專利名稱：Hiv患者中屏障完整性的提高的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及一種提高HIV患者中腸內(nèi)屏障完整性的方法和適合應(yīng)用于該方法的組合物。
背景技術(shù)：
腸胃上皮細胞功能通常起到選擇性屏障的作用，允許養(yǎng)分、電解液和水的吸收并且阻止包括食品過敏源在內(nèi)的膳食和微生物抗原的暴露。腸胃上皮細胞限定了通往體循環(huán)的抗原通道，其可能引起炎癥反應(yīng)，例如，過敏反應(yīng)。由于過敏特別是食品過敏發(fā)病率的增加，許多研究小組尋找這些疾病的(預(yù)防)治療方法。
EP1272058公開了一種含有不消化的低聚糖的組合物，其中低聚糖用于提高緊密連接以降低腸內(nèi)滲透性并減少過敏反應(yīng)。該組合物可以包括LC-PUFA`s(長鏈多不飽和脂肪酸)。
EP745001公開了一種用于治療潰瘍性結(jié)腸炎的不消化低聚糖n-3和n-6脂肪酸的組合物。
Usami et al(臨床營養(yǎng)學(xué)2001，20(4)351-359)公開了二十碳五烯酸(EPA)對腸內(nèi)單層細胞中緊密連接滲透性的影響。其中發(fā)現(xiàn)EPA提高了滲透性，這表明EPA不適于提高腸內(nèi)的屏障完整性。
現(xiàn)有技術(shù)沒有理想的適于提高屏障完整性的配方。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種特選長鏈不飽和脂肪酸(LC-PUFA`s)和特選低聚糖的并用藥物(combination)。LC-PUFA`s和低聚糖的這種并用藥物通過協(xié)同地提高腸內(nèi)滲透性、粘液生成、并減少可能損害腸內(nèi)屏障完整性的發(fā)炎介質(zhì)的粘膜生成來有效地提高屏障完整性。營養(yǎng)或藥物配方中的這些化合物的組合特別適合于提高HIV和AIDS患者的腸內(nèi)完整性。
令人驚奇的是，特選LC-PUFA`s有效地減少了上皮細胞側(cè)(paracellular)的滲透性。與Usami et al(臨床營養(yǎng)學(xué)2001，20(4)351-359)中報道的形成對比的是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)C18和C20多不飽和脂肪酸，特別是二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)和花生四烯酸(ARA)，能夠有效地減少腸內(nèi)緊密連接的滲透性。
除了LC-PUFA`s之外，本發(fā)明組合物包含低聚糖。該特選低聚糖通過刺激粘液的產(chǎn)生來提高屏障完整性，這導(dǎo)致粘液層厚度增加。應(yīng)當(dāng)相信，這種影響是由截然不同的低聚糖對短鏈脂肪酸(SCFA)的產(chǎn)生所造成的影響引起的。因此，當(dāng)對哺乳動物腸內(nèi)用藥時，LC-PUFA和不消化低聚糖的化合物通過同時降低緊密連接滲透性和刺激粘液生成來協(xié)同地提高屏障完整性和/或協(xié)同地減少腸內(nèi)滲透性。
進一步的方面，該組合物提高了腸內(nèi)粘液層的質(zhì)量。該粘液層包括粘液素。粘液素是杯狀細胞合成和分泌的高分子量糖蛋白。它們在粘膜表面形成一個類凝膠層，以此提高屏障完整性。該粘液層包括不同類型的粘液素，例如，酸性、中性和磺化粘液素。粘液層的增強異質(zhì)據(jù)信以提高屏障功能性。
本組合物優(yōu)選包括至少兩種不同的低聚糖，其直接地或通過改變腸內(nèi)菌類來影響粘膜構(gòu)造并有利地影響粘液層中粘膜素異質(zhì)。每個不同的特選低聚糖據(jù)信對粘液數(shù)量和質(zhì)量具有不同影響。此外，兩種截然不同的低聚糖還能刺激粘液的質(zhì)量，其質(zhì)量由通過低聚糖對SCFA產(chǎn)生的協(xié)同刺激的硫化程度來反應(yīng)。本發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的兩種不同低聚糖的混合物協(xié)同地刺激了醋酸酯的產(chǎn)生。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)粘液產(chǎn)生以來于醋酸酯產(chǎn)生。
進一步發(fā)現(xiàn)ARA的前體，γ-亞麻酸(GLA)可以有利地結(jié)合在用于治療HIV患者的本組合物中。HIV患者經(jīng)常承受腸內(nèi)發(fā)炎的病痛，這導(dǎo)致不希望的ARA高吸收，因為ARA增加了發(fā)炎反應(yīng)。還發(fā)現(xiàn)部分ARA可以由GLA代替，而不對脂肪混合的效果造成負面影響。因此，進一個方面，本發(fā)明提供一種包括低聚糖、EPA、DHA、ARA和GLA的組合物，及其在HIV或AIDS的治療和/或預(yù)防上的應(yīng)用。
本組合物優(yōu)選通過提供長鏈和短鏈的低聚糖而進一步提高。提供不同鏈長導(dǎo)致在回腸和結(jié)腸的不同部分中粘液產(chǎn)生的刺激。短鏈低聚糖(通常是聚合度(DP)為2、3、4或5)刺激近側(cè)結(jié)腸和/或回腸末端中的粘液素產(chǎn)生，而較長鏈長(優(yōu)選聚合度(DP)大于5直至60)的低聚糖據(jù)信在結(jié)腸更末端部分刺激粘液素產(chǎn)生。
通過提供都作為短鏈和長鏈低聚糖的至少兩種不同的低聚糖，可以獲得甚至更進一步的屏障完整性。這些優(yōu)選的實施例都有助于進一步提高整個回腸和/或結(jié)腸中的屏障完整性。
此外，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)EPA、DHA和ARA能減少白細胞介素4(IL-4)對腸內(nèi)滲透性的有害影響。IL-4是一種特定患者中由粘膜T-細胞的增加數(shù)量所分泌并降低腸內(nèi)滲透性的細胞因子。因此，本發(fā)明還提供一種用來治療和/或預(yù)防腸內(nèi)IL-4濃度增加的疾病的方法，如過敏，特別是遺傳性過敏性皮炎。
具體實施例方式
本發(fā)明涉及一種營養(yǎng)組合物，包括a)EPA、DHA和ARA，其中20和22個碳原子的長鏈多不飽和脂肪酸的含量不超過總脂肪含量的85wt.％；和b)至少兩種截然不同的低聚糖，其中該兩種截然不同的低聚糖具有單糖元中低于90wt.％的同源性。
這種組合物可以有利地用于刺激腸內(nèi)屏障完整性的方法中，所述方法包括將所述組合物用藥于哺乳動物。
本發(fā)明進一方面提供了多不飽和脂肪酸的用途，該多不飽和脂肪酸用于制造在治療感染有人類免疫缺陷病毒(HIV)的患者的方法中所采用的組合物，所述方法包括對所述感染人類免疫缺陷病毒(HIV)的患者給予一種組合物，包括a).二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)和花生四烯酸(ARA)，其中20和22個碳原子的長鏈多不飽和脂肪酸含量不超過脂肪總含量的85wt.％；和b).至少兩種截然不同的低聚糖(OL1和OL2)，其中這兩種截然不同的低聚糖具有單體中低于90wt.％的同源性。
治療感染HIV的患者的特別實施例是營養(yǎng)治療。本發(fā)明的其他實施例是向感染HIV的患者提供營養(yǎng)的方法中上述所限定組合物的使用，所述方法包括給予所述HIV感染患者所述組合物和上述用于刺激HIV感染患者腸內(nèi)屏障完整性的方法中所限定組合物的使用，所述方法包括給予所述HIV感染患者所述組合物。
多不飽和脂肪酸本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)二十碳五烯酸(EPA，n-3)、二十二碳六烯酸(DHA，n-3)和花生四烯酸(ARA，n-6)有效地降低腸內(nèi)緊密連接滲透性。GLA(n-6)也有效地減少屏障滲透性。因此，特別適合提高腸內(nèi)屏障完整性的本組合物包括EPA、DHA和ARA，任選地組合有GLA。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，特選LC-PUFA`s有效地減少緊密連接滲透性(見對比Usami et al的實施例)。本發(fā)明組合物中20和22個碳原子的LC-PUFA的含量優(yōu)選不超過總脂肪含量的85wt.％，優(yōu)選不超過總脂肪含量的35wt.％，更優(yōu)選不超過總脂肪含量的15wt.％。本發(fā)明組合物優(yōu)選包括總脂肪含量的至少0.1wt.％的20和22個碳原子LC-PUFA，優(yōu)選至少0.25wt.％，更優(yōu)選至少0.5wt.％，更優(yōu)選至少0.75wt.％，更進一步優(yōu)選至少5wt.％，更進一步優(yōu)選至少15wt.％和最優(yōu)選至少25wt.％。因為相同的原因，EPA含量優(yōu)選不超過總脂肪含量的55wt.％，優(yōu)選不超過總脂肪含量的35wt.％，更優(yōu)選不超過總脂肪含量的25wt.％，但優(yōu)選占總脂肪含量的至少0.05wt.％，更優(yōu)選至少0.1wt.％，最優(yōu)選至少1％。DHA含量優(yōu)選不超過總脂肪含量的15wt.％，更優(yōu)選不超過總脂肪含量的10wt.％，但占總脂肪含量的至少0.1wt.％。由于發(fā)現(xiàn)ARA對降低緊密連接滲透性特別有效，本組合物包含相對高的數(shù)量，優(yōu)選占總脂肪的至少0.1wt.％，甚至更優(yōu)選至少0.25wt.％，最優(yōu)選至少0.5wt.％。ARA含量優(yōu)選不超過總脂肪的15wt.％，優(yōu)選不超過5wt.％，更優(yōu)選不超過1wt.％。本發(fā)明中，有利地添加包含腸內(nèi)組合物EPA和DHA的ARA以平衡ARA的作用，如減少ARA代謝物的潛在促炎性作用。來自ARA的過量新陳代謝可能引起發(fā)炎。本發(fā)明營養(yǎng)組合物優(yōu)選還包含γ-亞麻酸(GLA，C18)。GLA作為ARA的前體至少部分代替組合物中ARA含量，以進一步降低ARA的促炎性作用。
因此，本發(fā)明組合物優(yōu)選包括ARA、GLA、EPA和DHA，其中(ARA+GLA)/DHA重量比優(yōu)選高于0.10，優(yōu)選高于0.25，更優(yōu)選高于0.5。該比值優(yōu)選低于25，最優(yōu)選低于3。
本發(fā)明組合物優(yōu)選包括基于脂肪總量5至75wt.％的多不飽和脂肪酸，優(yōu)選10至50wt.％。
可以提供20和22個碳原子的LC-PUFA作為游離脂肪酸，以甘油三酸酯的形式、以磷脂的形式，或上述一種以上的混合物。本組合物優(yōu)選包括磷脂形式的ARA和DHA的至少一種。
本發(fā)明營養(yǎng)組合物優(yōu)選還具有Ω-9(n-9)脂肪酸(優(yōu)選為油酸，18∶1)，以提供足夠的營養(yǎng)。本發(fā)明組合物優(yōu)選提供基于總脂肪重量至少1wt.％的n-9脂肪酸，更優(yōu)選至少5wt.％。n-9脂肪酸的含量優(yōu)選低于80wt.％。
合適的每日量可以是至少0.1克EPA和0.05克ARA或ARA+GLA，或0.1至5克EPA和0.05至2.5克ARA或ARA+GLA，或0.5至2.5克EPA和0.25至1.25克ARA或ARA+GLA，或0.75至1.5克EPA和0.37至0.75克ARA或ARA+GLA。DHA合適的每日量根據(jù)以上給出的比值(ARA+GLA)/DHA得出。
低聚糖根據(jù)本發(fā)明合適的低聚糖是具有至少2個單糖元聚合度(DP)的糖類，其在腸內(nèi)未消化或通過人體上消化道(小腸和胃)中存在的酸或消化酶作用僅部分地消化，但是可以通過人體腸內(nèi)菌類發(fā)酵。術(shù)語單糖元指的是具有閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)的單元，優(yōu)選為己糖，如吡喃糖或呋喃糖形式。該低聚糖的聚合度通常低于60單糖元，優(yōu)選低于40，更優(yōu)選低于20。
本發(fā)明組合物包括至少兩種不同的低聚糖，其中，低聚糖具有單糖元中低于大約90％的同源性，優(yōu)選低于50％，更優(yōu)選低于25％，甚至更優(yōu)選低于5％。本發(fā)明中使用的術(shù)語“同源性”是不同低聚糖中相同單糖元百分?jǐn)?shù)的累積。例如，低聚糖1(OL1)具有fruc-fruct-glu-gal的結(jié)構(gòu)，由此包括50％的fruc，25％的gal和25％的glu。低聚糖2(OL2)具有fruc-fruc-glu的結(jié)構(gòu)，由此包括66％的fruc，33％的glu。因此不同的低聚糖具有75％(50％fruc+25％glu)的同源性。
在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明組合物包括半乳糖低聚糖和選自由果糖低聚糖和菊粉組成的組中的至少一種。
每個本發(fā)明低聚糖優(yōu)選包括至少66％、更優(yōu)選至少90％的單糖元，該單糖元選自由甘露糖、樹膠醛糖、果糖、海藻糖、鼠李糖、半乳糖、β-D-吡喃型半乳糖、核糖、葡萄糖、木糖、糖醛酸及其衍生物組成的組中，以包含其中的單糖元總數(shù)來計算。
根據(jù)本發(fā)明另一個實施例，本組合物低聚糖中至少一個選自由果聚糖、果糖寡聚體、不消化的糊精半乳糖低聚糖(包括反式半乳糖低聚糖)、木低聚糖、阿拉伯低聚糖、葡萄糖低聚糖、甘露糖低聚糖、海藻糖低聚糖、酸性低聚糖(見下，如糖醛酸低聚糖，如果膠水解產(chǎn)物)及其混合物組成的組中。本組合物優(yōu)選包括選自由果糖低聚糖(fructooligosaccharides)或菊粉、半乳糖低聚糖和果膠水解產(chǎn)物組成的組中的至少一種、優(yōu)選至少兩種低聚糖。
為了好的粘液數(shù)量和質(zhì)量，本組合物優(yōu)選包括至少一種低聚糖，其包括至少66％的半乳糖或果糖作為單糖元。在優(yōu)選實施例中，組合物包括至少一種低聚糖，其包括至少66％的半乳糖作為單糖元和包括至少66％的果糖作為單糖元的至少一種低聚糖。在特別優(yōu)選的實施例中，本組合物包括半乳糖低聚糖和一種選自果糖低聚糖和菊粉中的低聚糖。果糖低聚糖刺激人體菌類聯(lián)合鼠(flora-associated rats)結(jié)腸末端中硫粘蛋白的產(chǎn)生(Kleessen et al，(2003)Brit J Nutr 89597-606)，半乳糖低聚糖刺激酸性粘液素的產(chǎn)生(Meslin et al.Brit.J.Nutr(1993)，69903-912)。
為了進一步提高整個結(jié)腸區(qū)域中粘液層的厚度，本發(fā)明組合物中至少10wt.％的低聚糖具有2至5(即，2、3、4和/或5)的DP值，至少5wt.％具有10至60的DP值。優(yōu)選至少50wt.％，更優(yōu)選至少75wt.％的低聚糖具有2至9(即，2、3、4、5、6、7、8和/或9)的DP值，因為據(jù)信其在整個回腸和結(jié)腸的近端及中間部份起作用，并因為需要合并到組合物中以獲得理想效果的低聚糖重量百分比得到降低。
優(yōu)選重量比a.(DP值為2至5的低聚糖)(DP值為6、7、8和/或9的低聚糖)＞1；且b.(DP值為10到60的低聚糖)(DP值為6、7、8和/或9的低聚糖)＞1，a和b兩者都大于1。
優(yōu)選兩個重量比都大于2，更優(yōu)選大于5。
為了進一步提高整個結(jié)腸區(qū)域內(nèi)的粘液層厚度和質(zhì)量，優(yōu)選至少兩種不同低聚糖的每個具有不同的鏈長，優(yōu)選基于各自低聚糖總重量的每個低聚糖的至少10wt.％具有2到5(即，2、3、4和/或5)的DP值和至少5wt.％具有10到60的DP值。優(yōu)選基于該低聚糖總重量的至少50wt.％，更優(yōu)選至少75wt.％的低聚糖具有2到10的DP值，因為據(jù)信其在回腸內(nèi)和結(jié)腸的近體部分及中間部份始終起作用。
酸性低聚糖為了進一步提高屏障完整性，本組合物優(yōu)選包括DP值為2到60的酸性低聚糖。術(shù)語酸性低聚糖表示包括至少一個酸性基團的低聚糖，該酸性基團選自由n-乙酰神經(jīng)氨(糖)酸，、N-glyoloylneuraminic acid、游離或酯化羧酸、硫磺酸基團和磷酸基團組成的組。酸性低聚糖優(yōu)選包括糖醛酸單元(即，糖醛酸聚合物)，更優(yōu)選半乳糖醛酸單元。酸性低聚糖可以是同質(zhì)(homogeneous)或異質(zhì)(heterogeneous)的糖類。合適的實施例是果膠和/或藻酸鹽的水解產(chǎn)物。在腸道中，糖醛酸聚合物水解成糖醛酸單體，其刺激腸內(nèi)醋酸鹽的產(chǎn)生，該醋酸鹽依次刺激腸內(nèi)粘液分泌物(Barcelo et al.Gut 2000；46218-224)。
優(yōu)選地，酸性低聚糖具有以下結(jié)構(gòu)I，其中，末位己糖(左)優(yōu)選包括一個雙鍵。除末位己糖單元之外的其它己糖單元優(yōu)選為糖醛酸單元，甚至更優(yōu)選為半乳糖醛酸單元?；谶@些單元的羧酸基團可以是游離的或(部分)酯化的，優(yōu)選至少10wt％是甲基化的(見下)。
結(jié)構(gòu)I聚合酸性低聚糖 其中R優(yōu)選選自氫、羥基或酸基，優(yōu)選為羥基；R2、R3、R4和R5中的至少一個代表N-乙酰神經(jīng)氨(糖)酸、N-glyoloylneuraminic acid、游離或酯化羧酸、硫磺酸基團和磷酸基團，其余代表氫和/或羥基。優(yōu)選R2、R3、R4和R5中的一個代表N-乙酰神經(jīng)氨(糖)酸、N-glyoloylneuraminic acid、游離或酯化羧酸、硫磺酸基團和磷酸基團，R2、R3、R4和R5中的其余代表氫和/或羥基。更優(yōu)選R2、R3、R4和R5中的一個代表游離或酯化羧酸，且其余代表氫和/或羥基。
n為整數(shù)，表示己糖單元的數(shù)目(也參見下面的聚合度)，該己糖可以是任何己糖單元。適合地，n為1～5000的整數(shù)。優(yōu)選己糖單元(多個)為糖醛酸單元。最優(yōu)選地，R1、R2和R3代表羥基，R4代表氫，R5代表羧酸，n為1～250優(yōu)選1～10間的任何數(shù)字，且己糖單元為半乳糖醛酸。
用于本發(fā)明方法中的優(yōu)選酸性低聚糖的檢測、測量和分析已經(jīng)在與酸性低聚糖相關(guān)的較早專利申請即WO0/160378中給出。
為了在整個結(jié)腸區(qū)域中刺激性提高粘膜層厚度，本組合物優(yōu)選包括至少10wt％的DP值為2到5(即2、3、4和/或5)的酸性低聚糖和至少5wt％的DP值為10到60的酸性低聚糖，所述wt％是基于低聚糖的總重量。
用于本發(fā)明中的酸性低聚糖優(yōu)選由膠質(zhì)、果膠酸鹽(pectate)、藻酸鹽、chondroitine、透明質(zhì)酸、肝素、肝磷脂(heparane)、細菌性碳水化合物(bacterial carbohydrate)、sialoglycan、巖藻依聚糖(fucoidan)、海藻糖低聚糖(fucooligosaccharides)或角叉菜聚糖制備，更優(yōu)選由果膠和/或藻酸鹽制備。
低聚糖含量當(dāng)為可以喂給的流體形態(tài)時，本發(fā)明組合物優(yōu)選包括0.1～100克每升的不消化低聚糖，更優(yōu)選為0.5～50克每升，更優(yōu)選1～25克每升。低聚糖的過高含量可能由于過度發(fā)酵而引起不舒服，而過低含量也可能導(dǎo)致不足的粘膜層。
至少兩種不同低聚糖的重量比優(yōu)選為1～10，更優(yōu)選為1～5。最優(yōu)地，這些重量比刺激腸內(nèi)不同位置處不同類型的粘膜產(chǎn)生。
包括在根據(jù)本發(fā)明的組合物中的低聚糖的數(shù)量超過基于組合物總干重的0.1wt％，優(yōu)選超過0.2wt％，更優(yōu)選超過0.5wt％，甚至更優(yōu)選超過1wt％。本發(fā)明組合物優(yōu)選具有低于20-wt％的低聚糖含量，更優(yōu)選低于10-wt％，甚至更優(yōu)選低于5-wt％。
向本組合物中加入核苷酸和/或核苷進一步提高腸粘膜的屏障作用，特別是由于其抑制和/或降低了細菌移動的發(fā)生并減少腸內(nèi)損傷。因此，本組合物還優(yōu)選包括1～500mg核苷酸和/或核苷/100g干配方，甚至更優(yōu)選5～100mg。
應(yīng)用本組合物可以有利地用于提高哺乳動物尤其是人類的屏障完整性的方法中。本組合物還可以有利地用于與屏障完整性降低有關(guān)的疾病治療或預(yù)防的方法中，所述方法包括將本組合物用藥于哺乳動物。本組合物優(yōu)選口服。
對于病人和嬰兒來說，本組合物優(yōu)選配伍完全的營養(yǎng)素，包括蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪。本組合物有利地對0～2歲的嬰幼兒用藥。該組合物可以對屏障完整性削弱的患者和無癥狀患者用藥。本組合物有利地用于對早產(chǎn)兒(在妊娠37周前出生的嬰兒)提供必需營養(yǎng)的方法中。
通過在可能導(dǎo)致腸內(nèi)損傷的醫(yī)療之前或之后將本組合物用藥于患者，本組合物還可以有利地用于腸內(nèi)損傷的治療和/或預(yù)防方法中。這種醫(yī)療可以是如外科手術(shù)或腸內(nèi)藥物治療(enteral medicine treatment)(如抗生素、止痛劑、NSAID、化療劑等)。
本組合物還可以有利地用來治療或預(yù)防疾病，其中腸內(nèi)屏障的瓦解為病程發(fā)展的基礎(chǔ)，如在治療或預(yù)防慢性炎癥的方法中，尤其是腸炎(IBD)、過敏性腸綜合征(IBS)、脂瀉病、胰腺炎、肝炎、關(guān)節(jié)炎或糖尿病。此外，本發(fā)明還可用于對已經(jīng)經(jīng)受或正在經(jīng)受腹部外科手術(shù)的患者和術(shù)后內(nèi)臟功能紊亂的患者和/或營養(yǎng)不良的患者提供營養(yǎng)的方法中。
在本發(fā)明的進一步實施例中，本組合物有利地對遭受獲得性免疫缺損綜合癥(AIDS)的患者和/或感染有人體免疫缺損病毒(HIV)的患者用藥，如在治療AIDS和/或HIV感染的方法中。所述方法包括口服本組合物，優(yōu)選配伍選自碳水化合物、蛋白質(zhì)或脂肪中的營養(yǎng)素。根據(jù)本發(fā)明的組合物對低于約700細胞/μl血液的臨界水平的CD4+T細胞計數(shù)患者特別有用，此時通常高度活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART)尚不需要，但患者確實已經(jīng)經(jīng)受病情發(fā)展或甚至經(jīng)歷著與腸內(nèi)屏障完整性有關(guān)的一個或多個問題，特別是腸內(nèi)屏障完整性的功能紊亂。因此，本發(fā)明進一方面提供了一種停止或減緩CD4+T細胞計數(shù)降低或提高HIV和/或AIDS患者體內(nèi)CD4+T細胞計數(shù)的方法，所述方法包括對患者給藥。在一個實施例中，該方法包括對患者給藥，所述患者為CD4+T-淋巴細胞細胞計數(shù)在200～700細胞/μl血液之間。在另一個實施例中，該方法包括將本組合物用藥于患者，所述患者沒有接受高度活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART)。在一個特殊實施例中，患者具有200～700細胞/μl血液之間的CD4+T-淋巴細胞細胞計數(shù)且未接受高度活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART)。
此外，本發(fā)明還可以用來治療或預(yù)防由屏障完整性降低引起的并發(fā)癥，特別是治療和/或預(yù)防痢疾的方法中，特別是嬰兒痢疾。由于嬰兒痢疾的發(fā)病減少，本組合物還可以有利地用來減少尿疹。
本組合物的給藥減少了飲食和微生物抗原特別是食物過敏原從腸道內(nèi)腔進入粘膜或體循環(huán)的途徑，因此可以有利地用于治療或預(yù)防過敏和/或過敏反應(yīng)的方法中，特別用于治療或預(yù)防食物過敏的方法中，如由食物吸收引起的過敏反應(yīng)。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，EPA、DHA和/或ARA能夠減小IL-4對腸內(nèi)滲透性的影響。因此，本發(fā)明一方面提供用于治療和/或預(yù)防疾病的方法，所述疾病中的腸內(nèi)IL-4濃度被提高(如過敏性疾病)，所述方法包括LC-PUFA的給藥，LC-PUFA優(yōu)選選自EPA、DHA或ARA，優(yōu)選配伍本發(fā)明特選低聚糖。因此，本組合物還可以有利地用于治療特異性皮炎的方法中。
本組合物優(yōu)選用包裝的粉末或包裝的可喂給形態(tài)來提供。為了防止成品損壞，可喂給形態(tài)的包裝尺寸優(yōu)選不超過一份劑量，如優(yōu)選不超過500ml；粉末狀形式的本組合物包裝尺寸優(yōu)選不超過250份劑量。粉末的合適包裝尺寸為2000g或更少，優(yōu)選每(per)1000g或更少。
該具有標(biāo)簽的包裝產(chǎn)品由本發(fā)明完成，其標(biāo)簽向消費者明確或隱含指出根據(jù)一個或多個上述或下述目的所述產(chǎn)品的使用。這種標(biāo)簽可以是如表示本方法中用來預(yù)防對食物過敏原的過敏反應(yīng)時用包括如“降低食物敏感性”、“提高腸內(nèi)耐受力”、“提高食品耐受性”或類似文字來表示。類似地，表示本方法用于治療和/或預(yù)防過敏時可以通過合并與“提高抵抗力”或“降低敏感性”等同的術(shù)語來表示。
配方已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本組合物可以有利地用于食品如幼(嬰)兒食品和臨床產(chǎn)品。這種食品優(yōu)選包括脂類、蛋白質(zhì)和碳水化合物，并優(yōu)選以液體形式用藥。本發(fā)明使用的術(shù)語“液體食品”包括干食(如粉末的)，其帶有說明書以便指導(dǎo)適量液體(如水)混合所述干食。
因此，本發(fā)明還涉及一種營養(yǎng)組合物，其優(yōu)選包括5～50en％的脂類、5～50en％的蛋白質(zhì)、15～90en％的碳水化合物和低聚糖和LC-PUFA’s的本組合物。優(yōu)選地，本營養(yǎng)組合物優(yōu)選包括10～30en％的脂類、7.5～40en％的蛋白質(zhì)和25～75en％的碳水化合物(en％是能量百分比的縮寫，表示構(gòu)成制劑的總卡值中各組分的相對數(shù)量)。
優(yōu)選地，使用植物脂類和選自魚油和Ω-3植物、藻類或細菌性油中至少一種油的組合物。
用于營業(yè)性制劑的蛋白質(zhì)優(yōu)選選自非人類的動物性蛋白質(zhì)(如牛乳蛋白質(zhì)、肉蛋白質(zhì)和蛋類蛋白質(zhì))、植物蛋白質(zhì)(如大豆蛋白質(zhì)、小麥蛋白質(zhì)、大米蛋白質(zhì)和花生蛋白質(zhì))、游離氨基酸及其混合物。牛乳是氮源，特別是牛乳蛋白質(zhì)如干酪素和乳清蛋白質(zhì)為特別優(yōu)選。
排便不規(guī)律(如大便秘結(jié)、大便不足、腹瀉)是許多嬰兒和接受流體食物病人的主要問題。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，大便問題可以通過在流體食物中加入本發(fā)明低聚糖來減少，其中重量克分子滲透壓濃度為50～500mOsm/kg，更優(yōu)選為100～400mOsm/kg。
鑒于上述內(nèi)容，還有一個重要的是，液體食物不具有過量卡值密度，然而仍能向喂給對象提供充足的熱量。因此，液體食物優(yōu)選具有0.1～2.5kcal/ml的熱量密度，更優(yōu)選具有0.5～1.5kcal/ml的熱量密度，最優(yōu)選為0.6～0.8kcal/ml。
具體實施例方式
實施例1LC-PUFA對屏障完整性的影響在transwell過濾器(Corning，Costar BV，荷蘭)中培養(yǎng)腸內(nèi)上皮細胞系T84(美國典型培養(yǎng)物(ATTC)，Manassas，USA)的單細胞層(MC)，供給粘膜和漿膜兩種樣品，并刺激人類腸內(nèi)上皮細胞。兩周后融合(confluency)，單細胞層潛伏在具有多不飽和脂肪酸ARA(花生四烯酸；5，8，11，14-二十碳四烯酸)、DHA(順式-4，7，10，13，16，19二十二碳六烯酸)、EPA(二十碳四烯酸)或?qū)φ兆貦?C 16∶0)酸(Palm)(Sigma，St.Louis，USA)的腔室。選擇后一個過程來模仿活體內(nèi)食物化合物的給藥路徑。細胞與不同濃度的(10μM和100μM)ARA、DHA、EPA、GLA或棕櫚酸孵育0、24、48和72小時。實施實驗來評估基礎(chǔ)的屏障完整性。通過測量透過上皮的抵抗力(TER，Ω.cm2)、對4kD FITC右旋糖酐(旁細胞滲透性標(biāo)記(paracellular permeabilitymarker)，Sigma，USA)的滲透性、抵抗力來確定上皮屏障功能，該透過上皮的抵抗力是由上皮電壓-電阻表(EVOM；World PrecisionInstruments，德國)來測定。對4kDa FITC-右旋糖酐的上皮滲透性按如下確定。在右旋糖酐加入培養(yǎng)基之前，該培養(yǎng)基采用不含酚紅的培養(yǎng)基更新一小時，然后向內(nèi)腔代謝區(qū)添加5μl(原料100mg/ml)4kDaFITC-右旋糖酐。30分鐘孵育之后，100μl樣品從漿膜區(qū)收集起來，并在485nm激發(fā)波長和520nm發(fā)射波長(FLUOstar Galaxy，BMGLabtechnologies，USA)下測量熒光信號。FITC-右旋糖酐的流量(fluxes)以每mol的FITC-右旋糖酐/cm2/h來計算。使用ANOVA(10版本的SPSS)來進行統(tǒng)計學(xué)分析。
表1中給出了孵育72小時后脂肪酸(100μM)的對天然屏障完整性的影響結(jié)果。表1示出LC-PUFA’sARA、EPA、GLA和DHA減少了分子流量，提高了上皮抵抗力。相反對照實驗表明棕櫚酸具有相反作用，即損害屏障完整性。這些結(jié)果對于有利地使用根據(jù)本發(fā)明的組合物中的EPA、DHA、GLA和ARA、特別是ARA和根據(jù)本發(fā)明的方法如提高屏障完整性方法的使用給出了指示。這些結(jié)果進一步支持了脂肪酸和不消化低聚糖的本發(fā)明組合物的增強效應(yīng)。


圖1示出了根據(jù)各種脂肪酸(棕櫚酸、DHA、GLA和AA)對基本屏障完整性(TER)影響的時間和劑量(10μM和100μM)。圖1不出LC-PUFA’sAA、DHA和GLA提高了上皮屏障完整性，由提高的抵抗力(TER)反應(yīng)。這些結(jié)果表明，EPA、DHA、GLA和ARA、特別是ARA有利地用于根據(jù)本發(fā)明的組合物中，并指示了用于根據(jù)本發(fā)明的方法即提高屏障完整性的方法中。這些結(jié)果進一步支持了脂肪酸和不消化低聚糖的本發(fā)明組合物的增強效應(yīng)。
表1


實施例2LC-PUFA對IL-4介導(dǎo)(mediated)屏障完整性的影響在transwell過濾器(Corning，Costar BV，荷蘭)中培養(yǎng)腸內(nèi)上皮細胞系T84(ATTC，USA)的單細胞層(MC)，補充粘膜和漿膜兩種樣品，并刺激人類腸內(nèi)上皮細胞。兩周后融合(confluency)，單細胞層孵育在IL-4(2ng/ml，漿膜區(qū)，Sigma，USA)中，具有或不具有多不飽和脂肪酸ARA、DHA、GLA、EPA或?qū)φ兆貦八?10μM或100μM，粘膜區(qū)，Sigma，St.Louis USA)。在IL-4孵育之前，細胞與GLA、ARA、DHA、EPA或棕櫚酸預(yù)孵育48小時。PUFA’s和具有IL-4的棕櫚酸的共同孵育再繼續(xù)48小時；同時，培養(yǎng)基和添加物每24小時更換一次。上皮屏障功能通過測量如實施例1所述的透過上皮的抵抗力(TER)和滲透性來確定。按實施例1所述來進行統(tǒng)計學(xué)評價。
表2中給出了GLA、ARA、DHA、EPA和棕櫚酸(100μM)對IL-4介導(dǎo)屏障破壞的影響的結(jié)果。表2示出，LC-PUFA’sGLA、ARA、DHA和EPA抑制了由IL-4引起的流量增加。相反，棕櫚酸具有不利的影響，與對照相比，降低了屏障破壞性。這些結(jié)果指示了，GLA、ARA、DHA和EPA在臨床和嬰幼兒營養(yǎng)配方以防止或減少IL-4介導(dǎo)屏障破壞上有利的使用，如在食物或牛奶中發(fā)生過敏。這些結(jié)果進一步支持了脂肪酸和不消化低聚糖的本發(fā)明組合物的增強效應(yīng)。
圖2示出了根據(jù)各種FA’s(棕櫚酸、DHA、GLA和ARA)對IL-4介導(dǎo)屏障破壞性(流量)影響的時間和劑量(10μM和100μM)。圖2示出ARA、DHA和GLA保護不受IL-4介導(dǎo)屏障破壞，由降低的4kD右旋糖苷反應(yīng)。這些結(jié)果表明，GLA、ARA、DHA和EPA在臨床和嬰幼兒營養(yǎng)配方以防止或減少IL-4介導(dǎo)屏障破壞上有利的使用，如在食物或牛奶中發(fā)生過敏。這些結(jié)果進一步支持了脂肪酸和不消化低聚糖的本發(fā)明組合物的增強效應(yīng)。
表2

↓＝由PUFA降低的滲透性；↑＝由PUFA提高的抵抗力。
實施例3低聚糖對醋酸鹽產(chǎn)物的影響從奶瓶喂養(yǎng)的嬰兒的新鮮糞便中獲取微生物。1～4個月大嬰兒的新鮮排屑物收集并放入防腐介質(zhì)中2小時。由于培養(yǎng)基或者是益生元(prebiotics)(TOS；TOS/菊粉(HP)混合物為9/1(w/w)比值、菊粉；低聚糖(OS)/菊粉混合物為1/1(w/w)比值，或者一個(空)也不使用。轉(zhuǎn)乳低聚糖(transgalactooligosaccharides)(TOS)從VivinalGOS，Borculo Domo Ingredients，Zwolle，荷蘭中獲得，并包括不消化低聚糖33wt％二糖、39wt％三糖、18wt％四糖、7wt％五糖、3wt％六糖、七糖和八糖(en octasaccharides)。菊粉(HP)Orafti活性食品成分、Tienen、Belgium即Raftiline HP，平均DP為23；培養(yǎng)基McBain & MacFarlane培養(yǎng)基含有緩沖劑的蛋白胨水為3.0g/l，酵母抽提物為2.5g/l，粘液素(細胞刷狀緣)為0.8g/l，胰蛋白胨為3.0g/l，L-半胱氨酸-HCL為0.4g/l，膽汁鹽為0.05g/l，K2HPO4·3H2O為2.6g/l，NaHCO3為0.2g/l，NaCl為4.5g/l，MgSO4·7H2O為0.5g/l，CaCl2為0.228g/l，F(xiàn)eSO4·7H2O為0.005g/l。用培養(yǎng)基填充500ml斯科特瓶并在121℃下殺菌15分鐘。含有緩沖劑的培養(yǎng)基K2HPO4·3H2O為2.6g/l，NaHCO3為0.2g/l，NaCl為4.5g/l，MgSO4·7H2O為0.5g/l，CaCl2為0.228g/l，F(xiàn)eSO4·7H2O為0.005g/l。用K2HPO4或NaHCO3調(diào)節(jié)pH值為6.3±0.1。用培養(yǎng)基填充500ml斯科特瓶并在121℃下殺菌15分鐘。防腐培養(yǎng)基含有緩沖劑蛋白胨為20.0g/l，L-半胱氨酸-HCL為0.5g/l，巰基乙酸鈉為0.5g/l，每升刃天青(resazurine)藥片1個，用1M的NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH值為6.7±0.1。在微波爐中沸騰。血清瓶用25ml培養(yǎng)基填充，并在121℃下殺菌15分鐘。
新鮮的糞便樣品與防腐培養(yǎng)基混合，在4℃下保存幾個小時。糞便的保存溶液以13000rpm離心處理15分鐘，去除上清液，糞便以1∶5的重量比與McBain&Mac Farlane培養(yǎng)基混合。3ml糞便懸浮液與85mg葡萄糖或益生元或無添加劑(空)的結(jié)合放入瓶子，充分混合。t＝0的樣品被收回(0.5ml)，得到懸浮液的2.5ml被引入在填充有60ml含緩沖劑培養(yǎng)基的60ml瓶中的滲析管中。該瓶密封好，并在37℃下培養(yǎng)。3、24和48小時后，樣品用皮下注射器從滲析管(0.2ml)或透析緩沖液(1.0ml)取出，并立即放入冰中以停止發(fā)酵。該實驗使用如下樣品來實施1)85mgTOS2)85mg菊粉3)85mg比值為9/1(w/w)的TOS/菊粉4)85mg比值為1/1(w/w)的OS/菊粉使用裝配有火焰電離探測器的Varian 3800氣相色譜儀(GC)(Varian Inc.，Walnut Creek，USA)測定SCFA(醋酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽)的數(shù)量。0.5μl的樣品使用氦作為載氣(3.0psi)在80℃注射到柱中(Stabilwax，15×0.53mm，薄膜厚度1.00μm，Restek，Co.，USA)中。注射樣品之后，以16℃/min的速度將烤箱加熱至160℃，隨后以20℃/min的速度加熱至220℃，最后在220℃下保溫1.5分鐘。注射器和探測器的溫度為200℃。2-ethylbytyric酸作為內(nèi)標(biāo)物。
圖3示出了不同低聚糖發(fā)酵引起的的絕對(圖3A)和相對SCFA剖面(profile)(圖3B)。圖3A示出了兩種不同低聚糖的混合物(TOS/菊粉)，其中這兩種截然不同的低聚糖具有低于90的單糖單元同源性，不同鏈長導(dǎo)致每克纖維比單一成分更顯著且增強數(shù)量的SCFA(特別是醋酸鹽)。圖3B示出了TOS/菊粉組合物的添加有利于有益醋酸鹽(B)的更高比例。體內(nèi)的醋酸鹽產(chǎn)生通過杯形細胞和用于腸內(nèi)粘液層厚度的測量轉(zhuǎn)換成提高的粘液產(chǎn)生(參見實施例4)。這些結(jié)果表明本發(fā)明組合物有利的使用。
實施例4SCFA對粘液產(chǎn)生的影響在24或96孔(well)組織培養(yǎng)皿(Coming B.V.)中培養(yǎng)腸內(nèi)上皮細胞T84細胞(ATCC，USA)的單細胞層。T84用短鏈脂肪酸醋酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽(SFCA，Merck，USA)在0.025～4.0mM濃度下培養(yǎng)24小時。收集上清液和/或細胞，確定MUC-2(粘液素)的表達。點印跡技術(shù)被用來確定細胞培養(yǎng)中的MUC-2表達，因為粘液素是非常大的糖蛋白質(zhì)(超過500kDa)，這使得它們難以在western印跡技術(shù)中進行處理。該方法使用預(yù)先免疫的血清(T84污損的負性)、CCD-18Co(ATCC，USA)負性對照細胞和牛血清白蛋白(BSA)來實現(xiàn)。細胞樣品收集在Laemmli(蛋白質(zhì)分離緩沖劑)中，使用根據(jù)制造方法的微生物蛋白化驗(Biorad，USA)實施蛋白質(zhì)的確定。樣品(0.3-0.7-1.0μg/2μl)點跡在硝酸纖維膜(Schleicher&Schuell，德國)上。薄膜在TBST/5％Protivar(Nutricia，荷蘭)中封閉，隨后用抗-MUC-2抗體(由荷蘭Rotterdam的Erasmus大學(xué)Einerhand博士友善捐贈)培養(yǎng)1小時。洗滌之后，印跡用山羊的抗-兔-HRP(SantacruzBiotechnology，USA)培養(yǎng)，為了探測底物，使用ECL(RocheDiagnostics，荷蘭)。使用Lumi-Imager(Boehringer Mannheim B.V.，荷蘭)來實施密度計量學(xué)，用光單元(BLU)來表達信號。BLU’s還相對于對照培養(yǎng)(％BLU)來表達。為了比較SCFA對MUC-2表達的刺激效果，減去了基本的MUC-2表達水平。
圖4顯示了SCFA(醋酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽)對腸內(nèi)上皮細胞(MC T84)和上皮間充質(zhì)細胞聯(lián)合培養(yǎng)(CC T84)中MUC-2表達的不同影響。圖4還示出，醋酸鹽與丙酸鹽和丁酸鹽在刺激MUC-2表達(粘液的產(chǎn)生)上更有效。因此，本發(fā)明低聚糖的組合(其顯示出提高醋酸鹽的產(chǎn)生(參見實施例3))對于刺激粘液的產(chǎn)生特別有效，并可以有利地應(yīng)用于刺激屏障完整性的方法中。
實施例5嬰幼兒牛乳配方I成分(每升)，能量672千卡；蛋白質(zhì)15g；乳清∶干酪素的比值為60∶40；脂肪36g；碳水化合物72g；維生素A750RE；混合的天然頸動脈(carotids)400IU；維生素D10.6mcg，維生素F7.4mg；維生素K67.0mcg；維生素B1(硫胺)1000mcg；維生素B2(核黃素)1500mcg；維生素B6(吡哆素)600mvg；維生素B12(cyanacobalmine)2.0mcg；煙酸9.0mcg；葉酸80mcg；泛酸3000mcg；維生素H90mcg；維生素C(抗壞血酸)90mcg；膽堿100mg；肌醇33mg；鈣460Mg；磷333Mg；鎂64Mg；鐵8.0Mg；鋅6.0Mg；錳50mcg；銅560mcg；碘100mcg；鈉160mg；鉀650mg；氯化物433mg和硒14mcg；其中脂肪含量包括3克魚油和3克40％的花生四烯酸油(DSM Food Specialties；Delft，荷蘭)；進一步包括4克轉(zhuǎn)乳低聚糖Elix’orTM(Borculo DomoIngredients，荷蘭)和4克Raftiline(Orafti Active Food Ingredients，比利時)。
實施例6用于改善HIV/AIDS相關(guān)癥狀的營養(yǎng)(bar)的組合物原材料 g/天 蛋白質(zhì) 碳水化合物(carbs) 脂肪 g/100克牛乳蛋白質(zhì) 20.00 15.002.100.80 21.04蛋類蛋白質(zhì) 21.09 16.870.000.00 22.19玻璃苣油4.00 0.00 0.004.00 4.21EPA-DHA油 6.00 0.00 0.006.00 6.31半乳糖低聚糖15.38 0.00 4.780.00 16.18安茴酰牛扁堿0.79 0.00 0.000.00 0.83果膠玉米糖母液 8.54 0.11 0.090.00 8.98果糖組(Fructosestroop)15.40 0.00 11.92 0.00 16.20
甘油 3.85 0.00 3.830.00 4.05總計 95.05 31.98 22.72 10.80 100.00每天 每100克千卡 en％千卡能量蛋白質(zhì) 12840.5135能量碳水化合物 91 28.896能量脂肪97 30.810權(quán)利要求
1.一種多不飽和脂肪酸的用途，該多不飽和脂肪酸用于制造在治療感染有人類免疫缺陷病毒(HIV)的患者的方法中所采用的組合物，所述方法包括向所述感染人類免疫缺陷病毒的患者給藥一種組合物，其包括a.二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)和花生四烯酸(ARA)，其中具有20和22個碳原子的長鏈多不飽和脂肪酸含量不超過脂肪總含量的85wt.％；和b.至少兩種截然不同的低聚糖(OL1和OL2)，其中這兩種截然不同的低聚糖具有同源性低于90％的單糖元。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中，該組合物進一步包括γ-亞麻酸(GLA)。
3.一種營養(yǎng)組合物，包括a.EPA、DHA和ARA，其中具有20和22個碳原子的長鏈多不飽和脂肪酸的含量不超過總脂肪含量的85wt.％；和b.至少兩種截然不同的低聚糖(OL1和OL2)，其中該兩種截然不同的低聚糖具有同源性低于90％的單糖元。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的組合物，包括半乳低聚糖和選自果糖低聚糖、菊粉或其混合物的果聚糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4的組合物，其中低聚糖的至少10wt％具有2～5的聚合度(DP)，且至少5wt％具有10～60的DP。
6.根據(jù)權(quán)利要求3～5中任一個組合物，進一步包括酸性低聚糖，優(yōu)選DP為2～60的糖醛酸聚合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求3～6中任一個組合物，包括7.5～12.5能量％的蛋白質(zhì)；40～55能量％的碳水化合物；和35～50能量％脂肪，其中所述蛋白質(zhì)包括選自水解的牛乳蛋白質(zhì)、植物蛋白質(zhì)和/或氨基酸中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求3～7中任一個組合物，所述組合物具有0.6～0.8kcal/ml的含熱量；50～500mOsm/kg的重量克分子滲透壓濃度；和低于50mPas的粘度。
9.根據(jù)權(quán)利要求3～8中任一個組合物，其中該組合物進一步包括GLA。
10.根據(jù)權(quán)利要求3～9中任一個組合物，其用作藥物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中患者是CD4+T-淋巴細胞計數(shù)在200～700細胞/μl血液的人類，且其中所述患者沒有接受高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療。
12.根據(jù)權(quán)利要求3～9任一項組合物的用途，該組合物用于制造治療或預(yù)防腹瀉的方法中所采用的藥物，所述方法包括對哺乳動物給予根據(jù)權(quán)利要求3～9中任一項的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種刺激感染HIV的患者中腸內(nèi)屏障性的方法，該方法通過向所述患者包括(EPA)、(DHA)和(ARA)以及至少兩種明顯不同的低聚糖。
文檔編號A23L1/308GK1972604SQ200580020895
公開日2007年5月30日 申請日期2005年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月22日
發(fā)明者E·A·F·文托, L·E·M·威廉姆森, M·A·克齊爾, C·比爾曼, B·斯坦?fàn)?申請人:努特里希亞公司