專利名稱：日本血吸蟲抗原基因的融合基因及構(gòu)成的dna疫苗和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥領(lǐng)域，具體涉及一種日本血吸蟲抗原基因的融合基因，及構(gòu)成的日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗，和該疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害人類及家畜健康的人畜共患寄生蟲病，據(jù)WHO估計(jì)全球至少有6億人受到感染血吸蟲病威脅，約2億人受到感染，我國(guó)仍有150萬(wàn)病人，耕牛感染也相當(dāng)嚴(yán)重，是發(fā)展中國(guó)家包括中國(guó)的一個(gè)主要公共衛(wèi)生問題。雖然長(zhǎng)期以來(lái)，使用吡喹酮藥物化療安全高效，但由于其藥價(jià)高，治療后容易再感染，以及可能產(chǎn)生血吸蟲蟲株抗藥性，給血吸蟲病的控制帶來(lái)了較大的困難。因此，人們將對(duì)血吸蟲病的有效防治寄希望于有效疫苗的研制與開發(fā)。
現(xiàn)有的血吸蟲疫苗主要有減毒活疫苗和基因工程蛋白疫苗。血吸蟲尾蚴減毒活疫苗需要特定的設(shè)備，數(shù)量來(lái)源有限，攜帶也不方便，存在血吸蟲尾蚴的毒力回復(fù)，即存在安全性問題；基因工程蛋白疫苗流程長(zhǎng)，制備工藝難度較大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，人力物力花費(fèi)較大，成本很高，難以推廣應(yīng)用，且蛋白疫苗不易保存。自從1990年Wolff等首次報(bào)道肌肉注射“裸”質(zhì)粒DNA可被肌肉攝取并表達(dá)目的基因多編碼的蛋白質(zhì)以來(lái)，DNA疫苗受到了廣泛關(guān)注并得到迅速發(fā)展。與傳統(tǒng)的減毒活疫苗和亞單位疫苗相比，DNA疫苗因具有安全、高效、經(jīng)濟(jì)，方便等優(yōu)勢(shì)而成為血吸蟲疫苗研究領(lǐng)域的一個(gè)亮點(diǎn)。目前，國(guó)際衛(wèi)生組織所公布的6種特異性的日本血吸蟲抗原基因脂肪酸結(jié)合蛋白(sjFABP，fatty acid binding protein)，sjFABP含有133個(gè)氨基酸殘基，編碼區(qū)片段長(zhǎng)度為399bp，分子量約14kDa。sjFABP是血吸蟲運(yùn)輸脂質(zhì)的載體，血吸蟲利用它可以從宿主體內(nèi)獲得其自身不能合成長(zhǎng)鏈脂肪酸以及固醇類物質(zhì)，并合成拮抗宿主免疫的脂肪簇衍生物，從而逃避宿主免疫攻擊?，F(xiàn)在已經(jīng)證明的經(jīng)過(guò)人工純化天然或者重組表達(dá)的血吸蟲脂肪酸結(jié)合蛋白，以及攜帶脂肪酸結(jié)合蛋白編碼基因的DNA疫苗，免疫動(dòng)物均能夠誘發(fā)一定水平的抗血吸蟲感染免疫保護(hù)性作用。
23KDa膜內(nèi)在蛋白(sj23)，sj23含有個(gè)氨基酸殘基，編碼區(qū)片段長(zhǎng)度為657bp，分子量約23kDa。sj23是一個(gè)非糖基化、水溶性的膜相關(guān)蛋白，存在于日本血吸蟲的體表，作為對(duì)宿主有直接作用的主要抗原成份，對(duì)于維持血吸蟲的生長(zhǎng)和發(fā)育起著重要的作用，血吸蟲23kDa膜內(nèi)在蛋白由于直接暴露于宿主免疫系統(tǒng)，及獨(dú)特的免疫學(xué)及結(jié)構(gòu)特征，可以作為宿主免疫的攻擊目標(biāo)?，F(xiàn)在證明日本血吸蟲23kDa抗原蛋白的編碼基因構(gòu)成的DNA疫苗的確具有免疫效果，成為有價(jià)值的診斷抗原和候選疫苗。
谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(sj26)，sj26含有217個(gè)氨基酸殘基，編碼區(qū)片段長(zhǎng)度為657bp，分子量約26kDa。存在于雄蟲的實(shí)質(zhì)組織及雌蟲卵黃腺質(zhì)間的實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，表膜并沒有發(fā)現(xiàn)sj26的存在。sj26也是一種存在于人體中的酶，但是與正常的人蛋白無(wú)交叉反應(yīng)，使用sj26作為疫苗，不會(huì)引起人類自身免疫性疾病。從日本血吸蟲中提取的sj26蛋白免疫小鼠，能夠獲得一定的免疫保護(hù)力。
3-磷酸甘油醛脫氫酶(sjGAPDH)，sjGAPDH含有338個(gè)氨基酸殘基，編碼區(qū)片段長(zhǎng)度為1017bp，分子量36589Da。sjGAPDH具有糖酵解作用，以及在腦組織中微血管的聚合與解聚作用，還具有蛋白激酶的活力。一般認(rèn)為sjGAPDH作為日本血吸蟲疫苗候選抗原主要起著可逆的氧化作用，sjGAPDH作為細(xì)胞內(nèi)蛋白主要促使巰基-二硫化物的轉(zhuǎn)化，在氧化劑存在下sjGAPDH酶迅速減少氧化誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，因此sjGAPDH能夠保護(hù)血吸蟲對(duì)抗巨噬細(xì)胞等的氧介質(zhì)的攻擊。
磷酸丙糖異構(gòu)酶(sjTPI)，sjTPI含有252個(gè)氨基酸殘基，編碼區(qū)片段長(zhǎng)度為759bp，分子量約28kDa。sjTPI作為酶性抗原，sjTPI是近年日本血吸蟲疫苗研究中較為活躍的一個(gè)領(lǐng)域，sjTPI是-糖酵解酶，糖酵解在血吸蟲糖代謝過(guò)程中具有重要作用，催化磷酸二羥丙酮與3-磷酸甘油醛之間的可逆反應(yīng)，它存在于成蟲所有細(xì)胞，如腸、肌肉和表膜。
副肌球蛋白(Paramyosin Sj97)，sj97含有869個(gè)氨基酸殘基，編碼區(qū)片段長(zhǎng)度為2607bp，分子量約97kDa。sj97是無(wú)脊椎動(dòng)物所特有的副肌球蛋白，副肌球蛋白作為血吸蟲疫苗候選抗原的研究逐漸深入，它是一種糖蛋白。它于血吸蟲的肌肉組織中，也位于日本血吸蟲的腹吸盤后的腺體內(nèi)。Sj97原核表達(dá)的蛋白能夠特異性與免疫動(dòng)物和日本血吸蟲病患者的抗血清抗體反應(yīng)。
就目前國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀來(lái)看，日本血吸蟲病DNA疫苗針對(duì)這6種日本血吸蟲抗原基因的單價(jià)疫苗研究較多，但是免疫力普遍較低，而且免疫保護(hù)力不穩(wěn)定。究其原因，可能是由于血吸蟲感染后保護(hù)性免疫機(jī)制復(fù)雜多樣，不同的抗原分子所提供的保護(hù)性機(jī)制不同，免疫保護(hù)力也高低不一，單一分子很難針對(duì)體內(nèi)不同蟲期的蟲體產(chǎn)生完全保護(hù)力。因而，需要不同的抗原分子協(xié)同作用，利用不同抗原表位的不同免疫作用，協(xié)同誘導(dǎo)多種免疫殺蟲機(jī)制，殺滅多個(gè)發(fā)育期的血吸蟲，以克服單個(gè)分子抗原誘導(dǎo)的免疫保護(hù)水平偏低的問題來(lái)提高免疫保護(hù)力。所以，復(fù)合多價(jià)疫苗成為目前DNA疫苗研究的新方向和應(yīng)用熱點(diǎn)。
融合PCR技術(shù)是一種新型的基因工程技術(shù)，它是PCR技術(shù)的一種延伸應(yīng)用。PCR技術(shù)(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是現(xiàn)代分子生物學(xué)的一個(gè)巨大突破，它能在體外迅速、大量、靈敏地?cái)U(kuò)增基因片段?？墒牵?jīng)PCR技術(shù)擴(kuò)增的大量相關(guān)基因片段如何能有效拼接，卻是一個(gè)很值行探討的問題。傳統(tǒng)的方法是引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，這不但操作繁雜，而有時(shí)為了構(gòu)建限制性位點(diǎn)還會(huì)影響解讀三聯(lián)密碼的正確性。1989年，Horton等人提出了SOE法(Gene splicing by over lap extension)，即通過(guò)復(fù)制時(shí)DNA鏈的交錯(cuò)延伸實(shí)現(xiàn)基因拼接的融合PCR技術(shù)。分四步進(jìn)行(1)引物設(shè)計(jì)序列I的引物a和b，a是常規(guī)引物，b的左半段為常規(guī)引物，右半段為鉸鏈區(qū)(-)序列和基因II的部分引物序列；序列I的引物c和d，c右半段為常規(guī)引物，左半段為鉸鏈區(qū)(+)序列和基因I的部分引物序列，則b和c的鉸鏈區(qū)部分堿基可互補(bǔ)配對(duì)；(2)引物a，b擴(kuò)增I片段，引物c，d擴(kuò)增II片段；(3)兩種PCR產(chǎn)物I，II混合，經(jīng)變性及退火處理，I的下游部分和II的上游部分的堿基互補(bǔ)配對(duì)形成鉸鏈區(qū)，在DNA聚合酶作用下，I和II鏈互為引物和模板，重疊延伸；(4)加入引物a和d，在DNA聚合酶作用下，合成“I-鉸鏈-II”的融合基因片段。
通過(guò)融合PCR的手段，任意兩個(gè)血吸蟲抗原基因通過(guò)中間的疏水性柔韌性多肽編碼基因連接，能夠一定程度上避免了單個(gè)抗原基因的抗原表位在融合蛋白折疊后被封閉，抗原表位無(wú)法與T細(xì)胞和B細(xì)胞有效結(jié)合，以致產(chǎn)生無(wú)效免疫。
日本血吸蟲抗原基因的融合基因所構(gòu)成的DNA疫苗與原核表達(dá)多種抗原蛋白及多聚物進(jìn)行混合相比較，有其獨(dú)到的好處。將日本血吸蟲抗原基因進(jìn)行融合后克隆入真核表達(dá)載體，然后導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，利用機(jī)體自身的真核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)翻譯日本血吸蟲抗原基因的融合基因，進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)修飾有糖基化、羥基化、?；c二硫鍵的形成。原核細(xì)胞中沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，這些化學(xué)修飾在原核表達(dá)中自然無(wú)法進(jìn)行，所以，原核表達(dá)的產(chǎn)物并不是真正天然的日本血吸蟲抗原，自然不是最有效的抗原形式。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種日本血吸蟲抗原基因的融合基因，該融合基因具有多個(gè)抗原基因的抗原決定簇，因而具有多個(gè)抗原基因的免疫原性，從而達(dá)到血吸蟲抗原基因的融合基因表達(dá)的多價(jià)抗原的多重免疫和多重保護(hù)。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供由該融合基因構(gòu)成的日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗，該日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗減蟲率和減卵率顯著高于單價(jià)疫苗，免疫效果持久。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供該日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗的制備方法，該制備方法具有生產(chǎn)簡(jiǎn)便、分離效率高、分離速度快、制備規(guī)模可放大，產(chǎn)品為高濃度的日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗超螺旋形式，無(wú)有毒化學(xué)試劑污染、內(nèi)毒素含量極低，且具有無(wú)宿主細(xì)菌基因組DNA、RNA污染的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明提供的一種日本血吸蟲抗原基因的融合基因，該融合基因由日本血吸蟲抗原基因脂肪酸結(jié)合蛋白 sjFABP23kDa膜蛋白 sj23甘油磷酸脫氫酶 sjGAPDH谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶 sj26磷酸丙糖異構(gòu)酶 sjTPI副肌球蛋白 sj97兩兩之間任意組合，在兩抗原基因間通過(guò)一段編碼疏水性多肽的DNA序列(G4S)m連接，并且在翻譯的過(guò)程中保持原來(lái)的閱讀框，其中1＜m＜10。
由上述的融合基因構(gòu)成的日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗，其特征在于以pVIVO2，pcDNA3.1(+/-)，pVAC，pBOOST2，pFUSE-Fc為真核表達(dá)載體，在該真核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)上插入有至少一個(gè)日本血吸蟲抗原基因的融合基因。
上述日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗的制備方法，其步驟包括(1)提取日本血吸蟲總RNA；(2)RT-PCR獲得日本血吸蟲抗原基因，克隆基因并測(cè)序驗(yàn)證；(3)利用“融合PCR”的手段獲得融合日本血吸蟲抗原基因的融合基因，克隆基因并測(cè)序驗(yàn)證；(4)將日本血吸蟲抗原基因的融合基因插入真核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)；或在日本血吸蟲抗原基因的融合基因插入真核表達(dá)載體的1個(gè)多克隆位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，再在另一個(gè)多克隆位點(diǎn)插入另一個(gè)融合基因或者日本血吸蟲抗原基因；從而構(gòu)建成若干種日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗，酶切驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證，選取陽(yáng)性克隆菌保種；(5)發(fā)酵陽(yáng)性克隆菌，收獲菌體，利用標(biāo)準(zhǔn)堿裂解法獲得日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗粗提物；(6)利用色譜純化法，采用凝膠排阻色譜、離子柱層析和親和吸附聯(lián)用的手段，獲得達(dá)到醫(yī)用級(jí)疫苗純度水平的日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗樣品。
融合基因是通過(guò)融合PCR的重疊延伸技術(shù)，通過(guò)一段柔韌的疏水性氨基酸多肽編碼的核苷酸序列作為鉸鏈區(qū)，將兩兩血吸蟲抗原基因進(jìn)行融合，刪除血吸蟲抗原基因的融合基因中的終止密碼子保證血吸蟲抗原基因的融合基因序列通讀。本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)融合PCR的鉸鏈引物，成功地融合30種日本血吸蟲抗原基因的融合基因。DNA疫苗最大的弱點(diǎn)之一就是不能多價(jià)抗原共同保護(hù)，大多數(shù)的單價(jià)DNA疫苗都是將單個(gè)抗原基因插入到真核表達(dá)的載體的多克隆位點(diǎn)，這樣的免疫保護(hù)力度很有限。然而，將兩個(gè)基因融合為一個(gè)基因，使得一個(gè)基因具有兩個(gè)基因的免疫原性和抗原決定簇，單個(gè)疫苗載體上能夠容納和表達(dá)更多的抗原基因，從根本上解決原來(lái)單價(jià)DNA疫苗的缺陷。
本發(fā)明通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)編碼日本血吸蟲抗原基因的融合基因的日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗的宿主菌，堿裂解法大規(guī)模粗提取質(zhì)粒。采用色譜純化的手段，對(duì)日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗粗提物進(jìn)行純化。本發(fā)明采用的融合表達(dá)方式，將兩種日本血吸蟲抗原基因融合在一起表達(dá)；同時(shí)選用具有兩個(gè)多克隆插入位點(diǎn)的載體，在一個(gè)位點(diǎn)插入一個(gè)融合抗原基因之后，可在另一個(gè)多克隆位點(diǎn)插入另一個(gè)融合抗原基因或單基因，可同時(shí)利用多個(gè)日本血吸蟲抗原基因表達(dá)的抗原蛋白的不同免疫保護(hù)作用，顯著提高免疫效果，而且明顯優(yōu)于兩個(gè)日本血吸蟲抗原基因單個(gè)表達(dá)的多價(jià)疫苗的免疫效果。本發(fā)明日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗不僅具有單價(jià)疫苗生產(chǎn)簡(jiǎn)便、安全高效、使用方便、價(jià)格低廉、利于貯運(yùn)等優(yōu)點(diǎn)，而且減蟲率和減卵率顯著高于單價(jià)疫苗，免疫效果持久，在目前血吸蟲DNA疫苗研究中具有更廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。下面通過(guò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)了各種疫苗的藥效。
本發(fā)明制備方法采用凝膠排阻色譜、離子柱層析和親和吸附聯(lián)用的色譜純化手段，對(duì)日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗的粗提物進(jìn)行純化，獲得達(dá)到醫(yī)用級(jí)疫苗純度水平的日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗樣品。本工藝具有生產(chǎn)簡(jiǎn)便、分離效率高、分離速度快、制備規(guī)?？煞糯?，產(chǎn)品為高濃度的日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗超螺旋形式，無(wú)有毒化學(xué)試劑污染、內(nèi)毒素含量低，且具有無(wú)宿主細(xì)菌基因組DNA、RNA污染的優(yōu)點(diǎn)。
經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗通過(guò)融合表達(dá)的日本血吸蟲抗原基因能通過(guò)表達(dá)抗原免疫產(chǎn)生較好的保護(hù)力。WHO指出疫苗誘導(dǎo)肌體抗血吸蟲的保護(hù)力能達(dá)到50％，即可認(rèn)為疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)程度較高。
免疫方案如下190只8周齡的雄性BALB/c小鼠購(gòu)自武漢生物制品研究所，隨機(jī)分到18個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組經(jīng)股四頭肌肌肉注射0.75％鹽酸布比卡因，35μl/只。1天后在相同部位根據(jù)分組分別注射18種日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗，100μg/只，免疫1次，對(duì)照組注射生理鹽水。
免疫后4周，每只實(shí)驗(yàn)鼠經(jīng)腹部皮膚人工感染40±2條日本血吸蟲尾蚴。攻擊后6周剖殺，肝門靜脈灌注收集成蟲計(jì)數(shù)。稱右葉肝組織重量，加入5％KOH 20ml，于37℃孵箱中消化12h(過(guò)夜)，蟲卵計(jì)數(shù)，算出蟲卵數(shù)/g肝組織(EPG)。減蟲率和肝組織減卵率的計(jì)算公式為減蟲率(％)＝(對(duì)照組平均蟲數(shù)-免疫組平均蟲數(shù))×100％/(對(duì)照組平均蟲數(shù))；減卵率(％)＝(對(duì)照組平均肝內(nèi)蟲卵數(shù)-免疫組平均肝內(nèi)蟲卵數(shù))×100％/(對(duì)照組平均肝內(nèi)蟲卵數(shù))；剖殺后，取肝片組織于10％福爾馬林中固定，常規(guī)石蠟連續(xù)切片，厚度為5μm，蘇木素-伊紅染色，在光鏡下觀察鼠肝病變。用目鏡網(wǎng)狀測(cè)微器(Olympus，日本)觀察，蟲卵肉芽腫面積的測(cè)量，按照方格數(shù)切割拼接，計(jì)算肉芽腫截面積，并求出蟲卵肉芽腫的平均面積，每組以20個(gè)單卵肉芽腫面積計(jì)算。
本實(shí)驗(yàn)的觀察指標(biāo)如下1.減蟲率


(1)Δ與生理鹽水組比較；(2)★與pVIVO2sj23組比較；(3)※與pVIVO2組比較；(4)#與pVIVO2sjFABP-23組比較2.減卵率

(1)Δ與生理鹽水組比較；(2)★與pVIVO2sj23組比較；(3)※與pVIVO2組比較；(4)#與pVIVO2sjFABP-23組比較3.蟲卵肉芽腫面積的比較

※與pVIVO2組比較本發(fā)明日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗的減蟲率達(dá)到為52.1％～65.3％，肝臟減卵率達(dá)到為39.8％～75.6％。按照WHO制定的血吸蟲疫苗標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明效果明顯，能高效誘導(dǎo)抗血吸蟲的免疫保護(hù)作用。


圖1為pVIVO2真核表達(dá)載體；圖2為日本血吸蟲總RNA電泳圖；圖3為血吸蟲抗原基因sjFABP、sj23、sjGAPDH、sj26；血吸蟲抗原基因的融合基因sj23-FABP、sjFABP-23、sj26-GAPDH、sjGAPDH-26的PCR產(chǎn)物鑒定電泳圖；圖4為pVIVO2/sjFABP-23構(gòu)建策略圖；圖5為pVIVO2sjFABP-23/sjGAPDH-26構(gòu)建策略圖；圖6為pVIVO2/sjFABP-23單酶切、雙酶切鑒定電泳圖；圖7為pVIVO2sjFABP-23/sjGAPDH-26單酶切、雙酶切、四酶切鑒定電泳圖；圖8為第一步分離樣品電泳圖和色譜收集曲線；圖9為第二步分離樣品電泳圖和色譜收集曲線。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明以WHO/TDR推薦的血吸蟲最具潛力的疫苗候選分子為血吸蟲抗原基因，包括sj23(23kDa膜蛋白)，sjFABP(脂肪酸結(jié)合蛋白)，sj26(谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶)，sjGAPDH(甘油磷酸脫氫酶)，sj97(副肌球蛋白)，sjTPI(磷酸丙糖異構(gòu)酶)。這6種日本血吸蟲抗原基因編碼區(qū)核苷酸序列通過(guò)查找GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)而獲得。上述基因的克隆方案均采用反轉(zhuǎn)錄PCR的方法進(jìn)行，即根據(jù)各基因兩端的序列設(shè)計(jì)PCR引物，然后以組織來(lái)源的RNA為模板，采用RT-PCR反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增相應(yīng)基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序加以驗(yàn)證。然后通過(guò)“融合PCR的重疊延伸技術(shù)”實(shí)驗(yàn)手段，人工構(gòu)建含有sj23、sjFABP、sj26、sjGAPDH、sjTPI、sj97的日本血吸蟲抗原基因的融合基因。
該融合基因由sjFABP、sj23、sjGAPDH、sj26、sjTPI、sj97這6種日本血吸蟲抗原基因兩兩之間任意組合，在兩抗原基因間通過(guò)一段編碼疏水性多肽(G4S)m(1＜m＜10)的DNA序列連接，并且在翻譯的過(guò)程中保持原來(lái)的閱讀框。該編碼疏水性多肽(ggnggnggnggnagy)m，其中，其中y＝(c或t)，n＝(a或g或c或t)。30種日本血吸蟲抗原基因的融合基因編碼區(qū)核苷酸序列，如表一所示。
本發(fā)明以pVIVO2，pcDNA3.1(+/-)，pVAC，pBOOST2，pFUSE-Fc為真核表達(dá)載體(例如附圖1)，將日本血吸蟲抗原基因的融合基因或者日本血吸蟲抗原基因插入真核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建了若干種日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗。
在下面的實(shí)施例中，進(jìn)一步說(shuō)明了本發(fā)明，這并不限制本發(fā)明的范圍。
〔實(shí)例1〕日本血吸蟲抗原基因sjFABP、sj23、sjGAPDH、sj26、sjTPI、sj97的克隆1.成蟲總RNA的提取1)用生理鹽水主動(dòng)脈灌注法從感染42天的家兔門靜脈收集成蟲；2)取新鮮成蟲100mg，加入1ml Trizol，以玻璃勻漿器于冰上快速碾磨使成勻漿，室溫下放置5min；3)加入0.2ml氯仿，振搖15S，室溫放置3min；
4)4℃，12000rpm離心15min，將上清轉(zhuǎn)移至另一EP管中；5)加入0.5ml異丙醇，渦旋混勻，室溫靜置10min；6)4℃，12000rpm離心10min，沉淀RNA，棄上清；7)加入75％乙醇1ml，4℃，7500rpm離心5min，棄上清；8)空氣中干燥RNA 10min，加DEPC水50μl懸浮，55℃靜置10min使之完全溶解，于-70℃保存；9)取2μlRNA溶液，0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性，電泳檢測(cè)圖片見附圖2；10)取2μl RNA溶液，用DEPC水作50倍稀釋，以核酸蛋分析儀測(cè)定標(biāo)定濃度，RNA濃度(μg/μl)＝40×OD260值×稀釋倍數(shù)/1000。
2.cDNA第一鏈制備按Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書，于PCR管中加入下列成分

總反應(yīng)體系為20μl，瞬時(shí)離心混勻后25℃退火5min，37℃逆轉(zhuǎn)錄60min，70℃15min終止反應(yīng)，得到cDNA，-20℃保存。以上述cDNA為模板分別以相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到含有不同酶切位點(diǎn)的目的單基因片段。
3.RT-PCR擴(kuò)增抗原基因片段根據(jù)sjFABP、sj23、sjGAPDH、sj26、sjTPI、sj97的堿基序列以及表達(dá)載體的特征設(shè)計(jì)八對(duì)特異性引物P1～P12。


反應(yīng)體系

反應(yīng)條件

4.血吸蟲抗原基因sjFABP、sj23、sjGAPDH、sj26、sjTPI、sj97的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，0.7％瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖片見圖3。
5.血吸蟲單價(jià)抗原基因sjFABP、sj23、sjGAPDH、sj26、sjTPI、sj97的基因克隆1)將經(jīng)過(guò)電泳鑒定的PCR產(chǎn)物，用膠帶回收試劑盒(Omega公司)進(jìn)行目的條帶回收；2)回收產(chǎn)物用加A試劑盒(申能博采公司)對(duì)PCR產(chǎn)物加A尾；3)用pGEM T(Promega公司)試劑盒進(jìn)行連接，4℃連接過(guò)夜；
4)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌GT110，涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上(Amp100μg/ml，X-Gal 20μg/ml，IPTG 200μg/ml)，37℃培養(yǎng)16h；5)進(jìn)行蘭白斑篩選，PCR、酶切鑒定陽(yáng)性克隆子；6)測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆子插入序列，獲得插入sj23的陽(yáng)性克隆子(pGEM-sj23)，插入sjFABP的陽(yáng)性克隆子(pGEM-sjFABP)，插入sjGAPDH的陽(yáng)性克隆子(pGEM-sjGAPDH)，插入sj26的陽(yáng)性克隆子(pGEM-sj26)，插入sjTPI的陽(yáng)性克隆子(pGEM-sjTPI)，插入sj97的陽(yáng)性克隆子(pGEM-sj97)。
(實(shí)例2)融合抗原基因的制備1.構(gòu)建30種日本血吸蟲抗原基因的融合基因所需的融合PCR鉸鏈區(qū)引物，以及上下游引物，如表二所示。
2.融合PCR制備30種日本血吸蟲抗原基因的融合基因(以sj23-FABP為例，其他29種依此類推)1)第一步PCR反應(yīng)



2)重疊延伸PCR反應(yīng)將上述PCR產(chǎn)物獲得的目的基因sj23和sjFABP片段電泳后，用膠帶回收試劑盒(Omega公司)進(jìn)行目的條帶混合回收，以如下反應(yīng)條件進(jìn)行重疊延伸

3)第三步PCR反應(yīng)將上述重疊延伸PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行第三步PCR反應(yīng)，以如下反應(yīng)條件合成融合抗原基因sj23-FABP

3.日本血吸蟲抗原基因sj23，sjFABP的融合基因sj23-FABP的基因克隆1)將經(jīng)過(guò)電泳鑒定的PCR產(chǎn)物，用膠帶回收試劑盒(Omega公司)進(jìn)行目的條帶回收；2)用pGEM T(Promega公司)試劑盒進(jìn)行連接，4℃連接過(guò)夜；3)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌GT110，涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上(Amp100μg/ml，X-Gal 20μg/ml，IPTG 200μg/ml)，37℃培養(yǎng)16h；
4)進(jìn)行蘭白斑篩選，PCR、酶切鑒定陽(yáng)性克隆子；5)測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆子插入序列，獲得插入sj23-FABP的陽(yáng)性克隆子。
5.日本血吸蟲抗原基因的融合基因PCR產(chǎn)物電泳鑒定將已經(jīng)獲得的30種日本血吸蟲抗原基因的融合基因sj23-FABP，sj23-26，sj23-GAPDH，sj23-97，sj23-TPI，sjFABP-23，sjFABP-26，sjFABP-GAPDH，sjFABP-97，sjFABP-TPI，sj26-23，sj26-FABP，sj26-GAPDH，sj26-97，sj26-TPI，sjGAPDH-23，sjGAPDH-FABP，sjGAPDH-26，sjGAPDH-97，sjGAPDH-TPI，sj97-23，sj97-FABP，sj97-26，sj97-GAPDH，sj97-TPI，sjTPI-23，sjTPI-FABP，sjTPI-26，sjTPI-GAPDH，sjTPI-97的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，0.7％瓊脂糖凝膠電泳，其中sj23-FABP，sjFABP-23，sjGAPDH-26，sj26-GAPDH電泳圖片，日本血吸蟲抗原基因，日本血吸蟲抗原基因的融合基因電泳圖片見圖3Lane 1，6，11，16DL2000；Lane211kb Ladder；Lane2sj23；Lane3sjFABPLane4sj23-FABP；Lane5sjFABP-23；Lane7sj26；Lane8sjGAPDH；Lane9sj26-GAPDH；Lane10sjGAPDH-26；Lane12sjTPI；Lane13sjFABP；Lane14sjTPI-FABP；Lane15sjFABP-TPI；Lane17sjGAPDH；Lane18sj97；Lane19sjGAPDH-97；Lane20sj97-GAPDH。
〔實(shí)例3〕日本血吸蟲DNA多價(jià)疫苗pVIVO2/sjFABP-23，pVIVO2/sjFABP-23/sjGAPDH-26的構(gòu)建融合抗原基因片段sjFABP-23，其5’端含有BamHI酶切位點(diǎn) 其3’端含有EcoRI酶切位點(diǎn) 將以上含sj FABP-23融合抗原基因的T載體用Bam HI和EcoR I雙酶切，回收sjFABP-23基因。用Bam HI和EcoR I雙酶切pVIVO2，回收pVIVO2片段。將sjFABP-23基因插入pVIVO2的BamHI和EcoRI之間，構(gòu)建策略見附圖4。具體操作如下1.構(gòu)建pVIVO2sjFABP-23的重組質(zhì)粒用限制型內(nèi)切酶EcoRI和BamHI對(duì)sjFABP-23片段DNA進(jìn)行雙酶切。反應(yīng)體系為10×(Y+TangoTM)buffer 5μl，質(zhì)粒5μg，BamHI 10U，EcoRI 10U，補(bǔ)水至50μl?；靹蚝?7℃水浴中反應(yīng)8-9小時(shí)或者過(guò)夜。之后將消化樣品進(jìn)行1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收sjFABP-23片段。同時(shí)用EcoRI和BamHI雙酶切pVIVO2載體。反應(yīng)體系10×(Y+TangoTM)buffer 5μl，質(zhì)粒5μg，BamHI 10U，EcoRI 10U，補(bǔ)水至50μl?；靹蚝?7℃水浴中反應(yīng)8-9小時(shí)或者過(guò)夜。之后將消化樣品進(jìn)行1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收pVIVO2片段。
將上述的pVIVO2酶切片段與sjFABP-23片段混合，以T4DNA ligase(MBI)進(jìn)行連接。連接體系為pVIVO2酶切片段0.1μg，sjFABP-23片段3μg，10×Ligation Buffer 1μl，Ligase 0.2U，補(bǔ)水至10μl。連接反應(yīng)條件定為12℃10小時(shí)。
將上述連接反應(yīng)產(chǎn)物以CaCl2法轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌GT110中(詳見分子克隆手冊(cè)實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002)；連接產(chǎn)物10μl與GT110(1～2×109細(xì)菌/ml)感受態(tài)細(xì)胞200μl混合，冰浴30分鐘，42℃2分鐘，冰浴10分鐘，加入0.6ml 2YT液體培養(yǎng)基(16g蛋白胨/L，10g酵母提取物/L，5g NaCl/L)，37℃培養(yǎng)45分鐘后鋪于含有潮霉素B(50μg/ml)的瓊脂平板。37C培養(yǎng)12小時(shí)后在瓊脂平板上出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子。挑選轉(zhuǎn)化子接種在含有100μg/ml潮霉素B的3ml 2YT培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，6000rpm/分鐘離心收集菌體，以質(zhì)粒小抽試劑盒(Promega)提取質(zhì)粒DNA。然后用EcoRI和BamHI進(jìn)行雙酶切鑒定。反應(yīng)體系為10×(Y+TangoTM)buffer 5μl，重組質(zhì)粒1μg，BamHI 10U，EcoRI 10U，補(bǔ)水至50μl。37℃水浴中反應(yīng)8-9小時(shí)或者過(guò)夜。之后將消化的樣品進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可見約1000bp的sjFABP-23片段和5.89kb的pVIVO2載體片段。說(shuō)明篩選到的該陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子為日本血吸蟲DNA多價(jià)疫苗pVIVO2sjFABP-23。
日本血吸蟲DNA多價(jià)疫苗pVIVO2sjGAPDH-26的構(gòu)建采取類似的方法融合抗原基因片段sjGAPDH-26，其5’端含有BspHI酶切位點(diǎn) 其3’端含有XbaI酶切位點(diǎn) 將以上含sjGAPDH-26融合抗原基因的T載體用BspHI和XbaI雙酶切，回收sjGAPDH-26基因。用BspHI和XbaI雙酶切pVIVO2sjFABP-23，回收pVIVO2sjFABP-23片段。將sjGAPDH-26基因插入pVIVO2sjFABP-23的BspHI和XbaI之間，構(gòu)建策略見附圖5。
2.構(gòu)建pVIVO2sjFABP-23/sjGAPDH-26的重組質(zhì)粒用限制型內(nèi)切酶BspHI和XbaI對(duì)sjGAPDH-26片段DNA進(jìn)行雙酶切。反應(yīng)體系為10×(O+)buffer 5μl，質(zhì)粒5μg，BspHI 10U，XbaI 10U，補(bǔ)水至50μl?；靹蚝?7℃水浴中反應(yīng)8-9小時(shí)或者過(guò)夜。之后將消化樣品進(jìn)行1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收sjGAPDH-26片段。同時(shí)用BspHI和XbaI雙酶切pVIVO2sjFABP-23載體。反應(yīng)體系10×(O+)buffer 5μl，質(zhì)粒5μg，BspHI 10U，XbaI10U，補(bǔ)水至50μl。混勻后37℃水浴中反應(yīng)8-9小時(shí)或者過(guò)夜。之后將消化樣品進(jìn)行1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收pVIVO2sjFABP-23片段。
將上述的pVIVO2sjFABP-23酶切片段與sjGAPDH-26片段混合，以T4DNA igase(MBI)進(jìn)行連接。連接體系為pVIVO2sjFABP-23酶切片段0.1μg，sjGAPDH-26片段3μg，10×Ligation Buffer 1μl，Ligase 0.2U，補(bǔ)水至10μl。連接反應(yīng)條件為12℃10小時(shí)。
將上述連接反應(yīng)產(chǎn)物以CaCl2法轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌GT110中(詳見分子克隆手冊(cè)實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002)；連接產(chǎn)物10μl與GT110(1～2×109細(xì)菌/ml)感受態(tài)細(xì)胞200μl混合，冰浴30分鐘，42℃2分鐘，冰浴10分鐘，加入0.6ml 2YT液體培養(yǎng)基(16g蛋白胨/L，10g酵母提取物/L，5g NaCl/L)，37℃培養(yǎng)45分鐘后鋪于含有潮霉素B(50μg/ml)的瓊脂平板，37℃培養(yǎng)12小時(shí)后在瓊脂平板上出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子。挑選轉(zhuǎn)化子接種在含有100μg/ml潮霉素B的3ml 2YT培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，6,000rpm/分鐘離心收集菌體，以質(zhì)粒小抽試劑盒(Promega)提取質(zhì)粒DNA。然后用BspHI和XbaI進(jìn)行雙酶切鑒定。反應(yīng)體系為10×(O+)buffer 5μl，重組質(zhì)粒1μg，BspHI 10U，XbaI 10U，補(bǔ)水至50μl。37℃水浴中反應(yīng)8-9小時(shí)或者過(guò)夜。之后將消化的樣品進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可見越1700bp的sjGAPDH-26片段和6.89kbpVIVO2sjFABP-23載體片段。說(shuō)明篩選到的該陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子為重組pVIVO2sjFABP-23/sj GAPDH-26。
3.日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗pVIVO2sjFABP-23，pVIVO2sjFABP-23/sj GAPDH-26酶切電泳驗(yàn)證用限制型內(nèi)切酶EcoRI和BamHI對(duì)pVIVO2sjFABP-23質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切。反應(yīng)體系為10×(Y+TangoTM)buffer 5μl，質(zhì)粒5μg，BamHI 10U，EcoRI 10U，補(bǔ)水至50μl?；靹蚝?7℃水浴中反應(yīng)8-9小時(shí)或者過(guò)夜。0.7％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，見附圖6Lanel，41kb Ladder；Lane2EcoRI和BamHI對(duì)pVIVO2/sjFABP-23質(zhì)粒雙酶切；Lane3pVIVO2/sjFABP-23質(zhì)粒。
用限制型內(nèi)切酶BspHI和XbaI對(duì)pVIVO2sjFABP-23/sjGAPDH-26質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切。反應(yīng)體系為10×(O+)buffer 5μl，質(zhì)粒5μg，BspHI 10U，XbaI 10U，補(bǔ)水至50μl。混勻后37℃水浴中反應(yīng)8-9小時(shí)或者過(guò)夜。0.7％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，見附圖7。
用限制型內(nèi)切酶EcoRI和BamHI對(duì)pVIVO2sjFABP-23/sjGAPDH-26質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切。反應(yīng)體系為10×(Y+TangoTM)buffer 10μl，質(zhì)粒10μg，BamHI 20U，EcoRI20U，補(bǔ)水至100μl。混勻后37℃水浴中反應(yīng)8-9小時(shí)或者過(guò)夜。0.7％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，見附圖7。
取50μl用EcoRI和BamHI對(duì)pVIVO2sjFABP-23/sjGAPDH-26質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切酶切后的混合液，用等體積酚/氯仿(V/V＝1∶1)混合液抽提，上清轉(zhuǎn)移到另外一只干凈EP管中，加入等體積氯仿抽提，上清轉(zhuǎn)移到另外一只干凈EP管中，用兩倍體積的冰冷無(wú)水乙醇沉淀，置于-70℃冰箱30min。4℃，15000rpm離心15min，用75％乙醇脫鹽兩次，稍稍涼干，再用適量超純水融解沉淀。再用用限制型內(nèi)切酶BspHI和XbaI對(duì)已經(jīng)經(jīng)過(guò)限制型內(nèi)切酶EcoRI和BamHI雙酶切的pVIVO2sjFABP-23/sj GAPDH-26質(zhì)粒DNA再次進(jìn)行雙酶切。反應(yīng)體系為10×(O+)buffer 5μl，質(zhì)粒5μg，BspHI 10U，XbaI 10U，補(bǔ)水至50μl?；靹蚝?7℃水浴中反應(yīng)8-9小時(shí)或者過(guò)夜。0.7％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，見附圖7Lane1DL2000；Lane2BspHI和XbaI對(duì)pVIVO2sjFABP-23/sjGAPDH-26質(zhì)粒雙酶切；Lane3EcoRI和BamHI對(duì)pVIVO2sjFABP-23/sj GAPDH-26質(zhì)粒雙酶切；Lane4EcoRI，BamHI，BspHI和XbaI對(duì)pVIVO2sjFABP-23/sj GAPDH-26質(zhì)粒四酶切；Lane5EcoRI對(duì)pVIVO2sjFABP-23/sj GAPDH-26質(zhì)粒單酶切；Lane61kb Ladder。
〔實(shí)例4〕日本血吸蟲DNA多價(jià)疫苗pVIVO2sjFABP-23/sj26大規(guī)模制備本發(fā)明的日本血吸蟲DNA多價(jià)疫苗使用上述的重組菌落大規(guī)模發(fā)酵制備的。培養(yǎng)方式為液體培養(yǎng)。采用細(xì)菌發(fā)酵罐進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，選用LB液體培養(yǎng)基(5g酵母膏/L；10g蛋白胨/L；10gNaCl/L)作為種子培養(yǎng)基，選用發(fā)酵培養(yǎng)基配方(30g酵母膏/L，10gNaCl/L；滅菌前調(diào)整pH到7)。發(fā)酵時(shí)添加礦物油作為消泡劑。培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間24h。繁殖之后的菌體中分離日本血吸蟲DNA多價(jià)疫苗，采用常規(guī)方法(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002)，純化步驟如下1.樣品溶解將堿裂解法最后得到的異丙醇沉淀樣品稱重，然后用玻棒輕輕攪碎以便充分溶解，按照25ml/g的量加入TE溶液在搖床上4℃回旋5h。
2.樣品初步去蛋白溶解的樣品按9.9g/g的量加入固體(NH4)2SO4，然后再用TE定容到30ml/g，使最終(NH4)2SO4的濃度為2.5M。樣品12000rpm離心20min，收集上清，然后用0.45μm微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾。
3.粗樣品去除RNA，去蛋白用硫酸銨粗提后的大提質(zhì)粒樣品，經(jīng)凝膠過(guò)濾柱Sepharose 6FF(Pharmacia制造)除去RNA。線速度1cm/min；緩沖液10mM EDTA，100mM Tris-HCl，0.2M(NH4)2SO4，pH8.0。見圖8，分離樣品電泳圖Lane1質(zhì)粒DNA和宿主RNA混合物；Lane2純化后的質(zhì)粒DNA；Lane3被除去的雜質(zhì)RNA，和第一步分離樣品的色譜收集曲線。
4.經(jīng)過(guò)去除RNA的樣品，經(jīng)Plasmid Select(Pharmacia制造)以不同離子強(qiáng)度洗脫，從超螺旋DNA、開環(huán)DNA中純化超螺旋DNA。經(jīng)凝膠過(guò)濾除去RNA的樣品(V1ml)，加入固體硫酸銨(132.FABP×2.5×1.2×V1ml)，溶解后，用TE緩沖液定容到1.2×V1ml，按100∶1的體積比加入無(wú)水乙醇，0.45μm過(guò)濾。線速度0.5cm/min；平衡緩沖液；2.0M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH8.0，按100∶1的體積比加入無(wú)水乙醇；洗脫緩沖液1.4M(NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH8.0。見圖9，分離樣品電泳圖Lane1從樣品中除去的開環(huán)質(zhì)粒DNA；Lane 2從樣品中純化的超螺旋質(zhì)粒DNA；Lane3樣品(開環(huán)質(zhì)粒DNA和超螺旋質(zhì)粒DNA的混合物)，和第二步分離樣品的色譜收集曲線。
5.通過(guò)Source30Q(Pharmacia制造)去除內(nèi)毒素將純化好的超螺旋DNA加入四倍體積無(wú)菌水。線速度3cm/min，平衡緩沖液0.4M NaCl，10mM EDTA，100mMTris-HCl，pH 8.0；洗脫緩沖液1.0M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 8.0。電泳檢測(cè)，收集第二峰。
表一30種日本血吸蟲抗原基因的融合基因的核苷酸序列和它們?cè)贜CBI的GenBank所對(duì)應(yīng)的各自的Accession Number


表二為30種日本血吸蟲抗原基因的融合基因的鉸鏈區(qū)(-)、(+)鏈引物





權(quán)利要求
1.一種日本血吸蟲抗原基因的融合基因，該融合基因由日本血吸蟲抗原基因脂肪酸結(jié)合蛋白sjFABP
23kDa膜蛋白 sj23甘油磷酸脫氫酶sjGAPDH谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶sj26磷酸丙糖異構(gòu)酶sjTPI副肌球蛋白sj97兩兩之間任意組合，在兩抗原基因間通過(guò)一段編碼疏水性多肽的DNA序列(G4S)m連接，并且在翻譯的過(guò)程中保持原來(lái)的閱讀框，其中1＜m＜10。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合基因，其特征在于所述編碼疏水性多肽的DNA序列為(ggnggnggnggnagy)m，其中y＝c或t，n＝a、g、c或t，1＜m＜10”。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的融合基因，其特征在于該融合基因?yàn)楸硪凰镜?0種日本血吸蟲抗原基因的融合基因編碼區(qū)核苷酸序列。
4.一種由權(quán)利要求1所述的融合基因構(gòu)成的日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗，其特征在于以pVIVO2，pcDNA3.1(+/-)，pVAC，pBOOST2，pFUSE-Fc為真核表達(dá)載體，在該真核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)上插入有至少一個(gè)日本血吸蟲抗原基因的融合基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗，其特征在于在所述真核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)上還插入有日本血吸蟲抗原基因。
6.一種權(quán)利要求4所述的日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗的制備方法，其步驟包括(1)提取日本血吸蟲總RNA；(2)RT-PCR獲得日本血吸蟲抗原基因，克隆基因并測(cè)序驗(yàn)證；(3)利用“融合PCR”的手段獲得融合日本血吸蟲抗原基因的融合基因，克隆基因并測(cè)序驗(yàn)證；(4)將日本血吸蟲抗原基因的融合基因或者日本血吸蟲抗原基因插入真核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建若干種日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗，酶切測(cè)序驗(yàn)證，挑取陽(yáng)性克隆子保種；(5)發(fā)酵陽(yáng)性克隆菌，收取菌體，利用標(biāo)準(zhǔn)堿裂解法獲得日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗粗提物；(6)利用色譜純化法，采用凝膠排阻色譜、離子柱層析和親和吸附聯(lián)用的手段，獲得達(dá)到醫(yī)用級(jí)疫苗純度水平的日本血吸蟲多價(jià)DNA疫苗樣品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種日本血吸蟲抗原基因的融合基因及構(gòu)成的DNA疫苗和制備方法。該日本血吸蟲DNA多價(jià)疫苗是由日本血吸蟲抗原基因(包括 sj23、 sjFABP、 sj26、sjGAPDH、sjTPI、sj97)及其日本血吸蟲抗原基因的融合基因與具有多個(gè)插入位點(diǎn)的真核表達(dá)載體所組成。30種日本血吸蟲抗原基因的融合基因是由6種日本血吸蟲抗原基因通過(guò)“融合PCR”制備得到。將融合基因或者抗原基因插入真核表達(dá)載體，構(gòu)建日本血吸蟲DNA多價(jià)疫苗。該融合基因在抗原基因基礎(chǔ)上進(jìn)行了改造，實(shí)現(xiàn)了多重抗原免疫保護(hù)，形成針對(duì)血吸蟲多個(gè)發(fā)育階段的持續(xù)免疫殺傷，起到良好的免疫保護(hù)效果。其減蟲率達(dá)到為52.1～65.3％，肝臟減卵率達(dá)到為39.8～75.6％，是一種較為理想的疫苗，在血吸蟲病的預(yù)防與防治中具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/79GK1904053SQ200610124690
公開日2007年1月31日 申請(qǐng)日期2006年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月30日
發(fā)明者余龍江, 朱路, 魯明波, 劉智, 李春艷 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)