專利名稱：神經(jīng)細(xì)胞分化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在體外從多能細(xì)胞，特別是ES細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元。
背景長久以來就已經(jīng)知道多能細(xì)胞如胚胎癌性(EC)細(xì)胞和胚胎干(ES)細(xì)胞可以在體外分化成神經(jīng)元。原則上，用ES細(xì)胞可以產(chǎn)生分離所選分化階段的細(xì)胞和表征神經(jīng)元前體的可能性。ES細(xì)胞方便了體外分子和遺傳發(fā)育途徑的研究，并且也是用于移植到腦中以治療神經(jīng)疾病的細(xì)胞的潛在來源。
然而，這些和其他應(yīng)用已經(jīng)受到培養(yǎng)物中神經(jīng)元發(fā)育的不均一性、無組織的和經(jīng)常不可再現(xiàn)的性質(zhì)的阻礙。細(xì)胞不均一性是使用ES細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞中的巨大問題(綜述見參考文獻(xiàn)3，4)。通常，來自ES細(xì)胞的神經(jīng)元培養(yǎng)物含有多種不同的神經(jīng)元亞型以及非神經(jīng)元細(xì)胞，包括神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。缺少足夠多數(shù)目的具有確定和均一的表型的細(xì)胞是神經(jīng)生物學(xué)中的主要困難。從ES細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)元的方法沒有一種可以導(dǎo)致一致數(shù)目的神經(jīng)元或者它們的確定群體，從而不能以足夠的量得到均一的細(xì)胞群體以使用生物化學(xué)方法表征腦神經(jīng)元。而且，神經(jīng)元與它們的直接前體的譜系關(guān)系仍然不清楚。
關(guān)于使用ES細(xì)胞來源的神經(jīng)元用于移植，希望得到能夠產(chǎn)生已知的后代的確定的祖細(xì)胞，而不是細(xì)胞的混合物，該混合物包括可以繼續(xù)分裂和形成腫瘤的某些細(xì)胞(參考文獻(xiàn)3，4)。異源細(xì)胞也可以干擾來自宿主組織的營養(yǎng)信號和/或引導(dǎo)信號，該信號促進(jìn)移植的組織整合到腦中。植入的細(xì)胞類型是功能上重要的，例如，尤其需要多巴胺能神經(jīng)元來治療諸如帕金森病的疾病，因此，此類醫(yī)學(xué)應(yīng)用需要對產(chǎn)生的前體和神經(jīng)細(xì)胞亞型增強(qiáng)控制。需要減小細(xì)胞不均一性來減小不希望的副作用，降低腫瘤風(fēng)險(xiǎn)；和通過增加具有所希望的神經(jīng)元譜系的細(xì)胞的比例來提高治療潛力。
最近，通過使用誘導(dǎo)信號和轉(zhuǎn)錄因子大量地富集神經(jīng)元亞型，尤其包括多巴胺能神經(jīng)元和運(yùn)動神經(jīng)元，已經(jīng)取得了進(jìn)步。從而，轉(zhuǎn)錄因子，像Nurr1(參考文獻(xiàn)5)或者與干細(xì)胞與其他類型的共同培養(yǎng)物(參考文獻(xiàn)6)顯著增加了多巴胺能神經(jīng)元的產(chǎn)生，而加入外在因子，包括Shh蛋白(sonichedgehog)，增加了運(yùn)動神經(jīng)元的產(chǎn)生，運(yùn)動神經(jīng)元在移植后也顯示出整合到宿主組織中(參考文獻(xiàn)7)。但是盡管取得了這些進(jìn)步，但是對于可以產(chǎn)生特定神經(jīng)元表型的確定的神經(jīng)元前體的體外產(chǎn)生仍然知之甚少。
有許多不同的方案描述神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)生(參考文獻(xiàn)14、15、25-31)。如以前用胚胎癌性細(xì)胞系P19實(shí)現(xiàn)的，用視黃酸處理多能細(xì)胞團(tuán)塊引起神經(jīng)元分化(參考文獻(xiàn)32)。隨后，已經(jīng)觀察到用RA處理ES細(xì)胞來源的胚狀體(EB)也促進(jìn)神經(jīng)基因表達(dá)并且抑制中胚層基因表達(dá)(參考文獻(xiàn)33)。EB是ES細(xì)胞聚集和增殖產(chǎn)生的三維團(tuán)聚體。通過在ES細(xì)胞不能貼壁的基質(zhì)上，通常在細(xì)菌培養(yǎng)皿上培養(yǎng)ES細(xì)胞可以產(chǎn)生EB(見例如，參考文獻(xiàn)41)。
如Bain等人(參考文獻(xiàn)14)和Li等人(參考文獻(xiàn)10)例證的，用于從ES細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞的一種方法包括步驟培養(yǎng)ES細(xì)胞；形成EB；將EB與視黃酸(RA)接觸；解離EB；和平板接種并培養(yǎng)所解離的EB細(xì)胞。
通常，最初的ES細(xì)胞培養(yǎng)在飼養(yǎng)細(xì)胞層支持體(滅活的成纖維細(xì)胞)上進(jìn)行以使ES細(xì)胞保持在多能未分化的ES細(xì)胞集落形式中。認(rèn)為成纖維細(xì)胞維持ES細(xì)胞的未分化狀態(tài)。在培養(yǎng)基中可以包括白血病抑制因子(LIF)以抑制分化。然而，已經(jīng)觀察到即使在LIF的存在下，一些ES細(xì)胞也傾向于分化并且在EB形成期間，可以觀察到不同譜系的細(xì)胞(參考文獻(xiàn)3，34)。
在Bain等人和Li等人(參考文獻(xiàn)10，14，15)描述的方法中，將培養(yǎng)的ES細(xì)胞用胰蛋白酶處理和/或研磨成小團(tuán)塊，然后將其接種在非貼壁的細(xì)胞培養(yǎng)物中用于EB形成。細(xì)胞在沒有RA的條件下培養(yǎng)4天，然后在培養(yǎng)基中加入RA培養(yǎng)4天，之后將EB解離并接種在層粘連蛋白包被的皿中。接種的細(xì)胞培養(yǎng)在含有血清的培養(yǎng)基中。
使用該方法，Bain等人報(bào)導(dǎo)產(chǎn)生了由緊密附著到層粘連蛋白包被的基質(zhì)的扁平細(xì)胞群體和多數(shù)位于扁平細(xì)胞頂部的神經(jīng)元樣細(xì)胞群體組成的培養(yǎng)物。觀察到約38％的細(xì)胞在2天培養(yǎng)后具有神經(jīng)元樣形態(tài)。這些培養(yǎng)物是由多種類型的神經(jīng)元，特別是γ-氨基丁酸能神經(jīng)元組成的混合組分。
一些方法已經(jīng)利用了神經(jīng)元前體的選擇標(biāo)記，從而除去了在分化步驟中不是神經(jīng)元前體的細(xì)胞。從ES細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)祖細(xì)胞已經(jīng)多數(shù)通過中間絲標(biāo)記如巢蛋白(參考文獻(xiàn)9)或者通過轉(zhuǎn)錄因子如sox基因(參考文獻(xiàn)10)的表達(dá)來限定。Li等人使用譜系選擇通過除去Sox-2陰性細(xì)胞富集它們的異質(zhì)細(xì)胞群體得到表達(dá)Sox2的細(xì)胞(參考文獻(xiàn)10)。盡管選擇方法已經(jīng)被證明可用于富集神經(jīng)元前體，但是可疑的是所選的前體是否可以用于產(chǎn)生確定的神經(jīng)元表型。在Li等人中可得到的數(shù)據(jù)表明，如與確定的亞譜系相反，Sox陽性細(xì)胞可以產(chǎn)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中發(fā)現(xiàn)的多數(shù)細(xì)胞類型。從而，盡管Sox-陽性細(xì)胞的選擇可以增加ES細(xì)胞來源的群體中神經(jīng)元前體細(xì)胞的比例，但是似乎這種選擇不可能特別富集單一亞型的神經(jīng)元前體或者神經(jīng)元。
已經(jīng)建立了不使用RA的其他方法。例如，用于Okabe等人(參考文獻(xiàn)27，參考文獻(xiàn)43)的方法不使用RA，但是包括在解離前在特別培養(yǎng)基中貼壁基質(zhì)上培養(yǎng)所形成的EB的中間步驟。在Abe等人(參考文獻(xiàn)30)中也使用了中間步驟，其中將培養(yǎng)的EB轉(zhuǎn)移到基質(zhì)上，它們可以附著到所述基質(zhì)。然后將它們以貼壁狀態(tài)培養(yǎng)，之后用胰蛋白酶解離。
一些方法，如Abe等人(參考文獻(xiàn)30)和Okabe等人(參考文獻(xiàn)27)的方法已經(jīng)包括使用堿性成纖維細(xì)胞生長因子。Abe等人隨后使用有絲分裂抑制劑，其導(dǎo)致神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞的死亡(參考文獻(xiàn)30)。
本發(fā)明我們發(fā)現(xiàn)了這樣的方法，通過該方法，ES細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化可以優(yōu)化以得到在產(chǎn)生確定的神經(jīng)細(xì)胞譜系和神經(jīng)細(xì)胞群體的均一性方面令人驚奇的優(yōu)點(diǎn)。因此，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)和/或促進(jìn)ES細(xì)胞發(fā)育和/或分化成神經(jīng)元或者神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞，以在體外從ES細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞的改進(jìn)方法。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法允許產(chǎn)生基本上均一的神經(jīng)細(xì)胞群體，其中神經(jīng)細(xì)胞基本上都是單一的確定的神經(jīng)元譜系、表型、細(xì)胞類型和/或處于同一分化階段。
如在本文別處詳細(xì)描述的，我們設(shè)計(jì)了得到均一神經(jīng)元前體的步驟，所述前體被鑒定為放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。在隨后培養(yǎng)中，ES細(xì)胞來源的放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行性地分化成錐體細(xì)胞。通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的前體和神經(jīng)元基本上均一，與現(xiàn)有技術(shù)的方法相比，顯示出單一譜系神經(jīng)元細(xì)胞的更高的％產(chǎn)率。
從而，在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以產(chǎn)生放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和錐形神經(jīng)元的基本上純的群體，其是在現(xiàn)有技術(shù)中使用ES細(xì)胞難以產(chǎn)生的皮質(zhì)的最重要的神經(jīng)元群體。
考慮到本發(fā)明產(chǎn)生的神經(jīng)前體/祖細(xì)胞的高水平的均一性，這些細(xì)胞適于進(jìn)一步分化和/或成熟以產(chǎn)生確定譜系的神經(jīng)元細(xì)胞。前體/祖細(xì)胞可以分化以產(chǎn)生如本文所示的錐形神經(jīng)元，或者可以通過外在或者內(nèi)在因子操作以產(chǎn)生其他神經(jīng)元群體。
本發(fā)明提供的細(xì)胞數(shù)目和均一性方面的優(yōu)點(diǎn)與神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)細(xì)胞分化的現(xiàn)有技術(shù)方法產(chǎn)生的細(xì)胞和從小鼠或者大鼠腦可以制備的有限數(shù)目的原代神經(jīng)元形成對比。
生物化學(xué)研究以前受到通過現(xiàn)有技術(shù)方法可以方便地產(chǎn)生的有限數(shù)目的神經(jīng)細(xì)胞的阻礙。本發(fā)明方便了涉及神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育，特別涉及從神經(jīng)前體向神經(jīng)元細(xì)胞的過渡的生物化學(xué)和遺傳學(xué)機(jī)理的研究。ES細(xì)胞可以容易地進(jìn)行遺傳學(xué)操作和以不受限制的數(shù)目產(chǎn)生，并且本發(fā)明理想地適于產(chǎn)生用于生物化學(xué)研究的大數(shù)目的確定譜系的神經(jīng)元。
此外，由于ES細(xì)胞可以容易地進(jìn)行遺傳學(xué)操作或者從攜帶相關(guān)突變的小鼠分離，所以本發(fā)明方便了野生型和突變神經(jīng)元的比較和導(dǎo)致神經(jīng)變性疾病中特定細(xì)胞類型的損失的機(jī)理的鑒定。盡管ES細(xì)胞的遺傳操作是容易的，但是原代神經(jīng)元的操作是極端困難的，特別是穩(wěn)定操作。ES細(xì)胞的遺傳操作可以提供均一的經(jīng)修飾的品系，其中整個子代含有相同的突變并且可以在一或者兩個月內(nèi)實(shí)現(xiàn)，而具有穩(wěn)定突變的小鼠品系的建立可以花費(fèi)數(shù)年。從而，通過提供在體外從ES細(xì)胞產(chǎn)生前體、祖細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的方法，本發(fā)明避免了對建立轉(zhuǎn)基因小鼠品系的需要，從而允許在以前不現(xiàn)實(shí)的水平上研究突變神經(jīng)元。
本發(fā)明的方法還提供了神經(jīng)元的細(xì)胞測定系統(tǒng)(例如，軸突延長、神經(jīng)細(xì)胞死亡、神經(jīng)發(fā)生和突觸發(fā)生)。此類測定法是本領(lǐng)域需要的，但是它們的用途和性能受到限制，因?yàn)椴荒芤宰銐蛄糠奖愕禺a(chǎn)生神經(jīng)元。本發(fā)明使得比以前以更大量和更高均一性產(chǎn)生神經(jīng)元，從而使得可以進(jìn)行神經(jīng)元測定。
本發(fā)明產(chǎn)生的神經(jīng)元和/或神經(jīng)元前體/祖細(xì)胞也適于醫(yī)學(xué)應(yīng)用，如植入腦中以治療神經(jīng)變性疾病或者神經(jīng)元損失。由于通過本發(fā)明產(chǎn)生的所希望的亞型的神經(jīng)細(xì)胞的更大的均一性，治療的治療潛力得到提高并且植入后腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)減小。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及產(chǎn)生或生成神經(jīng)細(xì)胞，例如，神經(jīng)元和/或神經(jīng)元前體/祖細(xì)胞、促進(jìn)或者誘導(dǎo)ES細(xì)胞向神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞的分化的方法，還涉及促進(jìn)或者誘導(dǎo)前體或者祖細(xì)胞向神經(jīng)元分化或者成熟的方法。
本發(fā)明涉及誘導(dǎo)和/或促進(jìn)胚胎干(ES)細(xì)胞向神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元的發(fā)育和/或分化，和/或產(chǎn)生或者生成神經(jīng)細(xì)胞的體外方法，該方法包括培養(yǎng)ES細(xì)胞；形成胚狀體(EB)；將EB與視黃酸(RA)接觸；和解離EB；組合下文描述的一種或多種進(jìn)一步的特征或者步驟。
在本發(fā)明方法中，解離的EB細(xì)胞是神經(jīng)元前體細(xì)胞或者神經(jīng)元祖細(xì)胞。從而，EB的解離可以產(chǎn)生神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞的培養(yǎng)物。
任選地，該方法還包括平板接種解離的EB細(xì)胞，從而得到神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞的平板接種的培養(yǎng)物。
該方法可以包括培養(yǎng)神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞以產(chǎn)生神經(jīng)元。從而，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，包括平板接種并培養(yǎng)解離的EB細(xì)胞以產(chǎn)生神經(jīng)元。
本發(fā)明的方法還包括如下述的一種或多種特征/步驟。除非上下文中指出，任意特征或者步驟可以單獨(dú)使用或者與任意其他特征或者步驟組合使用。
無飼養(yǎng)細(xì)胞的ES細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)選地，該方法包括不存在飼養(yǎng)細(xì)胞(通常是滅活的成纖維細(xì)胞)的條件下培養(yǎng)ES細(xì)胞。方法可以包括最初用飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)ES細(xì)胞，然后不用飼養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。飼養(yǎng)細(xì)胞可以通過ES細(xì)胞的反復(fù)傳代稀釋或者除去。優(yōu)選在胚狀體形成之前進(jìn)行沒有飼養(yǎng)細(xì)胞情況下的至少一次，更優(yōu)選至少兩次傳代。從而，飼養(yǎng)細(xì)胞優(yōu)選缺席用于EB形成的ES細(xì)胞培養(yǎng)。“傳代”包括解離細(xì)胞，并將許多細(xì)胞再次平板接種。例如，傳代可以包括從培養(yǎng)皿(通常使用胰蛋白酶)脫離/解離細(xì)胞，解離細(xì)胞的團(tuán)聚體并再次平板接種許多解離的ES細(xì)胞(貼壁培養(yǎng)物)并培養(yǎng)ES細(xì)胞。
合適的培養(yǎng)基在本文別處描述。在ES細(xì)胞培養(yǎng)基中可以任選包括白血病抑制因子(LIF)。
用于EB形成的ES細(xì)胞的選擇和平板接種我們已經(jīng)認(rèn)識到ES細(xì)胞的增殖狀態(tài)影響它們的多能性，并且該方法中接種的細(xì)胞的密度對它們分化的能力和傾向有影響。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過選擇和以受控的細(xì)胞密度接種增殖的ES細(xì)胞，可以得到具有確定的細(xì)胞譜系的更多神經(jīng)元前體并且產(chǎn)生更少的不均一性細(xì)胞。
優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括選擇高增殖性和/或形態(tài)上均一的ES細(xì)胞用于EB形成。優(yōu)選地，方法包括平板接種經(jīng)測量/估計(jì)/確定/決定數(shù)目或者密度的所述ES細(xì)胞用于EB形成。優(yōu)選地，該方法包括選擇經(jīng)測量、估計(jì)、確定或者決定數(shù)目的ES細(xì)胞用于平板接種以產(chǎn)生EB。
該方法優(yōu)選包括測量、估計(jì)、觀察或者決定ES細(xì)胞的增殖狀態(tài)(其可以通過確定倍增時間、細(xì)胞數(shù)目的增加或者任何其他合適的度量來測量和估計(jì))；ES細(xì)胞的形態(tài)；和/或平板接種用于EB形成的ES細(xì)胞的數(shù)目或者密度。
從而，優(yōu)選地，將細(xì)胞以測量的、估計(jì)的或者確定的密度平板接種。細(xì)胞數(shù)目的測量、估計(jì)或者確定可以通過本領(lǐng)域已知的任一方法來進(jìn)行，例如，包括在顯微鏡下對給定區(qū)域中的細(xì)胞計(jì)數(shù)，或者使用常規(guī)細(xì)胞計(jì)數(shù)器，如Casy1(Scharfe System GmbH)。通過顯微鏡觀察可以觀察到細(xì)胞形態(tài)。
在下面更詳細(xì)地討論這些方面的每一方面。
高增殖性細(xì)胞的產(chǎn)生和選擇高增殖性細(xì)胞可以是通過如本文描述的特定培養(yǎng)方法產(chǎn)生的細(xì)胞。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過培養(yǎng)ES細(xì)胞的方法可以改變ES細(xì)胞的增殖狀態(tài)。
ES細(xì)胞培養(yǎng)或者傳代優(yōu)選產(chǎn)生高增殖性細(xì)胞。優(yōu)選地，傳代約每2天重復(fù)，ES細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)選包含在飼養(yǎng)細(xì)胞上至少兩次傳代，接著是沒有飼養(yǎng)細(xì)胞時至少兩次傳代。ES細(xì)胞應(yīng)該在高增殖狀態(tài)中除去飼養(yǎng)細(xì)胞，例如，通過將飼養(yǎng)細(xì)胞上的ES細(xì)胞的10cm培養(yǎng)皿分裂培養(yǎng)并在沒有飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下再次平板接種(例如，取1/4體積的細(xì)胞懸浮液并在最初體積的培養(yǎng)基中再次平板接種)將在第二天再次得到60％匯合的ES細(xì)胞培養(yǎng)物。不用飼養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行的傳代可以包括平板接種約0.5×105個細(xì)胞/cm2。
優(yōu)選地，培養(yǎng)ES細(xì)胞包括測量、估計(jì)或者確定用于ES細(xì)胞培養(yǎng)而接種的細(xì)胞的數(shù)目或者密度。
高增殖性細(xì)胞可以是基本上如下(基本上無飼養(yǎng)細(xì)胞)培養(yǎng)或者傳代ES細(xì)胞而產(chǎn)生的ES細(xì)胞以約0.3×105到4×105個細(xì)胞/cm2的密度，例如，約0.5-2×105，優(yōu)選約1×105個細(xì)胞/cm2的密度平板接種ES細(xì)胞；并在平板接種后2天回收/解離ES細(xì)胞，和任選地再次平板接種。
應(yīng)該在平板接種后2天通過分裂(解離)回收ES細(xì)胞。通常，該培養(yǎng)步驟(傳代)應(yīng)該進(jìn)行至少2次或者3次，然后選擇高增殖性細(xì)胞用于EB形成。
例如，可以將約2×106個細(xì)胞平板接種在10cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿中。上面的步驟通常使得在2天后回收10×106到35×106個細(xì)胞/10cm2，例如，10-20×106個。
可以按照ES細(xì)胞的倍增時間測量增殖狀態(tài)。本發(fā)明的方法可以包括測量ES細(xì)胞的倍增時間，并選擇高增殖性細(xì)胞。例如，高增殖性細(xì)胞可以具有8小時或者更短、16小時或者更短、或者24小時或者更短，通常8到24小時的倍增時間。
形態(tài)特征用于EB形成的ES細(xì)胞優(yōu)選是形態(tài)上均一的，其中所有或者基本上所有ES細(xì)胞都具有相同或者相似的形態(tài)特征。
優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括選擇用于EB形成的形態(tài)上均一的ES細(xì)胞，并平板接種那些細(xì)胞用于EB形成。優(yōu)選地，選擇用于EB形成的所有或者基本上所有(例如，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％或者至少99％)ES細(xì)胞具有一種或多種，并且最優(yōu)選地所有下面的形態(tài)特征(無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下培養(yǎng))以扁平單層生長；鄰近細(xì)胞不相互直接接觸(但是仍然稠密疊積)；大核；許多核仁；細(xì)胞不在相互的上方生長或者以集落樣形式生長。優(yōu)選地，細(xì)胞稠密疊積，例如，細(xì)胞的密度為每10cm2培養(yǎng)皿約20×106個細(xì)胞(2×106個細(xì)胞/cm2)，優(yōu)選密度為每10cm2培養(yǎng)皿約10-30×106個細(xì)胞，例如，15-25×106個細(xì)胞。該方法可以包括觀察ES細(xì)胞的一種或多種優(yōu)選的形態(tài)特征，和/或選擇具有一種或多種這些特征的細(xì)胞。
細(xì)胞形態(tài)還可以用作增殖狀態(tài)的指示劑。高增殖性細(xì)胞優(yōu)選具有一種或多種，優(yōu)選所有上面列出的形態(tài)特征。
優(yōu)選地，所有培養(yǎng)的ES細(xì)胞都來自單個ES細(xì)胞，例如，該方法的早期步驟可以包括選擇單個ES細(xì)胞集落并從該集落培養(yǎng)ES細(xì)胞。從而，可以增加培養(yǎng)物中ES細(xì)胞的均勻性和均一性，包括形態(tài)均一性。
平板接種密度對于EB形成，所產(chǎn)生的高增殖性細(xì)胞和/或形態(tài)上均一的細(xì)胞應(yīng)該通常使用每15ml培養(yǎng)基約0.5×106到5×106個細(xì)胞，例如，15ml培養(yǎng)基中3×106個細(xì)胞接種用于EB形成。通常應(yīng)該接種約0.3-3.5×105個細(xì)胞ml-1，優(yōu)選1.6-2.5×105個細(xì)胞ml-1，最優(yōu)選2×105個細(xì)胞ml-1。15ml培養(yǎng)基是優(yōu)選的體積，盡管通常在10cm培養(yǎng)皿上可以使用10ml，或者10-15ml。
用于EB形成而平板接種的細(xì)胞的密度應(yīng)該根據(jù)所用的ES細(xì)胞的增殖狀態(tài)來調(diào)節(jié)。從而，如果ES細(xì)胞培養(yǎng)物更稠密，那么應(yīng)該接種更多細(xì)胞，而如果培養(yǎng)物較不稠密，那么應(yīng)該接種較少的細(xì)胞。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用多數(shù)快速增殖的ES細(xì)胞得到了最好的結(jié)果。
例如，可以選擇具有約12-16小時的倍增時間的均一形態(tài)的ES細(xì)胞并以每cm2約0.5×105個細(xì)胞的密度平板接種。
細(xì)胞的解離一般在本發(fā)明的方法中，細(xì)胞的解離優(yōu)選包括解離細(xì)胞(ES細(xì)胞或者EB)以形成單個細(xì)胞的懸浮液，其基本上缺少多于2或者3個細(xì)胞的團(tuán)聚體。優(yōu)選地，懸浮液完全是單個解離的細(xì)胞(即，懸浮液沒有細(xì)胞團(tuán)聚體)。優(yōu)選地，懸浮液中的90％、95％、98％或者99％的細(xì)胞是單個解離的。優(yōu)選地，懸浮液中少于5％的細(xì)胞形成4個或者更多細(xì)胞的團(tuán)聚體。
使用本文別處詳述的方法，胰蛋白酶(例如，0.05％)和/或研磨可以用于解離細(xì)胞。
ES細(xì)胞在平板接種用于EB形成之前應(yīng)該是良好解離的。從而，優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括解離ES細(xì)胞以形成單個細(xì)胞的懸浮液，其基本上缺少多于2個或3個細(xì)胞的團(tuán)聚體。優(yōu)選地，懸浮液完全是單個解離的細(xì)胞(即，懸浮液沒有細(xì)胞團(tuán)聚體)。優(yōu)選地，懸浮液中的90％、95％、98％或者99％的細(xì)胞是單個解離的。優(yōu)選地，懸浮液中少于5％的細(xì)胞形成4個或者更多細(xì)胞的團(tuán)聚體。
本發(fā)明的方法可以包括確定或者估計(jì)ES細(xì)胞的解離水平。優(yōu)選地，方法包括解離ES細(xì)胞并根據(jù)本發(fā)明選擇解離細(xì)胞的懸浮液。顯微鏡觀察或者常規(guī)細(xì)胞計(jì)數(shù)器可以用于確定或者估計(jì)解離程度。例如，使用Casy1細(xì)胞計(jì)數(shù)器，如果存在團(tuán)聚體，那么就檢測到更大直徑的細(xì)胞峰。
EB細(xì)胞的直接解離EB以懸浮培養(yǎng)，然后解離EB細(xì)胞，產(chǎn)生解離的EB細(xì)胞的懸浮液。通常，EB在8天后解離，即在用于EB形成的細(xì)胞平板接種后第8天，或者在加入RA后4天。解離可以在這之前或者之后進(jìn)行，但是通常在加入RA后3到5天進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過實(shí)驗(yàn)確定最佳的解離時間。
優(yōu)選地，EB在解離之前不平板接種在貼壁的基質(zhì)上，而是保持在非貼壁的培養(yǎng)物中直到細(xì)胞解離。從而，EB應(yīng)該優(yōu)選在接種之前解離而不是直接平板接種。
EB的解離通常包括將EB與胰蛋白酶(通常0.05％，或者0.01-0.5％)溫育。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括過濾解離的EB的懸浮液以除去細(xì)胞團(tuán)塊，例如，細(xì)胞可以通過網(wǎng)孔或者過濾器過濾，通常用尼龍網(wǎng)孔或者過濾器過濾。通常，使用40μm細(xì)胞網(wǎng)孔或者過濾器。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，孔或者網(wǎng)孔直徑優(yōu)選為至少20、30或者40μm，更優(yōu)選為100、80、60或者50μm或者更小。
EB細(xì)胞的保存本發(fā)明的方法可以包括保存解離的EB細(xì)胞，例如，在液氮中冷凍細(xì)胞。例如，保存可以包括離心細(xì)胞，離心后在EB培養(yǎng)基+10％DMSO中重懸浮細(xì)胞，并用液氮冷凍細(xì)胞。從而，在一些實(shí)施方案中，該方法包括解離EB，并保存解離的EB細(xì)胞。從而可以得到神經(jīng)前體的方便的、容易的供應(yīng)。
冷凍的原種當(dāng)需要時可以解凍，例如，用于平板接種和培養(yǎng)產(chǎn)生神經(jīng)元。保存此類前體用于以后使用的可能性以前還沒有在本領(lǐng)域中公布。通常，將細(xì)胞解凍并且在解凍后立即重懸浮在培養(yǎng)基，通常10ml N2培養(yǎng)基中，離心(通常以1000轉(zhuǎn)/分鐘在室溫下離心5分鐘)，并重懸浮(通常在N2培養(yǎng)基中)。
解離的EB細(xì)胞的平板接種密度在其中接種EB細(xì)胞的方面，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)EB細(xì)胞的接種密度對于細(xì)胞存活和分化是重要的。接種太稀減小細(xì)胞存活，而接種太密不利地影響分化的速度。接種的密度也影響培養(yǎng)物的純度，即，非神經(jīng)元細(xì)胞對比神經(jīng)元細(xì)胞的量。優(yōu)選地，應(yīng)該接種約0.5×105到2.5×105個解離的EB細(xì)胞/cm2，例如，約1-2×105，最優(yōu)選約1到1.5×105個細(xì)胞/cm2。
本發(fā)明的方法可以包括使用本文描述的方法測量、估計(jì)或者確定接種的EB細(xì)胞的數(shù)目或者密度。
培養(yǎng)基的更換我們已經(jīng)觀察到，如果在平板接種解離的EB細(xì)胞后約2小時更換培養(yǎng)基，那么實(shí)現(xiàn)細(xì)胞存活率的明顯的很大增加。該發(fā)現(xiàn)使得可能產(chǎn)生長期神經(jīng)元培養(yǎng)物，其直到現(xiàn)在在本領(lǐng)域還是罕見的。
在該上下文中，更換培養(yǎng)基是指更新或者替換培養(yǎng)基。新培養(yǎng)基優(yōu)選與所解離的EB細(xì)胞最初或者以前接種的培養(yǎng)基具有相同組成，即，使用相同類型的培養(yǎng)基?？梢允褂孟嗨平M成的培養(yǎng)基，但是優(yōu)選地，組成與以前使用的相同。例如，培養(yǎng)基可以是N2培養(yǎng)基。
因此，本發(fā)明的方法優(yōu)選包括解離EB后更換培養(yǎng)基并將解離的EB細(xì)胞在培養(yǎng)基中接種。優(yōu)選地，在接種后約1到6小時更換培養(yǎng)基。
培養(yǎng)基可以在平板接種的6小時內(nèi)更換，優(yōu)選在接種的5、4、3或2.5小時內(nèi)更換。在接種后至少約1小時、1.5小時或者2小時后更換培養(yǎng)基。
最優(yōu)選地，在接種后約1到3小時，更優(yōu)選地在約1.5到2.5小時，最優(yōu)選地約2小時后更換培養(yǎng)基。
平板接種的解離的EB細(xì)胞的培養(yǎng)優(yōu)選在N2培養(yǎng)基中接種解離的EB細(xì)胞。
2天后，優(yōu)選將培養(yǎng)基更換成用于神經(jīng)元分化的合適的培養(yǎng)基，如“完全培養(yǎng)基”(見實(shí)施例)。培養(yǎng)基的選擇和組成可以取決于所希望的神經(jīng)元譜系。例如，本文所用的完全培養(yǎng)基基于Brewer培養(yǎng)基并且設(shè)計(jì)成促進(jìn)錐形神經(jīng)元的發(fā)育。可以選擇其他培養(yǎng)基或者因子來維持不同的神經(jīng)元譜系，例如，Shh(Sonic hedgehog)來產(chǎn)生膽堿能運(yùn)動神經(jīng)元。
我們發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的前體在植入雞胚后能夠分化成許多不同的特異神經(jīng)元譜系，包括運(yùn)動神經(jīng)元。
在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選培養(yǎng)基不含有T3。本文所用的完全培養(yǎng)基是基于Brewer培養(yǎng)基，但是組分中省略T3。在FCS中發(fā)現(xiàn)的T3可能抑制神經(jīng)元分化。
優(yōu)選地，不使用神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Neurobasal medium)。神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基+B27添加物(都可以從GIBCO得到)通常在現(xiàn)有技術(shù)中用于神經(jīng)元培養(yǎng)。然而，我們觀察到神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育而不是神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)育。從而，使用神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以導(dǎo)致在所產(chǎn)生的神經(jīng)元細(xì)胞中存在不希望的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。相比，本文使用的完全培養(yǎng)基似乎抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育，有利于神經(jīng)元發(fā)育。
優(yōu)選地，平板接種的細(xì)胞(解離的EB細(xì)胞、神經(jīng)元前體/祖細(xì)胞)在不存在血清的條件下培養(yǎng)，不在血清存在下培養(yǎng)。(血清可以用于在細(xì)胞解離后失活胰蛋白酶，但是應(yīng)該之后例如通過離心沉淀細(xì)胞并基本上完全除去上清液來除去血清)。
優(yōu)選地，生長因子(特別是EGF、FGF/bFGF和PDGF)不存在于培養(yǎng)基中并且不在這些和其他生長因子的存在下培養(yǎng)前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞。
方法可以包括培養(yǎng)神經(jīng)元，并且神經(jīng)元也優(yōu)選不在血清的存在下培養(yǎng)并且優(yōu)選不在生長因子，特別是EGF、FGF/bFGF或PDGF的存在下培養(yǎng)。
此外，本發(fā)明的方法不需要并且優(yōu)選不包括陽性或者陰性選擇步驟，例如，Sox-2遺傳選擇，以富集神經(jīng)細(xì)胞或者神經(jīng)元，盡管如果希望，可以使用此類選擇步驟。即使沒有選擇步驟，本發(fā)明的方法也基本上產(chǎn)生均一的神經(jīng)細(xì)胞群體。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法不包括對非神經(jīng)或者非神經(jīng)元細(xì)胞類型(例如，分裂的細(xì)胞)進(jìn)行陰性選擇的步驟。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法不包括陽性選擇以富集神經(jīng)細(xì)胞或者神經(jīng)元的步驟。已知的選擇方法包括遺傳選擇，例如，對Sox-2陰性細(xì)胞進(jìn)行Sox-2選擇，和將細(xì)胞與陰性選擇劑接觸以抑制和/或殺死非神經(jīng)或非神經(jīng)元細(xì)胞，例如，將細(xì)胞與抗促分裂劑如AraC或者FRDU接觸以抑制和/或殺死正分裂的細(xì)胞。
ES細(xì)胞胚胎干細(xì)胞是從哺乳動物胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離的多能干細(xì)胞。用于本發(fā)明的胚胎干細(xì)胞可以來自任意哺乳動物，其可以是人或者非人，如豚鼠、大鼠、小鼠或者其他嚙齒動物、貓、狗、豬、綿羊、山羊、牛、馬或者靈長類動物，例如，猴。通常使用小鼠ES細(xì)胞。
在本發(fā)明中，ES細(xì)胞通常是多能細(xì)胞，不是全能細(xì)胞，并且不能產(chǎn)生生殖細(xì)胞。用于本文中實(shí)施例的ES細(xì)胞是多能的。任選地，可以使用全能ES細(xì)胞。
許多ES細(xì)胞系是本領(lǐng)域已知的并且可以用于本發(fā)明(例如，J1、E14)。
設(shè)計(jì)ES細(xì)胞以允許可以使用選擇步驟，例如Sox2選擇。
如本文別處描述的，用于本發(fā)明的ES細(xì)胞可以是靶定細(xì)胞系或者遺傳操作的細(xì)胞系，該靶定細(xì)胞系或者遺傳操作的細(xì)胞系含有導(dǎo)入的基因或者突變基因或者過表達(dá)內(nèi)源基因。
可以使用包含有效連接啟動子(例如，用于神經(jīng)元特異的表達(dá)的啟動子)的報(bào)道基因的ES細(xì)胞系。我們描述了本文的Tau-GFP細(xì)胞系的應(yīng)用。Tau基因座的性質(zhì)包括所插入的cDNA的高相關(guān)表達(dá)水平、高重組效率、僅在神經(jīng)元中表達(dá)，并且Tau敲除者沒有明顯的表型。我們使用tau基因座插入將研究的cDNA。Tau可以容易地被多種cDNA置換，或者cDNA可以插入Tau基因座(從而它們的表達(dá)有效連接Tau啟動子)，以快速建立在神經(jīng)元中特異的高水平穩(wěn)定表達(dá)(參考文獻(xiàn)42)。
神經(jīng)細(xì)胞如本文使用的，除非上下文中指出，神經(jīng)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞，并且包括神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞，和神經(jīng)元(神經(jīng)元細(xì)胞)。術(shù)語“神經(jīng)元”和“神經(jīng)元細(xì)胞”可以互換使用。
“干細(xì)胞”是指可以自身更新的任何細(xì)胞類型，如果它是多能的或者神經(jīng)干細(xì)胞，那么可以產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)中的所有細(xì)胞類型，包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。干細(xì)胞可以表達(dá)一種或多種下面的標(biāo)記Oct-4；Sox1-3；時期專一的胚胎抗原(SSEA-1、-3和-4)(Tropepe等人，2001，Neuron 30，65-78)。神經(jīng)干細(xì)胞可以表達(dá)一種或多種下面的標(biāo)記巢蛋白；p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體；Notch1、SSEA-1(Capela和Temple，2002，Neuron35，865-875)。
“神經(jīng)祖細(xì)胞”是指神經(jīng)干細(xì)胞的子細(xì)胞或者后代，與所述干細(xì)胞相比具有更分化的表型和/或更小的分化潛力。前體細(xì)胞是指在發(fā)育期間與神經(jīng)元處于或不處于直接譜系的任意其他細(xì)胞，其在確定的環(huán)境條件下可以誘導(dǎo)而轉(zhuǎn)分化或者再分化或者獲得神經(jīng)元表型。
“譜系”是指一種確定的細(xì)胞類型的子代或者從該細(xì)胞類型得到的細(xì)胞。“亞譜系”是指某種譜系的亞型。
標(biāo)記的檢測和細(xì)胞類型的鑒定本發(fā)明的方法優(yōu)選產(chǎn)生細(xì)胞群體，其中至少80％、至少85％、至少90％或者至少95％的細(xì)胞是神經(jīng)元前體/祖細(xì)胞，例如，放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，或者神經(jīng)元，例如，錐形神經(jīng)元。方法優(yōu)選包括鑒定至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％的細(xì)胞是神經(jīng)元前體/祖細(xì)胞，例如，放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，或者神經(jīng)元，例如，錐形神經(jīng)元。本發(fā)明的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)方法優(yōu)選產(chǎn)生具有少于5％星形膠質(zhì)細(xì)胞，例如，少于4％、3％、2％或者1％的細(xì)胞群體。
如上述的本發(fā)明的方法優(yōu)選為諸如實(shí)現(xiàn)這些比例。本發(fā)明提供了使用如上述的一個或多個方法步驟和特征實(shí)現(xiàn)、產(chǎn)生或者生成這些比例的細(xì)胞的方法。
本發(fā)明的方法可以包括鑒定解離的EB細(xì)胞為神經(jīng)元前體，或者(下面接種的培養(yǎng)物)為神經(jīng)元。該方法可以包括確定、觀察或者證實(shí)至少80％、至少85％、至少90％或者至少95％的細(xì)胞并鑒定至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％的細(xì)胞是神經(jīng)元前體/祖細(xì)胞，例如，放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，或者神經(jīng)元，例如，錐形神經(jīng)元。通常，通過本文描述的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)方法產(chǎn)生的細(xì)胞中少于5％的細(xì)胞是星形膠質(zhì)細(xì)胞，例如，少于4％、3％、2％或者1％。
通過觀察細(xì)胞形態(tài)，例如，通過顯微鏡檢查可以確定細(xì)胞譜系和/或細(xì)胞類型。該方法可以包括至少在所產(chǎn)生的這些比例的細(xì)胞中觀察神經(jīng)元前體/祖細(xì)胞形態(tài)或者神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)。神經(jīng)元前體/祖細(xì)胞可以延長和/或具有兩極紡錘體形態(tài)。通過觀察神經(jīng)元形態(tài)可以確定神經(jīng)元譜系，例如，錐形神經(jīng)元是三角形并且具有分枝的軸突延伸，而膽堿能神經(jīng)元具有兩極形態(tài)。
根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的細(xì)胞可以備選地或者額外地通過檢測標(biāo)記，通常被抗體識別的細(xì)胞表面標(biāo)記來鑒定。該方法可以包括檢測一種或多種標(biāo)記的存在，其存在表明細(xì)胞是特定譜系或者亞譜系，或者特定細(xì)胞類型或者亞型。技術(shù)人員已知可以鑒定并且用作譜系或者細(xì)胞類型的指示的標(biāo)記。
例如，本發(fā)明可以包括檢測細(xì)胞上標(biāo)記Pax6的存在并鑒定細(xì)胞為神經(jīng)元前體，例如，放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞?？梢詸z測的其他標(biāo)記包括巢蛋白、RC2和BLBP，其存在于放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上，和p75、GluR1、突觸泡蛋白、Trk(例如，TrkA、TrkB、TrkC)和APP，其存在于某些神經(jīng)元細(xì)胞上。
該方法可以包括檢測高百分比的表達(dá)神經(jīng)元前體標(biāo)記的細(xì)胞，例如，至少80％、至少85％、至少90％或者至少95％的細(xì)胞，并鑒定至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％的細(xì)胞為神經(jīng)元前體。
該方法可以包括檢測高百分比的表達(dá)神經(jīng)元前體標(biāo)記的細(xì)胞，例如，至少80％、至少85％、至少90％或者至少95％的細(xì)胞，并鑒定至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％的細(xì)胞為神經(jīng)元，優(yōu)選確定譜系的神經(jīng)元，例如，錐形神經(jīng)元或者多巴胺能神經(jīng)元。
從而，該方法可以產(chǎn)生神經(jīng)元前體細(xì)胞或者神經(jīng)元的基本上均一的群體。至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％的細(xì)胞可以是相同類型/譜系或者亞型/譜系，例如，相同類型的神經(jīng)元前體，例如，放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或者相同譜系的神經(jīng)元，如錐形神經(jīng)元。
本文的實(shí)例提供了多種標(biāo)記的表達(dá)的時間過程和隨著時間的形態(tài)發(fā)展。本發(fā)明的方法可以包括在EB解離后(如實(shí)施例中指出)的某些時間檢測標(biāo)記和/或觀察特定形態(tài)，例如，在EB解離后2天內(nèi)觀察神經(jīng)元形態(tài)和/或在約7天后檢測Trk受體的表達(dá)。例如，本文中闡明通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的約99％的細(xì)胞是放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，如通過檢測99％的解離的EB細(xì)胞的RC2+表達(dá)所指出。本文中還顯示至少80％的神經(jīng)元可以通過本發(fā)明的方法常規(guī)地產(chǎn)生，如通過在EB解離后約7天后測量vGLUT1和GFP的表達(dá)或者計(jì)數(shù)所指出。
百分比可以計(jì)算為表達(dá)核標(biāo)記，例如DAPI或者Hoechst的％存活細(xì)胞或者％細(xì)胞。
EB的形成和用RA治療一般在本發(fā)明的方法中，在培養(yǎng)基中形成并培養(yǎng)EB細(xì)胞。在EB形成和培養(yǎng)期間，通常每兩天更換培養(yǎng)基。
通常，在本發(fā)明的方法中，在RA的存在下培養(yǎng)EB一天或者多天，通常2、3或者優(yōu)選4天，或者多達(dá)5、6、7或者8天。在與RA接觸前，可以最初在RA缺失下培養(yǎng)EB一天或多天，通常2到6天，通常2、3、或者優(yōu)選4天，或者多達(dá)5天或者6天。Bain等人和Li等人使用了4-天/4+天的步驟。
技術(shù)人員可以選擇合適濃度的RA。例如，濃度可以為例如至少0.25μM，至少0.5μM或者至少1μM。濃度可以為例如，10μM或者更小，7.5μM或者更小或者5μM或者更小。優(yōu)選地，濃度為0.5到5μM(包括0.5和5μM)。例如，濃度可以為1μM或者5μM。
神經(jīng)細(xì)胞測定本發(fā)明的其他方面提供了用神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行的細(xì)胞測定方法，所述細(xì)胞通常是體外產(chǎn)生的細(xì)胞(不是原代神經(jīng)元)并且優(yōu)選是本發(fā)明的方法產(chǎn)生的細(xì)胞。該測定方法可以包括如本文描述的本發(fā)明方法，其用于產(chǎn)生神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元。本發(fā)明的方法可以包括進(jìn)行如本文描述的本發(fā)明的方法用于神經(jīng)分化(產(chǎn)生神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元)，并且還包括本文描述的細(xì)胞測定方法的步驟。
從而，上面描述的神經(jīng)分化方法可以用于測定法的上下文中。
此外，由于我們已經(jīng)首次提供了神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞的基本上均一的培養(yǎng)物/群體，所以本發(fā)明還提供了用神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞的基本上均一的培養(yǎng)物/群體進(jìn)行的測定方法，所述細(xì)胞可以是或者不是由本發(fā)明的神經(jīng)分化方法產(chǎn)生，但是通常通過體外方法產(chǎn)生。
本發(fā)明的測定方法可以包括檢測、定量、觀察或者確定神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞，或者神經(jīng)元的一種或多種特征(“神經(jīng)元特征”)，例如，軸突生長或者軸突延長/退化、神經(jīng)元形狀、神經(jīng)元細(xì)胞死亡、神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)元分化、電活性、突觸發(fā)生和/或神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)記。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的測定方法可以包括用于產(chǎn)生神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞的本文描述的神經(jīng)分化方法，其中該方法還包括在測試條件下培養(yǎng)ES細(xì)胞和/或EB，并檢測、定量、觀察或者確定神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞的一種或多種神經(jīng)元特征。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的測定方法可以包括在測試條件下培養(yǎng)神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞；并檢測、定量、觀察或者確定細(xì)胞的一種或多種神經(jīng)元特征。任選地，根據(jù)本文別處描述的神經(jīng)分化方法可以產(chǎn)生和/或培養(yǎng)所述細(xì)胞。
測定方法可以任選包括比較在測試條件(“測試培養(yǎng)”)下的神經(jīng)元特征與在第二種條件(“對照培養(yǎng)”)下培養(yǎng)的細(xì)胞的神經(jīng)元特征，任選與從第二種條件下培養(yǎng)的細(xì)胞的組織學(xué)數(shù)據(jù)比較。方法可以包括在第二種條件下培養(yǎng)細(xì)胞。
從而，測定方法可以包括本文描述的神經(jīng)分化方法，其用于產(chǎn)生神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞，所述方法包括在第一種和第二種條件下培養(yǎng)ES細(xì)胞或者EB細(xì)胞；并分別比較在第一種條件下培養(yǎng)的神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞的一種或多種神經(jīng)元特征與在第二種條件下培養(yǎng)的神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞的一種或多種相同的神經(jīng)元特征。
在測試條件或者第一種條件下培養(yǎng)可以包括將細(xì)胞與測試化合物接觸或者將細(xì)胞暴露于測試化合物或者將細(xì)胞在測試化合物的存在下培養(yǎng)，測試化合物可以加入或者包括在培養(yǎng)基中。在第二種條件下培養(yǎng)可以包括在所述測試化合物不存在時培養(yǎng)，或者不將細(xì)胞接觸或暴露于測試化合物。
測試化合物可以是任一分子或者可以來自測試化合物文庫。在一些實(shí)施方案中，測試化合物是雙鏈RNA(dsRNA)分子，并且在第一種或測試條件下培養(yǎng)包括將ES細(xì)胞或者EB細(xì)胞暴露于雙鏈RNA分子從而通過RNA干擾(RNAi)抑制細(xì)胞中的基因。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)dsRNA在基因沉默中比僅僅有義或者反義鏈更有效(Fire A.等人Nature，Vol 391，(1998))。dsRNA介導(dǎo)的沉默是基因特異的并且通常稱作RNA干擾(RNAi)(也參見Fire(1999)Trends Genet.15358-363，Sharp(2001)Genes Dev.15485-490，Hammond等人(2001)Nature Rev.Genes 21110-1119和Tuschl(2001)Chem.Biochem.2239-245)。
RNA干擾是兩步過程。首先，dsRNA在細(xì)胞內(nèi)被切割產(chǎn)生長約21-23nt的短的干擾RNA(siRNA)，其具有5’末端磷酸和3’短突出端(-2nt)。siRNA靶定對應(yīng)的mRNA序列特別用于破壞(Zamore P.D.Nature StructuralBiology，8，9，746-750，(2001)。
使用化學(xué)合成的具有3’-突出端的相同結(jié)構(gòu)的siRNA雙鏈體可以有效誘導(dǎo)RNAi(Zamore PD等人Cell，101，25-33，(2000))。已經(jīng)證明，合成的siRNA雙鏈體特異抑制多種哺乳動物細(xì)胞系中內(nèi)源和異源基因的表達(dá)(Elbashir SM.等人Nature，411，494-498，(2001))。可以使用含有20到25bp，更優(yōu)選21到23bp序列的siRNA雙鏈體。
備選地，可以在體外(用于回收和利用)或體內(nèi)產(chǎn)生siRNA。
在其他實(shí)施方案中，測試化合物可以是核酸(DNA、cDNA或者RNA)，任選地，編碼基因，例如，cDNA。從而，測試化合物可以是編碼基因的載體，其中將細(xì)胞暴露于核酸或者載體導(dǎo)致該基因在細(xì)胞中表達(dá)。在一個實(shí)施方案中，載體可以在有義和反義方向包含根據(jù)本發(fā)明的核酸序列，從而當(dāng)作為RNA表達(dá)時，有義和反義部分將結(jié)合而形成雙鏈RNA。這可以例如是長的雙鏈RNA(例如，長于23nt)，其可以在細(xì)胞中被加工而產(chǎn)生siRNA用于RNAi(見例如，Myers(2003)Nature Biotechnology 21324-328)。
在其他實(shí)施方案中，測試化合物可以是抗體。
從而，測定方法可以鑒定增加或者減少目的特征的化合物或者條件。
通常用神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行比較，例如，接種解離的EB細(xì)胞后一周進(jìn)行比較。
測試和對照培養(yǎng)物通常是兩種單獨(dú)的培養(yǎng)物，它們在其他方面相同的條件下培養(yǎng)。當(dāng)條件是存在測試化合物，特別當(dāng)它是核酸時，在測試條件或者第一種條件下培養(yǎng)可以包括將細(xì)胞(特別是ES細(xì)胞或者解離的EB細(xì)胞)暴露于測試化合物然后培養(yǎng)細(xì)胞。
通過導(dǎo)致并允許神經(jīng)元特異的報(bào)道基因表達(dá)，并檢測或定量該報(bào)道基因的表達(dá)，可以檢測神經(jīng)元特征(例如，軸突生長或者軸突延長)。報(bào)道基因可以編碼熒光蛋白，例如，綠色熒光蛋白(GFP)。報(bào)道基因可以靶定或者有效連接神經(jīng)元特異的基因座或者啟動子(如tau基因座或者啟動子)用于神經(jīng)元特異的表達(dá)。已經(jīng)描述了神經(jīng)元特異的報(bào)道基因從tau基因座的表達(dá)(Tucker等人(42))。一旦細(xì)胞分化成神經(jīng)元，報(bào)道基因的表達(dá)就被接通，并且僅在神經(jīng)元，而不在神經(jīng)系統(tǒng)的前體或者其他細(xì)胞類型中表達(dá)。包括神經(jīng)元細(xì)胞測定法的本發(fā)明的方法可以使用含有報(bào)道基因的細(xì)胞系(ES細(xì)胞)，其具有神經(jīng)元特異的表達(dá)，所述報(bào)道基因有效連接僅在神經(jīng)元中表達(dá)的啟動子或者基因座(例如，如本文別處描述的Tau-GFP細(xì)胞系)。
本發(fā)明還提供了用于鑒定抑制或者減小神經(jīng)元特征的增加的試劑的方法，所述神經(jīng)元特征的增加由已知增加所述特征或者與所述特征的增加有關(guān)的條件產(chǎn)生(例如，在一些實(shí)施方案中，其中該條件是在淀粉狀蛋白β肽的存在下培養(yǎng))，即，鑒定減小或者抑制與這種條件有關(guān)的效應(yīng)的試劑。
這種測定法可以包括在試劑存在下并且在已知增加神經(jīng)元特征或者與神經(jīng)元特征有關(guān)的條件下培養(yǎng)神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞；在所述試劑不存在并且在已知增加神經(jīng)元特征的條件下培養(yǎng)神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞；
定量或者測定神經(jīng)元特征的水平；并比較存在試劑時的神經(jīng)元特征的水平與不存在該試劑時神經(jīng)元特征的水平；其中，與不存在試劑時相比，存在試劑時神經(jīng)元特征的較低水平表明該試劑抑制或者減小所述條件產(chǎn)生或者與該條件相關(guān)的神經(jīng)元特征的增加。
已知增加神經(jīng)元特征或者與神經(jīng)元特征的增加有關(guān)的條件可以是通過本發(fā)明的測定法鑒定為增加神經(jīng)元特征的條件的條件。
例如，當(dāng)測試化合物是核酸(例如，dsRNA)時，在已知增加神經(jīng)元特征的條件下培養(yǎng)可以包括將細(xì)胞暴露于核酸然后培養(yǎng)細(xì)胞。
用試劑培養(yǎng)和在所述條件下培養(yǎng)可以同時進(jìn)行，或者用試劑培養(yǎng)可以在所述條件下培養(yǎng)之前進(jìn)行，或者在所述條件下培養(yǎng)可以在用試劑培養(yǎng)之前進(jìn)行。技術(shù)人員可以確定合適的順序，并且在一些實(shí)施方案中，一種順序可以比另一種順序優(yōu)選。例如，細(xì)胞優(yōu)選暴露于核酸，然后在試劑的存在下培養(yǎng)。
軸突延長或者退化本發(fā)明的方法可以包括定量軸突生長、軸突延長或者軸突退化。定量可以包括確定軸突特異性蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，其中較高的表達(dá)水平表明較高水平的軸突生長和/或軸突延長和/或較低水平的軸突退化，并且其中較低的表達(dá)水平表明較低水平的軸突生長和/或軸突延長和/或較高水平的軸突退化。定量可以包括導(dǎo)致或允許神經(jīng)元特異的報(bào)道基因表達(dá)并測量報(bào)道基因的表達(dá)水平，從而定量軸突生長、軸突延長或者軸突退化。例如，當(dāng)報(bào)道基因編碼熒光蛋白，如GFP時，表達(dá)水平的測量包括測量熒光。本發(fā)明的方法可以包括定量軸突生長、軸突延長或者軸突退化，通過將神經(jīng)元與針對軸突標(biāo)記(如微管蛋白、神經(jīng)絲、突觸泡蛋白)的抗體接觸，并測定或者定量結(jié)合所述標(biāo)記的抗體，從而檢測或者定量軸突生長或者延長來進(jìn)行所述定量。
神經(jīng)元與抗體接觸可以在裂解細(xì)胞后，用細(xì)胞提取物進(jìn)行(例如，在蛋白質(zhì)印跡上)。備選地，可以將完整神經(jīng)元接觸抗體。
測定方法可以包括將神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞分別在第一和第二種條件下接觸，并比較在第一種條件下培養(yǎng)的神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞與在第二種條件下培養(yǎng)的神經(jīng)元前體或者祖先或者神經(jīng)元的軸突生長、延長或者退化。例如，當(dāng)在第一種條件下培養(yǎng)的細(xì)胞中軸突生長、延長或者退化高于(如通過軸突特異的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的升高/降低指出，見上面)在第二種條件下培養(yǎng)的細(xì)胞中時，這表明第一種條件(相對于第二種條件)分別增加軸突生長、延長或者退化。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，在第一種條件下的培養(yǎng)包括在受試化合物存在下培養(yǎng)細(xì)胞，其中受試化合物優(yōu)選為淀粉狀蛋白(Aβ)肽(來自淀粉狀蛋白前體蛋白，APP)。
本發(fā)明提供了鑒定抑制或者減小一種條件產(chǎn)生的軸突退化加劇的試劑的測定方法，已知所述條件增加軸突退化(例如，其中該條件是在淀粉狀蛋白β肽的存在下培養(yǎng))，即，鑒定減小或者抑制與這種條件有關(guān)的效果的試劑的測定法。該測定法可以包括在試劑和已知增加軸突退化的條件下培養(yǎng)神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞；在試劑不存在和已知增加軸突退化的條件下培養(yǎng)神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞；定量或者測定存在和不存在試劑時軸突退化的水平；并比較存在試劑時的軸突退化水平與不存在試劑時的軸突退化水平；其中與不存在試劑時相比，存在試劑時的軸突退化的較低水平表明該試劑抑制或者減小所述條件產(chǎn)生的或者與該條件有關(guān)的軸突退化的增加。
如上指出，比較突觸退化的水平可以包括比較突觸特異的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，其中與不存在試劑相比，存在試劑時的表達(dá)的較高水平(較低的降解水平)表明該試劑抑制或者減小所述條件產(chǎn)生的軸突退化的增加。
所述條件可以是化合物的存在，該化合物可以是通過本發(fā)明的測定方法鑒定的能夠增加軸突退化的化合物Aβ肽。
神經(jīng)元細(xì)胞死亡本領(lǐng)域存在對神經(jīng)元細(xì)胞死亡測定法的需要，并且此類測定法由本發(fā)明提供。
神經(jīng)元細(xì)胞死亡測定法可以用于測試或者測定神經(jīng)元或者神經(jīng)元細(xì)胞群體對給定條件，例如，一種或多種化合物的存在的敏感性，例如，以鑒定增加或者減小神經(jīng)元細(xì)胞死亡的條件(例如，化合物)。
例如，根據(jù)本發(fā)明的測定法可以包括在第一種條件下培養(yǎng)神經(jīng)元(“測試培養(yǎng)”)；在第二種條件下培養(yǎng)神經(jīng)元(“對照培養(yǎng)”)；定量或者測定在第一種和第二種條件下的神經(jīng)元細(xì)胞死亡；和比較在第一種條件下神經(jīng)元細(xì)胞死亡的水平與在第二種條件下神經(jīng)元細(xì)胞死亡的水平；其中與第二種條件下相比，在第一種條件下神經(jīng)元細(xì)胞死亡的較高水平表明第一種條件增加細(xì)胞死亡；和/或其中與第二種條件相比，在第一種條件下神經(jīng)元細(xì)胞死亡的較低水平表明第一種條件減小神經(jīng)元細(xì)胞死亡。
在神經(jīng)元細(xì)胞死亡測定中，特別是用于鑒定減小神經(jīng)元細(xì)胞死亡的條件的測定中，神經(jīng)元優(yōu)選遺傳上傾向于細(xì)胞凋亡。例如，神經(jīng)元可以表達(dá)p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體，和/或可以表達(dá)有效連接神經(jīng)元特異的啟動子(例如，Tau基因座)的細(xì)胞凋亡蛋白(例如，胱天蛋白酶)。因此，用于本發(fā)明以產(chǎn)生用于神經(jīng)元細(xì)胞死亡測定的神經(jīng)元的ES細(xì)胞可以表達(dá)有效連接神經(jīng)元特異的啟動子(例如，Tau基因座)的細(xì)胞凋亡蛋白(例如，胱天蛋白酶)。
神經(jīng)元細(xì)胞死亡測定可以用于鑒定抑制或者減小已知增加神經(jīng)元細(xì)胞死亡的條件產(chǎn)生的神經(jīng)元細(xì)胞死亡的增加的試劑，即，減小或者抑制這種條件的效果的試劑。該測定可以包括在試劑存在和已知增加神經(jīng)元細(xì)胞死亡的條件下培養(yǎng)神經(jīng)元；
在試劑不存在和已知增加神經(jīng)元細(xì)胞死亡的條件下培養(yǎng)神經(jīng)元；定量或者測定存在和不存在試劑時神經(jīng)元細(xì)胞死亡的水平；并比較存在試劑時的神經(jīng)元細(xì)胞死水平與不存在試劑時的神經(jīng)元細(xì)胞死亡水平；其中與不存在試劑時相比，存在試劑時的神經(jīng)元細(xì)胞死亡的較低水平表明該試劑抑制或者減小所述條件產(chǎn)生的神經(jīng)元細(xì)胞死亡的增加。
通過本領(lǐng)域已知的方法，例如，通過測定神經(jīng)元中細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)機(jī)制，可以測定細(xì)胞死亡?？梢源_定的細(xì)胞死亡的指征包括凋亡蛋白(例如，胱天蛋白酶，特別是胱天蛋白酶-3，見，參考文獻(xiàn)43)的誘導(dǎo)、用碘化丙錠染色和/或DNA片段化和/或核小體破壞(例如，通過抗體與DNA和/或組蛋白的結(jié)合可以檢測，見參考文獻(xiàn)44)。
神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)元分化本發(fā)明的方法可以包括神經(jīng)發(fā)生或者神經(jīng)元分化的測定法，其中檢測和/或定量神經(jīng)元的產(chǎn)生或者生成或者ES細(xì)胞和/或神經(jīng)元前體和/或祖細(xì)胞的分化。該方法可以包括檢測和/或定量一種或多種神經(jīng)元特異的標(biāo)記。本發(fā)明的方法可以包括監(jiān)視一種或多種特定神經(jīng)元亞型或者譜系的神經(jīng)發(fā)生的水平，或者通常神經(jīng)元的水平，這取決于所選的標(biāo)記。通過檢測和/或定量譜系特異的標(biāo)記，可以測定確定譜系的神經(jīng)元的產(chǎn)生。方法可以包括將細(xì)胞與針對細(xì)胞標(biāo)記的抗體接觸并測定結(jié)合，其中標(biāo)記的存在(因此抗體結(jié)合)表明細(xì)胞是特定細(xì)胞類型、亞型、譜系或者亞譜系的細(xì)胞。方法可以包括測定或者定量抗體結(jié)合水平，并因此測定或定量細(xì)胞的分化水平、分化階段，和/或特定類型、亞型、譜系或者亞譜系或特定分化階段的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。關(guān)于標(biāo)記的檢測和細(xì)胞類型的鑒定的更多細(xì)節(jié)包含在本文中，并且適宜的標(biāo)記是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
本發(fā)明的神經(jīng)元分化測定方法適于測定標(biāo)記，所述標(biāo)記可以用于鑒定特定分化階段的ES細(xì)胞和/或神經(jīng)細(xì)胞，或者鑒定細(xì)胞的類型或亞型，從而指出該細(xì)胞或者細(xì)胞類型或者亞型的分化狀態(tài)。例如，測定方法可以包括誘導(dǎo)或者允許ES細(xì)胞分化以產(chǎn)生神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞，和/或培養(yǎng)神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞以產(chǎn)生神經(jīng)元(優(yōu)選使用如本文別處描述的神經(jīng)分化方法)；比較在一種分化階段下細(xì)胞中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與第二種分化階段下細(xì)胞中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平；和鑒定在第一種和第二種分化階段下細(xì)胞中表達(dá)水平不同的蛋白質(zhì)。表達(dá)水平的不同表明該蛋白質(zhì)可以用作標(biāo)記來指出細(xì)胞的分化狀態(tài)、類型或者亞型和/或區(qū)分在第一種和第二種分化狀態(tài)下的細(xì)胞。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定的任意合適的方法可以比較表達(dá)水平。優(yōu)選地，比較在細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的表達(dá)，例如，將細(xì)胞或者細(xì)胞提取物與抗體的表面表達(dá)文庫接觸并測定結(jié)合。例如，該方法可以包括比較神經(jīng)元前體/祖細(xì)胞(例如，放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)與ES細(xì)胞中蛋白質(zhì)的表達(dá)。
表達(dá)水平的差異可以例如為至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.8倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍，或者以上?？梢詸z測第一種分化階段下細(xì)胞中的表達(dá)并且根本不檢測第二種分化階段下細(xì)胞中的表達(dá)。
電活性可以觀察、檢測、測定或者定量神經(jīng)元中電活性，例如指示特定通道(例如，離子通道)的打開的電活性的水平。
測定方法可以用于鑒定能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元的電活性的化合物。方法可以包括在第一種條件下培養(yǎng)神經(jīng)元，在第二種條件下培養(yǎng)神經(jīng)元，并比較分別在第一種條件下培養(yǎng)的神經(jīng)元的電活性與第二種條件下培養(yǎng)的神經(jīng)元的電活性。電活性的差異表明該條件調(diào)節(jié)電活性。
突觸發(fā)生測定方法可以包括檢測或定量神經(jīng)元細(xì)胞中的突觸發(fā)生。檢測或定量可以包括測量細(xì)胞的電生理活性和/或檢測或測量表明突觸發(fā)生的一種或多種標(biāo)記(例如，突觸泡蛋白)的表達(dá)。
遺傳上不同的神經(jīng)元的比較本發(fā)明提供了比較參照(通常野生型)神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元與突變的神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元的方法，所述神經(jīng)元具有不同的表型。該方法可以包括上述用于產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞的方法。
因此，本發(fā)明提供了方法，其包括提供神經(jīng)元細(xì)胞或神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞的第一種和第二種培養(yǎng)物，其中第一種培養(yǎng)物中的細(xì)胞與第二種培養(yǎng)物中的細(xì)胞具有不同表型；和比較第一種培養(yǎng)物中的神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元與第二種培養(yǎng)物中的神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元。
可以比較目的基因中具有和不具有突變的神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞。突變可以是例如所有或者部分基因的缺失，所有或者部分基因啟動子和/或增強(qiáng)子的缺失，或者在編碼區(qū)、啟動子或者增強(qiáng)子中一個或多個核苷酸的替代。通常，突變導(dǎo)致改變的(減小或者增加)基因表達(dá)水平，或者突變蛋白質(zhì)(例如，在其氨基酸序列中截短的或者含有一個或多個缺失或替代)的表達(dá)。備選地，第一種培養(yǎng)物中的神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞可以含有導(dǎo)入的基因(例如，插入的基因或者插入的cDNA)或者過表達(dá)內(nèi)源基因，而第二種培養(yǎng)物中的神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞則否。
ES細(xì)胞可以被遺傳操作并且可以在ES細(xì)胞中誘導(dǎo)突變，或者可以從攜帶突變的動物，例如，具有目的突變的小鼠ES細(xì)胞分離ES細(xì)胞。本發(fā)明的方法可以使用具有和不具有目的突變的ES細(xì)胞，以產(chǎn)生具有和不具有目的突變的神經(jīng)細(xì)胞，例如，分別地神經(jīng)元或者神經(jīng)元祖細(xì)胞/前體細(xì)胞。從而，本發(fā)明可以產(chǎn)生突變的和野生型神經(jīng)細(xì)胞，例如，神經(jīng)元或者神經(jīng)元祖細(xì)胞/前體細(xì)胞。可以例如進(jìn)行從不同ES細(xì)胞類型(一種具有目的突變，另一種不具有)產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞之間的比較以鑒定負(fù)責(zé)或者促進(jìn)神經(jīng)變性疾病中神經(jīng)細(xì)胞類型損失的機(jī)理，和鑒定疾病表型中相關(guān)的靶標(biāo)。
在一些實(shí)施方案中，該方法可以包括分別從ES細(xì)胞的第一種和第二種培養(yǎng)物產(chǎn)生神經(jīng)元前體/祖細(xì)胞或者神經(jīng)元，其中第一種和第二種培養(yǎng)物中的ES細(xì)胞具有不同表型。任選地，通過如本文別處描述的方法可以從ES細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)元前體/祖細(xì)胞或者神經(jīng)元。第一種培養(yǎng)物中的ES細(xì)胞可以含有目的基因中的突變，而第二種培養(yǎng)物中的ES細(xì)胞不含有該突變(例如，野生型細(xì)胞)。備選地，第一種培養(yǎng)物中的ES細(xì)胞可以含有導(dǎo)入的基因或者過表達(dá)內(nèi)源基因，而第二種培養(yǎng)物中的ES細(xì)胞則否。
作為使用遺傳上不同的ES細(xì)胞的備選方案，可以在遺傳上操作解離的EB細(xì)胞。方法可以包括用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染解離的EB細(xì)胞、或者神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞的第一種培養(yǎng)物，從而與第二種培養(yǎng)物中的細(xì)胞相比，改變第一種培養(yǎng)物中細(xì)胞的表型。例如，核酸構(gòu)建體可以編碼內(nèi)源基因，或者編碼含有突變的目的基因。本發(fā)明的此類方法通常包括允許從核酸構(gòu)建體表達(dá)(通常瞬時表達(dá)，持續(xù)約2、3或者4天)。該方法可以包括培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生神經(jīng)元細(xì)胞。第一種培養(yǎng)物中的細(xì)胞將與第二種培養(yǎng)物中的神經(jīng)元前體、祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞比較，其中第二種培養(yǎng)物中的細(xì)胞不含有所述核酸構(gòu)建體、導(dǎo)入的基因和/或突變。
比較神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元可以包括比較(通常測定或定量)一種或多種特征，如軸突生長或者軸突延長、神經(jīng)元形狀、神經(jīng)元細(xì)胞死亡、神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)元分化、電活性、突觸發(fā)生和/或神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)記。在其他實(shí)施方案中，比較可以包括比較目的基因，例如，導(dǎo)入的或突變的或過表達(dá)的基因的讀數(shù)，或者該基因的效果。讀數(shù)的性質(zhì)取決于該基因，但是可以由技術(shù)人員為給定基因確定。從而，可以闡明、阻斷和/或操作神經(jīng)元信號傳遞機(jī)制。
比較神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞可以包括比較在測試條件下該細(xì)胞的一種或多種特征，并且比較遺傳上不同的神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞的方法可以用于本文別處描述的測定方法的上下文中。從而，在優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞的第一種和第二種培養(yǎng)物每種培養(yǎng)在測試條件下，并比較細(xì)胞的神經(jīng)元特征。其他方法和變通方案如上面關(guān)于細(xì)胞測定所描述。例如，在測試條件下培養(yǎng)可以包括在Aβ肽存在下培養(yǎng)。
抗體如本文所用，“抗體”覆蓋具有結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任意特異性結(jié)合物質(zhì)，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有所需的特異性。從而，該術(shù)語覆蓋抗體片段、抗體的衍生物、功能等同物和同源物，包括包含免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的天然或合成的任意多肽。因此包括嵌合分子，其包含融合另一多肽的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者等同物。嵌合抗體的克隆和表達(dá)在EP-A-0120694和EP-A-0125023中描述。
已經(jīng)表明完整抗體的片段可以執(zhí)行結(jié)合抗原的功能。結(jié)合片段的實(shí)例為(i)由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段；(ii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iii)由單一抗體的V1和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(iv)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward，E.S.等人，Nature341，544-546(1989)；(v)分離的CDR區(qū)；(vi)F(ab’)2片段，其是包含兩個連接的Fab片段的二價(jià)片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域通過肽接頭連接，該接頭使得兩個結(jié)構(gòu)域結(jié)合而形成抗原結(jié)合部位(Bird等人，Science，242，423-426，1988；Huston等人，PNAS USA，85，5879-5883，1988)；(viii)雙特異性單鏈Fv二聚體(PCT/US92/09965)和(ix)“雙抗體”，其是通過基因融合構(gòu)建的多價(jià)或者多特異性片段(WO94/13804；PHolliger等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA90 6444-6448，1993)。
雙抗體是多肽的多聚體，每個多肽包含第一個結(jié)構(gòu)域和第二個結(jié)構(gòu)域，第一個結(jié)構(gòu)域包含免疫球蛋白輕鏈的結(jié)合區(qū)，第二個結(jié)構(gòu)域包含免疫球蛋白重鏈的結(jié)合區(qū)，兩個結(jié)構(gòu)域相連(例如，通過肽接頭)但是不能彼此結(jié)合形成抗原結(jié)合部位抗原結(jié)合部位通過多聚體內(nèi)一個多肽內(nèi)的第一個結(jié)構(gòu)域與該多聚體內(nèi)另一多肽的第二個結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成(WO94/13804)。
可以以多種方式修飾抗體，例如，它們可以經(jīng)標(biāo)記，例如，用熒光標(biāo)記物標(biāo)記，使得可以通過測量熒光水平定量抗體的結(jié)合。
考慮到本公開，本發(fā)明的多種其他方面和實(shí)施方案將是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。
本說明書中提到的所有文獻(xiàn)都完整引入本文作為參考。
現(xiàn)在將僅通過實(shí)施例并參考

圖1闡明本發(fā)明的實(shí)施方案的一些方面，圖1顯示了在接種解離的EB細(xì)胞后在所選的時間點(diǎn)的％Pax6陽性細(xì)胞。Pax-6最初由多數(shù)細(xì)胞表達(dá)但是快速消失。結(jié)果代表用2種不同ES細(xì)胞系進(jìn)行的4個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。它們表達(dá)為％±SD，100％為DAPI陽性細(xì)胞核的數(shù)目。
實(shí)施例ES細(xì)胞的培養(yǎng)導(dǎo)致從ES細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)元的該方法包括下面的步驟，概述如下1.培養(yǎng)在飼養(yǎng)層上的細(xì)胞以集落生長，然而飼養(yǎng)層耗竭后，它們作為扁平單層生長。
2.非貼壁細(xì)菌培養(yǎng)皿上的ES細(xì)胞形成懸浮生長的細(xì)胞團(tuán)聚體(EB)。
3.EB形成4天后，加入RA再培養(yǎng)4天。
4.共8天后EB解離并將其接種在PDL/層粘連蛋白包被的培養(yǎng)皿上N2培養(yǎng)基中。
5.N2培養(yǎng)基在2小時后更換，12-24小時后再次更換。在該階段，多數(shù)前體細(xì)胞具有紡錘形形態(tài)。在30-48小時后加入神經(jīng)元分化培養(yǎng)基。
使用表達(dá)來自tau基因座的GFP(參考文獻(xiàn)13)的ES細(xì)胞對該方法顯色。GFP從內(nèi)源啟動子的表達(dá)允許在紫外線下觀察神經(jīng)元和它們的過程，并且我們用它最大化熒光細(xì)胞的產(chǎn)生。
解凍后，首先將ES細(xì)胞培養(yǎng)在飼養(yǎng)細(xì)胞上進(jìn)行2-3次傳代，然后漸進(jìn)地耗竭飼養(yǎng)細(xì)胞。然后用確定數(shù)目(3×106)的細(xì)胞形成團(tuán)聚體(胚狀體，EB)，其在非貼壁的細(xì)胞培養(yǎng)皿(10cm培養(yǎng)皿，15ml培養(yǎng)基)中培養(yǎng)8天。4天后加入視黃酸(RA，5μM)并經(jīng)過最后4天。一個重要步驟是選擇具有均一、扁平形態(tài)和高增殖速率的飼養(yǎng)細(xì)胞耗盡的ES細(xì)胞(見材料和方法)。
8天后，用新鮮制備的胰蛋白酶懸浮液解離EB細(xì)胞并將其接種在由聚-D-賴氨酸(PDL)和層粘連蛋白組成的基質(zhì)上。發(fā)現(xiàn)接種密度(1.5×105個細(xì)胞/cm2)是關(guān)鍵的，因?yàn)檩^低密度的細(xì)胞傾向于快速死亡。將解離的細(xì)胞接種在無血清培養(yǎng)基中，接種后2小時更換培養(yǎng)基以除去殘?jiān)退劳龅募?xì)胞。一天(約24小時)后再次更換培養(yǎng)基。48小時后，用富含補(bǔ)充物(參考文獻(xiàn)12)的無血清培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。除了表達(dá)來自兩個tau等位基因的GFP的ES細(xì)胞外，我們還使用了超過7種其他的ES細(xì)胞系，結(jié)果與該研究中報(bào)導(dǎo)的結(jié)果無差別。這些細(xì)胞系包括野生型J1和E14ES細(xì)胞，以及GFP在一個或兩個tau等位基因中的J1。我們還從混合的BL6/SV129背景的胚泡分離了四種不同的ES細(xì)胞系并將它們進(jìn)行我們的分化方案，得到相似結(jié)果。
神經(jīng)元前體ES細(xì)胞分化成放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的均一群體。
從EB解離的細(xì)胞采取了明顯延長的、紡錘形形態(tài)，其暗示放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形狀(見參考文獻(xiàn)16)。相差圖像圖解了在2小時分化后的二極紡錘形態(tài)。
通過用針對中間絲蛋白巢蛋白的抗體(參考文獻(xiàn)9)染色，將這些細(xì)胞鑒定為神經(jīng)前體細(xì)胞。接種后2小時，發(fā)現(xiàn)與通過細(xì)胞核染色定量的接種細(xì)胞的總數(shù)目比較時，多數(shù)細(xì)胞對于巢蛋白為陽性(表I)。
我們?nèi)缓笫褂肦C2，其是所有放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的一種標(biāo)記物，并且發(fā)現(xiàn)幾乎所有細(xì)胞都是陽性的(表I)。用針對腦脂類結(jié)合蛋白(BLBP)對抗體染色進(jìn)一步證實(shí)了從EB新鮮解離的細(xì)胞的身份(表I)，發(fā)育中的CNS中放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也表達(dá)BLBP。同源域轉(zhuǎn)錄因子Pax-6由所有皮質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)(參考文獻(xiàn)19)并且發(fā)現(xiàn)EB中的基本上所有細(xì)胞都在它們解離前表達(dá)，這意味著在該階段，它們已經(jīng)是前體細(xì)胞。
接種后2小時的定量揭示多數(shù)細(xì)胞都是Pax-6陽性的(圖1)，并且其表達(dá)在后面的幾天中快速下降到在7天后基本上不存在(圖1)。
表1
接種后2小時％神經(jīng)元前體。接種解離的EB后2小時，通過免疫細(xì)胞化學(xué)分析巢蛋白、RC2、BLBP、Pax-6。確定相對于通過細(xì)胞核標(biāo)記DAPI染色的細(xì)胞總數(shù)，陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(±SD)。
神經(jīng)元分化在EB解離后2天內(nèi)開始出現(xiàn)具有神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞。所有正分化的細(xì)胞都表達(dá)GFP，表明它們是神經(jīng)元。通過用染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該結(jié)論，該實(shí)驗(yàn)中使用的抗體識別微管蛋白的神經(jīng)元特異形式。
4天后，約85％的細(xì)胞都是GFP-和微管蛋白陽性的。通過相差和熒光，我們被神經(jīng)元細(xì)胞體的非常均一的外觀所震驚。隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，它們越來越采用從嚙齒動物海馬分離的細(xì)胞觀察到的錐形性狀(參考文獻(xiàn)20)。當(dāng)用針對突觸泡蛋白的抗體染色時，看到許多簇內(nèi)襯在GFP-陽性過程中，表明在我們的培養(yǎng)物中可以產(chǎn)生突觸接觸。
為了測試這些神經(jīng)元是否使用谷氨酸作為神經(jīng)遞質(zhì)，我們用針對泡狀谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白vGlut1的抗體將細(xì)胞染色，vGlut1是大腦皮質(zhì)和海馬中多數(shù)錐形神經(jīng)元表達(dá)的一種膜蛋白(參考文獻(xiàn)21)。培養(yǎng)7天后，將93±4.7％的細(xì)胞用vGlut1抗體染色。用vGlut1抗體得到的發(fā)現(xiàn)與將神經(jīng)元鑒定為錐形細(xì)胞相一致。在EB解離后第一周結(jié)束時，少于0.1％的細(xì)胞對Is1-1、酪氨酸羥化酶和膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶陽性染色。少于5％的細(xì)胞在3周后為GABA陽性。
為了鑒定在從放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞到神經(jīng)元過渡期間表達(dá)的蛋白質(zhì)，我們使用在不同時間間隔制備的體外分化的神經(jīng)元進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析。
盡管在放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的裂解物中檢測不到，但是AMPA受體亞基GluR1像突觸泡蛋白一樣，在培養(yǎng)幾天后可以清楚地檢測到。隨著神經(jīng)元開始分化，GluR1和突觸泡蛋白蛋白質(zhì)水平增加。
由于錐形神經(jīng)元在大腦皮質(zhì)和海馬中都表達(dá)高水平的Trk受體(參考文獻(xiàn)22)，我們還使用針對這些神經(jīng)營養(yǎng)因子受體的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的抗血清分析了它們的表達(dá)。盡管在第5天時，幾乎檢測不到Trk受體，但是在接下來的幾天內(nèi)，它們的水平顯著增加。約7天后在體外觀察到Trk受體的大量表達(dá)，之后它顯著增加。相反地，發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)元成熟期間，神經(jīng)營養(yǎng)因子受體p75的水平下降，跟它們在體內(nèi)的情況很像(參考文獻(xiàn)23)。
最后，我們測試了淀粉樣蛋白前體(APP)的表達(dá)。已經(jīng)表明，該膜蛋白被放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)(參考文獻(xiàn)24)，以及被包括神經(jīng)元的許多細(xì)胞在發(fā)育后期表達(dá)。我們的結(jié)果表明，不像所測試的其他膜蛋白，在放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的裂解物中清楚地檢測到APP。表達(dá)水平隨后增加，可能是由于神經(jīng)元成熟的結(jié)果，神經(jīng)元成熟包括神經(jīng)元過程的顯著生長。植入的前體的體內(nèi)分化本發(fā)明的神經(jīng)元前體細(xì)胞的發(fā)育潛力是通過將它們植入雞胚中來測試的，在雞胚中，所述細(xì)胞可以分化成不同的特異神經(jīng)元譜系，包括運(yùn)動神經(jīng)元。
電生理學(xué)電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明神經(jīng)元形成突觸，顯示出AP并且在電生理學(xué)特征中非常均一。神經(jīng)元主要是谷氨酸能的(通過用NBOX阻斷突觸電流，vGAT染色證明)，具有一定的γ-氨基丁酸能輸入(用荷包牡丹堿阻斷，否則培養(yǎng)物將不存活)。電生理學(xué)清楚地表明在所用的條件下不存在其他神經(jīng)元細(xì)胞類型。
為了表征我們的ES細(xì)胞來源的神經(jīng)元的電生理學(xué)特征，對培養(yǎng)10到最多22天的細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄。所有研究的細(xì)胞(n＝22)都顯示出自發(fā)的或者去極化誘導(dǎo)的動作電位并且在所有情況中，這些都可以通過應(yīng)用河豚毒素阻斷。而且，所研究的細(xì)胞的電生理學(xué)特征表明它們關(guān)于它們的功能性質(zhì)方面相當(dāng)均一，所述功能性質(zhì)類似于以前對錐形神經(jīng)元所描述的功能性質(zhì)?？梢杂^察到自發(fā)突觸電流(SSC)，其可以通過加入NBQX/AP-5和荷包牡丹堿或者僅加入NBQX/AP-5來完全阻斷。這些結(jié)果表明ES細(xì)胞來源的神經(jīng)元形成功能突觸，其利用谷氨酸作為神經(jīng)遞質(zhì)。由于這些實(shí)驗(yàn)還揭示在長期培養(yǎng)物中存在功能GABA神經(jīng)元，所有我們定量了在3周后GABA神經(jīng)元的數(shù)目。使用針對小泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白vGAT的抗體，我們發(fā)現(xiàn)3周后，約5％的細(xì)胞對于該標(biāo)記是陽性的。與和谷氨酸和GABA系統(tǒng)不相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)缺少染色一致的是，我們沒有檢測到可以規(guī)因于谷氨酸或者GABA的任何突觸活性。
討論使用小鼠ES細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致產(chǎn)生定義為放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)元前體的幾乎純的群體的條件。這些細(xì)胞然后繼續(xù)產(chǎn)生具有錐形細(xì)胞特征的神經(jīng)元的均一群體。
當(dāng)高度增殖時，選擇未定型的干細(xì)胞用于形成EB，我們發(fā)現(xiàn)用RA處理將整個細(xì)胞群體轉(zhuǎn)化成確定類型的神經(jīng)元前體。未定型ES細(xì)胞的選擇是重要的，因?yàn)橐呀?jīng)觀察到即使存在LIF時，一些ES細(xì)胞也傾向于分化并且在EB形成期間，可以通常觀察到不同譜系的細(xì)胞(綜述見參考文獻(xiàn)3，34)。
為了在進(jìn)行性除去飼養(yǎng)細(xì)胞后選擇高增殖性ES細(xì)胞，在用確定數(shù)目的細(xì)胞開始EB形成之前，我們通過細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞的相差外觀以及它們達(dá)到的匯合程度來監(jiān)視分裂速率。
還使用ES細(xì)胞或者P19胚胎癌性細(xì)胞報(bào)導(dǎo)了在非解離的EB中存在放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(參考文獻(xiàn)35)。當(dāng)將EB接種在聚賴氨酸基質(zhì)上時，可以觀察到延長的細(xì)胞放射狀遷移，遠(yuǎn)離EB并且不斷轉(zhuǎn)化成星形膠質(zhì)細(xì)胞(參考文獻(xiàn)35)。我們通過解離EB得到的細(xì)胞的鑒定是基于用RC2-、BLBP-和Pax-6抗體染色時它們的形態(tài)和它們的定量。以前已經(jīng)表明皮質(zhì)中的放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)該組標(biāo)記(參考文獻(xiàn)11，16)。重要的是，不是所有放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞都表達(dá)Pax-6。具體地，那些定位于神經(jīng)節(jié)隆起的放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)Pax-6并且不是神經(jīng)發(fā)生性的(參考文獻(xiàn)11)。有趣的是，最近已經(jīng)表明向EB加入RA導(dǎo)致誘導(dǎo)Wnt信號傳遞拮抗劑sFRP2(參考文獻(xiàn)36)。然后可以想象正發(fā)育的前腦中存在的分子的Wnt信號傳遞的抑制導(dǎo)致細(xì)胞采取放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表型。sFRP1的空間和時間上的表達(dá)與該觀點(diǎn)是相容的(參考文獻(xiàn)37)。
在我們的體外條件下，RA的加入是關(guān)鍵的(參考文獻(xiàn)38)。然而RA處理后4天，幾乎所有細(xì)胞都在EB中表達(dá)Pax-6，不存在RA時不能觀察到Pax-6陽性細(xì)胞，并且未處理的EB解離后不能得到神經(jīng)元。盡管似乎RA不可能在正發(fā)育的皮質(zhì)中Pax-6的誘導(dǎo)中起生理學(xué)作用，但是對于正發(fā)育的CNS的其他部分，有充分的理由可以是這種情況。實(shí)際上，盡管在包括大腦皮質(zhì)的CNS中，Pax-6具有受限制的表達(dá)模式，但是在大部分腹部神經(jīng)管的發(fā)育期間也表達(dá)Pax-6，并且最近的結(jié)果提示體節(jié)來源的RA在神經(jīng)管的腹部圖式發(fā)育中起生理作用(參考文獻(xiàn)39，40)。關(guān)于RA處理的EB，Renoncourt等人(參考文獻(xiàn)28)和Wichterle等人(參考文獻(xiàn)7)也觀察到EB中的一些細(xì)胞在RA處理后是Pax-6陽性的。然而，也觀察到Pax-7陽性細(xì)胞具有相似的豐度(參考文獻(xiàn)7)，提示RA處理的EB的細(xì)胞組成中的不均一性。
在用層粘連蛋白包被的聚陽離子基質(zhì)上，放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞快速失去它們的紡錘形形態(tài)。當(dāng)使用我們的EGP-ES細(xì)胞系時，我們注意到熒光細(xì)胞數(shù)目快速增加并且神經(jīng)元在它們的形狀和它們的細(xì)胞體的大小方面都看起來非常相似。到解離后第四天，幾乎所有細(xì)胞都已經(jīng)具有神經(jīng)元特征。隨著時間的推移，幾乎所有神經(jīng)元都采取了錐形形狀并且也發(fā)現(xiàn)對于谷氨酸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是陽性的。所有細(xì)胞不管它們的身份都在所有時間染色。相比，當(dāng)培養(yǎng)1周后用針對Is1-1、酪氨酸羥化酶或者膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶染色時，小于0.1％的細(xì)胞是明顯陽性的。三周后，小于5％的細(xì)胞是vGAT陽性的。GABA和Is1-1染色的缺乏排除了許多中間神經(jīng)元和長投射神經(jīng)元，尤其包括運(yùn)動神經(jīng)元，它們的許多也來自體內(nèi)的Pax-6陽性細(xì)胞。
可能需要誘導(dǎo)信號如sonic hedgehog的存在以沿著該特定分化途徑驅(qū)動Pax-6-陽性放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(參考文獻(xiàn)7)。我們的神經(jīng)元的谷氨酸能表型與它們作為皮質(zhì)錐形神經(jīng)元的身份相一致，如它們的形狀所表明。最重要地，該表明與這些神經(jīng)元都來自放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞這一觀察相符合。實(shí)際上，Malatesta等人(參考文獻(xiàn)11)最近證明皮質(zhì)放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的后代是錐形神經(jīng)元，其定居于所有皮質(zhì)層，以及海馬。從而，我們的培養(yǎng)條件可以描述為“允許的”，允許放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)在的分化程序在體外展開。與這符合的是，我們使用的培養(yǎng)基最初開發(fā)是用于維持從胚胎嚙齒動物海馬分離的錐形神經(jīng)元的存活和分化(參考文獻(xiàn)12)。該培養(yǎng)基的一種性質(zhì)也是防止或者抑制諸如星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。將預(yù)期這些細(xì)胞存在于我們的培養(yǎng)物中，因?yàn)樗鼈円矊儆诜派錉钌窠?jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的后代。
使用GFAP抗體，我們觀察到我們的培養(yǎng)物中一些分枝的星形膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育。然而，它們的數(shù)目非常少(3周后總細(xì)胞數(shù)目的1-2％)。
我們的神經(jīng)元培養(yǎng)物的相對均勻性促使我們檢查已知在特定發(fā)育時間點(diǎn)表達(dá)的膜蛋白質(zhì)的表達(dá)。與體內(nèi)結(jié)果相符(參考文獻(xiàn)23)，我們發(fā)現(xiàn)p75表達(dá)與我們的培養(yǎng)物中神經(jīng)元的外觀高度相關(guān)并且隨后被下調(diào)。相比，盡管Trk受體表達(dá)在早期時間點(diǎn)不能檢測到，但是它在幾天后顯著增加，提示神經(jīng)元同步發(fā)育。Trk受體表達(dá)的高水平是體內(nèi)錐形神經(jīng)元特征性的(參考文獻(xiàn)22)。RT PCR實(shí)驗(yàn)表明盡管TrkB和TrkC促成使用pan-Trk抗體得到的信號，但是在體外前幾天后幾乎檢測不到TrkA表達(dá)。相比，使用p75和Trk受體，EB解離后2小時就可以清楚地檢測到APP并且它的水平在神經(jīng)元分化期間增加。這與免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符，表明APP特異標(biāo)記正發(fā)育的嚙齒動物皮質(zhì)中的放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(參考文獻(xiàn)24)。
材料和方法材料從Gibco得到ES細(xì)胞培養(yǎng)基成分，LIF來自Chemicon，PDL和N2和完整培養(yǎng)基的母液來自Sigma。BSA粉劑級分(powder fraction)V來自Gibco。從Engelbreth-Holm-Swarm肉瘤分離層粘連蛋白(Roche)。RA從Sigma得到并且當(dāng)使用不同批時，沒有觀察到結(jié)果的差異。
抗體用于免疫組織化學(xué)的一級抗體是小鼠單克隆抗體抗巢蛋白(大鼠401，IgG1；1∶10；Developmental Studies Hybridoma Bank，DSHB)、小鼠單克隆抗體RC2(IgM；1∶4；DSHB)、兔多克隆抗體抗-BLBP(1∶2000；由N.Heintz(Rockefeller University，New York)友情提供給M.Goetz)、小鼠多克隆抗體抗-Pax6(IgG1；1∶100；DSHB)、小鼠單克隆抗體抗-β微管蛋白III(IgG2b；1∶100；Sigma)和兔多克隆抗體抗-vGlut1(1∶5000；SYSY)。亞類特異的Cy2-或Cy3-偶聯(lián)的抗血清用作二級抗體。對于蛋白質(zhì)印跡，我們使用小鼠單克隆抗體抗-突觸泡蛋白(IgG1；1∶1000；Sigma)、兔多克隆抗體抗-GluR1(1∶1000；Upstate)、兔多克隆抗體抗Trk(C-14，sc-11；1∶1000；SantaCruz)、兔多克隆抗體抗-APP(1∶3000；由P.Paganetti(Novartis，Basel)友情提供)和兔多克隆抗體抗-p75(1∶2000；Promega)。
培養(yǎng)基ES培養(yǎng)基(500ml)DMEM 410mlFCS 75ml(55℃下熱失活30分鐘)LIF 5ml谷氨酰胺 5ml非必需氨基酸 5mlβ-MeOH 5μl
EB培養(yǎng)基(500ml)DMEM 440mlFCS 50ml谷氨酰胺 5ml非必需氫基酸 5mlβ-MeOH 5μlN2培養(yǎng)基DMEM 125ml谷氨酰胺 1.25mlF-12(Gibco#21765029) 125ml胰島素1.25ml25μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白 6.25ml50μg/ml黃體酮0.25ml6ng/ml腐胺 0.25ml16μg/ml亞硒酸鈉 25μl 30nMBSA 1.25ml50μg/mlP/S 2.5ml 1％P/S代表抗生素，例如，青霉素/鏈霉素。它可以任選地被排除在本文的培養(yǎng)基之外并且被等體積的DMEM替換。
N2培養(yǎng)基的貯存液BSA Gibco #A-9418 Powder Fraction V100g等分試樣10mg/ml貯存在-20℃終濃度50μg/ml
胰島素Sigma I-6634 100mg水中的貯存液5mg/ml(滴加濃鹽酸酸化到pH2以溶解胰島素)貯存在-80℃轉(zhuǎn)鐵蛋白Sigma#T-1147脫鐵運(yùn)鐵蛋白人100mg水中貯存液2mg/ml貯存在-80℃黃體酮Sigma#P-8783 5gEtOH中貯存液2mM，貯存在-80℃工作溶液20μM，貯存液在水中的稀釋液，貯存在-80℃腐胺Sigma#P-5780水中的貯存液100μM，貯存在-80℃亞硒酸鈉Sigma#S-5261 25g水中的貯存液300μM，貯存在4℃完全培養(yǎng)基水溶液L-丙氨酸(Sigma#A-7627)[貯存液2mg/ml]2μg/ml生物素(Sigma#B-4501)[貯存液0.1mg/ml]0.1μg/mlL-肉堿(Sigma#C-0283)[2mg/ml]2μg/ml乙醇胺(Sigma#E-9508)[1mg/ml)1μg/mlD+-半乳糖(Sigma#G-0625)[15mg/ml]15μg/mlL-脯氨酸(Sigma#P-0380)[7.76mg/ml] 7.76μg/ml腐胺(Sigma P-7505)[16.1mg/ml] 16.1μg/ml丙酮酸鈉(Sigma#P-5280)[25mg/ml] 25μg/ml
亞硒酸鈉(Sigma#S-1382)
0.016μg/ml維生素B12(Sigma#V-2876)
0.34μg/ml硫酸鋅(Sigma#Z-4750)
0.194μg/ml過氧化氫酶(Sigma#C-40)[16mg/ml]16μg/ml谷胱甘肽(Sigma#G-6013)[1mg/ml] 1μg/mlSOD(Sigma#S-2515)[2.5mg/ml]2.5μg/ml乙醇溶液亞油酸(Sigma#L-1376)[100mg/ml] 1μg/ml亞麻酸(Sigma#L-2376)[100mg/ml] 1μg/ml黃體酮(Sigma#P-8783)
6.3ng/ml全反式視黃醇(Sigma#R-7632)[10mg/ml]100ng/ml乙酸視黃酯(Sigma#R-7882)[10mg/ml] 100ng/ml生育酚(Sigma#T-3251)[100mg/ml] 1μg/ml維生素E(tocopherolacetate)(Sigma#T-3001)[100mg/ml]1μg/ml溶解BSA 1g轉(zhuǎn)鐵蛋白2mg胰島素 1.6mg谷氨酰胺2mMP/S(任選的) 1％在400ml DMEM中并加入上面的溶液。
ES細(xì)胞培養(yǎng)物最初，將ES細(xì)胞解凍后在由絲裂霉素失活的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞組成的飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)至少兩次傳代。對于接下來的傳代，在沒有飼養(yǎng)細(xì)胞時培養(yǎng)ES細(xì)胞并且可以在沒有飼養(yǎng)細(xì)胞下至少兩次傳代后立即開始分化或者從無飼養(yǎng)細(xì)胞的ES細(xì)胞的冷凍原種開始分化。用于分化的原種在開始該過程前傳代至少兩次。在飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)ES細(xì)胞后，沒有飼養(yǎng)細(xì)胞的第一次傳代是重要的。成功的分化取決于用于第一次傳代的ES細(xì)胞的密度。ES細(xì)胞在第一次分裂培養(yǎng)后1天應(yīng)該占據(jù)平板的至少1/3。ES培養(yǎng)基是基于含有15％FCS(特別為ES細(xì)胞培養(yǎng)物測試，然后是神經(jīng)元分化)、LIF(1000U/ml)、非必需氨基酸和β-巰基乙醇的DMEM。細(xì)胞培養(yǎng)板總是用0.2％明膠溶液包被至少10分鐘。發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的溫度是重要的因素，因?yàn)樵?7℃以上時神經(jīng)元分化不是成功的。將ES細(xì)胞在7％CO2/空氣下保持在最高溫度37℃下。所有培養(yǎng)基都在37℃預(yù)熱。
ES細(xì)胞每2天分裂培養(yǎng)一次，在10cm細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning)上的接種密度為1.5×106到4×106個細(xì)胞。2天后，可以回收10-25×106個細(xì)胞，并且高增殖速率是實(shí)驗(yàn)成功的必要條件。細(xì)胞必須處于快速生長相中并且形成扁平單層。
通過2×PBS洗滌并將細(xì)胞與胰蛋白酶溶液(1×胰蛋白酶溶液Gibco-0.02％EDTA中0.05％)薄膜在37℃7％CO2中培養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)胞的分裂，可以用手搖動培養(yǎng)板并且細(xì)胞將脫落并且通過上下抽吸(失活胰蛋白酶)重懸浮在新鮮ES培養(yǎng)基中。然后以1000轉(zhuǎn)/分鐘在室溫下離心5分鐘。通過上下抽吸幾次將沉淀再次重懸浮在新鮮ES培養(yǎng)基中。細(xì)胞將解離成單個細(xì)胞培養(yǎng)物，盡管可以存在2-3個細(xì)胞的團(tuán)聚體；但是將不存在更大的團(tuán)塊。將所希望量的細(xì)胞再次接種在明膠包被的平板上。
為了使ES細(xì)胞脫離飼養(yǎng)細(xì)胞。它們可以在解凍后在飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)約2次，然后將進(jìn)行沒有飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下至少兩次傳代，從而將稀釋除去成纖維細(xì)胞。從而ES細(xì)胞從集落樣形狀改變成扁平形態(tài)。
解凍ES細(xì)胞涉及快速解凍約3×106個ES細(xì)胞的原種瓶，將細(xì)胞重懸浮在10ml ES培養(yǎng)基中并以1000轉(zhuǎn)/分鐘在室溫下離心5分鐘。將細(xì)胞沉淀物再次重懸浮在ES培養(yǎng)基中并將細(xì)胞的量接種在6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。通過將胰蛋白酶消化并離心后分裂時的細(xì)胞重懸浮在ES培養(yǎng)基+10％DMSO中進(jìn)行ES細(xì)胞的冷凍。
神經(jīng)元分化方案對于EB形成，將3×106個ES細(xì)胞接種在非貼壁的細(xì)菌培養(yǎng)皿(Greiner)中15ml EB培養(yǎng)基(沒有LIF并且僅有10％FCS的ES培養(yǎng)基)中并培養(yǎng)8天。
通過從細(xì)菌培養(yǎng)皿(50ml Falcon管中)除去總細(xì)胞培養(yǎng)物并讓EB靜置(約3-5分鐘)，每2天更換培養(yǎng)基。然后小心吸除上清液，并用15ml EB培養(yǎng)基再次回收EB。EB應(yīng)該通過移液小心地重懸浮在培養(yǎng)基中，使用具有足夠?qū)掗_口的移液器以避免損傷或者解離EB(例如，10ml塑料移液器)。
4天后，將5μM RA(Sigma)直接加到培養(yǎng)皿并通過輕輕搖動培養(yǎng)皿分散。RA不應(yīng)該在光線下放置太長時間，因?yàn)樗枪饩€敏感的。然后解離EB并將細(xì)胞接種在PDL/層粘連蛋白包被的平板上，如下。
將細(xì)胞培養(yǎng)皿用硼酸鹽緩沖液(150mM pH8.4)中的10μg/ml PDL溶液包被并在培養(yǎng)箱中放置過夜(37℃，7％CO2)。還使用100μg/ml的多鳥氨酸得到相似的結(jié)果。用PBS(對于多鳥氨酸使用水)洗滌平板3次，向PBS溶液中直接加入層粘連蛋白(約0.5μg/cm2)并將平板返回到培養(yǎng)箱中至少2小時。
EB形成8天后，將EB用PBS洗滌2次并通過將它們在37℃水浴中在0.04％EDTA/PBS中的0.05％胰蛋白酶溶液(用胰蛋白酶粉劑新鮮制備，TPCK處理的，Sigma)溫育3分鐘。溫育時間期間，F(xiàn)alcon管應(yīng)該用手小心搖動幾次并且可以容易地看到EB的崩解。然后EB的解離變得溫和，但是完全重懸浮在含有用于胰蛋白酶失活的血清的10ml EB培養(yǎng)基中。可以通過約5次上下吹吸進(jìn)行解離。最好的研磨是通過具有小體積(約1.5ml)的平滑邊緣的/in flame巴斯德移液器進(jìn)行兩次，然后用5ml塑料移液器進(jìn)行。然后通過以1000轉(zhuǎn)/分鐘在室溫下離心研制(trituration)。然后完全除去上清液，將沉淀物重懸浮在N2培養(yǎng)基中，并通過40μm Nylon細(xì)胞滲濾器(Falcon)過濾細(xì)胞懸浮液。
從包被的平板除去層粘連蛋白，并立即加入細(xì)胞懸浮液，不讓平板干燥。將解離的細(xì)胞以1.5×105個細(xì)胞/cm2的密度接種。2小時后更換N2培養(yǎng)基，1天后再次更換。2天后，通過Brewer和Cotman(參考文獻(xiàn)12)描述的富集的無血清培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中的變動是省略谷氨酸、HEPES、皮質(zhì)酮、硫辛酸和T3。
神經(jīng)元分化繼續(xù)并且神經(jīng)元培養(yǎng)物可以保持?jǐn)?shù)周。
免疫化學(xué)通過將玻璃蓋玻片在水中洗滌并在65％硝酸中溫育1到2天來準(zhǔn)備玻璃蓋玻片。隨后，將它們漂浮在水中幾小時，用乙醇沖洗、風(fēng)干并在紫外線下消毒。將細(xì)胞用4％低聚甲醛(PFA)固定10分鐘，用PBS洗滌并在封閉緩沖液(0.03％角叉藻聚糖，10％NGS，0.3％Triton X-100)中封閉1小時。在AquaPoly/Mount(Polysciences)中封固。
蛋白質(zhì)印跡如上述接種解離的EB并在所指示的時間點(diǎn)收集蛋白質(zhì)印跡的樣品。收獲前將平板用冰預(yù)冷的PBS洗滌兩次。在補(bǔ)加蛋白酶抑制劑混合物(Roche)的用于6cm平板的750μl裂解緩沖液(50mM Tris pH7.4，150mMNaCl，10％甘油，1％Triton X-100)中制備全細(xì)胞提取物。以4200轉(zhuǎn)/分鐘在Eppendorf離心機(jī)中離心30分鐘后，除去上清液并通過DC蛋白質(zhì)測定法(BioRad)測定蛋白質(zhì)含量。樣品在Laemmli緩沖液中煮沸并將5μg樣品裝入聚丙烯酰胺凝膠。用5％奶溶液封閉印跡，用一級抗體溫育過夜溫育并用二級抗體溫育2小時。用ECL Plus(Amersham)進(jìn)行檢測。
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權(quán)利要求
1.誘導(dǎo)胚胎干(ES)細(xì)胞分化成神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞的方法，其包括培養(yǎng)ES細(xì)胞；形成胚狀體(EB)；將EB與視黃酸(RA)接觸；和解離EB以產(chǎn)生神經(jīng)元前體細(xì)胞的培養(yǎng)物，其中形成EB包括選擇高增殖性ES細(xì)胞并將那些細(xì)胞以所測量的密度接種以形成EB。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將所述細(xì)胞以約0.5×105到5×105個細(xì)胞/ml的密度接種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2方法，其中形成EB包括將ES細(xì)胞以約2.5×105到3.5×105個細(xì)胞/ml的密度接種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、權(quán)利要求2或者權(quán)利要求3的方法，其中EB保持在非貼壁的培養(yǎng)物中直到EB細(xì)胞解離。
5.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中該方法包括觀察ES細(xì)胞的形態(tài)并選擇形態(tài)上均一的ES細(xì)胞用于EB形成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中該方法包括選擇具有一種或多種下面的形態(tài)特征的ES細(xì)胞以扁平單層生長；鄰近細(xì)胞不相互直接接觸；大細(xì)胞核；許多核仁；細(xì)胞不在相互的上方生長也不以集落樣形式生長。
7.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中該方法包括確定ES細(xì)胞的增殖狀態(tài)并選擇高增殖性細(xì)胞用于EB形成。
8.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中培養(yǎng)ES細(xì)胞包括在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下傳代ES細(xì)胞。
9.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中培養(yǎng)ES細(xì)胞包括通過將ES細(xì)胞以約0.5-2×105個細(xì)胞/cm2的密度接種并在接種后2天解離ES細(xì)胞進(jìn)行傳代。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞時將傳代重復(fù)至少兩次。
11.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中該方法包括解離ES細(xì)胞以形成單個細(xì)胞懸浮液，其中懸浮液中少于約5％的細(xì)胞形成4個或更多細(xì)胞的團(tuán)聚體，并接種細(xì)胞以形成EB。
12.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中解離EB包括用胰蛋白酶解離EB細(xì)胞以形成解離的EB細(xì)胞的懸浮液，然后過濾懸浮液以除去細(xì)胞團(tuán)塊。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中通過約40μm的網(wǎng)孔過濾解離的EB細(xì)胞。
14.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其包括通過冷凍細(xì)胞來貯存解離的EB細(xì)胞。
15.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其還包括接種和培養(yǎng)解離的EB細(xì)胞以產(chǎn)生神經(jīng)元，和任選地培養(yǎng)神經(jīng)元。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中將解離的EB細(xì)胞以約0.5×105到2.5×105個細(xì)胞/cm2的密度接種。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中將解離的EB細(xì)胞以約1×105到1.5×105個細(xì)胞/cm2的密度接種。
18.根據(jù)權(quán)利要求15到17任一項(xiàng)的方法，其包括在接種解離的EB細(xì)胞后約1到6小時，更換解離的EB細(xì)胞的培養(yǎng)基。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其包括在接種后約1到3小時更換培養(yǎng)基。
20.根據(jù)權(quán)利要求15到19任一項(xiàng)的方法，其中不在血清的存在下培養(yǎng)解離的EB細(xì)胞或神經(jīng)元。
21.根據(jù)權(quán)利要求15到20任一項(xiàng)的方法，其中不在生長因子存在下培養(yǎng)神經(jīng)元前體細(xì)胞、祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求15到21任一項(xiàng)的方法，其中不在神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)神經(jīng)元前體細(xì)胞、祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞。
23.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中該方法不包括負(fù)選擇步驟。
24.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中ES細(xì)胞是非人ES細(xì)胞。
25.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其包括將至少80％的解離的EB細(xì)胞鑒定為神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞。
26.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其包括將至少99％的解離的EB細(xì)胞鑒定為神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞。
27.根據(jù)權(quán)利要求15到22任一項(xiàng)的方法，其包括將至少80％的細(xì)胞鑒定為神經(jīng)元。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其包括將至少90％的細(xì)胞鑒定為神經(jīng)元。
29.測定方法，其包括確定神經(jīng)元前體細(xì)胞或祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞的一種或多種特征。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的測定方法，其中所述一種或多種特征是軸突生長或軸突延長/退化、神經(jīng)元形狀、神經(jīng)元細(xì)胞死亡、神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)元分化、電活性、突觸發(fā)生和/或神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)記的一種或多種。
31.根據(jù)權(quán)利要求29或者權(quán)利要求30的測定方法，其中通過根據(jù)權(quán)利要求1到28任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生所述細(xì)胞。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的測定方法，其包括誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化成根據(jù)權(quán)利要求1到28任一項(xiàng)的神經(jīng)元前體細(xì)胞或祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞；并確定在測試條件下所述神經(jīng)元前體細(xì)胞或祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞的一種或多種特征。
33.根據(jù)權(quán)利要求29到32任一項(xiàng)的測定方法，其包括在第一種條件下培養(yǎng)神經(jīng)元前體細(xì)胞或祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞；在第二種條件下培養(yǎng)神經(jīng)元前體細(xì)胞或祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞；確定或定量所述細(xì)胞的一種或多種神經(jīng)元特征；和比較分別在第一種條件下培養(yǎng)的細(xì)胞的一種或多種神經(jīng)元特征與在第二種條件下培養(yǎng)的細(xì)胞中相同的一種或多種神經(jīng)元特征。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的測定方法，其中神經(jīng)元特征是軸突延長并且其中該方法包括定量軸突特異的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平；和比較軸突特異的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平；其中在第一種條件下較高的表達(dá)水平表明第一種條件增加軸突延長。
35.根據(jù)權(quán)利要求33的測定方法，其中神經(jīng)元特征是軸突退化并且其中該方法包括定量軸突特異的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平；和比較軸突特異的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平；其中在第一種條件下較低的表達(dá)水平表明第一種條件增加軸突退化。
36.鑒定抑制或者減小已知增加軸突退化的化合物產(chǎn)生的軸突退化的增加的試劑的方法，其包括在試劑存在并且在已知增加軸突退化的條件下培養(yǎng)神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞；在所述試劑不存在并且在已知增加軸突退化的條件下培養(yǎng)神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞；定量或者測定存在和不存在所述試劑時軸突退化的水平；并比較存在試劑時軸突退化的水平與不存在試劑時軸突退化的水平；其中，與不存在試劑時相比，存在試劑時軸突退化的較低水平表明該試劑抑制或者減小所述條件產(chǎn)生的或者與該條件相關(guān)的軸突退化的增加。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中通過定量軸突特異的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平來定量軸突退化的水平，其中與不存在試劑時相比，存在所述試劑時軸突特異的蛋白質(zhì)的較高的表達(dá)水平表明該試劑抑制或者減小所述條件產(chǎn)生的或者與該條件相關(guān)的軸突退化的增加。
38.根據(jù)權(quán)利要求33的測定方法，其中神經(jīng)元特征是神經(jīng)元細(xì)胞死亡，并且其中該方法包括在第一種條件下培養(yǎng)神經(jīng)元；在第二種條件下培養(yǎng)神經(jīng)元；定量或者測定在第一種和第二種條件下培養(yǎng)的細(xì)胞的神經(jīng)元細(xì)胞死亡；和比較在第一種條件下神經(jīng)元細(xì)胞死亡的水平與在第二種條件下神經(jīng)元細(xì)胞死亡的水平；其中與第二種條件下相比，在第一種條件下神經(jīng)元細(xì)胞死亡的較高水平表明該化合物增加細(xì)胞死亡；和/或其中與第二種條件下相比，在第一種條件下神經(jīng)元細(xì)胞死亡的較低水平表明該條件減小神經(jīng)元細(xì)胞死亡。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的測定方法，其中神經(jīng)元表達(dá)p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白和/或細(xì)胞凋亡蛋白。
40.鑒定抑制或者減小神經(jīng)元細(xì)胞死亡的增加的試劑的方法，所述神經(jīng)元細(xì)胞死亡的增加由已知增加神經(jīng)元細(xì)胞死亡的條件產(chǎn)生，該方法包括在試劑存在和已知增加神經(jīng)元細(xì)胞死亡的條件下培養(yǎng)神經(jīng)元；在試劑不存在和已知增加神經(jīng)元細(xì)胞死亡的條件下培養(yǎng)神經(jīng)元；定量或者測定存在和不存在所述試劑時神經(jīng)元細(xì)胞死亡的水平；并比較存在所述試劑時的神經(jīng)元細(xì)胞死亡水平與不存在所述試劑時的神經(jīng)元細(xì)胞死亡水平；其中與不存在試劑時相比，存在試劑時神經(jīng)元細(xì)胞死亡的較低水平表明該試劑抑制或者減小所述條件產(chǎn)生的神經(jīng)元細(xì)胞死亡的增加。
41.根據(jù)權(quán)利要求33到35、38和39任一項(xiàng)的測定方法，其中在第一種條件下培養(yǎng)包括在測試化合物存在下培養(yǎng)細(xì)胞或者將細(xì)胞暴露于測試化合物，并且其中在第二種條件下培養(yǎng)包括在所述測試化合物不存在時培養(yǎng)細(xì)胞，或者不將細(xì)胞暴露于測試化合物。
42.根據(jù)權(quán)利要求29到31任一項(xiàng)的測定方法，其用于鑒定指示細(xì)胞的分化狀態(tài)的標(biāo)記，所述方法包括誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化以產(chǎn)生神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞，和/或培養(yǎng)神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞以產(chǎn)生神經(jīng)元；比較在一種分化階段下細(xì)胞中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與第二種分化階段下細(xì)胞中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平；和鑒定在第一種和第二種分化階段下細(xì)胞中表達(dá)水平不同的蛋白質(zhì)；其中表達(dá)水平的差異表明該蛋白質(zhì)可以用作標(biāo)記來指出細(xì)胞的分化狀態(tài)。
43.根據(jù)權(quán)利要求29到32之一的測定方法，其中神經(jīng)元特征是突觸發(fā)生并且其中該方法包括測量細(xì)胞的電生理學(xué)活性和/或檢測或測量指示突觸發(fā)生的一種或多種標(biāo)記的表達(dá)。
44.方法，其包括提供神經(jīng)元細(xì)胞或神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞的第一種和第二種培養(yǎng)物，其中第一種培養(yǎng)物中的細(xì)胞與第二種培養(yǎng)物中的細(xì)胞具有不同表型；并比較第一種培養(yǎng)物中的神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元與第二種培養(yǎng)物中的神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中第一種培養(yǎng)物中的細(xì)胞含有目的基因中的突變，并且第二種培養(yǎng)物中的細(xì)胞不含有所述突變。
46.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中第一種培養(yǎng)物中的細(xì)胞含有導(dǎo)入的基因，并且第二種培養(yǎng)物中的細(xì)胞不含有所述導(dǎo)入的基因。
47.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中第一種培養(yǎng)物中的細(xì)胞過表達(dá)一種內(nèi)源基因，并且第二種培養(yǎng)物中的細(xì)胞不過表達(dá)所述內(nèi)源基因。
48.根據(jù)權(quán)利要求44到47任一項(xiàng)的方法，其包括誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化成根據(jù)權(quán)利要求1到28任一項(xiàng)的方法的神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中在第一種培養(yǎng)物中，ES細(xì)胞含有目的基因中的突變，在第二種培養(yǎng)物中，所述細(xì)胞不含有所述突變。
50.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其包括用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染解離的EB的第一種培養(yǎng)物，從而與第二種培養(yǎng)物中的細(xì)胞相比，改變第一種培養(yǎng)物中細(xì)胞的表型。
51.根據(jù)權(quán)利要求44到50任一項(xiàng)的方法，其包括在測試條件下培養(yǎng)神經(jīng)元前體細(xì)胞或者祖細(xì)胞或者神經(jīng)元細(xì)胞的第一種和第二種培養(yǎng)物；檢測、定量、觀察或者確定細(xì)胞的一種或多種神經(jīng)元特征；并比較第一種培養(yǎng)物中細(xì)胞的神經(jīng)元特征與第二種培養(yǎng)物中細(xì)胞的神經(jīng)元特征。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中在第一種條件下培養(yǎng)包括在Aβ肽存在下培養(yǎng)細(xì)胞，并且在第二種條件下培養(yǎng)細(xì)胞包括在Aβ肽不存在時培養(yǎng)細(xì)胞。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中神經(jīng)元特征是軸突降解。
54.基本上如本文描述的方法。
全文摘要
提供了用于誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化成神經(jīng)元前體的方法以及神經(jīng)元前體或者祖細(xì)胞的測定法，和用于鑒定抑制或者減小軸突退化的增加的試劑的方法。
文檔編號C12N5/00GK1997733SQ200580021045
公開日2007年7月11日 申請日期2005年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月5日
發(fā)明者Y-A·巴德, M·彼貝爾, J·里奇特, K·L·特克 申請人:諾瓦提斯研究基金會弗里德里克·米謝爾生物醫(yī)學(xué)研究所