一種ngr-peg-qd納米材料及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，特別涉及一種NGR-PEG-QD納米材料及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最為常見的原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)病率約為7.2/100, OOOo目前手術(shù)切除是治療該疾病最有效的方法，但由于腫瘤全切困難，殘留的腫瘤細(xì)胞無限增殖并導(dǎo)致膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)，因此患者預(yù)后差，術(shù)后平均生存期通常少于14個(gè)月。因此對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行術(shù)前顯影并在手術(shù)中實(shí)時(shí)顯示出腫瘤輪廓以便盡可能有效全切膠質(zhì)瘤將有助于避免術(shù)后復(fù)發(fā)，提高患者生存質(zhì)量。
[0003]眾所周知，構(gòu)成血腦屏障(blood-brain-barrier，BBB)和血瘤屏障(blood-tumor-barrier，BTB)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞與外周組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞有很大區(qū)別，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞有連續(xù)的緊密連接、不存在窗孔或孔隙很小，< 50nm(外周腫瘤細(xì)胞間隙為380-780nm，最大不超過2 μπι)、缺少胞飲作用等，這一堅(jiān)固的屏障阻擾了絕大多數(shù)藥物從血液進(jìn)入腦組織而發(fā)揮其作用。同時(shí)，外周血液循環(huán)中的物質(zhì)或藥物要進(jìn)入腦組織，除了需歷經(jīng)較長的體循環(huán)，躲避網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞識(shí)別、吞噬和破壞，更主要的是還需依靠細(xì)胞旁路(被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn))和跨細(xì)胞途徑(主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn))兩種方式穿越血腦血瘤屏障。因此，一種能順利通過體循環(huán)、跨越血腦屏障的生物材料必須要以納米級(jí)粒徑作為前提，才能順利通過血腦屏障并靶向膠質(zhì)瘤細(xì)胞。
[0004]量子點(diǎn)(Quantum Dot，QD)是一種能自發(fā)焚光的納米晶體，尺寸限制在納米量級(jí)。由于QD具有普通熒光物質(zhì)無法比擬的光學(xué)特性，如熒光強(qiáng)度高，不易碎滅等，將其作為熒光探針用于生物醫(yī)學(xué)分子標(biāo)記和檢測(cè)將擁有廣闊的臨床前景。CdSe/ZnS是構(gòu)成QD的一種化學(xué)元素，它的激發(fā)波長范圍極廣，在350-650nm范圍內(nèi)均能被激發(fā)，尤其是在410-500nm范圍內(nèi)可激發(fā)出較強(qiáng)的綠光，且熒光可視濃度遠(yuǎn)小于細(xì)胞毒性濃度，因而在細(xì)胞或活體成像過程中避免了該物質(zhì)自身帶來的毒性作用。而且將QD進(jìn)行聚乙二醇(PEG)化后，在很大程度上避免體內(nèi)巨噬細(xì)胞對(duì)該物質(zhì)的吞噬，因此能使QD有效進(jìn)入長循環(huán)并隨血流到達(dá)相應(yīng)部位。
[0005]腫瘤的生長依靠周圍血管中營養(yǎng)物質(zhì)的供給，由于腫瘤細(xì)胞高代謝和無限增殖的特點(diǎn)，導(dǎo)致營養(yǎng)供應(yīng)不足，腫瘤細(xì)胞處于長期缺氧狀態(tài)，使之分泌大量血管生長相關(guān)因子，從而促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中血管內(nèi)皮細(xì)胞活化和新生血管的形成。已有文獻(xiàn)報(bào)道:腫瘤微環(huán)境中由于VEGF和bFGF等血管生長因子的釋放以及缺氧將活化RAS信號(hào)通路并引起其下游P1-3K和ERK激活導(dǎo)致新生血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上⑶13表達(dá)顯著增高，而在正常靜息狀態(tài)下的血管內(nèi)皮細(xì)胞中⑶13表達(dá)陰性。⑶13又名氨基肽酶N，是一種分子量約為150kDa的具有金屬蛋白酶活性的跨膜糖蛋白，由967個(gè)氨基酸構(gòu)成，通過近N端的跨膜螺旋區(qū)固定在細(xì)胞膜上。⑶13基因編碼序列定位于染色體15q25_26，基因全長35kb，包含20個(gè)外顯子，擁有近端和遠(yuǎn)端兩個(gè)啟動(dòng)子。目前已有大量證據(jù)表明CD13在甲狀腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、等惡性腫瘤中表達(dá)顯著升高，并有助于腫瘤細(xì)胞生長，侵襲，迀移，粘附，耐藥和血管形成。綜上所述，針對(duì)CD13可能對(duì)膠質(zhì)瘤及其腫瘤血管具有雙靶向作用。
[0006]NGR多肽由天門冬氨酸-精氨酸-甘氨酸序列構(gòu)成，是1998年用噬菌體展示技術(shù)篩選而得到的對(duì)活化的新生血管具有靶向性的短肽，能與活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上CD13特異性結(jié)合，因此可作為⑶13特異性配體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了一種NGR-PEG-QD納米材料及其制備方法，所述將QD外表包被一層PEG使該納米材料能在長循環(huán)中不被巨噬細(xì)胞吞噬而順利通過血液循環(huán)，并將PEG-QD與NGR連接，使其能夠與腫瘤血管上的CD13特異性結(jié)合，同時(shí)利用QD的納米粒徑使其順利通過BBB或BTB并與膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜上的CD13結(jié)合，最終依靠量子點(diǎn)自發(fā)熒光的特點(diǎn)靶向膠質(zhì)瘤及其血管熒光成像。以便能夠在熒光手術(shù)顯微鏡視野下確定膠質(zhì)瘤切除程度及殘留部分，達(dá)到手術(shù)過程中盡可能全切腫瘤的目的。
[0008]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0009]一種NGR-PEG-QD納米材料，所述納米材料包括NGR多肽、PEG和QD，所述NGR多肽的氨基酸序列包括天門冬氨酸-精氨酸-甘氨酸，所述PEG吸附在QD表面，形成PEG-QD，所述NGR多肽通過生物素與親和素的連接作用將NGR多肽與PEG-QD連接，即形成所述的NGR-PEG-QD納米材料。
[0010]本發(fā)明的另一目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0011]所述的NGR-PEG-QD納米材料的制備方法，包括以下步驟:
[0012]A) PEG-QD 的制備
[0013]將QD和PEG在避光條件下攪拌12?36h混勻，使PEG通過物理吸附作用，吸附在QD表面，并除去未與QD結(jié)合的PEG，即得到純化的PEG-QD ；
[0014]B) NGR-PEG-QD 的制備
[0015]將步驟A)制備得到的PEG-QD與NGR多肽攪拌混勻，所述NGR多肽通過生物素與親和素的連接作用將NGR多肽與PEG-QD連接，并除去未與PEG-QD連接的NGR，即形成純化的NGR-PEG-QD納米材料。
[0016]進(jìn)一步的，步驟A)中除去未與QD結(jié)合的PEG的方法，以及為步驟B)中除去未與PEG-QD連接的NGR的方法，為離心法、透析法，或通過脫鹽柱去除多余的NGR，所述脫鹽柱為NAP_5Column0
[0017]進(jìn)一步的，所述制備方法還包括對(duì)NGR-PEG-QD的無毒篩選處理，所述處理為MTT法。
[0018]進(jìn)一步的，所述步驟A)中QD與PEG的混合比例為1: 100。
[0019]進(jìn)一步的，所述步驟B)中PEG-QD與NGR的混合比例為1:6。
[0020]本發(fā)明利用了 NGR的靶向性，其靶向性主要由兩個(gè)因素產(chǎn)生:1.⑶13基因中有兩個(gè)不同啟動(dòng)子，即近端啟動(dòng)子和遠(yuǎn)端啟動(dòng)子，骨髓起源細(xì)胞中CD13表達(dá)主要源于遠(yuǎn)端啟動(dòng)子，而上皮細(xì)胞中CD13表達(dá)主要由近端啟動(dòng)子形成。這兩個(gè)不同的啟動(dòng)子串聯(lián)排列，中間間隔8kb，近端啟動(dòng)子緊靠⑶13編碼區(qū)，而遠(yuǎn)端啟動(dòng)子在其下游。兩者編碼產(chǎn)生的⑶13中序列存在明顯差異，而NGR僅與近端啟動(dòng)子所編碼產(chǎn)生的CD13結(jié)合；2.腫瘤細(xì)胞中近端啟動(dòng)子出現(xiàn)部分突變，從而轉(zhuǎn)錄翻譯出的CD13也與正常上皮細(xì)胞中CD13在部分序列和空間結(jié)構(gòu)中存在不同，而NGR對(duì)近端啟動(dòng)子突變后產(chǎn)生的CD13蛋白親和力更強(qiáng)。因此將NGR與化療藥物結(jié)合后不僅能增加化療藥物結(jié)合聚集腫瘤部位殺滅腫瘤細(xì)胞的作用，還降低了藥物對(duì)機(jī)體的毒副作用，因此，本發(fā)明將靶向性應(yīng)用在臨床腫瘤治療中。
[0021]本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的有益效果是:
[0022]1、本發(fā)明所述的NGR-PEG-QD為納米級(jí)，能夠順利通過體循環(huán)、穿過血腦屏障和血瘤屏障，并通過NGR多肽與膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜上的CD13特異性結(jié)合，通過依靠量子點(diǎn)自發(fā)熒光的特點(diǎn)，靶向膠質(zhì)瘤及其血管熒光呈現(xiàn)，以便能夠在熒光手術(shù)顯微鏡視野下確定膠質(zhì)瘤切除程度及殘留部分，達(dá)到手術(shù)過沖中盡可能全切除腫瘤的目的；
[0023]2、本發(fā)明所述的NGR-PEG-QD經(jīng)過無毒篩選，對(duì)人體無毒副作用，可供手術(shù)時(shí)放心使用；
[0024]3、本發(fā)明所述的NGR-PEG-QD納米微粒無創(chuàng)、高效、靶向性，使膠質(zhì)瘤及其腫瘤血管熒光成像研宄，可改善對(duì)該疾病的診斷和治療，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0025]圖1為量子點(diǎn)電鏡檢測(cè)不意圖；
[0026]圖2為納米材料焚光強(qiáng)度檢測(cè)不意圖；
[0027]圖3為NGR-PEG-QD不同波長下的熒光強(qiáng)度檢測(cè)示意圖；
[0028]圖4為緊密連接蛋白表達(dá)的電泳結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029]實(shí)施例1
[0030]一種NGR-PEG-QD納米材料，所述納米材料包括NGR多肽、PEG和QD，所述NGR多肽的氨基酸序列包括天門冬氨酸-精氨酸-甘氨酸，所述PEG吸附在QD表面，形成PEG-QD，所述NGR多肽通過生物素與親和素的連接作用將NGR多肽與PEG-QD連接，即形成所述的NGR-PEG-QD納米材料。
[0031]所述生物素與親和素的結(jié)合具體為:PEG-QD上修飾了 streptavidin，NGR—端上修飾了 b1tin，主要是通過avidin-b1tin之間的結(jié)合，這兩個(gè)東西是自然界自發(fā)結(jié)合非常強(qiáng)的物質(zhì)，把它們混在一起就能彼此之間有效結(jié)合