專利名稱：：神經(jīng)細(xì)胞的移植的制作方法神經(jīng)細(xì)胞的移植發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及神經(jīng)細(xì)胞的移植，以提高腦中的抑制性神經(jīng)元活性。本發(fā)明具體涉及可能得益于抑制性神經(jīng)元活性提高的疾病的治療和用于治療這種疾病的組合物，這種疾病可包括但不限于特征是抑制性神經(jīng)元功能丟失的疾病，本發(fā)明還涉及治療包括癲癇和帕金森病在內(nèi)的人類疾病。
背景技術(shù)：
：許多神經(jīng)疾病的特征是抑制性神經(jīng)元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，具體是缺少抑制性神經(jīng)元分泌的神經(jīng)遞質(zhì)Y-氨基丁酸(GABA)。GABA是谷氨酸代謝物，它是抵消興奮性神經(jīng)遞質(zhì)作用的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。興奮性神經(jīng)遞質(zhì)(一般是乙酰膽堿、谷氨酸或5-羥色胺)能打開陽離子通道，引起N^內(nèi)流，使突觸后膜去極化，達(dá)到閾值電位后發(fā)放(firing)動作電位，從而引起信號跨突觸傳遞。相反，抑制性神經(jīng)遞質(zhì)能打開cr通道或K+通道，通過使動作電位的發(fā)放更難受到興奮性作用以使突觸后膜去極化，從而抑制動作電位的發(fā)放。抑制功能異?？赡墚a(chǎn)生帕金森病的癥狀，并且是數(shù)種其它神經(jīng)病的發(fā)病機(jī)理，這些疾病包括亨廷頓病、精神分裂癥、孤獨癥、慢性疼痛和多種形式的癲癇癥。與大部分這類疾病相同，癲癇癥沒有治愈方法，只能用各種控制癥狀的藥物進(jìn)行治療。因此，以活動、疼痛、抑郁、焦慮、活力降低以及睡眠或休息不足的天數(shù)衡量，發(fā)現(xiàn)癲癇癥和其治療導(dǎo)致生活質(zhì)量嚴(yán)重降低(類似于關(guān)節(jié)炎、心臟病、糖尿病和癌癥)。癲癇癥在世界范圍內(nèi)影響著50,000,000人，癲癇癥患者死亡率比正常人高2-3倍，他們猝死的風(fēng)險是正常人的24倍以上。除患者痛苦外，癲癇癥每年僅在美國就造成155億美元的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，相關(guān)的健康護(hù)理成本以及就業(yè)、工資和生產(chǎn)力的損失。因此，任何可選的或新的療法，尤其是可能治愈的療法都將帶來非常深遠(yuǎn)的有益影響。目的是通過細(xì)胞移植來提高抑制性神經(jīng)元功能的研究關(guān)注于使用經(jīng)遺傳工程改造產(chǎn)生GABA的多能細(xì)胞和永生化神經(jīng)元(Bosch等，(2004)ExpNeurol190，42-58;Thompson(2005)Neuroscience133，1029-37)。為了使移植細(xì)胞有效到達(dá)患病區(qū)域并進(jìn)行功能性整合，需要該細(xì)胞從移植物部位遷移并與宿主細(xì)胞混合起來，與局部興奮性神經(jīng)元一起建立抑制性突觸。早先嘗試由前體細(xì)胞驅(qū)動新神經(jīng)組織的缺點在于移植細(xì)胞缺少遷移活性，如胚胎干細(xì)胞(ES)衍生的神經(jīng)元(Wernig等(2004)JNeurosci24,5258-68;Ruschenschmidt等(2005)Epilepsia46增干U5,174-83)和遺傳工程改造的GABA產(chǎn)生細(xì)胞(Bosch等，同上；Thompson,同上)。移植入出生后的腦內(nèi)的ES衍生細(xì)胞或前體神經(jīng)前體細(xì)胞不會廣泛遷移，而是在移植部位或其附近形成移植物衍生細(xì)胞塊(Bosch等，同上；Ruschenschmidt等，同上；Thompson,同上)，因而限制了它的治療價值，因為需要應(yīng)用于多個移植部位而只有有限體積的腦實質(zhì)發(fā)生改變。而且，如果移植細(xì)胞主體的位置僅限于移植部位，那么植入的移植細(xì)胞就不可能充分有效地提高抑制水平。在發(fā)育過程中，來自內(nèi)側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起(medialganglioniceminence)的細(xì)胞形成抑制性中間神經(jīng)元。對MGE細(xì)胞的研究相互矛盾。一項近期研究(OlssonM等，Neuroscience69(4)1169-82(1995))斷定，與前體神經(jīng)前體細(xì)胞相比，植入宿主腦的MGE細(xì)胞的遷移能力相對較低，它們不能跨越患神經(jīng)病的腦部區(qū)域，而Butt等的文章(Neuron48,591-604,2005)則報道了快速遷移。已證明，ES細(xì)胞能在宿主腦中產(chǎn)生分化的神經(jīng)元，因此似乎具有恢復(fù)患病腦中抑制性神經(jīng)元功能的優(yōu)良前景。然而，ES衍生的移植物也形成異源細(xì)胞群一約14。/。植入出生后腦中的ES衍生細(xì)胞表達(dá)GAD67(含有GABA的中間神經(jīng)元的標(biāo)記物)，另外44%具有谷氨酰胺能表型，因而可能具有興奮功能(與所需的功能相反)，并且推測未知部分是星形細(xì)胞(Wernig等，同上)。從根本上來看，通過移植ES衍生的祖細(xì)胞以提高腦內(nèi)GABA能活性存在缺陷，不僅因為該細(xì)胞的遷移能力有限(如上所述)，而且因為移植后腫瘤的形成是一常見問題(Wemig等，同上；Ruschenschmidt等，同上)。發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提高腦中的抑制性神經(jīng)元功能，另一個目的是改善特征是抑制性中間神經(jīng)元活性或功能異常的疾病或為其至少提供另一種治療。此外，具體實施方式的目的是在抑制性中間神經(jīng)元功能正常、但興奮過度可能引起病理癥狀的情況下提高抑制水平。本發(fā)明具體實施方式的目的是通過移植細(xì)胞，使移植的細(xì)胞或其后代分散到患病區(qū)域并且分化成表達(dá)合適神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)肽的成熟神經(jīng)元來治療疾病。這些細(xì)胞應(yīng)功能性整合并直接影響受損宿主腦中的環(huán)路。優(yōu)選地，移植細(xì)胞應(yīng)能夠分散到患病區(qū)域并分化成能恢復(fù)(或調(diào)節(jié))現(xiàn)有神經(jīng)環(huán)路缺陷的神經(jīng)元。同樣，移植神經(jīng)前體細(xì)胞可用作需要提高抑制性神經(jīng)元功能的腦修復(fù)或環(huán)路調(diào)節(jié)的治療性方案。這些細(xì)胞也可用作各種疾病表達(dá)分子的運載體，這些疾病包括但不限于癌癥、感染性疾病、神經(jīng)變性疾病、外傷性腦損傷和精神病。發(fā)明概述本發(fā)明提供了提高哺乳動物的宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性神經(jīng)元活性的方法，所述方法包括將MGE細(xì)胞植入該哺乳動物的腦中。具體說，該方法用于調(diào)節(jié)腦，如患病腦中的抑制。本發(fā)明也提供了將抑制性中間神經(jīng)元遞送到哺乳動物腦中第一部分的方法，所述方法包括將MGE細(xì)胞遞送到腦中遠(yuǎn)離所述第一部分的第二部分。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生抑制性中間神經(jīng)元的方法，所述方法包括獲得MGE細(xì)胞并處理該細(xì)胞，以產(chǎn)生可能功能性整合到宿主CNS中的抑制性中間神經(jīng)元。提供了本發(fā)明組合物，其包含在適合植入人腦的載體中的分離的人MGE細(xì)胞。本發(fā)明還提供了MGE細(xì)胞在制備提高哺乳動物抑制性中間神經(jīng)元活性的組合物中的應(yīng)用。因此，本發(fā)明提供了提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)中抑制性中間神經(jīng)元功能的方法和組合物，并可提供治療特征是抑制異常的疾病，特別是諸如癲癇癥等人類疾病的方法和組合物。此外，本發(fā)明還提供了用于治療特征是興奮異常(可能是運動障礙或神經(jīng)痛的特征)的疾病，特別是人類疾病的方法和組合物。本發(fā)明在某些實施方式中還提供了遞送治療性分子以治療疾病的方法，具體是在移植的MGE細(xì)胞中表達(dá)這些分子，以便使它們在產(chǎn)生的功能性中間神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)。發(fā)明詳述本發(fā)明基于將MGE細(xì)胞植入成年或成熟腦中，以形成可恢復(fù)或調(diào)節(jié)神經(jīng)環(huán)路的新的功能性抑制性中間神經(jīng)元。本發(fā)明第一方面是在哺乳動物中提高抑制水平的方法，所述方法包括將MGE細(xì)胞植入該哺乳動物腦中。該方法用于這類中間神經(jīng)元的功能受到損傷、損壞或破壞的患病腦，因此本發(fā)明宜用于恢復(fù)腦中抑制性中間神經(jīng)元的功能。因此，可治療可能受益于CNS中抑制性功能提高的疾病，例如特征是興奮性神經(jīng)元功能異常的疾病。在應(yīng)用中，移植MGE細(xì)胞，在腦中從頭形成或產(chǎn)生抑制性中間神經(jīng)元。一般采用多個細(xì)胞，形成多個中間神經(jīng)元。在下面更詳細(xì)描述的實施例中，發(fā)現(xiàn)它們已經(jīng)從移植位置分散開并由原始MGE細(xì)胞發(fā)生分化。本發(fā)明第二方面是將抑制性中間神經(jīng)元遞送到哺乳動物腦中第一部分的方法，所述方法包括將MGE細(xì)胞遞送到腦中遠(yuǎn)離所述第一部分的第二部分。MGE細(xì)胞的遷移和隨后的分化產(chǎn)生了功能性中間神經(jīng)元。通常在患病腦的許多區(qū)域都可觀察到缺少抑制性中間神經(jīng)元環(huán)路，本發(fā)明優(yōu)選包括植入一個位置，隨后細(xì)胞和后代從該位置分散，在許多遠(yuǎn)端位置提供中間神經(jīng)元群體。因此，不需要將細(xì)胞植入多個位點。中間神經(jīng)元可經(jīng)遺傳工程改造而表達(dá)異源基因。在實施例中，中間神經(jīng)元表達(dá)GFP，本發(fā)明其它細(xì)胞可經(jīng)修飾而表達(dá)需要遞送至腦的其它蛋白質(zhì)。中間神經(jīng)元也可經(jīng)遺傳工程改造而表達(dá)具有治療價值的異源基因。例如，可利用MGE細(xì)胞遞送選自下組的蛋白質(zhì)對抗CNS惡性腫瘤的蛋白質(zhì)；例如，通過修飾特定信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑治療癲癇癥的蛋白質(zhì)；治療神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病的蛋白質(zhì)，包括能清除神經(jīng)毒性物質(zhì)的分子；和治療神經(jīng)精神病如孤獨癥和精神分裂癥的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一方面是產(chǎn)生抑制性中間神經(jīng)元的方法，所述方法包括獲得MGE細(xì)胞并處理該細(xì)胞以產(chǎn)生抑制性中間神經(jīng)元。抑制性中間神經(jīng)元優(yōu)選是神經(jīng)環(huán)路的一部分，通過分泌抑制性神經(jīng)遞質(zhì)如GABA提供抑制性反饋。合適的治療是將該細(xì)胞植入哺乳動物腦，特別是患病腦中。本發(fā)明通?？蓱?yīng)用于哺乳動物，具體說所述哺乳動物選自小鼠、大鼠、人、牲畜或家養(yǎng)動物。優(yōu)選地，所述哺乳動物是人，且本發(fā)明提供了含有人細(xì)胞的組合物以及治療人類疾病的方法和應(yīng)用。許多報道中描述了MGE細(xì)胞。用于本發(fā)明時，可使用來自各種不同來源的MGE細(xì)胞。所述細(xì)胞可獲自胎兒或胚胎腦，例如通過切除組織、接著分離細(xì)胞，產(chǎn)生含有分離細(xì)胞的組合物。也可通過神經(jīng)干細(xì)胞的分化來獲得MGE細(xì)胞。因此，可處理神經(jīng)干細(xì)胞使其分化成MGE細(xì)胞?？捎苫颊呓M織直接獲得神經(jīng)干細(xì)胞。可通過多能細(xì)胞如ES細(xì)胞的分化獲得神經(jīng)干細(xì)胞。在本發(fā)明的一個實施方式中，將MGE細(xì)胞植入選自下組的腦部區(qū)域內(nèi)海馬區(qū)、大腦皮層、底丘腦核、其它丘腦或下丘腦區(qū)、小腦、紋狀體和脊髓。優(yōu)選地，所述方法用于治療疾病，治療的患者腦部包含一處或多處損傷，如抑制性中間神經(jīng)元損傷或破壞的區(qū)域，所述患者一般是抑制性中間神經(jīng)元活性降低或興奮活性異常的哺乳動物，特別是人。在下面更詳細(xì)描述的例子中，將分離的MGE細(xì)胞(優(yōu)選與載體一起)注射到腦中，這種載體優(yōu)選為空氣緩沖的細(xì)胞培養(yǎng)基。本文所述方法適用于治療患有特征是抑制性中間神經(jīng)元活性不足或興奮性神經(jīng)元功能提高的疾病的患者，這些疾病包括癲癇癥、帕金森病、亨廷頓病、精神分裂癥和慢性疼痛。本發(fā)明另一方面是一種組合物，其包含在適合植入人腦的載體中的分離的人MGE細(xì)胞。該組合物可容易地裝載到用于給予接受者的注射器中。各種載體均適合該目的，包括組織培養(yǎng)基。優(yōu)選地，載體應(yīng)具有合適的滲透壓和pH以維持細(xì)胞活力。一般給予約105-107個，優(yōu)選約3X10S-3X1()S個細(xì)胞，通常使用約0.5-20nl培養(yǎng)基，濃度為5000到2X106個細(xì)胞/微升，優(yōu)選5乂104到106個細(xì)胞/微升。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可通過常規(guī)實驗按照宿主(如人)優(yōu)化細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞密度。本發(fā)明另一方面是MGE細(xì)胞在制備提高哺乳動物抑制水平的組合物中的應(yīng)用，所述組合物優(yōu)選用于恢復(fù)抑制性中間神經(jīng)元功能或抵消提高的興奮性神經(jīng)元功能，以便(例如)治療特征是抑制性中間神經(jīng)元活性不足或興奮性神經(jīng)元活性過高的疾病如神經(jīng)痛。另一方面是在(具體說)人體內(nèi)從頭產(chǎn)生抑制性中間神經(jīng)元。提到本發(fā)明具體實施方式，例如下文所詳述，移植細(xì)胞是MGE細(xì)胞，或具有MGE細(xì)胞的特征性表型。移植后，這些細(xì)胞在宿主腦中產(chǎn)生抑制性中間神經(jīng)元功能，整合到宿主腦中但不會致瘤。通常發(fā)現(xiàn)它們能發(fā)生快速遷移，速度一般為5-10微米/小時，這有助于該細(xì)胞和其后代神經(jīng)元在整個腦中的分布。這種遷移能夠?qū)⒅虚g神經(jīng)元遞送到遠(yuǎn)離移植位點的腦部區(qū)域內(nèi)，例如，植入大腦皮層可導(dǎo)致海馬區(qū)產(chǎn)生抑制性中間神經(jīng)元。在植入后可利用分子標(biāo)記物(如GFP)跟蹤移植細(xì)胞。移植的MGE樣前體細(xì)胞能在宿主腦中形成分化的中間神經(jīng)元，產(chǎn)生抑制性中間神經(jīng)元的形態(tài)，并且發(fā)現(xiàn)其能夠在腦中跨損傷(可能是神經(jīng)病產(chǎn)生的損傷)遷移。移植細(xì)胞產(chǎn)生抑制性中間神經(jīng)元的表型，它們表達(dá)成熟抑制性神經(jīng)元的特征性分子，發(fā)現(xiàn)它們能改變(優(yōu)選以永久方式改變)宿主腦中的神經(jīng)功能。優(yōu)選地，移植細(xì)胞不形成皮層錐體神經(jīng)細(xì)胞并且不會提高腦中的興奮性神經(jīng)元活性，但相對于興奮性功能使腦中的抑制性神經(jīng)元功能發(fā)生凈升高。因此，在特征是缺乏抑制性神經(jīng)元功能或病態(tài)興奮的疾病中利用移植細(xì)胞將抑制性神經(jīng)元功能恢復(fù)至正常水平。整合到宿主腦中后，該細(xì)胞接受突觸輸入。整合到宿主腦中后，該細(xì)胞也接受興奮性輸入。本發(fā)明的優(yōu)點是，植入MGE細(xì)胞后，細(xì)胞發(fā)生遷移并且原位形成功能性抑制性中間神經(jīng)元。因此，提到下文所述的實施例時，由于形成了功能性抑制性中間神經(jīng)元，接受者的抑制性中間神經(jīng)元活性提高。這種中間神經(jīng)元可用于替換由于疾病而損失的神經(jīng)元，或者可以是額外的中間神經(jīng)元。這種中間神經(jīng)元不僅接受突觸輸入，而且接受興奮性輸入。該細(xì)胞能夠產(chǎn)生的抑制性輸出結(jié)果是在MGE細(xì)胞衍生的抑制性神經(jīng)元附近GABA介導(dǎo)的突觸事件的增加。另一優(yōu)點是該細(xì)胞能原位產(chǎn)生成熟的GABA分泌性中間神經(jīng)元，以及無需人工修飾移植細(xì)胞即能分泌GABA。因此，本發(fā)明可用于治療諸如癲癇癥和本文所述的其它疾病等疾病，這些疾病缺乏抑制性中間神經(jīng)元功能，隨后的興奮性中間神經(jīng)元活性過高或調(diào)節(jié)不足構(gòu)成該疾病的根本原因。在下面更詳細(xì)討論的本發(fā)明實施例中，通過對胎兒和/或胚胎腦切除部分的機(jī)械破壞而獲得MGE細(xì)胞。如此獲得用于植入人體的MGE細(xì)胞。含有MGE細(xì)胞的組合物優(yōu)選為相對純凈的，因為基本上去除了其它污染細(xì)胞。在本發(fā)明的某些實施方式中，含有MGE細(xì)胞的組合物中至少85%、至少90。/。或至少95。/。的相比組分是MGE細(xì)胞。在一些實施方式中，至少98。/。的細(xì)胞是MGE細(xì)胞。在本領(lǐng)域中，已知某些基于藥物的治療，這些治療能提高腦中神經(jīng)遞質(zhì)如GABA的水平，有時導(dǎo)致抑制活性普遍增加。本發(fā)明的特征是在腦中原位從頭形成抑制性中間神經(jīng)元，一般形成功能性突觸以恢復(fù)神經(jīng)環(huán)路-在(例如)癲癇癥的情況下通過形成抑制性中間神經(jīng)元恢復(fù)對神經(jīng)環(huán)路的正常調(diào)節(jié)。與只治療這些疾病的癥狀不同，本發(fā)明的優(yōu)點是直接針對該疾病的根本機(jī)理。也提供了靶向抑制移植細(xì)胞遷移所限定的區(qū)域的方法。這與在整個神經(jīng)系統(tǒng)中提高抑制作用的治療完全不同。下面參照附圖描述以下具體實施例，以闡述本發(fā)明，其中.-圖1顯示MGE細(xì)胞在移植后快速遷移，因此在整個宿主腦中分布;圖2顯示分布在整個宿主腦中的MGE細(xì)胞形成成熟的中間神經(jīng)元的形態(tài)；圖3顯示，軀體感覺皮層和扣帶回皮層中整合的MGE細(xì)胞表達(dá)中間神經(jīng)元特征性分子；圖4顯示，60DAT時海馬區(qū)的齒狀回中存在移植的MGE衍生細(xì)胞；圖5顯示，整合的MGE衍生細(xì)胞以抑制性中間神經(jīng)元特征性方式發(fā)揮作用；圖6顯示對宿主腦中抑制電流進(jìn)行分析的記錄圖；圖7顯示MGE移植細(xì)胞改變宿主腦中的突觸功能；圖8顯示在移植小鼠的海馬區(qū)中突觸抑制電流增加；圖9顯示在MGE移植小鼠的新皮層中，谷氨酸能突觸興奮未改變；和圖10顯示由發(fā)育早期(P0-P2)植入MGE祖細(xì)胞的DIx突變小鼠制備的大腦皮層切片的抑制水平(用含MGE-GFP中間神經(jīng)元的區(qū)域中突觸后錐體細(xì)胞靶點上的自發(fā)性和微小IPSC測定)與對照DIx雜合小鼠的觀察值相當(dāng)。附圖詳述更詳細(xì)說，圖1顯示植入新皮層和紋狀體3天后MGE衍生細(xì)胞的分布。(A)通過GFP的免疫組化檢測MGE衍生細(xì)胞。利用連續(xù)切片確定標(biāo)記細(xì)胞的位置。注該細(xì)胞廣泛分布于新皮層、紋狀體和海馬區(qū)。(B)A中高倍放大區(qū)域，顯示MGE細(xì)胞從注射位點("遷移開。(C)典型的MGE遷移細(xì)胞的詳情。(D)3和60DAT時移植細(xì)胞的分布；細(xì)胞數(shù)/連續(xù)切片距離。比例尺A:lmm;B:250D:25|im;F，正面；D，背面；L，側(cè)面；圖2顯示60DAT成熟中間神經(jīng)元形態(tài)的獲取和分布。(A)明箱圖(cameralucidamap)，它表明植入新皮層(Ctx)、海馬區(qū)(Hp)和紋狀體(St)后MGE移植物衍生細(xì)胞在三個吻尾水平(rostrocaudallevel)的位置。(B)通過GFP免疫組化檢測同側(cè)軀體感覺皮層中的移植細(xì)胞。注移植細(xì)胞廣泛分布于多個皮層中。比較注射半球(B)與對側(cè)半球(C)的層I-II和V中的暗背景。(E-K)通過免疫組化進(jìn)行GFP檢測提供了高爾基體被染色的移植細(xì)胞。皮層中的MGE衍生細(xì)胞分化成呈現(xiàn)中間神經(jīng)元亞型的典型形態(tài)的神經(jīng)元，如雙叢毛細(xì)胞或雙極細(xì)胞(E)、突觸終扣類似于燭臺(箭頭)的枝形細(xì)胞(chandeliercells)(F)、籃細(xì)胞(H)、含有小體的神經(jīng)元(I)和多極細(xì)胞(J)。在海馬區(qū)中，移植細(xì)胞蓄積在CA1(D)和齒狀回(G)中。在紋狀體中，大部分細(xì)胞分化成中等無刺(mediumaspiny)中間神經(jīng)元(K)。B、C、D、F、H和I中的比例尺100E、G、J和K中的比例尺50pm;圖3顯示60DAT，軀體感覺皮層(A-F、J-O)和扣帶皮層(G-I)中MGE植入物衍生細(xì)胞的分子特征。移植的GFP+細(xì)胞與GABA、小清蛋白(PV)、鈣視網(wǎng)膜蛋白(CR)、促生長素抑制素(SOM)和神經(jīng)肽-Y(NP-Y)進(jìn)行免疫組化共定位。箭頭表示GFP和特定標(biāo)記物的雙陽性細(xì)胞。A-0的比例尺為50nm;圖4顯示60DAT海馬區(qū)的齒狀回中移植的MGE衍生細(xì)胞。表達(dá)GFP的MGE衍生細(xì)胞與GABA(A-C)、小清蛋白(PV)(D-F)和促生長素抑制素(SOM)(GI)進(jìn)行免疫組化共定位。箭頭表示雙陽性細(xì)胞。A-I的比例尺為100圖5顯示MGE衍生細(xì)胞具有中間神經(jīng)元發(fā)放特性。(A)與含有GFP+MGE-衍生細(xì)胞的快速冠狀切片(acutecoronalslice)(移植后4周)的落射熒光圖像重疊的IR-DIC圖像；在膜片記錄過程中充滿Alexa紅的細(xì)胞右頂U(kuò)(atrightof)的落射熒光圖像。(B)用電流鉗以靜息電位(約-71mV)記錄的圖A所示的GFP+細(xì)胞的膜電位。注超極化電流階躍(200ms)獲得低度內(nèi)向整流，用長時程去極化電流階躍(1000ms)導(dǎo)致峰值頻率適應(yīng)性的缺乏，這是成熟皮層中間神經(jīng)元的典型特征。(C)在去極化階躍為0.2nA(n^4)時記錄的GFP+細(xì)胞的激發(fā)頻率圖。注頻率-電流線性相關(guān)(插圖)；圖6顯示分析宿主腦中的抑制性電流的記錄圖(A)左圖顯示快速冠狀切片的代表性例子?？蛑斜硎精@得電生理記錄的區(qū)域。(B)圖顯示在IR-DIC和落射熒光顯微鏡下觀察的I-III層中含有GFP+細(xì)胞的快速冠狀切片。由GFP+細(xì)胞附近的錐體細(xì)胞(星號)獲取記錄。(C)圖顯示GFP+MGE細(xì)胞(綠色箭頭)和充滿螢光黃的錐體細(xì)胞(黃色箭頭)的記錄位點的高倍放大圖。圖7顯示MGE移植細(xì)胞改變宿主腦中的突觸功能；(A)移植4周后由錐體細(xì)胞(對照腦和移植腦)記錄的sIPSC的樣品描記線。注相對于日齡匹配的對照，移植動物的IPSC振幅和頻率升高。(B)顯示來自對照(淡灰色柱)和移植(黑色柱)動物的所有IPSC記錄的累計數(shù)據(jù)圖。在移植后2、3和4周進(jìn)行記錄。各柱的數(shù)據(jù)代表7-10個細(xì)胞，數(shù)據(jù)表示為平均值士S.E.M.;用單向AN0VA法測定pO.05時有顯著性。(C,D)對照和移植腦的錐體細(xì)胞的總電荷轉(zhuǎn)移測定值。注4周時移植腦的測定值顯著性提高。(E)sIPSC事件間間隔的累計概率圖顯示移植腦的頻率值較高(p〈0.05);圖8顯示在移植小鼠的海馬區(qū)中突觸抑制電流增加；(A)對照移植小鼠的海馬區(qū)錐體細(xì)胞的自發(fā)性IPSC，以及對照(淡灰色柱；n-10)和移植小鼠(黑色柱；n-10)的海馬區(qū)錐體細(xì)胞的sIPSC的頻率和振幅的柱狀圖。(B)由對照和移植腦的CA1海馬區(qū)錐體細(xì)胞記錄的IPSC總電荷轉(zhuǎn)移的測定值。注4周時移植腦的測定值顯著性提高。(C)sIPSC事件間間隔的累計概率圖顯示移植腦的頻率值較高(P〈0.05)。誤差線表示SEM;*p<0.001;**p<0.05(ANOVA);圖9顯示在MGE移植小鼠的新皮層中，谷氨酸能突觸興奮未改變。(A)所有皮層錐體細(xì)胞樣品的自發(fā)性EPSC數(shù)據(jù)的柱狀圖。sEPSC振幅、衰減時間和頻率表明，對照(淡灰色柱)和移植(黑色柱)腦之間沒有顯著性差異。(B)移植4周后由GFP+移植細(xì)胞記錄的sEPSC的代表性描記線。通過應(yīng)用CNQX和APV消除sEPSC(最下面一條描記線)。(C)在不同保持電位下由GFP+移植細(xì)胞記錄的eEPSC樣本記錄顯示出0mV時發(fā)生膜電位逆轉(zhuǎn)(見插圖)；和圖10顯示由發(fā)育早期(P0-P2)植入MGE祖細(xì)胞的DIx突變小鼠制備的大腦皮層切片的抑制水平(用含MGE-GFP中間神經(jīng)元區(qū)域中突觸后錐體細(xì)胞靶點上的自發(fā)性和微小IPSC測定)與對照DIx雜合小鼠的觀察值相當(dāng)。實施例1將來自表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的小鼠的MGE細(xì)胞移植到出生后腦中。確定這些神經(jīng)元前體細(xì)胞的遷移和分化的時程。還用針對GABA、促生長素抑制素(SOM)和神經(jīng)肽Y(NPY)的抗體分析移植的MGE前體細(xì)胞的分子表型。利用移植動物的皮層切片，我們證明MGE-GFP神經(jīng)元的固有發(fā)放特性類似于快速發(fā)放的籃型皮層中間神經(jīng)元。電生理測定證明，MGE衍生的神經(jīng)元能提高GABA介導(dǎo)的突觸抑制水平，從而調(diào)節(jié)新皮層抑制特性。材料和方法組織切除和細(xì)胞分離由E12.5-E13.5胚胎GFP+轉(zhuǎn)基因小鼠切下內(nèi)側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起前部的腦室和腦室下層，此處腦溝將內(nèi)側(cè)和外側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起明顯分開(Hadjantonakis等(1998)，MechDev76，79-卯)。將檢測到精栓的那天定為E0.5。在切除過程中丟棄相鄰區(qū)域之間的邊界組織，以避免污染。用200nl黃色塑料槍頭吹打(10-20次)，以機(jī)械分離組織外植體。用1ml含有DNA酶I(10-100ng/ml)的L-15培養(yǎng)基洗滌分離的細(xì)胞，離心沉淀(2分鐘，800g)。將細(xì)胞重懸于4-5pl的L-15培養(yǎng)基中，保持在冰上待用。移植高度濃縮的細(xì)胞懸液(106個細(xì)胞/微升)面對裝載到預(yù)先填充有礦物油和L-15培養(yǎng)液的傾斜的微量吸管中。微量吸管與安裝在特別適合新生小鼠的立體定向儀的微量注射器相連。通過-4'C處理麻醉3-4日齡CD-1小鼠(CharlesRiver)，直到足底反射消失。在冰冷的鋁板上進(jìn)行手術(shù)，維持麻醉狀態(tài)。采用45。傾角以及相對于前囟點的如下坐標(biāo)對每只小鼠注射50-100nl體積的5乂104個細(xì)胞，所述坐標(biāo)紋狀體(3.3mmA,2.5mmL,2.6mmD);皮層(2.2mmA,3.5mmL,1.2mmD);海馬區(qū)(1.2mmA,1.7mmL,2.0mmD)。為了估計存活情況和遷移距離，將5X103個細(xì)胞植入一個點(2.5mmA，3.0mmL，2.5-1.5mmD)。將移植的小動物放回母體，3天，1、2、3、4周和3個月后分析。按照UCSF實驗室動物研究中心指南處理所有實驗動物。免疫染色用4%多聚甲醛穿心灌注不同日齡的動物。取出腦，在相同溶液后固定過夜，用振動切片機(jī)作冠狀切片(50pm)。用以下抗體對漂浮的腦切片進(jìn)行免疫染色兔抗-GABA(1:2500，西格瑪公司(Sigma))、小鼠抗小清蛋白(1:4000，西格瑪公司)和兔抗鈣視網(wǎng)膜蛋白(1:4000，施旺瑞士抗體公司(SwantSwissAbs))、大鼠抗促生長素抑制素(SOM)(1:500，開米康公司(Chemicon))、兔抗神經(jīng)肽Y(l:5000，免疫星公司(ImmunoStar))和小鼠抗GFP(1:200，Q-生物基因公司(Q-Biogene))。采用以下第二抗體Cy3-偶聯(lián)的驢抗小鼠抗體、Cy3-偶聯(lián)的驢抗兔抗體、Cy2-偶聯(lián)的驢抗小鼠抗體和生物素偶聯(lián)的驢抗小鼠抗體(1:400，均來自賓夕法尼亞州杰克遜免疫研究公司(JacksonImmunoResearch,PA))。用PBS洗滌切片，并用含有10%驢血清和0.1%TritonX-100的PBS在室溫下封閉1小時。然后，用含有10%驢血清和0.1%TritonX-100的PBS稀釋的第一抗體于4。C將切片孵育過夜，接著用PBS洗滌三次，用第二抗體在室溫下避光培育1-2小時。在GABA免疫染色中，從該方案中清除TritonX-100。利用生物素化的第二抗體和ABC試劑盒(Vector)實現(xiàn)與二氨基聯(lián)苯胺(DAB)的過氧化物酶反應(yīng)。細(xì)胞計數(shù)和定量在用DFC480數(shù)碼相機(jī)和IM500/FW4000圖像管理軟件(英國劍橋的萊卡微系統(tǒng)成像解決方案公司(LeicaMicrosystemsImagingSolutions,Cambridge,UK))通過DM6000B顯微鏡(德國維斯萊的萊卡微系統(tǒng)公司)獲得的數(shù)字圖像上確定用免疫組化或GFP染色的細(xì)胞體的數(shù)量。通過對10個冠狀切片(相距300Hm，1個切片在注射位點、4個在注射位點之前、5個在注射位點之后)中所有GFP+細(xì)胞計數(shù)來估計移植細(xì)胞的存活百分?jǐn)?shù)。在坐標(biāo)紙上繪制細(xì)胞數(shù)與離開注射部位距離的圖。將曲線下面積估計為存活細(xì)胞總數(shù)。計算以下各區(qū)域的3個冠狀切片中移植后表達(dá)GABA、PV、CR1、SOM或NPY的移植GFP+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)軀體感覺皮層、紋狀體和海馬區(qū)。在軀體感覺皮層中，用立體定位坐標(biāo)(前囟點水平+0.50和-0.50mm;Paxinos和Franklin,2001)確定各切片相距500[im;紋狀體切片相距400,(前囟點水平+1.60和+0.80mm);海馬區(qū)切片相距300,(前囟點水平—1.50and-2.10mm)。就每只動物的每個標(biāo)記而言，至少分析100個GFP+細(xì)胞(50個在皮層II-IV中，~50個在層V-VI中，用DAPI染色觀察)。在移植后1、3和6個月分析腦(n-5)。用斯氏t檢驗(Student，st-test)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。如下所述定量測定用免疫組化對移植和對側(cè)半球的中間神經(jīng)元標(biāo)記進(jìn)行染色的神經(jīng)元在軀體感覺皮層中，選擇每只小鼠的隔膜(前囪點水平+0.75mm)和背側(cè)海馬(前囪點水平-1.25mm)之間的5個冠狀切片(相距400pm)。分析各切片(各1.2mm"中從白質(zhì)到軟膜表面之間的lmm皮層條帶。在海馬區(qū)中，每只小鼠的3個冠狀切片(相距300nm，在前囪點水平-1.50和-2.10mm之間)中測定門和CA1區(qū)域中陽性中間神經(jīng)元的數(shù)量。在紋狀體中，每只小鼠的3個冠狀切片(相距400pm，在前囪點水平+1.60和+0.80mm之間)中測定陽性細(xì)胞的數(shù)量。對至少5只不同移植小鼠的腦進(jìn)行計數(shù)并求平均值。為了比較移植半球和對側(cè)半球之間的結(jié)果，采用斯氏t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，將對側(cè)半球的結(jié)果標(biāo)定為100%。結(jié)果表示為平均值士SEM。將pO.05視作具有顯著性水平。電生理學(xué)如前所述(Calcagnotto等(2002)JNeurosci22,7596-605)，用MGE細(xì)胞或鹽水(對照)移植2、3和4周后，由雄性和雌性CD-1小鼠制備快速組織切片。用紅外差示干擾對比(IR-DIC)視頻顯微鏡系統(tǒng)和落射熒光顯微鏡(分子設(shè)備公司(MolecularDevices))由視頻鑒定的神經(jīng)元(錐體細(xì)胞和GFP+細(xì)胞)獲得全細(xì)胞記錄值。用于全細(xì)胞電壓鉗記錄以研究抑制性突觸后電流(IPSC)的細(xì)胞內(nèi)膜片鉗吸量管溶液含有(以mM計)120葡糖酸銫、IOHEPES、IIEGTA、UCsCl2、1MgCl2、1.25QX314、2Na2-ATP、0.5Na2-GTP(pH7.25;285-290mOsm);用于研究興奮性突觸后電流(EPSC)的溶液含有(以mM計)135CsCl2、10NaCl、2MgCl2、10HEPES、10EGTA、2Na2ATP、0.2Na2GTP和1.25QX-314,用CsOH調(diào)節(jié)至pH7.2(285-290mOsm)。為了分離GABA能電流，用含有20^M6-氰基-7-二硝基喹噁啉-2,3-二酮(CNQX)和50d-(-)-2-氨基-5-膦酰戊酸(D-APV)的nACSF灌注切片，在保持電位0mV下記錄IPSC;對于興奮性突觸后電流(EPSC)而言，用含有10甲碘荷包牡丹堿(BMI)的nACSF灌注切片，除非另有說明在保持電位-75mV下記錄電流。在含有1^M河豚毒素(TTX)的nACSF中記錄微小抑制性突觸電流(mIPSC)。在相同切片或不同切片中的"日齡匹配"錐體神經(jīng)細(xì)胞(MGE移植衍生的或假手術(shù)的)上記錄IPSC/EPSC。日齡匹配指在三天時間內(nèi)由小鼠獲得的切片。用位于白質(zhì)中的單極電極引發(fā)誘發(fā)電流。用生物胞素充填錐體細(xì)胞并由此進(jìn)行分析。為了用電流鉗研究GFP+細(xì)胞的固有發(fā)放特性，細(xì)胞內(nèi)膜片鉗吸量管溶液含有(以mM計)120甲基葡糖酸鉀(KmeGluconate)、10KC1、1MgCl2、0.025CaCl2、IOHEPES、0.2EGTA、2Mg國ATP、0.2Na-GTP，pH7.2(285國2卯mOsm)。通過直接電流注射(持續(xù)5-1000ms)使細(xì)胞去極化和超極化；細(xì)胞被Alexa紅充填并由此進(jìn)行分析。用埃克森膜片鉗1D放大器(AxopatchIDamplifier)(?？松瓋x器公司(AxonInstruments))記錄電壓和電流，用示波器和PC奔騰計算機(jī)(得克薩斯州圓石的戴爾計算機(jī)公司(DellComputerCompany,RoundRock,TX))運行的pClamp8.2軟件(?？松瓋x器公司)進(jìn)行監(jiān)測。以lkHz低通過濾(-3dB，8-極點貝塞耳函數(shù))全細(xì)胞電壓鉗數(shù)據(jù)，以lOkHz進(jìn)行數(shù)字采樣。在整個記錄過程中仔細(xì)監(jiān)測全細(xì)胞進(jìn)路電阻，如果數(shù)值改變超過25%(或超過20MQ)則排除該細(xì)胞；只有連續(xù)電阻穩(wěn)定<20MQ的記錄才可用于分析(小型分析軟件5.6.28(MiniAnalysis5.6.28software);佐治亞州迪凱特的賽納軟件公司(Synaptosoft，Decatur，GA))。結(jié)果表示為平均值士SEM。為了比較不同細(xì)胞類型的結(jié)果我們使用了顯著性水平為P<0.05的單向ANOVA。結(jié)果植入少年腦中的胚胎MGE細(xì)胞快速長距離分散。為了建立將MGE前體細(xì)胞移植到宿主腦中并進(jìn)行功能評價的有效方法，由表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的轉(zhuǎn)基因E12.5-E13.5小鼠切下MGE(Hadjantonakis等，同上)。用GFP表達(dá)追蹤移植細(xì)胞在活組織或固定組織中的遷移和分化。機(jī)械分離后，將0+MGE細(xì)胞加載到玻璃微量吸量管中，植入新生后第3或4天(P3-P4)小鼠腦的新皮層和背側(cè)紋狀體中(Lois和Alvarez-Buylla(1994)Science264，1145-8)。在移植3天，1、2、3和4周后處死宿主動物。GFP+細(xì)胞的注射位點和遷移后行為的代表性例子參見圖1A和2A。移植(DAT)3天后，許多GFP+細(xì)胞已經(jīng)遷移離開注射位點(圖1B)，進(jìn)入大部分新皮層、紋狀體和海馬區(qū)(圖1A)。這個時間點上移植細(xì)胞的存活率為38.9±7.3%(n=10)。在3DAT,大部分GFP+細(xì)胞具有典型的切線遷移中間神經(jīng)元的形態(tài)，帶有少量細(xì)長體細(xì)胞和分叉引導(dǎo)過程(圖IC)。GFP+細(xì)胞廣泛分布于注射部位的所有方向上。3DAT分析時，移植細(xì)胞覆蓋的線性距離為336±82pm/天(r^20)，最大值為525^mi/天；這種遷移速度大于成年動物的報道值(120(im/天)，并且類似于體外測定值(在基質(zhì)膠上280—天)(Wichterle等(1999)NatNeurosci2,461-6)。將3DAT時細(xì)胞數(shù)與遷移距離作圖產(chǎn)生鐘形曲線(圖1D)。這些數(shù)據(jù)表明，細(xì)胞不會強(qiáng)烈偏向某一具體遷移路線，而是沿注射位點的所有方向分散。移植MGE細(xì)胞在宿主腦中分化。對7DAT的移植腦進(jìn)行分析表明，GFP+MGE細(xì)胞廣泛分布。在7DAT，大部分移植細(xì)胞不再具有遷移形態(tài)，而是具有多種進(jìn)程，一些細(xì)胞形成薄且較長軸突樣進(jìn)程(數(shù)據(jù)未顯示)。這表明移植的MGE衍生的神經(jīng)元前體細(xì)胞在移植后3-7天之間開始分化。14和21DAT，細(xì)胞進(jìn)行性獲得更成熟的形態(tài)，顯示出具有較長軸突的較大和較精細(xì)的樹枝狀結(jié)構(gòu)。在30DAT，一些GFP+細(xì)胞距離注射位點5mm以上，其分布情況類似于3DAT(圖1C和2A)。然而，存活百分?jǐn)?shù)降低至19.9±3.9%(n=10)。在90DAT觀察到相似的存活率，即21.2±4.1%(n=10)。按照能提供高爾基樣染色的GFP免疫組化研究移植細(xì)胞的形態(tài)。移植2個月后，GFP+細(xì)胞具有精細(xì)的樹枝狀結(jié)構(gòu)，廣泛延伸通過皮層(圖2)。也可觀察軸突及其突觸前末端(圖2B-C)。因此，移植細(xì)胞似乎能在移植后一個月內(nèi)完全分化成功能上完整的中間神經(jīng)元。皮層中的MGE衍生細(xì)胞分化成具有至少五種不同中間神經(jīng)元亞型的形態(tài)的神經(jīng)元，例如雙叢毛細(xì)胞或雙極細(xì)胞、枝形細(xì)胞、籃細(xì)胞、含有小體的神經(jīng)元和多極細(xì)胞(圖2)。例如，一些神經(jīng)元顯示出類似于燭臺陣列的突觸終扣，提示它們分化成枝形細(xì)胞(圖2B、E、F、H、I、J)。相反，紋狀體中的移植細(xì)胞主要分化成中等無刺中間神經(jīng)元(圖2K)，而海馬區(qū)中的移植細(xì)胞分化成具有該區(qū)域典型形態(tài)的中間神經(jīng)元(籃細(xì)胞、軸一軸突觸細(xì)胞和雙層細(xì)胞(bistratifiedcell))(圖2D和G)。MGE衍生的神經(jīng)元都不具有皮層錐體神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)特征，例如延伸出粗壯的刺狀尖端樹突的三角體細(xì)胞。在注射位點周圍，特別是胼胝體附近總是存在一些不成熟的少突細(xì)胞，偶爾在皮層中也發(fā)現(xiàn)一些，它們成輻射狀分布(數(shù)據(jù)未顯示)。沒有觀察到具有星形細(xì)胞形態(tài)的GFP+細(xì)胞。因此，我們移植的MGE細(xì)胞主要是中間神經(jīng)元譜系。MGE衍生細(xì)胞具有皮層中間神經(jīng)元的分子特性。近期研究表明，MGE祖細(xì)胞是皮層GABA能中間神經(jīng)元的主要來源(Lavdas等，(1999)JNeurosci19，7881-8;Sussel等，(1999)Development126,3359-70;Anderson等，(2001)Development128,353-63;Wichterle等，(200)Development128,3759-71)。根據(jù)神經(jīng)化學(xué)標(biāo)記物，可將中間神經(jīng)元分為幾種亞型，這些化學(xué)標(biāo)記物包括例如Ca^-結(jié)合蛋白(小清蛋白(PV)、鈣結(jié)合蛋白(CB)和鈣視網(wǎng)膜蛋白(CR))、神經(jīng)肽(如促生長素抑制素(SOM)、神經(jīng)肽Y(NPY)、膽囊收縮素(CCK)l和血管活性腸多肽(VIP))(DeFelipe，(1993)CerebCortex3，273-89;Kubota等，(1994)BrainRes649，159-73;DeFelipe，(1997)JChemNeuroanat14，1-19;Gonchar和Burkhalter，(1997)CerebCortex7，347-58;DeFelipe,(2002)ProgBrainRes136，215-38)，并記錄其生理學(xué)特性(Freund和Buzsaki，(1996)Hippocampus6，347-470;Cauli等，(1997)JNeurosci17，3894-906;Gupta等，(2000)Science287，273-8;Klausberger等，(2003)Nature421，844-8)。為了評價移植的MGE-GFP細(xì)胞的中間神經(jīng)元表型和分子特征，我們在60DAT進(jìn)行了一系列免疫組化研究。雙染免疫熒光揭示出約65-70%的皮層GFP+移植物衍生細(xì)胞表達(dá)GABA(圖3;表1);用GAD67抗體雙染得到相當(dāng)水平的GFP+細(xì)胞(70。/。；數(shù)據(jù)未顯示)。GFP+神經(jīng)元亞組表達(dá)NPY、SOM、PV和CR(圖3;表1)，其表達(dá)水平和分布類似于宿主中間神經(jīng)元。令人感興趣的是，在皮層的i-n層富集表達(dá)SOM的神經(jīng)元，而CR陽性細(xì)胞幾乎只存在于后壓部皮層和扣帶皮層中。這表明局部環(huán)境會導(dǎo)致一些中間神經(jīng)元亞型的特異性。MGE衍生細(xì)胞也是紋狀體和海馬區(qū)中這些神經(jīng)遞質(zhì)和標(biāo)記物的免疫陽性細(xì)胞(圖4，表1)。它們分布在通常含有這些類型的中間神經(jīng)元的相同區(qū)域中。GFP+細(xì)胞是膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP)或膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的抗體的免疫陰性細(xì)胞，這表明移植細(xì)胞不會分化成星形細(xì)胞或膽堿能神經(jīng)元。MGE衍生細(xì)胞具有中間神經(jīng)元發(fā)放特性。為了評估MGE衍生細(xì)胞是否具有皮層中間神經(jīng)元的電生理特性，在移植4周后耙向GFP+細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞電壓鉗記錄。Alexa紅由膜片鉗吸移管擴(kuò)散，從而實時確認(rèn)細(xì)胞記錄位點(圖5A)。如果MGE細(xì)胞成熟為中間神經(jīng)元表型，那么它們的峰頻率適應(yīng)性應(yīng)該很低，這是GABA能中間神經(jīng)元的典型電學(xué)特征。在皮層V中采樣的15個GFP+細(xì)胞的電流鉗記錄中，經(jīng)測定靜息膜電位(RMP)的平均值為-70.9±0.9mV，輸入電阻(RIN)為101.4±4.1MQ。在14個GFP+細(xì)胞中，去極化電流脈沖誘發(fā)動作電位(持續(xù)3.0±0.4ms;振幅69.0±3.3mV)，超極化電流脈沖誘發(fā)較低程度的"下降"電流(圖5B)。這些固有的膜特性屬于"成熟的"非適應(yīng)性皮層中間神經(jīng)元的預(yù)計范圍內(nèi)(Markram等(2004)NatRevNeurosci5，793-807)。最重要的是，長時程去極化脈沖(1000ms)明顯揭示出籃細(xì)胞皮層中間神經(jīng)元特征性的快速達(dá)峰、適應(yīng)性極低的發(fā)放活性。在步進(jìn)式去極化過程中一個細(xì)胞不具有主動發(fā)放特性，但具有-70mV的RMP和100MQ的R1N。圖5B顯示了采集的GFP+細(xì)胞中常見的高發(fā)放頻率；頻率-電流關(guān)系為線性，如前所述的快速達(dá)峰海馬區(qū)中間神經(jīng)元那樣(Smith等(1995)JNeurophysiol.74，650-72)。移植的MGE細(xì)胞影響宿主動物的突觸功能。為了測定移植的MGE前體細(xì)胞是否功能性整合到宿主腦中，進(jìn)行了一系列體外電生理研究。在落射熒光下鑒定含有GFP+細(xì)胞的新皮層區(qū)域(圖6)，選擇GFP+細(xì)胞圍繞區(qū)域中的錐體神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗記錄。用螢光黃充填記錄的細(xì)胞，以便由此確認(rèn)細(xì)胞的位置和身份(圖6A)。在移植后的不同時間點(2、3和4周)制備腦切片。錐體神經(jīng)元的自發(fā)性IPSC(圖7A)反映出動作電位依賴性小泡遞質(zhì)釋放后突觸后GABA受體的激活；IPSC被10BMI(—種GABA受體拮抗劑)完全消除(數(shù)據(jù)未顯示)。如果大量移植的MGE細(xì)胞整合到宿主的微循環(huán)中成為新GABA能中間神經(jīng)元，我們預(yù)計GABA誘發(fā)的突觸事件總體水平會提高到天然錐體神經(jīng)元水平。與對側(cè)半球相比，在注射位點同側(cè)皮層半球中觀察到表達(dá)GABA、PV和SOM的神經(jīng)元遞增(表2)。在移植物周圍100nm區(qū)域內(nèi)這種增加是顯著的。與這些解剖學(xué)觀察結(jié)果相一致，手術(shù)4周后移植動物切片的IPSC幅度和頻率顯著增加。由假手術(shù)小鼠或移植小鼠的對側(cè)皮層(缺少GFP+細(xì)胞)獲得對照皮層切片(圖7B-C)。移植4周后，移植動物的海馬區(qū)中IPSC頻率和振幅也提高(圖8)。與產(chǎn)生GABA的神經(jīng)元的數(shù)量增加相一致，與對照(皮層1.3士0.2Hz，n=4;CAl:l.l土O.lHz，n-3)相比，移植4周后新皮層和海馬區(qū)錐體細(xì)胞中的mIPSC頻率也提高(皮層2.3±0.1Hz，n=4;CA1:2.4±0.2Hz'n=3;p<0.05)。在移植2或3周后，沒有觀察到GABA能移植作用顯著提高，這并不出乎意料，因為在這些時間進(jìn)行的組織學(xué)分析己顯示出移植細(xì)胞的不成熟表型。在任何時間點上都沒有觀察到IPSC上升時間或下降時間常數(shù)的顯著改變(圖7B)，這表明在移植動物中突觸后GABA亞基受體表達(dá)總體上沒有改變。為了評價移植動物中抑制作用的總體水平，我們進(jìn)行了兩個額外的分析。第一，總電荷轉(zhuǎn)移的測定值(對應(yīng)于特定時間區(qū)間IPSC電流下總面積)表明，與日齡匹配對照相比含有GFP+細(xì)胞的切片中突觸抑制顯著提高(圖7C-D)。第二，與GABA能作用的提高相一致，描繪為累積分布的sIPSC頻率顯著提高(圖7E)。為了檢測移植的MGE細(xì)胞是否與現(xiàn)有中間神經(jīng)元形成突觸，從而調(diào)節(jié)皮層興奮(通過抑制中間神經(jīng)元功能)，分析EPSC。由含有GFP+細(xì)胞的區(qū)域內(nèi)錐體神經(jīng)元記錄EPSC(保持電位為-75mV)，通過施加CNQX和APV消除自發(fā)性EPSC，確認(rèn)突觸后谷氨酸受體的作用。在比較MGE移植動物(n-4)和對照(n=4)的錐體細(xì)胞上記錄的自發(fā)性EPSC的過程中，沒有觀察到振幅、下降時間常數(shù)、上升時間或頻率發(fā)生改變(圖9A)。這些發(fā)現(xiàn)表明，植入MGE前體細(xì)胞后不會改變宿主腦中的總體興奮作用。為了了解移植神經(jīng)元是否接受來自宿主軸突的興奮性突觸接觸，我們接著檢測了GFP+神經(jīng)元中引發(fā)和自發(fā)性的EPSC。GFP+細(xì)胞的自發(fā)性EPSC被CNQX和APV阻斷(『4)(圖9B)，引發(fā)性EPSC的逆轉(zhuǎn)電位接近0mV(圖9C)。EPSC的動力學(xué)類似于"正常"谷氨酸介導(dǎo)的突觸電流的預(yù)計情況。這些結(jié)果證實了移植的MGE-GFP神經(jīng)元的內(nèi)源性興奮性興奮?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，MGE衍生的GFP+細(xì)胞能用作抑制性中間神經(jīng)元，它們由局部錐體神經(jīng)元接受興奮性輸入并整合到宿主腦的皮層突觸環(huán)路中，以便選擇性調(diào)節(jié)抑制作用。該實施例證明，移植到早期出生后腦中的MGE衍生的神經(jīng)元前體細(xì)胞能夠跨越新皮層和少年腦的其他區(qū)域長距離分散。然后，這些細(xì)胞獲得成熟GABA能中間神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)、分子學(xué)和生理學(xué)特征。最后，這些移植的MGE衍生細(xì)胞功能性整合并顯著影響宿主腦中的突觸抑制作用。因此，本實施例證明，MGE前體細(xì)胞可用于調(diào)節(jié)出生后腦中的突觸環(huán)路。顯示了植入新生腦時這些細(xì)胞分散的能力，移植后2個月這些細(xì)胞所能達(dá)到的最大遷移距離為5mm。同樣，一次注射MGE前體細(xì)胞可影響宿主腦中相當(dāng)寬泛的區(qū)域，這是考慮移植細(xì)胞的潛在臨床用途的重要因素。本結(jié)果證明，超過65n/。的MGE衍生細(xì)胞表達(dá)GABA。移植細(xì)胞也含有SOM和NPY，它們是通常共同定位于成熟皮層中間神經(jīng)元亞型中的神經(jīng)肽(DeFelipe，(1993)同上；Kubota等，同上；DeFelipe，(1997)同上；Gonchar和Burkhalter，同上)。我們沒有檢測由移植的MGE細(xì)胞衍生的錐體樣神經(jīng)元或星形細(xì)胞。重要的是，在我們的MGE移植小鼠中從未觀察到腫瘤，但這是使用ES衍生的祖細(xì)胞進(jìn)行移植時的常見問題(Wernig等，同上；Ruschenschmidt等，同上)。在V層采樣的MGE衍生細(xì)胞具有成熟的含GABA中間神經(jīng)元的典型"電指紋"。例如，MGE-GFP細(xì)胞一致地高頻發(fā)放動作電位，并且具有非常低的適應(yīng)性。這些發(fā)放特性與分類為非適應(yīng)性籃細(xì)胞中間神經(jīng)元相一致，進(jìn)一步用電流鉗在移植皮層的其它層中對GFP+細(xì)胞采樣將有可能揭示其它中間神經(jīng)元亞型。在功能性整合的上述分析中，單細(xì)胞記錄只想證明移植細(xì)胞接受突觸輸入。在本文中，我們還證明移植的MGE衍生細(xì)胞接受興奮性突觸輸入(見圖6)。而且，我們提出了移植的祖細(xì)胞發(fā)出抑制性輸出的證據(jù)，從而影響(以功能相關(guān)方式)現(xiàn)有的錐體神經(jīng)元。顯然，我們發(fā)現(xiàn)含有MGE衍生細(xì)胞的區(qū)域中錐體細(xì)胞的GABA介導(dǎo)的突觸事件數(shù)量增加，并且在宿主腦的這些區(qū)域內(nèi)GABA能作用顯著增強(qiáng)。因為MGE衍生細(xì)胞不會改變興奮性皮層環(huán)路或分化成具有錐體細(xì)胞表型的神經(jīng)元，所以這些發(fā)現(xiàn)表明一種選擇性增強(qiáng)抑制系統(tǒng)的方法。我們證明，神經(jīng)發(fā)育的胚胎階段完成后，即使在內(nèi)源性GABA能神經(jīng)元的存在下，腦部廣泛區(qū)域內(nèi)移植的祖細(xì)胞仍能產(chǎn)生功能性整合的GABA能神經(jīng)元。這表明MGE衍生細(xì)胞可用于提高抑制水平產(chǎn)生有益效果的神經(jīng)疾病，例如癲癇癥或精神分裂癥。也可利用MGE前體細(xì)胞來校正傳入神經(jīng)阻滯的腦部區(qū)域，如帕金森病中的活性水平，或者與其抑制功能聯(lián)合用作將治療分子遞送給腦部廣泛區(qū)域的細(xì)胞載體。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>在軀體感覺皮層中進(jìn)行定量，只是a)軀體感覺皮層的I一in層，b)軀體感覺皮層的IV—VI層，和c)后壓部皮層，DG;齒狀回表2<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>將對側(cè)結(jié)果標(biāo)定為100%。l)注射位點周圍10(Him的細(xì)胞增量估計值。用注射位點前后50pm的2個切片進(jìn)行定量。2)注射位點周圍1200Mm的細(xì)胞增量估計值。用注射位點前3個切片加上后3個切片進(jìn)行定量。用T斯氏檢驗估計顯著性(p)，N=10。實施例2:在含有MGE祖細(xì)胞的切片中較難以引起強(qiáng)烈的癲癇樣爆發(fā)嘗試在接受MGE祖細(xì)胞移植物的皮層切片和未接受MGE祖細(xì)胞的對照皮層切片中引發(fā)癲癇樣爆發(fā)。已確定，在含有MGE祖細(xì)胞的切片中較難引起強(qiáng)烈的癲癇樣爆發(fā)。這一發(fā)現(xiàn)支持以下結(jié)論在宿主腦中MGE祖細(xì)胞遷移和分化成功能性中間神經(jīng)元(從而提高突觸抑制水平)。由帶有MGE移植物的野生型小鼠和日齡匹配的對照制備新皮層切片。以步進(jìn)的方式逐步提高胞外鉀水平，從3到6到9mM[K+]e，從而引起新皮層切片中的自發(fā)性發(fā)作。以前我們實驗室的研究(Baraban和Schwartzkroin，EpilepsyRes.1995年10月；22(2):145-56)和其它研究(Rutecki等，JNeurophysiol.1985年11月;54(5):1363-74;Traynelis禾口Dingledine，JNeurophysiol.1988年1月；59(1):259-76)證明，這是誘導(dǎo)自發(fā)性發(fā)作和體外測試抗驚厥藥的有效方式。"高K"模型能可靠地弓l發(fā)發(fā)作間持續(xù)癲癇狀態(tài)(status-likeinterictal-likeepileptiformactivity),經(jīng)設(shè)計能模擬臨床發(fā)作期間觀察到的高[K+]e。利用安置在外(IV/V層)和內(nèi)(II層)新皮層中的場記錄電極監(jiān)測癲癇樣活動。使用癲癇樣爆發(fā)放電振幅(以mV計)、持續(xù)時間(以毫秒計)和頻率(以Hz計)來定量比較實驗動物和對照動物之間的爆發(fā)。在不同[K+]e中比較發(fā)作間"爆發(fā)強(qiáng)度"的第二種方法包括使用海岸線爆發(fā)指數(shù)(CBI)(Kom等，JNeurophysiol.1987年1月；57(1):325-40)。CBI能響應(yīng)爆發(fā)數(shù)量或振幅的改變，它在神經(jīng)元同步、發(fā)放頻率或持續(xù)時間改變時增加，因此，可以認(rèn)為它是整合MGE祖細(xì)胞能否影響發(fā)作的靈敏的衡量指標(biāo)。用零MgZ+急性發(fā)作模型進(jìn)行另外一系列相同實驗。去除胞外浴培養(yǎng)基中的Mg^能消除鎂對NMDA型谷氨酸受體的阻斷作用，并引起過量突觸興奮驅(qū)動的癲癇樣活動(Mody等，JNeurophysiol.1987年3月；57(3):869-88)。將移植小鼠切片與日齡匹配對照切片中引發(fā)的癲癇樣活動作比較。如上所述進(jìn)行分析。將切片進(jìn)行后固定，用GFP抗體進(jìn)行免疫染色，以便評估移植的MGE-GFP+細(xì)胞數(shù)。利用這兩種不同的作用機(jī)制，我們能夠可靠地確定移植祖細(xì)胞在體外具有抗驚厥活性。結(jié)果已確定，在含有MGE祖細(xì)胞的切片中較難引起強(qiáng)烈的癲癇樣爆發(fā)活動。這一發(fā)現(xiàn)支持以下結(jié)論在宿主腦中MGE祖細(xì)胞遷移和分化成功能性中間神經(jīng)元(從而提高突觸抑制水平)。爆發(fā)振幅、持續(xù)時間或頻率的降低或者CBI指數(shù)改變提供定量證據(jù)證明，整合的MGE祖細(xì)胞通過提高抑制水平降低癲癇興奮過度。實施例3:在接受MGE祖細(xì)胞的小鼠中更難以激發(fā)發(fā)作。在野生型小鼠(和假手術(shù)對照；青年P(guān)30和成年P(guān)60日齡)中雙側(cè)植入MGE后，將EEG電極植入雙側(cè)新皮層，用視頻EEG監(jiān)測動物。手術(shù)后恢復(fù)1周之后，用紅藻氨酸(KA，谷氨酸受體激動劑)注射動物，其濃度是如前所述能引發(fā)小鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)的濃度，如腹膜內(nèi)注射30-40mg/kg(Baraban等，BrainResDevBrainRes.1997年9月20日；102(2):189-96;Baraban等，JNeurosci,1997年12月1日；17(23):8927-36)。在引發(fā)KA誘導(dǎo)的發(fā)作后分析視頻-EEG描記圖時，定量測定電圖發(fā)作事件的頻率和持續(xù)時間。用不知道動物狀態(tài)的研究人員密切觀測視頻-EEG記錄，從而充分鑒定伴隨這些放電的行為。實驗室中有大量臨床EEG經(jīng)驗的臨床醫(yī)生-科學(xué)家輔助分析該數(shù)據(jù)。用戊四唑(GABA拮抗劑，15-20mg/kg腹膜內(nèi))進(jìn)行第二組相同實驗。與切片電生理研究相似，利用兩種不同的發(fā)作誘導(dǎo)方式充分評價MGE祖細(xì)胞降低/抑制發(fā)作的能力。在所有動物中，在視頻-EEG實驗結(jié)束時進(jìn)行安樂死和穿心灌注?？焖偃〕瞿X，用多聚甲醛固定，用于隨后確認(rèn)EEG電極定位。此外，對腦進(jìn)行切片和染色，以分析GFP+中間神經(jīng)元。這些解剖學(xué)研究使我們能夠?qū)⒄螱FP祖細(xì)胞數(shù)與抗癲癇活性關(guān)聯(lián)起來。結(jié)果在接受MGE祖細(xì)胞的小鼠中較難引起發(fā)作。電圖發(fā)作事件(如果觀察到)在移植動物中很短暫，且很少或沒有觀察到痙攣行為的跡象。含有大量整合MGE祖細(xì)胞的動物對發(fā)生急性發(fā)作的抵抗力最高。實施例4:MGE祖細(xì)胞能降低自發(fā)性癲癇癥小鼠模型中的發(fā)作。利用移植的MGE祖細(xì)胞提高突觸抑制，以便明顯降低宿主動物的發(fā)作易感性。用野生型對照小鼠(移植后)和具有已知皮層中間神經(jīng)元缺陷的小鼠突變體的新皮層組織切片進(jìn)行研究。利用三種突觸抑制明顯降低和興奮過度的突變體具體是DIxl;、GAD65'、和uPAR;。DIxl小鼠顯示全身電圖發(fā)作和發(fā)作誘導(dǎo)的改組的組織學(xué)證據(jù)，從而顯示出與中間神經(jīng)元損失相關(guān)性人癲癇癥相當(dāng)?shù)谋硇?。GAD65突變體似乎含有正常數(shù)量的GABA能皮層中間神經(jīng)元，但合成GABA的能力降低(Kash等，ProcNatlAcadSciUSA.1997年12月9日；94(25):l楊0-5)。uPAR突變體的頂葉皮層中GABA能中間神經(jīng)元密度似乎降低(Powell等，JNeurosci.2003年1月15日；23(2):622-31)。(i)GAD65-A和uPAR-A小鼠曾報道，具有異常皮層中間神經(jīng)元的突變體(GAD65KO)和皮層中間神經(jīng)元數(shù)量減少的突變體(uPARKO)中發(fā)生過度興奮狀態(tài)。首先，破壞小鼠的GAD65基因?qū)е螺o因子誘導(dǎo)的GAD酶活性降低50%(Kash等，同上)。C57BI/6背景的GAD65-缺陷型小鼠易于發(fā)生不頻繁的自發(fā)性發(fā)作和應(yīng)激誘導(dǎo)性發(fā)作。其次，使小鼠的脲激酶血纖維蛋白溶酶原激活物受體(uPAR)基因失活導(dǎo)致皮層GABA能中間神經(jīng)元減少50-65。/。(Powell等，同上)。uPARKO小鼠(以C57BI/6背景飼養(yǎng))可以活下來，存活至成年，顯示出明顯的強(qiáng)直陣攣發(fā)作或?qū)TZ誘導(dǎo)的運動痙攣的易感性提高。使用兩種突變小鼠品系。因為背景品系可以是發(fā)作易感性的重要調(diào)節(jié)物(Schauwecker和Steward,ProcNatlAcadSciUSA.1997年4月15日；94(8):4103-8;Schauwecker，ProgBrainRes.2002;135:139-48)，我們仔細(xì)研究只由一種背景品系(如發(fā)作抗性相對較高的C57BI/6)繁育的突變型和野生型小鼠。在GAD65一和uPAR一小鼠，以及假手術(shù)、品系和日齡匹配的對照中雙側(cè)植入MGE后，將EEG電極雙側(cè)植入新皮層，用視頻-EEG監(jiān)測。手術(shù)后恢復(fù)1周之后，在每天6小時的記錄過程中監(jiān)測動物(共監(jiān)測2周)。在視頻-EEG描記圖分析中，定量測定記錄的電圖發(fā)作的頻率和持續(xù)時間。用不知道動物狀態(tài)的研究人員密切觀測視頻-EEG記錄，從而充分鑒定伴隨這些放電的行為，實驗室的臨床醫(yī)生-科學(xué)家輔助這些研究。發(fā)作間峰的頻率和振幅可能在睡眠-清醒周期中變化(MartinsdaSilva等，ElectroencephalogrClinNeurophysiol.1984年7月；58(1):1-13)。同樣，總是在非REM睡眠期間分析發(fā)作間峰。因為突變小鼠可能具有自發(fā)性發(fā)作(由頻繁的異常低波和伴隨有痙攣行為的發(fā)作間放電組成)，所以不必用紅藻氨酸或PTZ誘導(dǎo)發(fā)作。我們處死這些動物并測定新皮層中新的GABA能GFP+中間神經(jīng)元的數(shù)量。我們將GFP+細(xì)胞數(shù)與發(fā)作嚴(yán)重性(通過分析行為和EEG確定)關(guān)聯(lián)起來。用GAD、NPY、小清蛋白、促生長素抑制素和鈣結(jié)合蛋白的抗體進(jìn)行詳細(xì)的免疫細(xì)胞化學(xué)研究。也進(jìn)行有限數(shù)量的切片電生理研究，以分析未處理動物和移植動物中的sIPSC。結(jié)果通過將MGE祖細(xì)胞植入uPARKO小鼠，減輕了在uPARKO小鼠中觀察到的功能性GABA能中間神經(jīng)元減少導(dǎo)致的自發(fā)性癲癇癥表型。在接受MGE移植物的uPARKO小鼠中發(fā)作間峰和行為學(xué)發(fā)作減少(或被消除)。在GAD65突變小鼠中觀察到相似結(jié)果。(H)DIx-A小鼠以類似于實施例1的方式將MGE細(xì)胞植入DIxl-A小鼠腦中，DIxW-小鼠是一種鼠癲癇模型。有關(guān)DIxW-小鼠的詳情參見Cobos等，NatureNeuroscience,8:1059-1068,2005，特別全文納入本文作參考。DIxl小鼠顯示全身發(fā)作電記錄和發(fā)作誘導(dǎo)的改組的組織學(xué)證據(jù)，從而顯示出與中間神經(jīng)元損失相關(guān)性人癲癇癥相當(dāng)?shù)谋硇汀Ｍㄟ^測定處理后發(fā)作樣行為減輕且缺少EEG樣發(fā)作說明，植入MGE祖細(xì)胞的DIxl突變小鼠的癲癇表型似乎減輕。由發(fā)育早期(P0-P2)植入MGE祖細(xì)胞的DIx突變小鼠制備的大腦皮層切片的抑制水平(用含MGE-GFP中間神經(jīng)元區(qū)域中突觸后錐體細(xì)胞靶點上的自發(fā)性和小型ipsc測定)與對照DIx雜合小鼠的觀察值相當(dāng)。具體說，DIx突變體的IPSC頻率和振幅通常會降低，通過MGE移植會"拯救"這些值。參見圖10。在整體動物水平，DIx突變體通常顯示出處理誘導(dǎo)的發(fā)作和自發(fā)性發(fā)作。植入MGE細(xì)胞的DIx突變體不顯示處理誘導(dǎo)的發(fā)作，視頻-EEG記錄驗證其缺少發(fā)作表型。這證明MGE細(xì)胞可成功植入患病腦中，并且證明移植后癲癇癥狀減輕或消除。實施例5:嚙齒動物發(fā)作模型中mge前體細(xì)胞能提高發(fā)作潛伏期并且降低死亡率利用常用的嚙齒動物發(fā)作模型(如匹魯卡品)研究MGE衍生的中間神經(jīng)元的治療潛能。用上述方法將e13.5GFP表達(dá)小鼠的MGE細(xì)胞植入出生后(p4)腦中。使其發(fā)生遷移和整合后，給予單劑量的東茛菪堿，然后給予匹魯卡品(300mg/kg)，以誘導(dǎo)急性發(fā)作。比較假移植的小鼠、MGE細(xì)胞移植的接受者和用常規(guī)AED(抗癲癇藥)苯巴比妥(PB)預(yù)處理的小鼠中的死亡率和發(fā)作潛伏期。由不知道動物狀態(tài)的研究者根據(jù)拉辛標(biāo)準(zhǔn)(Racinescale)對發(fā)作行為評分。觀察到與假移植的同窩出生的動物相比，移植小鼠和PB預(yù)處理小鼠的發(fā)作潛伏期較長且死亡率較低。在移植小鼠中，發(fā)作保護(hù)與新產(chǎn)生的MGE-GFP細(xì)胞數(shù)有關(guān)。然后如本文所述進(jìn)行免疫組化和電生理研究，以驗證移植小鼠中觀察到的治療益處是否是由MGE衍生的中間神經(jīng)元的抑制活性引起的。免疫組化研究揭示出，不出所料，新皮層和海馬區(qū)中MGE衍生的移植細(xì)胞大部分是神經(jīng)元(NeuN+)和GABA能細(xì)胞。突觸前GFP+細(xì)胞和突觸后錐體細(xì)胞的全細(xì)胞電生理記錄證實，移植細(xì)胞能夠功能性整合和提高突觸抑制水平，以及接受內(nèi)源性錐體細(xì)胞的興奮性輸入。這些結(jié)果表明，MGE衍生的前體細(xì)胞能夠遠(yuǎn)距離遷移并功能性整合到現(xiàn)有皮層環(huán)路中，從而減輕誘導(dǎo)發(fā)作在移植小鼠中的有害作用。這些體內(nèi)數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明，MGE衍生的前體細(xì)胞在發(fā)作疾病和其它抑制疾病，包括癲癇癥和本文所述的其它疾病中具有治療價值。特別將所有引用的參考文獻(xiàn)全文納入本文作參考。權(quán)利要求1.一種提高哺乳動物的抑制性中間神經(jīng)元活性的方法，所述方法包括將MGE細(xì)胞移植入所述哺乳動物的腦中。2.如權(quán)利要求l所述的方法，所述方法用于恢復(fù)腦中的抑制性中間神經(jīng)元功能。3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，所述方法包括在腦中從頭產(chǎn)生抑制性中間神經(jīng)元。4.一種將功能抑制性中間神經(jīng)元遞送至哺乳動物腦中第一部分的方法，所述方法包括將MGE細(xì)胞移植入所述腦中遠(yuǎn)離所述第一部分的第二部分中。5.—種產(chǎn)生抑制性中間神經(jīng)元的方法，所述方法包括獲取MGE細(xì)胞并處理該細(xì)胞以產(chǎn)生抑制性中間神經(jīng)元。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述處理包括將所述MGE細(xì)胞移植入哺乳動物腦中。7.如權(quán)利要求l-6中任一項所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物選自下組小鼠、大鼠、人、牲畜和家畜。8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于，所述MGE細(xì)胞獲自胎兒或胚胎的腦。9.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于，所述MGE細(xì)胞是通過神經(jīng)干細(xì)胞分化獲得的。10.如權(quán)利要求l-9中任一項所述的方法，其特征在于，將所述MGE細(xì)胞移植入選自下組的腦部區(qū)域內(nèi)大腦皮層、海馬區(qū)、底丘腦核、小腦、脊髓、紋狀體(基底神經(jīng)節(jié))和下丘腦。11.如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，將所述MGE細(xì)胞移植入無損傷的腦部區(qū)域內(nèi)。12.如權(quán)利要求1-11中任一項所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物是抑制性中間神經(jīng)元活性降低的患者。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述患者是人。14.如權(quán)利要求1-13中任一項所述的方法，其特征在于，所述移植包括將分離的MGE細(xì)胞注射到腦中。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述MGE細(xì)胞與載體一起注射。16.如權(quán)利要求1-15中任一項所述的方法，所述方法用于治療患有特征是抑制性中間神經(jīng)元活性不足的疾病的患者。17.如權(quán)利要求1-15中任一項所述的方法，所述方法用于治療患有特征是興奮性神經(jīng)元活性提高的疾病的患者。18.如權(quán)利要求l-16中任一項所述的方法，所述方法用于治療患有癲癇癥、亨廷頓病、精神分裂癥或神經(jīng)性疼痛的患者。19.一種組合物，其包含適合移植入人腦的載體中的分離的人MGE細(xì)胞。20.如權(quán)利要求19所述的組合物，其特征在于，所述載體包括組織培養(yǎng)基o21.如權(quán)利要求19或20所述的組合物，其特征在于，所述MGE細(xì)胞的濃度為5000-2xl(^個細(xì)胞/微升。22.MGE細(xì)胞在制備提高哺乳動物抑制性中間神經(jīng)元活性的組合物中的應(yīng)用。23.如權(quán)利要求22所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用用于恢復(fù)抑制性中間神經(jīng)元功能。24.如權(quán)利要求22或23所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用用于治療特征是抑制性中間神經(jīng)元活性不足的疾病。25.如權(quán)利要求22-24中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用用于從頭產(chǎn)生功能性抑制性中間神經(jīng)元。26.如權(quán)利要求22-25中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述哺乳動物是人。全文摘要通過將MGE細(xì)胞植入腦中，在體內(nèi)恢復(fù)或提高抑制性中間神經(jīng)元功能。本發(fā)明提供了含有MGE細(xì)胞的組合物，用于治療特征是抑制性中間神經(jīng)元功能異常的各種疾病或提高抑制水平可改善異常激活的神經(jīng)環(huán)路的情況。文檔編號A61F2/06GK101389290SQ200780006654公開日2009年3月18日申請日期2007年1月18日優(yōu)先權(quán)日2006年1月20日發(fā)明者A·阿爾瓦雷茲-布伊拉,J·L·魯賓斯坦,S·C·巴拉班申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會