受體個體的神經系統中細胞的死亡或功能障礙,或刺激這些細胞的功能或再生和神經再分布(re-innervation)的能力。本發(fā)明特別提供了在保護性療法中使用的方法和組合物。更具體地,本發(fā)明提供了為治療性和/或預防性目的通過植入正常的或免疫抑制的哺乳動物(包括人類)的腦部來使用的方法和組合物。本發(fā)明特別提供了用于持續(xù)并安全地治療神經學缺損的方法和組合物。本發(fā)明范圍內的神經學缺損包括任何神經變性的疾病、紊亂或狀況。神經學缺損可能尤其是與如下有關的神經變性疾病受損害的和受創(chuàng)傷的神經元,尤其是外周神經、髓質、和/或脊髓的創(chuàng)傷損害,大腦缺血性神經損傷,神經病尤其是外周神經病,阿爾茨海默氏病,亨廷頓氏病,帕金森氏病,成膠質細胞瘤,肌萎縮性側索硬化或任何其他神經變性疾病,以及與癡呆相關聯的記憶障礙。分化除了其他已知的分化方法,如WO02/086106(NsGene)所述的TH誘導方法,NGC-407細胞系可以用已知的體外分化方法,如實施例1所述的那些(Bardford分化;Sah分化;Storch分化)來處理。這種分化可在替代療法之前進行或作為體外試驗或基因表達繪圖(profiling)的一部分。對分化規(guī)程的更具說明性的舉例包括實施例8中描述的兩個規(guī)程(在無EGF和bFGF的N2培養(yǎng)基中分化(N2分化);在無EGF和bFGF但有cAMP和GDNF的N2培養(yǎng)基(DA分化培養(yǎng)基)中分化)。進一步地,NGC-407細胞可通過用編碼負責或涉及多巴胺能分化的轉錄因子(如Nurri,Pitx3,En和Lmxib)的表達載體轉導或轉染來分化。優(yōu)選的4爭錄因子是Andersson等所述的Lmxla(Andersson等,2006,"Identificationofintrinsicdeterminantsofmidbraindopamineneurons",Cell124:393-405)。體外試驗在多項體外試驗中,NGC-407細胞系可用于試驗潛在的藥物(既可以是低分子量,也可以是蛋白質、基因或iRNA)。簡言之,細胞系接觸所需化合物,并將其反應與對照處理比較。所述反應可以是存活、分化、代謝活動、信號傳導、受體激活等?;蚶L圖(profiling)已經在多巴胺能神經元在人胎兒腹側中腦(ventralmidbrain)恰當發(fā)育時從腹側中腦建立了NGC-407細胞系??梢杂闷湔{控對NGC-407特異的基因作為來自腹側中腦的細胞的標記物,作為多巴胺能神經元的標記物,或作為來自腹側中腦的干細胞/先祖細胞的標記物。用NGC-407鑒定的基因的治療潛力也可被試驗。自殺基因療法如本申請發(fā)明背景部分所述,神經千細胞可用作向癌細胞遞送自殺基因的產物的遞送載體。如本文實施例所證明,NGC-407事實上能夠遷移到成膠質細胞瘤的腫瘤同時保持標記基因(GFP)的表達。因此,細胞系可用作載體來向腫瘤遞送異源自殺基因。已經觀察到給予4-PB會增加圍繞植入的肺瘤的GFP陽性細胞的數目。因此,在優(yōu)選的實施方案中,將4-PB給予已植入了表達自殺基因的NGC-407細胞的患者。給予4-PB和與自殺基因療法有關^:的類似物的方法和劑量見WO2005/079849所述。脫氧核苷激酶在旁觀者(bystander)介導的自殺基因療法的優(yōu)選實施方案中,已經遺傳改造本發(fā)明的細胞系來過表達異源脫氧核苷激酶。來自多種生物體的脫氧核苷激酶(dNK)在它們的底物特異性、基因表達的調控和細胞定位方面不同。在哺乳動物細胞中,有四種酶具有重疊的特異性,胸苦激酶1(TK1)和2(TK2),脫氧胞苷激酶(dCK)和脫氧鳥苷激酶(dGK)使。票呤和嘧啶脫氧核苷磷酸化。TK1和TK2是嘧啶特異性的并且使脫氧尿苦(dUrd)和胸苦(dThd)磷酸化,TK2也使脫氧胞苷(dCyd)磷酸化。dCK使dCyd、脫氧腺苦(dAdo)和脫氧鳥香(dGuo)磷酸化,但不使dThd磷酸化。dGK使dGuo和dAdo磷酸化。在哺乳動物中,TK1是胞質的,并且TK2和dGK定位于線粒體中,但近來的報道指出TK2也胞漿定位。最知名的并且研究最多的自殺基因療法例子是單純皰滲病毒(HSV)胸苷激酶(tk)基因(Karreman,1998,Anewsetofpositive/negativeselectablemarkersformammaliancells.Gene.218:57-61)。當生長細月包接觸到治療皰滲(antiherpetic)核香類似物如更昔洛韋(GCV),HSVtk基因導致細胞死亡,因為這一前藥和其它前藥被HSVTK代謝為毒性代謝產物。黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)脫氧核苷激酶(Dm-dNK)使所有四種天然脫氧核芬以及多種核苷類似物磷酸化(Munch-Petersen等,1998,FourdeoxynucleosidekinaseactivitiesfromDrosophilamelanogasterarecontainedwithinasinglemonomelicenzyme,anewmultifunctionaldeoxynucleosidekinase.JBiolChem.273:3926-31;M露h-Petersen等,2000,FunctionalexpressionofamultisubstratedeoxyribonucleosidekinasefromDrosophilamelanogasteranditsC-terminaldeletionmutants.JBiolChem.275:6673-9;WO00/36099"Newmedicaluseofgeneandvectorencodingamultisubstratedeoxyribonucleosidekinase(dNK)")。這種酶的寬底物特異性以及高催化率使已經開發(fā)了黑腹果蠅DmdNK的突變型,其具有寬底物特異性(WO01/88106"Multi-substrateinsectdeoxynucleosidekinasevariants")。凈寺另'H尤選的變體是變體B5,因為其活化度就吉西他濱(gemcitabine)而言比野生型DmdNK高大約50倍?;罨缺欢x為非轉染細胞系中前藥的ICso與轉染細胞系中核苷類似物的IC5Q的比例。在基因療法途徑中的這些及其它重組激酶通過將其處于強組成型啟動子控制下而可以在NGC-407細胞中過表達,所述啟動子如CMV啟動子,人UbiC啟動子,JeT啟動子(US6,555,674),SV40啟動子,和延伸因子lct啟動子(EFl-a)。脫氧核苷激酶的具體已知序列的非限制性例子包括,例如見下野生型HSV-tk,登錄號V00470(SEQIDNO1)MASYPGHQHASAFDQAARSRGHSNRRTALRPRRQQEATEVRPEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDPPPALTLIFDRHPIAALLCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDYNVFAWALDVLAKRLRSMHVFILDYDGSPAGCRDALLQLTSGMVQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEAN黑腹果蠅野生型激酶GenBanKACCNY18048(SEQIDNO2)ISSNQQPSPVLVSPSKRQRVAR番戒TK(SEQIDNO3)SPLVDP擬南芥(Arabidopsisthaliana)dNK(SEQIDNO4>EFVKKKQETSTEKSNS(2SPVLLPH(2NGGLWMGPAGNHVPGLDLPPLDLKSLLTRPSA黑腹果蠅B5突變體(SEQ工DNO5>LRTSPEVAYER工RQRARSEES^VPLKYLQELHELHEDWLIHQRRPQSCKVLVLDADLDLEN工GTEYQRSESSIFDA工SSNQQPSPVPVSPSKRQRVAR擬南芥dCGKNP一565032(SEQIDNO6)1mqkilcksttsstpvlstpvnslaagfislgfktpvknlppcsttkplstcffstsampt61ttasvssggvgfsaylqrtvhkpapasvrfstagyrtcrcsidgtnrawvgrtgswralf121csdstggltpvnatagavveseeesdgededeekdekpvr腿rrnrsssgsgefvg叩dl181lkipgvglrnqrklvdngigdvaelkklykdkfwkasqkmvdylrssvgiihrnhaesit241tfikesvddelkdsgpepnlnvkkrltfcvegnisvgkstflq:rianetvelqdlveivp301epvdkwqdvgpdhfnildafysepqryaytfqnyvfvtrlmqekesasgvkplrlmersv361fsd淺vfvravheakwmnemeisiydswfdpvvsslpglvpdgfiylraspdtchkrmml421rk:raeeggvslkylqdlhekheswllpfesgnhgvlsvsrpslhmdnslhpdikdrvfyl481egnhmhssiqkvpalvldcepnidfsrdieaktqyarqvaeffefvkkkqetsteksnsq541spvllphqngglwmgpagnhvpgldlppldlkslltrpsa稻(Oryzasativa)dCGKBAB86213(SEQIDNO7)1mveflqssvgiihknhaesitlfikesvdeelkgtdspnvsknkrltfcvegnisvgktt61flqrianetielrcilveivpepiakwqdvgpdhfnildafyaepqryaytfqnyvfvtrv121mqekesssgikplrlmersvfsdrmvvkflkvfvravheanwmnemeisiydswfdpvvs181slpglipdgfiylraspdtchkrmmvrkirseeggvtldylrglhekheswllpskgqgpg241vlsvsqvpvhmegslppdirervfylegdhmhssiqkvpalvldcehdidfnkdieakrq人類(H.sapiens)dCKXP—003471(SEQIDNO8)NGGNVLQMMYEKPERWSFTFQTYACI^GEVPILTLDVNEDFKDKYESLVEKVKEFLSTL人類dGKXP002341(SEQIDNO9)K肌WL工HKTT>人類TK2NP—004605(SEQIDNO10>NRKHCP人類TK1XP—037195(SEQIDNO11)PACLLRDVAQEALQCSPAN家蠶(Bombyxmori)dNKAAK28318(SEQIDNO12)1msa皿vkpftvfvegnigsgkttflehfrqfeditlltepverrrwrdlkgcnllelrnyk:dp61ekwamtfqsyvsltmldmhrrpaptpvklmerslfsarycfvehimrnntlhpaqfavld121ewfrfiqhnipidadlivylktspsivyqrikkrarseeqcvplsyieelhrlhedwlin181rihaecpapvlvldadldlsqitdeykrsehqilrkavnvvmsspnkhspkkpisttpik241itphmril>按蚊屬(Anopheles)dNKAA049462(SEQIDNO13>RAKTDF〉水稻(Rice)TKl(SEQIDNO14)HYLDGQIVIEATRIVLDLEKSKVIHAFK>擬南芥(義.thaliana)TKlAAF13097(SEQIDNO15)>擬南芥TKlb(SEQIDNO16)>番茄dCGK(SEQIDNO17)MVEFLQSS工GIIHRNHAESITTYIRKSVDEELKE畫SDSLWVPGGKFSESTLNLDFRRNMSFMSH對應的核苷酸序列可用如上給出的登錄號在Genbank中、在如上給出的參考文獻中、和WO03/100045(胸苷激酶)和WO2004/003185(dCK/dGK)(對于植物激酶)中見到。在優(yōu)選的實施方案中,脫氧核苷激酶選自下組a)具有SEQIDNo1-17任一的氨基酸序列的脫氧核苷激酶;b)脫氧核苷激酶變體,其包含與SEQIDNol-17任一具有至少50%序列同一性的氨基酸序列;c)脫氧核苷激酶,其由能與編碼SEQIDNol-17任一的核苷酸序列在高嚴謹條件雜交的核苷酸序列編碼。在本發(fā)明的范圍內,術語激酶變體為多肽(或蛋白),其具有的氨基酸序列與表示為SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,SEQIDNO:12,SEQIDNO:13,SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17的序列在一或多個氨基酸位點上不同,并且具有dNK活性。這些類似多肽包括包含保守取代的多肽,剪接變體,同種型(isoform),來自其它物種的同源物(homologue),和多態(tài)性(polymorphism)。在本文,術語"保守取代,,的定義為氨基酸殘基被另一種生物學類似的殘基取代。保守取代的例子包括(i)一個非極性或疏水性殘基(如丙氨酸,亮氨酸,異亮氨酸,纈氨酸,脯氨酸,曱硫氨酸,苯丙氨酸或色氨酸)被另一個取代,尤其是丙氨酸,亮氨酸,異亮氨酸,纈氨酸或脯氨酸被另一個取代;或(ii)一個中性(不帶電荷)的極性殘基(如絲氨酸,蘇氨酸,酪氨酸,天冬酰胺,谷氨酰胺或半胱氨酸)被另一個取代,尤其是精氨酸被賴氨酸取代,谷氨酸被天冬氨酸取代,或者谷氨酰胺被天冬酰胺取代;或(iii)帶正電荷的殘基(如賴氨酸,精氨酸或組氨酸)被另一個取代;或(iv)帶負電荷的殘基(如天冬氨酸或谷氨酸)被另一個取代。對這種一級氨基酸序列作修飾可得到與未經修飾的對應多肽相比具有基本等同活性的蛋白,因此可認為這些蛋白是親代蛋白的功能類似物。這種修飾可以例如通過定點誘變有意產生,或者它們可自發(fā)發(fā)生,它們包括剪接變體,同種型,來自其它物種的同源物,和多態(tài)性(polymorphism)。這種功能類似物也在本發(fā)明范圍內。已經發(fā)現,C-和/或N-末端有改變的脫氧核苷激酶顯著改變它們的特性,尤其是動力學特性,如轉換(turnover)和底物特異性。所以,本發(fā)明的脫氧核香激酶可以從具有更局限的特異性,通常是脫氧胞苷激酶(dCK)和脫氧鳥苷激酶(dGK)活性,轉變?yōu)榛旧嫌卸嘀氐孜锏拿?,后者具有使所有四種脫氧核苷磷酸化的能力。脫氧核苷激酶變體可以參照已知的脫氧核苷激酶(如本文公開的任一種激酶)的氨基酸序列來定義。在優(yōu)選的實施方案中,激酶變體與參照序列具有至少50。/。序列同一性,更優(yōu)選至少60。/。序列同一性,更優(yōu)選至少70%序列同一性,更優(yōu)選至少75%序列同一性,更優(yōu)選至少80%序列同一性,更優(yōu)選至少85%序列同一性,更優(yōu)選至少90%序列同一性,更優(yōu)選至少95%序列同一性。單個參照序列可以是SEQIDNO:1,SEQIDNO:2,SEQIDNO:3,SEQIDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,SEQIDNO:12,SEQIDNO:13,SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,和SEQIDNO:17的任一個。在更優(yōu)選的實施方案中,脫氧核苷激酶包含選自由下列組成的組的脫氧核苷激酶a)具有SEQIDNo1-5任一的氨基酸序列的脫氧核苷激酶;和b)脫氧核苷激酶變體,其包含與SEQIDNo1-5任一具有至少70%序列同一性的氨基酸序列并具有dNK活性。也可以將兩種或多種脫氧核香激酶給予同一個體。不受限制地,優(yōu)選如下激酶和核苷類似物的組合HSV-tk-GCV,ACV,噴昔洛韋(penciclovir)黑腹果蠅dNK或B5-吉西他濱,CdA,FaraA,araC,ddC植物TK包括番茄TK-AZT,D4T,ddT,5'-氟尿苷(fluorouridine)植物dNK包括擬南芥(Arabidopsisthaliana)dNK-吉西他濱,CdA,FaraA,araC,ddC。用于比對序列和計算序列同一性的數學算法的優(yōu)選非限制性例子是MyersandMillerCABIOS(1989)算法。此算法并入了作為FASTA序列比對軟件包一部分的ALIGN程序(2.0版)(PearsonWR,MethodsMolBiol,2000,132:185-219)。Align基于整體序列對比計算序列的同一性。AlignO不對序列末端的缺口罰分。當利用ALIGN或AlignO程序來比較氨基酸序列時,優(yōu)選使用缺口的開放/延伸罰分為-12/-2的BLOSUM50替代矩陣。股嚢化作用(encapsulation)膠嚢化(encapsulated)細胞療法是基于在植入宿主前用半滲透性的生物適合材料包繞細胞,從而使所述細胞與受體宿主的免疫系統隔離的概念。本發(fā)明包括將本發(fā)明細胞包裹在免疫隔離的膠嚢內的裝置。"免疫隔離的(immunoisolatory)膠嚢"指一種膠嚢,它在植入受體宿主后,使宿主免疫系統對裝置核心的細胞的有害作用最小。通過將細胞封閉在微孔膜所形成的可植入的聚合物膠嚢內,來使細胞與宿主免疫隔離。此種方法避免了宿主和植入組織之間的直接細胞-細胞接觸,通過直接呈遞消除了抗原識別。也可定制(tailor)所用的膜來基于分子(如抗體和補體)的分子量控制所述分子的滲透,同時允許治療性蛋白的滲透。利用膠嚢化技術,無論是否利用免疫抑制藥物,都可以將細胞移植到宿主但不引起免疫排斥。可用的生物適合性聚合物膠嚢常包含含細胞的核心及選擇通透的(permselective)基質或膜的周圍或外周區(qū)("外套(jacket)"),所述細胞懸浮于液態(tài)培養(yǎng)基中或固定在固定化(immobilizing)基質內;所述周圍或外周區(qū)不包含分離的細胞,是生物適合的并且足以保護核內的細胞不受有害的免疫學攻擊。膠嚢化作用妨礙免疫系統的元素進入膠嚢,從而保護被包裹的細胞不受免疫破壞。膠嚢的膜的半滲透性也允許所需的生物活性分子容易地從膠嚢滲透到周圍的宿主組織中。可從生物適合性材料制備膠嚢。"生物適合性材料"是一種材料,它在植入宿主后不引起有害的宿主反應,該反應足以導致對膠嚢的排斥或妨礙膠嚢起作用,例如通過降解。生物適合性材料對于大分子(如宿主免疫系統的組分)是相對不可滲透的,但對小分子(如胰島素,生長因子和營養(yǎng)素)是可滲透的,同時還可使代謝廢物排出。多種生物適合性材料適于通過本發(fā)明組合物來遞送生長因子。多種生物適合性材料是已知的,具有多種外表面形態(tài)和其它的機械和結構特性。優(yōu)選地,本發(fā)明膠嚢與WO92/19195或WO95/05452中所述的類似,在此引入作為參考;或與美國專利5,639,275;5,653,975;4,892,538;5,156,844;5,283,187;或美國專利5,550,050所述的那些類似,引入作為參考。這種膠嚢允許代謝物、營養(yǎng)物和治療性物質通過,而使宿主免疫系統的有害作用最小化。生物適合性材料的組分可包括周圍的半透膜和內部支持細胞的骨架(scaffolding)。優(yōu)選地,將重組細胞接種在骨架上,所述骨架被選擇通透的膜包裹。絲狀的支持細胞的骨架可用任何選自如下組成的組的生物適合性材料制備丙烯酸,聚酯,聚乙烯,聚丙烯,聚乙腈(polyacetonitrile),聚對苯二曱酸乙二酉享酉旨(polyethyleneteraphthalate),尼龍,聚酰胺,聚氨酯,聚丁酯(polybutester),絲,棉,殼多糖(chitin),碳,或生物適合的金屬。粘合的(bonded)纖維結構也可用于細胞植入(或美國專利5,512,600,引入作為參考)??缮锝到獾木酆衔锇ㄈ缦碌哪切┚廴樗?PLA),乳酸-乙醇酸共聚物(poly(lactic-coglycolicacid),PLGA),和聚乙醇酸(PGA)及其等效物。已經用泡沫骨架來提供移植的細胞可粘附其上的表面(WO98/05304,引入作為參考)。已經用編織網狀管(wovenmeshtube)作為血管移植物(WO99/52573,引入作為參考)。另外,核心可由使細胞位置穩(wěn)定的水凝膠所形成的固定化基質組成。水凝膠是基本由水組成的呈凝膠形式的交聯親水聚合物的三維網絡。外套的優(yōu)選分子量閾值不到1000kD,更優(yōu)選為50-700kD,最優(yōu)選為70-300kD。應選擇分子量閾值來確保生物活性治療性蛋白可離開膠嚢,同時保護被包裹的細胞免受患者免疫系統的攻擊。外套的厚度通常為2-200微米,更優(yōu)選為50-150微米。外套的厚度應賦予膠嚢足夠強度來保持細胞被包裹,并應記住要盡可能薄以占據盡可能少的空間。多種聚合物和聚合物共混物(blend)可用于制備周圍的半透膜,包括聚丙烯酸酯(包括丙烯酸共聚物),聚偏二乙烯(polyvinylidene),聚偏二氯乙烯(polyvinylchloride)共聚物,聚氨酯,聚苯乙烯,聚酰胺,醋酸纖維素酯,硝酸纖維素酯,聚砜(polysulfone)(包括聚醚砜(polyethersulfones)),聚磷腈(polyphosphazene),聚丙烯腈,丙烯腈/氯乙烯共聚物,及它們的衍生物,共聚物和混合物。優(yōu)選地,周圍的半透膜是生物適合的半滲透空心纖維的膜。這種膜及它們的制備方法公開見美國專利5,284,761和5,158,881,引入作為參考。周圍的半透膜可從聚醚砜空心纖維形成,如美國專利4,976,859或美國專利4,968,733所述的那些,引入它們作為參考。替代的周圍的半透膜材料是丙烯腈/氯乙烯共聚物。膠嚢可以是為了維持生物活性和提供遞送產物或傳遞功能的途徑的任何合適構型,包括例如圓柱形的、矩形的、圓盤形的、片狀的、卵圓形的、星形的或球形的。而且,膠嚢可以巻或纏成網孔狀或巢狀結構。如果膠嚢在植入后要將其回收,那么不優(yōu)選使膠嚢從植入位置遷移的構型,如小到可以在受體宿主的血管中運動的球形膠嚢。某些形狀,如矩形、片狀、圓盤形、圓柱形和平片狀提供了較高的結構完整性,因此在需要回收時是優(yōu)選的。特別優(yōu)選的形狀是圓柱形的,因為此形狀能用工業(yè)生產的空心纖維容易地制備。在使用大膠嚢時,優(yōu)選在每個裝置中包裹至少103個細胞,如包裹103-108個細胞,最優(yōu)選包裹105-107個細胞。當然,每個膠嚢中的細胞數取決于膠嚢大小。根據經驗,本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現在一種(下述的)泡沫膠嚢中可裝載10,000-100,000個細胞/pl月交嚢(體積以包括泡沫的內部體積加以計算),更優(yōu)選25,000-50,000個細胞/|11,更優(yōu)選30,000-40,000個細胞/^1。要裝載的細胞數也取決于細胞大小??梢酝ㄟ^植入較少或較多數目的膠嚢來控制劑量,優(yōu)選每名患者1-10粒膠嚢。本發(fā)明范圍內的大膠嚢是體積至少1|iL,如1-10jiL的膠嚢??捎冒饣|(ECM)分子來包被骨架。胞外基質分子的合適例子包括例如膠原蛋白,層粘連蛋白(laminin)和粘連蛋白(fibronectin)。骨架表面也可以通過用血漿照射處理來賦予電荷、從而增強細胞的粘著來進行修飾??墒褂萌魏蚊芊饽z嚢的合適方法,包括利用聚合物粘合劑或巻曲(crimping),打結(knotting)和熱封。另夕卜,也可如美國專利5,653,687(引入作為參考)所述使用任何合適的"干"封法。用已知技術植入膠嚢化的細胞裝置。很多植入位置對于本發(fā)明裝置和方法是可用的。這些植入位置包括但不限于中樞神經系統,包括腦,脊髓(見美國專利5,106,627,5,156,844,和5,554,148,引入作為參考),以及眼睛的房水和玻璃體液(見WO97/34586,引入作為參考)。泡沫骨架可用任何合適材料組成泡沫骨架,該合適材料形成帶有開孔(opencell)的生物適合性泡沫、或具有孔網絡的大孔結構。開孔泡沫是由相互連接的孔組成的網狀結構。泡沫骨架提供了不可生物降解的穩(wěn)定骨架材料,貼壁細胞可附著其上。在用于形成本發(fā)明裝置所用的泡沫骨架的聚合物中,有熱塑性塑料(thermoplastics)和熱塑性彈性體(elastomer)。用于形成合適的泡沫骨架的材料的一些例子列于表1。聚砜聚醚砜聚偏二氟乙烯優(yōu)選從聚砜和聚醚砜制備的熱塑性泡沫骨架,以及從聚氨酯和聚乙烯醇表1熱塑性塑#+:丙烯酸變性聚丙晞腈(Modacrylic)聚酰胺聚碳酸西旨(Polycarbonate)熱塑性彈性體聚酰胺聚酯聚乙烯聚丙歸聚苯乙烯聚氨酯聚乙烯醇(PolyvinylAlcohol)硅酮(Silicone)聚乙烯聚丙烯聚苯乙烯制備的熱塑性彈性體泡沫骨架。泡沫中一些(不必所有的)孔的尺寸必須允許細胞附著于孔內的壁或表面。泡沫骨架的孔徑、孔密度及空隙體積(voidvolume)可以變化。孔的形狀可以是圓形的、橢圓形的或不規(guī)則的。因為孔的形狀可以有顯著差別,其尺寸可根據被測量的軸而有差別。為本發(fā)明目的,泡沫中至少一些孔應具有20-500nm,優(yōu)選50-150)im的孔直徑。優(yōu)選地,上述尺寸代表了泡沫的平均孔徑。如果孔不是圓形的,它可能具有反復不定的尺寸,只要其大小足以允許貼壁細胞附著于孔內的壁或表面。在一個實施方案中,預計泡沫具有一些橢圓形孔,所述孔在沿短軸直徑為20-500沿長軸直徑最大1500nm。除了上述的細胞允許的孔徑,優(yōu)選泡沫中的至少一部分孔應小于10pm,使細胞不能通過,但仍可提供運輸營養(yǎng)物和生物活性分子至整個泡沫的通道。泡沫的孔密度(即每個單位體積中如上所述容納細胞的孔的數目)可在20-90%間變化,優(yōu)選在50-70%j。類似地,泡沫的空隙體積在20-90%間變化,優(yōu)選在30-70%間變化。孔的壁或表面通常包被一或多個胞外基質分子或其它合適的分子。此包被可利于細胞貼在孔壁上,使細胞保持特定表型和/或誘導細胞分化。白、層粘連蛋白:玻連蛋白、'聚鳥i酸和粘連蛋白。'其它合適的ECM分子包括糖胺聚糖和蛋白聚糖;如硫酸軟骨素,硫酸肝素,透明質酸酶(hyaluron),硫酸皮膚素,硫酸角質素,硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)和彈性蛋白。ECM可以通過培養(yǎng)已知沉積ECM的細胞來獲得,包括間充質或星形膠質細胞來源的細胞。神經膜細胞(Schwanncell)在用抗壞血酸鹽和cAMP處理時可經誘導合成ECM。見例如Baron-VanEvercooren等,"SchwannCelldifferentiationinvitro:ExtracellularMatrixDepositionandInteraction,"Dev.Neurosci.,8,pp.182-96(1986)。另夕卜,粘著肽(adhesionpeptide)片段,如含RGD的序列(ArgGlyAsp),含YIGSR的序列(TyrlleGlySerArg),以及含IKVAV的序列(IleLysValAlaVal)已經發(fā)現對于促進細胞附著有用。一些含RGD的分子可商購得到,如PepTite-2000.TM(Telios)。本發(fā)明泡沫骨架也可用其它材料處理,來改進裝置內的細胞分布。例如,可用抑制細胞增殖或移動的非允許性(non-permissive)水凝膠填充泡沫的孔。這種改進可提高貼壁細胞對泡沫骨架的附著。適合的水凝膠包括由于電荷而排斥細胞的陰離子水凝膠(例如藻酸鹽或鹿角菜膠)。或者,"實體(solid)"水凝膠(如瓊脂糖或聚環(huán)氧乙烯)也可用于通過阻礙細胞所分泌的胞外基質分子的結合來抑制細胞增殖。用非允許性材料區(qū)域處理泡沫骨架可以將裝置內的兩或多種不同的細胞群膠嚢化,而不會讓一種細胞群生長超過另一種。因此,可在泡沫骨架內使用非允許性材料來分隔不同的被包裹細胞群。不同的細胞群可以是相同或不同的細胞種類,并可以產生相同或不同的生物活性分子。在一個實施方案中,一種細胞群產生增強其它細胞群生長和/或存活的物質。在另一個實施方案中,產生多種生物活性分子的多種細胞種類被包裹。這為接受者提供了治療性物質的混合物或"混合液(cocktail)"。本發(fā)明裝置可用任何合適方法制備。在一個實施方案中,可以預先形成泡沫骨架,并將其插入作為個別組分的預制備的外套,如空心纖維膜??梢灶A形成任何合適的熱塑性塑料或熱塑性彈性體泡沫骨架材料來插入預制備的外套。在一個實施方案中,我們優(yōu)選聚乙烯醇(PVA)海綿用作泡沫骨架。數種PVA海綿都可以商購得到。例如,PVA泡沫海綿弁D-3,60pm孔徑是合適的(RippeyCorp,Kanebo)。類似地,PVA海綿可以從IvalonInc.(SanDiego,Cailf.)商購得到。PVA海綿是通過充氣的聚乙烯醇溶液與作為交聯劑的曱醛蒸汽反應形成的不溶水性海綿。PVA的羥基基團與醛基團共價交聯來形成聚合物網絡。所述泡沫在濕的時候是柔性且有彈性的,在干燥時是半剛性的??蛇x地,篩或紗可用作支持物,如US6,627,422所述。為了回收容易,可給膠嚢裝配用來系繩的系縛物。本發(fā)明NGC-407或源自NGC-407的細胞可如實施例所述擴增并裝載入免疫隔離的膠嚢。裝載后,可體外保存膠嚢數周。在此階段,生長培養(yǎng)基可以是允許在膠嚢內持續(xù)增殖以使膠囊更完整填充的培養(yǎng)基,或者可將該培養(yǎng)基替換為分化培養(yǎng)基來使被包裹的細胞分化,從而終止增殖。用于本發(fā)明的細胞的支持基質本發(fā)明方法還包括在植入哺乳動物腦部之前,在支持基質上體外培養(yǎng)本發(fā)明的細胞。植入腦部之前細胞預先粘附到微載體,被設計用于提高移植細胞的長期生存力,并提供長期功能益處。在支持基質上培養(yǎng)細胞的方法和將所述細胞植入腦部的方法見US5,750,103(Cherksey)所述。為提高移植細胞的長期生存力,要移植的細胞可在移植前體外附著于支持基質上。支持基質所包含的材料包括如下材料,體外溫育后細胞附著在所述材料上并在其上生長,并且所述材料可植入哺乳動物體內而不產生毒性反應或會破壞植入細胞或者干擾它們的生物或治療活性的炎性反應。這些材料可以是合成的或天然的化學物質,或具有生物來源的物質。基質材料包括但不限于玻璃及其他二氧化硅,聚苯乙烯,聚丙烯,聚乙烯,聚偏二氟乙烯,聚氨酯,聚藻酸鹽,聚砜,聚乙烯醇,丙烯腈聚合物,聚丙烯酰胺,聚碳酸酯,polypentent,尼龍,淀粉酶,天然的和經過修飾的明膠,和天然的和經過修飾的膠原蛋白,天然的和經過修飾的多糖,包括葡萄糖和纖維素(如硝化纖維素),瓊脂,和磁鐵礦??梢允褂每稍傥盏?resorbable)或不可再吸收的材料。本領域公知的胞外基質材料也包括在內。胞外基質材料可通過商購得到,或者其可通過培養(yǎng)分泌此種基質的細胞,除去分泌細胞,再使要被移植的細胞與基質相互作用并附著于基質上來制備得到。使要植入的細胞在其上生長或與所述細胞混合的基質材料,可以是細胞的天然產物。因此,例如,該基質材料可以是胞外基質或基底膜材料,它們是由要植入的細胞產生并分泌的。為了提高細胞的粘著、存活和功能,固相(solid)基質可選在其外表面用本領域已知的因子包被,來促進細胞粘著、生長或存活。這些因子包括細胞粘著分子,胞外基質如纖連蛋白,層粘連蛋白,膠原蛋白,彈性蛋白,糖胺聚糖或蛋白聚糖或生長因子?;蛘?,如果植入細胞所附著的固相基質由有孔(porous)材料構成,可以將促進生長或存活的一或多種因子摻入基質材料,它們會在植入體內后從基質材料緩慢釋放。用于移植的細胞在附著到本發(fā)明支持物上時,通常在支持物"外表面"上。支持物可以是實心或有孔的。然而,即使在有孔的支持物中,細胞仍直接接觸外部環(huán)境,沒有擋在中間的膜或其他障礙物。因此,根據本發(fā)明,即使細胞所附著的表面可以是有孔支持物材料向內的褶或盤旋的、其自身不在顆?;蛑樽油獠康男问?,所述細胞仍被認為在支持物"外表面"上。支持物構型優(yōu)選是球形,如在珠子中,但也可以是圓柱形,橢圓形,平片狀或條狀,針狀或大頭針狀等。支持基質的優(yōu)選形式是玻璃珠。另一種優(yōu)選的珠子是聚苯乙烯珠子。玉朱子大小大約直徑10|im-lmm,優(yōu)選大約90jam至大約150|im。對多種微載體珠子的描述,例如見FisherBiotechSource87-88,FisherScientificCo.,1987,pp.72-75;SigmaCellCultureCatalog,SigmaChemicalCo.,St,Louis1991,pp.162-163;VentrexProductCatalog,VentrexLaboratories,1989;這些參考文獻引入作為參考。珠子大小的上限由珠子刺激不良宿主反應而決定,所述不良宿主反應可能干擾被移植細胞的功能或對周圍組織造成損傷。珠子大小的上限也由給予方法決定。本領域技術人員可以容易地確定這些限制范圍。實施例實施例1NGC-407細胞系的生成和表征本實施例舉例說明了NGC-407細胞系的生成和體外表征。從前三個月的人胚胎腦(獲自LundUniversity,Sweden)制備處于初級培養(yǎng)物中的人中腦細胞。遵照瑞典法律和規(guī)章獲得組織。切下腹側中腦后,立刻將組織置于培養(yǎng)皿中的一滴細胞解離溶液(Sigma#C5914)中并切成小于0.5mm3的塊。將兩片解剖刀彼此移動來切碎組織。將組織轉移至2ml培養(yǎng)基中,該培養(yǎng)基由DMEM/F12(Gibco#31331-028)、補充有0.5%HSA(Sigma#A1653)的N2添加物(Gibco#17502-048)、0.6%葡萄糖(Sigma#G8769)、5mMHEPES(Gibco#15630-056)、B27添加物(Gibco#17504-044)、40(ig/mlbFGF(R&DSystems#233-FB)、20|ig/mlEGF(R&DSystems弁236-EG)組成,l,OOOrpm離心5分鐘,重懸于新鮮培養(yǎng)基。組織塊接種于用PLL/纖連蛋白包被的4孔腔式載玻片或24孔板的1-4個孔中。使用標準細胞培養(yǎng)塑料制品,PLL/纖連蛋白包被根據如下進行培養(yǎng)容器的包被1.用0.01%多聚-L-賴氨酸溶液(Sigma#P4832)于37°C孵育1小時;2.除去PLL,用dH20(Gibco#15230-071)漂洗,使表面干燥2小時。3.臨接種細胞前,加入足量的于dH20中稀釋至50叱/ml的纖連蛋白溶液以覆蓋表面,立刻吸干,讓表面干燥45分鐘,然后加入組織/細月包。細胞接種后第4天,以MOI=l加入病毒原液來用TD1-2逆轉錄病毒載體轉導培養(yǎng)物,溫育過夜,通過換培養(yǎng)基除去病毒。通過將v-myc(作為gag-vmyc片段)(GenBank登錄號AF033809)克隆為pLXSN(BDClontech,目錄號631509,GenBank登錄號M28248)的EcoRI和Hpal位點之間的EcoRI/Dral片段制備載體TDl-2。載體中也存在賦予新霉素抗性的基因。將培養(yǎng)物在培養(yǎng)基和PLL/纖連蛋白包被的容器中擴增,至T25培養(yǎng)瓶滿板。以800嗎/ml的濃度加入遺傳霉素,來選擇轉導的細胞。選擇后,培養(yǎng)物在上述培養(yǎng)基中以單層維持生長。接近滿板的培養(yǎng)物用細胞刮具傳代,每3-7天以1:4分弁瓦。除去生長因子bFGF和EGF導致細胞系分化。加入不同因子也影響分化后細胞表型的組成(圖l和2)。使用三種不同的分化培養(yǎng)基1.促有絲分裂生長因子bFGF和EGF用50ng/mlBDNF、20ng/mlCNTF、100ng/mlIGF-1和50pM毛喉素代替的培養(yǎng)基(Sahetal,1997)。2.促有絲分裂生長因子bFGF和EGF用50ng/mlBDNF、50|iM毛喉素和50|iM多巴胺代替的培養(yǎng)基(Bradford;Riazetal,2002)。3.促有絲分裂生長因子bFGF和EGF用10%FCS、100pg/mlIL-lb、1ng/mlIL-11、lng/mlLIF、10ng/mlGDNF代替的培養(yǎng)基(Storchetal,2001)。分化后,觀察TH(酪氨酸羥化酶)、p-III-微管蛋白和GFAP(膠質細胞原纖維酸性蛋白)免疫反應性細胞。為進行這種免疫細胞化學,細胞用4%低聚曱醛固定,用含一級抗體(TH抗體Chemicon#AB152,GFAP抗體DAKO#Z0334,卩-III-微管蛋白抗體Sigma#T-8660)的封閉緩沖液室溫溫育2小時,漂洗,然后用含有熒光團共軛的(FITC或Cy3,JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc)物種特異性二級抗體的封閉緩沖液于室溫再溫育1小時。培養(yǎng)物然后用PBS漂洗,滴加DAKO封固劑后用蓋玻片覆蓋,然后計數細胞,對代表性視野拍照。不同細胞類型的百分數根據用于分化的因子類型而有所不同。分化培養(yǎng)基中TH陽性細胞的數量大約為總細胞數量的2%。神經元(卩-III-微管蛋白陽性細胞)的數量在4-17%間變化,GFAP陽性星形膠質細胞的數量在0-6%之間變化。增殖細胞培養(yǎng)物始終含有1%以下的用任一標記物免疫標記的細胞(圖1和2)。這些結果顯示NGC-407是能分化成神經元、星形膠質細胞和多巴胺能神經元的神經先祖細胞系。參考文件RiazSS,JauniauxE,SternGM,BradfordHF,Thecontrolledconversionofhumanneuralprogenitorcellsderivedfromfoetalventralmesencephalonintodopaminergicneuronsinvitro,BrainResDevBrainRes.,2002May30;136(l):27-34.SahDW,RayJ,GageFH,BipotentprogenitorcelllinesfromthehumanCNS,NatBiotechnol1997Jun;15(6):574-80StorchA,PaulG,CseteM,BoehmBO,CarveyPM,KupschA,SchwarzJ.,Long-termproliferationanddopaminergicdifferentiationofhumanmesencephalicneuralprecursorcells,ExpNeurol.2001Aug;170(2):317-25.實施例2NGC-407細胞系的移植和體內轉基因表達本實施例舉例說明了慢病毒轉導、轉基因表達的穩(wěn)定性和NGC-407細胞系在實驗性移植入大鼠腦之后的整合。NGC-407細胞根據實施例1描述的方法擴增。移植前48小時,NGC-407細胞用表達GFP的自我滅活的慢病毒載體(LV-GFP-SIN;ZuffereyRetal,1998)轉導。所使用的感染復數為1,導致60-70%的轉導率。移植當天,將細胞洗三次,胰蛋白酶消化,600rpm離心5分鐘,細胞沉淀重懸于Hank's平衡鹽溶液(HBSS;Gibco,Sweden)。用血球計數儀估計細胞數,以50,000細胞/|^1的密度在HBSS中制成單細胞懸液??偣?0只成年雌性Sprague-Dawley大鼠(B&KUniversal,Stockholm,Sweden),每只籠子住有3只大鼠,在12小時的明暗周期中自由接觸食物和水。所有外科手術程序經過瑞典蘭德大學實驗室動物使用倫理委員會批準,并按該委員會指導方針進行。動物用氟烷(在02中,2%)麻醉,放入立體定4立才匡架(KopfInstruments,Tujunga,CA,USA)。才艮氺居Paxinos斗口MVatson(PaxinosandWatson,1986),在從前自起算的如下坐標點用lOjalHamilton注射器將100,000個細胞雙側注射入紋狀體前-后士1.2;中-側±3.0;背-腹-4.0和-5.0,將釘齒耙的釘齒座桿設置于0.0mm。為了評估GFP在移植后是否從被植入細胞向宿主細胞轉移,一只動物接受雙側細胞注射,通過反復冰凍-融熔周期殺死動物。在這些移植物中沒有發(fā)現GFP-或人核(hNuc)-陽性細胞(數據未顯示)。第一組的12只動物在手術前1和2天分別用倍他米松(20mg/kg,Betapred,DefianteFarmaceutica)詳口i不孑包菌素A(10mg/kg,SandimmunNeoral,Novartis)進行免疫抑制,而第二輪17只動物從手術前第2天開始僅接受環(huán)孢菌素A(15mg/kg)。試劑用帶硅頭的塑料管沿食道每天經口給予,直到動物一皮殺死。移植后第3天、l周、2周和3周,大鼠用戊巴比妥深麻醉,并如前所述灌注(EricsonCetal,2002),然后在冷凍階段顯微鏡用薄片切片機上以60lam的厚度切片6次。如別處所述進行亮視野和熒光染色(EricsonCetal,2002),所用的一級抗體為雞抗GFP(1:5000;Chemicon),小鼠抗hNuc(1:100;Chemicon),這是兩種神經膠質標記物;兔抗膠質細胞原纖維酸性蛋白(GFAP;1:5000;DAKOA/S)和小鼠抗S100(1:500;Sigma),神經膠質先祖標記物兔抗NG-2(1:200;Chemicon),神經元標記物小鼠抗NeuN(l:1000;Chemicon),未成熟神經細胞和反應性星形膠質細胞的兩種標記物;兔抗巢蛋白(1:200;Chemicon)和小鼠抗波形蛋白(1:50;DAKOA/S)和早期神經元標記物小鼠抗卩III微管蛋白(1:333;Sigma)。如前所述(EricsonCetal,2002),使用光學篩分儀(opticalfractionator)公式(WestMJ,1999)或通過Abercrombie公式(AbercrombieM,1946)通過立體測量學估計植入物中hNuc-和GFP陽性細胞的總數。移植后植入細胞存活長達3周,這是所研究過的最長時間點,是通過hNuc檢測的。立體測量學估計顯示表達hNuc的細胞在前2周內減少,但在3周內細胞數量得以維持(NGC-407:3天,3271士1866;l周,3729±3715;2周,1159士865;3周,1207±1225)。此夕卜,至少35%的hNuc陽性細胞在所有時間點共表達GFP(3天,2358±1070(72%);1周,1487±821(40%);2周,560±403(48%);3周,425±275(35%))。在12只動物中,與hNuc陽性細胞相比檢測到更多數量的表達GFP的細胞,提示hNuc檢測不到所有植入細胞。因此,在所有植入物中見到所估計的hNuc-陽性細胞的低數量可能是由于hNuc表達的減量調節(jié),導致未知數量的未檢測到的細胞,其結果是植入細胞的總數被低估。結論是,慢病毒轉導的NGC-407細胞在移植入大鼠腦后存活和整合良好,沒有任何炎癥或腫瘤形成的跡象。占大比率的植入細胞表達轉基因長達至少3周。參考文獻Abercrombie,M.,Estimationofnuclearpopulationsfrommicrotomesections.,Anat.Rec.,94(1946)239-247.Ericson,C.,Wictorin,K.andLundberg,C.,Exvivoandinvitrostudiesoftransgeneexpressioninratastrocytestransducedwithlentiviralvectors,ExpNeurol,173(2002)22-30.Paxinos,G.andWatson,C.,Theratbraininstereotxiccoordinates.,AcademicPress,SanDiego,1986.West,M.J.,Stereologicalmethodsforestimatingthetotalnumberofneuronsandsynapses:issuesofprecisionandbias,TrendsNeurosci,22(1999)51-61.Zufferey,R.,Dull,T.,Mandel,R丄,Bukovsky,A.,Quiroz,D.,Naldini,L.andTrono,D.,Self-inactivatinglentivirusvectorforsafeandefficientinvivogenedelivery,JVirol,72(1998)9873-80.實施例3用熒光染料轉移分析NGC-407和U343MGa-cl2:6細胞間的縫隙連接通訊,并用4-苯基丁酸鹽/酯對該縫隙連接通訊進行增強方法供體人胚胎神經干細胞(NGC-407)和受體人成膠質細胞瘤細胞(U343MGa-cl2:6)各自生長于2個獨立的35mm培養(yǎng)皿中(lxl0V皿)。對于NGC-407細胞,培養(yǎng)皿用多聚-L-賴氨酸(Sigma)包被,培養(yǎng)基為DMEM/F12與glutamaxl(Invitrogen)1:1,含有40ng/mlbFGF2(R&DSystems)、20ng/mlrhEGF、lxN2補充物,lx非必需氨基酸、5mMHEPES緩沖液溶液(來自Invitrogen)、0.5%人血清白蛋白和6g/LD-葡萄糖(來自Sigma)。受體細胞生長在含有10%FBS、100單位/ml青霉素和100嗎/ml鏈霉素(來自Invitrogen)的DMEM中。當細胞大約60%滿板,開始用0和0.5mM4-苯基丁酸鹽/酯(PB)處理供體細胞,用0和4mMPB處理受體細胞,并持續(xù)72小時。供體細胞然后用lml含有10jiM親脂類碳花青(Dil)和5pM鈣熒光素-AM(MolecularProbes)的細胞培養(yǎng)基溫育20分鐘來雙標記。吸去含染料的培養(yǎng)基后,細胞用純培養(yǎng)基洗4-5次,然后用PBS洗,以除去游離染料。短暫胰蛋白酶消化后,將細胞離心,并重懸于共培養(yǎng)培養(yǎng)基(含0.5。/。FBS的供體細胞培養(yǎng)基)。受體細胞的培養(yǎng)基用共培養(yǎng)培養(yǎng)基代替,將5乂104供體細胞加入到一個受體培養(yǎng)皿中。將用PB處理的供體細胞與用PB處理的受體細胞混合,在0.5mMPB濃度下繼續(xù)處理。共培養(yǎng)4小時后,用Olympus焚光顯微鏡觀察到鈣熒光素染料從供體向受體細胞轉移。結果發(fā)現NGC-407細胞與U343MGa-cl2:6細胞通過形成縫隙連接細胞偶聯來功能性地進行通訊,該通訊被4-PB顯著增強。參見附圖4。在另一類似實驗中,顯示HDAC抑制劑4-PB增強NGC-407細胞之間的縫隙連接通訊(GJC)和NGC-407細胞與U87成膠質細胞瘤細胞之間的縫隙連接通訊。通過使用焚光染料轉移技術對此進行半定量/定性分析。很顯然在體外分化和增殖條件下4-笨基丁酸鹽/酯都增強縫隙連接通訊。這是有關聯的,因為體內環(huán)境可能呈現給被移植的細胞既不刺激分化、也不刺激增殖的條件。實施例4:BrdU標記的NGC-407細胞朝U87MG成膠質細胞瘤細胞異體移植物體內遷移方法將U87細胞(2|il中200,000個)注射入棵鼠腦,從前囟向右側3mm、向尾側2mm、深5mm。U87-MG細胞獲自ATCC,登錄號HTB-14。一周后,當腫瘤已建立時,NGC-407細胞用2pMBrdU預標記72小時,在從前囟向右側3mm、向額側lmm、深5mm的位置注射。注射干細月包兩周后,處死動物,對腦進4亍切片(14(am),使用抗BrdU和人巢蛋白的抗體進行免疫熒光染色。結果沿腫瘤邊界和在腫瘤內發(fā)現較少數量的BrdU標記細胞。這些細胞也是人巢蛋白陽性的。結果指示這一神經先祖細胞系從注射位點向U87細胞腫瘤的向性遷移。實施例5:將番茄TK1激酶克隆入干細胞逆轉錄病毒表達載體含有源自莫洛尼鼠白血病毒(MoMuLV)和莫洛尼鼠肉瘤病毒的(MoMuSV)的元件、并禎沒計用于逆轉錄病毒基因遞送和表達的逆轉錄病毒表達載體pLHCX(獲自BDBiosciencesClontech,目錄號K1061-l)被用于表達番茄TK1激酶。pLHCX的多克隆位點由HindIII-HpaI-ClaI換成Hindin-XhoI-SaII-BamHI-SphI-MfeI-ClaI。這一改變通過兩個寡核苷酸5'-AGCTTCTCGAGGTCGACGGATCCGCATGCCAATTGAT-'3和5'陽CGATCAATTGGCATGCGGATCCGTCGACCTCGAGA-'3獲得,這兩個寡核苷酸被連接入用Hindll/Clal切割的pLHCX載體。被修飾的載體的新多聚接頭被命名為pLHCXZ,通過DNA測序證實。分別將番茄TK1野生型和番茄TK1AC基因(編碼C末端缺失26個氨基酸的番茄胸苷激酶I,WO03/100045)作為Xhol/Bglll片段從pZG69(TomTKl)和pZG59(TomTKlAC26)(均在WO03/100045中描述)中切下,克隆入pLHCXZ載體的XhoI/BamHI位點。pLHCXZ中含番茄TK1野生型基因的構建體命名為pZG556,pLHCXZ中的番茄TK1AC基因被命名為pZG561。實施例6:用pZG556和pZG561轉導NGC-407細胞勿/S^1^在多聚-L-賴氨酸(Sigma#P4832)包被的培養(yǎng)瓶/平板(CM-Lab,丹麥)上,在用人血清白蛋白(HSA)(Sigma#A1653)、N2(Gibco#17502-048)、B27(Gibco#17504-044)、葡萄糖(Sigma#G8769)、bFGF(R&DSystems#233-FB)、EGF(R&DSystems#236-EG)、MEMNEAA,xlOO(Gibco#11140-035)、HEPES(Gibco#15630-056)條件化的DMEM/F12(Gibco#31331-028)中培養(yǎng)人神經元先祖細胞系NGC-407。細胞在濕潤的溫育箱中在37°C和5%C02中培養(yǎng)。逆餘錄^44'沐的溝建々脊尋魂^在293T細胞中進行莫洛尼鼠白血病毒(MMLV)來源的復制缺陷VSV-G假型逆轉錄病毒的中等規(guī)模生產和濃縮,典型地產生總共107個轉導單位。293T包裝細胞(ATTCCRL-11268)于37°C、5%C02在OPTIMEM1培養(yǎng)基(LifeTechnologies,Inc.)中培養(yǎng)。根據供應商提供的實驗方案使用LipofectAMINEPLUS(Invitrogen-LifeTechnologies,Inc.)將所構建的pLHCXZ(Clontech)質粒載體pZG561(編碼C末端缺失26個氨基酸的番茄胸苷激酶I,WO03/100045)和pVPack-GP(Stratagene)加上pVPack-VSV-G(Stratagene)轉染入包裝細胞。轉染后48和72小時收集來自培養(yǎng)在DMEM(Invitrogen)中的被轉染細胞的培養(yǎng)基,經過0.45jim濾器過濾,用超速離心沉淀(50,000g,4°C,90分鐘),溶解于DMEM(Invitrogen)。用逆轉錄酶測試確定病毒滴度。病毒隨后用于轉導NGC-407細月包系。轉導前一天,將1乂106細胞/孔接種于6孔平板。轉染當天,以MOI=l加入病毒。細胞溫育3小時,此后更新培養(yǎng)基,擴增細胞,通過加入潮霉素(Sigma#H3274)選擇14天。隨后細胞可用于實驗。爿Zr4t/S7MG/,;濃傘/^/i勿應^的勿應殺仿效/對數生長的NGC-407野生型和表達番茄激酶(ZG561)的細胞以5,000細胞/孔的密度在10(Vl條件培養(yǎng)基中鋪板于多聚-L-賴氨酸包被的平板,于37。C在含5。/。C02的氣相中在濕潤溫育箱中溫育。48小時后,培養(yǎng)基用含有不同濃度AZT的培養(yǎng)基代替,AZT濃度從20mM開始遞減。此后,細胞連續(xù)120小時暴露于藥物條件化的培養(yǎng)基中。通過將存活細胞分數作為藥物濃度的函數監(jiān)測培養(yǎng)細胞的化學抗性。通過顯色XTT測定(XTTkitII-Roche,catno.1465015)確定細胞生存力。簡言之,小心移除培養(yǎng)基,每孔加入lOOjil新鮮培養(yǎng)基和50jilXTT混合物。使用ELISA平板讀數儀(Ascent,ThermoLab)確定450和690nm吸光度。所研究的化合物的ICso值(50%抑制濃度)使用SigmaPlot(DyrbergTrading,DK)以每次實驗的平均值加以計算。智果測試潮霉素選擇的ZG561和親代細胞的AZT活化。與親代細胞系相比,敏感性顯著升高(IC5o降低)(潮霉素選擇的ZG561和親代細胞的ICm)分別為0.05105mM和11.781mM),參見圖6A和6B。潛論番茄胸苦激酶明顯使NGC-407細胞對核苷類似物AZT的敏感性提高230倍的數量級,因此指示在人類多形性神經膠質瘤治療背景中的臨床相關性。實施例7:選擇表達番茄TK1的NGC-407細胞單克隆分離表達番茄TK1的NGC-407細胞系的單克隆細胞系,使用胸苷和AZT為底物測試酶活性。最好的單克隆細胞系所具有的AZT活性是表達番茄TK1的多克隆細胞系活性的2倍(圖6B)。通過添加100潮霉素/ml培養(yǎng)基(Sigma弁H3274)14天,選4奪逆轉錄病毒誘導的、表達番茄TKACpLHCXZ(ZG561)的NGC-407細胞(參見實施例6)。此后,細胞以30細胞/孔的細胞密度接種于4個多聚-L-賴氨酸包被的24孔平板,置于37。C、5。/。C02的濕潤溫育箱中。經常換培養(yǎng)基,21天后通過抽吸挑取32個克隆,轉移至多聚-L-賴氨酸包被的6孔平板。擴增后,細胞冷凍保存,制備沉淀用于激酶活性測定。胸苷激酶測定收獲用于活性測定的細胞,于-80。C儲存,直到進行活性測試。在提取緩沖液(50mMTris/HClpH7.5、1mMDTT、10%(v/v)甘油、1%(v/v)TritonX-IOO、蛋白酶抑制劑混合液(CompleteTM,來自RocheDiagnostics)中對細胞進行短暫超聲處理,并且此后通過基于四次樣品(fourtimesample)的起始速率測量、使用氖標記的核普底物、通過DE-81濾紙測定,測定細胞提取物的胸芬;敫酶活'hi。大約20|ig4是耳又物一皮用于測定。如M膽c/z-P"e^ew"a/.Functionalexpressionofamultisubstratedeoxyribonucleosidekinasefrom_Dmo/Mame/朋oga他randitsC-terminaldeletionmutants;J.Biol.Chem.20002756673-6679]所述進行測定。以200(iM的固定濃度測試脫氧核苷。1單位脫氧核苷激酶活性定義為每分鐘每mg蛋白質形成的lnmol相應單磷酸鹽。根據Bradford以BSA為標準蛋白確定蛋白濃度[BradfordMM:Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding;Anal.Biochem.197672248-254]。這些實驗的結果顯示于下表2。表2.NGC-407單克隆細胞粗提物中的胸苷激酶活性單位單位ThdAZTThdAZT比率比率CI.10,0750,0531,31,2CI.20,0590,0461,0l,OCI.30,0860,0711,51,6CI.40,1140,0851,91,9CI.50,0570,043l,O1,0CI.60,0690,0501,2l,lCI.70,0810,0611,41,4CI.80,0460,0370,80,8CI.90,1110,0981,92,2CI.100,0420,0240,70,5CI.110,0820,0561,41,2CI.120,0470,0320,80,7CI.130,0680,0501,21,1CI.140,0380,0270,70,6CI.150,0560,037i,o0,8CI.160,0770,0541,31,2CI.170,0700,0571,21,3CI.80,0750,0441,31,0CI.190,0790,0441,41,0CI.200,0730,0511,21,1CI.210,0610,0451,01,0CI.220,0610,0331,00,7CI.230,0910,0581,61,3CI.240,0750,0421,30,9NGC-407,ZG6510,0590,045i,o,0NGC-407,親代0,0160,0140,30,3與親本細胞和用ZG651轉導的細胞相比,兩個單克隆(第4號和第9號)顯示對胸苷和AZT的較高磷酸化活性。實施例8比較NGC-407和MESC2.10材沖牛和方法通過切下8周人胚胎腹側中腦并用含有v-myc癌基因的逆轉錄病毒載體在tet-off系統控制下無限增殖而產生MESC2.10人中腦細胞系(蘭德大學與SignalPharmaceuticalsInc,LAJolla,CA,USA[Lotharius,J.,etal.,銀e"o/ce〃//"e.JBiolChem,2002.277(41):p.38884-94])。MESC2.10細胞培養(yǎng)在含有N2補充物(N2培養(yǎng)基)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的DMEM/F12中、并通過將細胞鋪板于由含有四環(huán)素的N2培養(yǎng)基組成的分化培養(yǎng)基進行分化("在N2培養(yǎng)基中分化),或者對于多巴胺能分化,培養(yǎng)在含有四環(huán)素、二丁酰cAMP(dbcAMP,Sigma)和神經膠質細胞系來源的神經營養(yǎng)因子(GDNF,RDsystems)("DA分化培養(yǎng)基")中。NGC-407細胞系通過切下7周人胚胎腹側中腦并用含有v-myc癌基因的逆轉錄病毒載體無限增殖而產生。在這一細胞系中,無限增殖基因在常規(guī)生長培養(yǎng)基中組成型表達,通過改變細胞培養(yǎng)條件控制增殖。因此,在含有DMEM-F12、并添加有N2補充物+表皮生長因子(EGF)和bFGF的培養(yǎng)基中NGC-407細胞以貼壁單層生長。當細胞被轉移入不含bFGF和EGF的N2培養(yǎng)基("在N2培養(yǎng)基中分化),或對于多巴胺能分化被轉移入不含bFGF和EGF、而含有GDNF和dbcAMP的N2培養(yǎng)基("DA分化培養(yǎng)基")中時,它們開始分化成神經元和星形膠質細胞(詳細內容參見表3)。尤^€勿/S^學和i/^g#炎平行分化4天的MESC2.10和NGC-407細胞培養(yǎng)物用4%多聚曱醛室溫固定20分鐘,然后進行免疫細胞化學染色。被固定的培養(yǎng)物用含有5%正常山羊血清和0.3%Triton-X-100的封閉緩沖液預溫育,然后用稀釋于含有2%正常山羊血清和0.3%TritonX-100的PBS中的一種如下抗體溫育小鼠抗微管蛋白P-ni(1:750;Sigma)、兔抗GFAP(1:200;DAKO)、兔抗TH(1:400,Chemicon)或兔抗巢蛋白(1:200;chemicon)。溫育在4°C過夜進行。沖洗后,培養(yǎng)物用異硫氰酸熒光素(FITC)或得克薩斯紅共軛的物種特異的二級抗體溫育,再次漂洗,核用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,1pg/ml,Sigma)復染。為了從總群體中定量出TH免疫陽性細胞的百分比,在200x放大下計數細胞,每個培養(yǎng)物中隨機選擇三個視野,通過DAPI陽性核來指示TH免疫陽性細胞相對于細胞總數的百分比。數據來自三個獨立實驗。平均每個實驗檢查400個細月包。細應,秀為VA錄^使用免疫細胞化學,對處于不同神經元和多巴胺能分化階段的兩個源自胚胎人腹側中腦的人細胞系進行表征。這些無限增殖的細胞系可以長期擴增和培養(yǎng)而不會發(fā)生不受控制的轉化,代表均一、穩(wěn)定、可再生的細胞來源。在不同分化操作方案中TH陽性細胞的百分比顯示于表3。在"DA分化培養(yǎng)基"中4天后,在19.1+/-0.2%的已分化MESC2.10細胞和3.5+/-1.2%的已分化NGC-407細胞中檢測到TH免疫陽性神經元,而只有0.6+/-0.1%的MESC2.10細胞和0.5+/-%的NGC-407細胞"在N2培養(yǎng)基中分化"4天后TH陽性。NGC-407具有分化成pm-孩i管蛋白陽性神經元(18.1+/.4.9%)和GFAP陽性星形膠質細胞(26.5+/—4.0%)的能力,而MESC2.10細胞只產生pIII-微管蛋白陽性神經元(>90%)。因此,多克隆NGC-407細胞系可描述為神經干/先祖細胞系,MESC2.10細胞系描述為單能性神經元先祖細胞系。表3本研究中所用的兩個人中腦細胞系的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>實施例9NGC-407細胞在人多形性成膠質細胞瘤的棵鼠模型中(使用U87MG細胞系)的體內遷移研究材料和方法平均體重200g的8-9周大的無胸腺雄性棵鼠(mu/rnu;Harlan,德國)被用于我們的人多形性成膠質細胞瘤異種移植模型。它們以每組3只關在標準化的大籠子里,相對濕度50-70%,溫度20°-24°C,12/12晝/夜變化。用于這些無免疫應答能力動物的食物(隨意)、水和其他材料在使用前高壓滅菌。動物通過異氟烷吸入麻醉,頭固定在定向性裝置中。在顯微鏡指引下,在右側半球、前囟右側2mm處鉆一直徑lmm孔。使用5/il體積的Hamilton注射器,將3jil體積的1.5xl()S個U87MG細胞從表面以3.5mm深度緩慢注射以到達胼胝體。將重組表達綠色焚光蛋白(GFP)的2xl06神經先祖(NGC-407)鋪板于100mm培養(yǎng)皿中,以神經球的形式生長48小時。將它們收集、離心并重懸于50pl生長培養(yǎng)基中。腫瘤細胞植入l周后,(為了使腫瘤生長,)將3pl神經球剛好在U87MG細胞植入的對側注射入每只大鼠腦。從神經干細胞接種時開始,一半動物用250mg/kg體重的4-苯基丁酸鹽/酉旨每天兩次腹膜內處理,余下的接受磷酸鹽緩沖鹽水作為載體。對所有動物每天兩次觀察顯著體重喪失、異常行為或其它神經學癥狀,將此設為實驗的終點。否則的話,則繼續(xù)治療2周,然后通過斷頭處死動物。所收集的腦在干冰冷卻的2-曱基丁烷中冷凍,然后置于-75。C冰箱中,直到用恒冷切片機以14pm厚度切片。用蘇木精和伊紅染色對切片進行組織病理學分析來確定植入物的大小和定位。用雞抗GFP抗體(Chemicon弁AB16901)進行免疫熒光研究來追蹤大鼠腦中的NGC-407細胞。用免疫組織化學的方法,通過與組織學分析進行關聯和通過當切片用hoechst復染時的細胞密度確定肺瘤位置。結果當前結果證實了先前的體外結果,將其擴展以包括人NGC-407神經干細月包的體內遷移。使用重組表達自殺基因的NGC-407細胞的自殺基因治療性范例依賴于NGC-407細月包經過腦遷移到肺瘤位點,以及^皮活化的前藥向鄰近的腫瘤細月包的有效轉移。表達綠色熒光蛋白(GFP)的NGC-407細胞在棵鼠已形成的異種移植腫瘤的對側被植入后,能遷移過胼胝體到達瘤床,甚至進入腫瘤。腹膜內添加4-PB來治療大鼠,幾天內增強了胂瘤周圍以及內部的GFP染色。對這一現象的解釋是更多的表達GFP的細胞存在于腫瘤周圍和內部,突現了這些細胞未來可用于轉移自殺基因至腦胂瘤位點。然而不能排除GFP染色增強是由于4-PB對驅動GFP基因的CMV啟動子的誘導。權利要求1.一種人細胞系,所述細胞系可獲自NGC-407細胞,或源自NGC-407細胞,或由NGC-407細胞構成,所述NGC-407細胞根據布達佩斯條約于2005年3月31日以保藏號DSMACC2718保藏于德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心。2.權利要求1的細胞系,其為多克隆細胞系。3.權利要求l的細胞系,其為單克隆細胞系。4.權利要求l的細胞系,其進一步用能指導異源治療性基因表達的表達構建體轉染或轉導。5.權利要求4的細胞系,其中所述異源基因編碼治療性多肽。6.權利要求4的細胞系,其中所述異源基因包含自殺基因。7.權利要求6的細胞系,其中所述自殺基因是選自由下列組成的組的脫氧核苷激酶a.具有SEQIDNO.1-17中任一的氨基酸序列的脫氧核苷激酶;b.脫氧核苷激酶變體,其包含與SEQIDNO.1-17中任一具有至少50%序列同一性的氨基酸序列;和c.脫氧核苷激酶,其由能在高度嚴謹條件下與編碼SEQIDNO.1-17中任一的核苷酸序列進行雜交的核苷酸序列編碼。8.權利要求7的細胞系,其中所述脫氧核苷激酶包含選自由下列組成的組的脫氧核苷激酶a.具有SEQIDNO.1-5中任一的氨基酸序列的脫氧核苷激酶;b.脫氧核苷激酶變體,其包含與SEQIDNO.1-5中任一具有至少70%序列同一性的氨基酸序列,并具有dNK活性。9.權利要求4的細胞系,其中所述異源治療性基因編碼神經營養(yǎng)因子,特別是神經生長因子(NGF);胰島素樣生長因子(IGF),特別是IGFI或IGFII;轉化生長因子(TGF)超家族成員,包括轉化生長因子-a和-卩(TGFa和TGF卩),轉化生長因子-(32(TGF卩2),Neurturin(NTN),Persephin(PSP);神經膠質細胞系來源的神經營養(yǎng)因子(GDNF);Neublastin(NBN);睫狀神經營養(yǎng)因子(CNTF);腦來源的神經營養(yǎng)因子(BDNF);神經營養(yǎng)蛋白(NT),特別是NT3-9;腫瘤壞死因子(TNF),特別是TNF-a。10.權利要求2的細胞系,其中所述異源治療性基因編碼神經元存活因子,特別是超氧化物歧化酶(SOD),或者Hedgehog。11.權利要求2的細胞系,其中所述異源治療性基因編碼神經生長因子,特別是成纖維細胞生長因子(FGF),特別是酸性或堿性成纖維細胞生長因子(aFGF或bFGF);內皮生長因子(EGF),特別是血管內皮生長和通透因子(VEGPF);干擾素,特別是干擾素-a、干擾素-P或干擾素-Y;白細胞介素(IL),特別是IL-1、IL-1卩、GMCSF和IL2-14。12.權利要求2的細胞系,其中所述異源治療性基因編碼參與神經遞質物質合成的生物活性分子,特別是膽堿乙?;D移酶;酪氨酸羥化酶(TH);酪氨酸脫羧酶;胸苷激酶,胞嘧啶脫酰胺酶,單胺氧化酶,L-DOPA脫羧酶,組氨酸脫羧酶,谷氨酸脫羧酶,鳥氨酸轉氨曱酰酶(OTC)。13.權利要求12的細胞系,其中神經遞質物質是乙酰膽堿、去曱腎上腺素、腎上腺素、3,4-二輕基苯丙氨酸(L-DOPA)、多巴胺、章魚涎胺、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、y-氨基丁酸(GABA)、酪氨酸、牛磺酸、丙氨酸、胱硫醚、組胺、5-羥色胺(5-HT)、P物質、神經肽Y(NPY)、縮膽嚢素、神經降壓肽、腦啡肽或促生長素抑制素。14.權利要求2的細胞系,其中所述異源治療性因子編碼受體,特別是與乙酰膽堿、去曱腎上腺素、腎上腺素、3,4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)、多巴胺、章魚涎胺、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、y-氨基丁酸(GABA)、酪氨酸、?;撬帷⒈彼?、胱硫醚、組胺、5-輕色胺(5-HT)、P物質、神經肽Y(NPY)、縮膽嚢素、神經降壓肽、腦啡肽或促生長素抑制素結合的受體。15.權利要求6的細胞系,其中所述自殺基因是胸苷激酶(TK)基因,特別是單純皰瘆病毒胸苷激酶基因、巨細胞病毒胸苷激酶基因、或帶狀皰滲病毒胸苷激酶基因;Gpt基因;或胞嘧啶脫氨酶基因。16.權利要求l的細胞系,其能夠分化成星形膠質細胞。17.權利要求l的細胞系,其能夠分化成神經元,例如多巴胺能神經元。18.權利要求l的細胞系,其能夠分化成神經膠質。19.權利要求l的細胞系,其能夠作為貼壁培養(yǎng)物而生長。20.根據權利要求1-19中任一項的無限增殖人神經細胞系用于實驗性應用的用途,特別是用于藥物的篩選和/或體外表征。21.根據權利要求1-19中任一項的無限增殖細胞系用于治療性應用的用途。22.根據權利要求1-19中任一項的無限增殖細胞系用于替代療法的用途。23.根據權利要求22的用途,用于植入正?;蛎庖咭种频牟溉閯游?,包括人的腦,用于治療涉及受損害和受創(chuàng)傷神經元的神經學疾病,特別是外周神經、延髓和/或脊髓的創(chuàng)傷損害,大腦缺血性神經元損傷、神經病并且特別是外周神經病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓氏病、帕金森氏病、成膠質細胞瘤、肌萎縮性側索硬化或任何其他神經退化疾病、與癡呆相關聯的記憶障礙或遺傳的代謝性疾病。24.根據權利要求1-19中任一項的無限增殖治療性細胞系用于保護性療法的用途。25.根據權利要求24的用途,用于植入正?;蛎庖咭种频牟溉閯游?,包括人的腦,用于治療涉及受損害和受創(chuàng)傷神經元的神經學疾病,特別是外周神經、延髓和/或脊髓的創(chuàng)傷損害,大腦缺血性神經元損傷、神經病并且特別是外周神經病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓氏病、帕金森氏病、成膠質細胞瘤、肌萎縮性側索硬化或任何其他神經退化疾病、與癡呆相關聯的記憶障礙或遺傳的代謝性疾病。26.根據權利要求1-19任一項的無限增殖治療性細胞系用于抗癌療法的用途。27.—種生物適應膠嚢,包含a.核心,其包含根據權利要求1的細胞組合物,所述細胞能分泌向個體傳遞生物學功能的化合物;和b.包圍細胞組合物、并能使得由細胞組合物所分泌的化合物通過的半透膜。28.權利要求19的膠嚢,其中所述核心包含細胞支持物。全文摘要本發(fā)明涉及無限增殖的人神經前體細胞系,NGC-407。該細胞系建立自人胎兒組織。細胞系已使用含v-myc癌基因的逆轉錄病毒載體加以無限增殖。該細胞系是能分化成星形膠質細胞和包括多巴胺能神經元在內的神經元的神經前體細胞系。NGC-407細胞能遷移至植入大鼠腦中的成膠質細胞瘤,并與腫瘤細胞形成縫隙連接。表達自殺基因的NGC-407細胞可被用于向腫瘤遞送活化的核苷類似物形式的活化前藥。文檔編號C12N5/00GK101189327SQ200680019731公開日2008年5月28日申請日期2006年3月30日優(yōu)先權日2005年4月1日發(fā)明者本特·朱麗葉森申請人:Ns基因公司
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