專利名稱：Sj16重組蛋白及其在制備血吸蟲病疫苗、診斷試劑、治療藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制劑，尤其是涉及SJ16蛋白在制備血吸蟲病疫苗、診斷試劑、治 療藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血吸蟲病是危害人民身體健康最重要的寄生蟲病。醫(yī)藥業(yè)界普遍認(rèn)為研制血吸蟲 疫苗可能是控制血吸蟲流行最終措施。血吸蟲疫苗的研究已有60多年的歷史，至今尚未找 到一種真正有價值的疫苗。其原因是多方面的，但人們對血吸蟲感染的保護(hù)性免疫機(jī)制及 血吸蟲逃避機(jī)體免疫攻擊的機(jī)制的認(rèn)識不足可能是一個重要原因?，F(xiàn)已有十余個被公認(rèn)有 前途的日本血吸蟲(中國大陸棟)亞單位候選抗原在國內(nèi)獲得了克隆和表達(dá).如，如谷胱 甘肽轉(zhuǎn)移酶、副肌球蛋白、脂肪酸結(jié)合蛋白和23ku膜蛋白等，但其中大多數(shù)候選疫苗分子 尚未達(dá)到所要求的等于或大于40%減蟲率的免疫保護(hù)力。血吸蟲病的早期診斷也是一個尚未解決的難題。感染血吸蟲1個月后，感染者的 糞便中才能檢測到蟲卵，而特異性抗體的出現(xiàn)時間一般在感染后1周左右，且針對抗原的 血清抗體在宿主體內(nèi)長期存在，不能區(qū)分早期和既往感染，沒有療效考核價值。此外，目前 用于檢測特異性抗體的診斷抗原主要是成蟲抗原和蟲卵抗原，但這類抗原成分復(fù)雜，也不 易大量獲得。一般認(rèn)為宿主體內(nèi)(體液中)存在血吸蟲抗原，表明有活動性感染的可能，故 檢測宿主體內(nèi)是否存在血吸蟲循環(huán)抗原，可用于血吸蟲病的診斷和療效。但循環(huán)抗原進(jìn)入 血液系統(tǒng)后，以抗原抗體復(fù)合物的形式存在，降低了檢測的靈敏度，給診斷帶來了困難。特 別是慢性血吸蟲病患者感染度普遍偏低，血清和尿液中檢測循環(huán)抗原的陽性率較低。在慢 性血吸蟲病患者血清中，由于CAg不斷與血清抗體結(jié)合形成血吸蟲循環(huán)免疫復(fù)合物(CIC)， 故CAg含量較少。目前尚缺乏能實(shí)際應(yīng)用的抗原檢測試劑。學(xué)者們也為解決血吸蟲病療效考核的方法問題作了大量研究。目前國內(nèi)外在研究 短程抗體的檢測方面取得了較大進(jìn)展，如用抗獨(dú)特型抗體，重組抗原，或用某些血吸蟲抗 原組分對抗體亞類進(jìn)行檢測。但敏感性不及檢測總抗體者為高，故對其應(yīng)用價值還有待于
進(jìn)一步探索。綜上，尋求新的血吸蟲病疫苗候選分子和具有早期診斷價值的血吸蟲生物標(biāo)志物 是當(dāng)前血吸蟲病診斷技術(shù)實(shí)現(xiàn)突破的關(guān)鍵。我們注意到，日本血吸蟲(S. japonicunOSjie 是蟲體分泌蛋白，其基因序列已被克隆，并建立了重組表達(dá)體系。但尚未有人對SJ16進(jìn)行 在診斷和免疫預(yù)防中的價值的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明對SJ16蛋白在血吸蟲病診斷和免疫預(yù)防中的價值進(jìn)行了研究，目的在于 提供一種含有活性成分的SJ16重組蛋白，并提供含有活性成分基因編碼所述的融合蛋白 的多核苷酸及該多核苷酸序列相應(yīng)的核酸構(gòu)建體系、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。
進(jìn)一步的目的在于提供一種日本血吸蟲疫苗。再進(jìn)一步的目的在于，將SJ16蛋白作為診斷抗原，制備克隆抗體，并由此提供一 種日本血吸蟲病診斷試劑及其使用方法。更進(jìn)一步的目的在于，在此研究的基礎(chǔ)上提供治療日本血吸蟲病的藥物。具體的技術(shù)方案為一、關(guān)于SJ16重組蛋白及帶活性基因編碼的多核苷酸首先，我們對SJ16蛋白全長序列(SEQ ID NO 4)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)有2個核定位 序列肽段。分別將這兩個核定位序列肽段去除，或同時去除，得到了三個不同的活性成分片 段。SJ16在本發(fā)明中的作用，包括SJ16在日本血吸蟲在診斷方面的應(yīng)用；SJ16蛋白的疫苗 活性成分；并發(fā)現(xiàn)SJ16蛋白，以及SJ16蛋白的前、中、后三個活性片段并優(yōu)選其活性片段應(yīng) 用于診斷和制備血吸蟲疫苗。在本發(fā)明中，對這三個活性片段分別命名為SJ16-l、SJ16-2、 SJ16-3(對應(yīng)于 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，基因編碼見序列表)。在對全長的SJ16及三個活性片段進(jìn)行了克隆表達(dá)和對小鼠的保護(hù)性實(shí)驗(yàn)中，證 實(shí)了 SJ16蛋白及這些活性片段或它們的任意組合都能引起特異性免疫反應(yīng)，對實(shí)驗(yàn)動物 具有免疫保護(hù)作用。并跟據(jù)需要針對活性片段進(jìn)行重組表達(dá)，希望得到更優(yōu)質(zhì)的活性蛋白。 通過實(shí)驗(yàn)證明，在重組蛋白中，與SJ16蛋白或其活性片段具有70%以上的同一性的功能 性變體或這些功能性變體的組合物都具有較好的免疫保護(hù)作用，其中更優(yōu)選的范圍是具有 80%以上的同一性的功能性變體或這些功能性變體的組合物。在對上述SJ16蛋白及其活性片段進(jìn)行重組多肽的研究結(jié)果也表明，含SJ16蛋白 活性氨基酸片段的數(shù)量為10以上的多肽的免疫保護(hù)作用較好。在此研究的過程中，我們還提供了含有SJ16蛋白活性成分基因編碼所述的融合 蛋白的多核苷酸及該多核苷酸序列相應(yīng)的核酸構(gòu)建體系、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。二、應(yīng)用于制備日本血吸蟲病疫苗居于上述第一點(diǎn)研究的基礎(chǔ)上，我們將上述活性物質(zhì)應(yīng)用于制備預(yù)防日本血吸蟲 的疫苗。該疫苗包含上述所提及的重組蛋白作為活性成分。即該疫苗的蛋白組成多肽序列 包含SJ16蛋白或SJ16蛋白的活性片段SEQ ID NO :1或SEQID NO :2或SEQ ID NO 3序列 其中的一種或幾種?；虬cSJ16蛋白或SJ16蛋白的活性片段具有70%以上的同一性的 功能性變體中的一種或幾種。三、應(yīng)用于制備日本血吸蟲病診斷試劑在血吸蟲感染過程中，由于SJ16蛋白參與了免疫逃避，在患者體內(nèi)不引起強(qiáng)烈的 免疫應(yīng)答。SJ16蛋白主要以游離形式存在，因此，我們認(rèn)為可以通過對SJ16的檢測來區(qū)分 既往感染或現(xiàn)行感染；并可以達(dá)到很高的靈敏度。通過動物感染實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)，感染 1天后，即可檢測到血清中SJ16，比檢測特異性抗體的時間明顯提前，因此認(rèn)為以SJ16蛋白 作為診斷抗原，其檢測特異性抗體的靈敏度明顯高于現(xiàn)有的診斷抗原，并具有早期診斷價 值。具體方案為，以SJ16蛋白活性成份作為診斷抗原，通過抗體克隆技術(shù)得到對應(yīng)的 克隆抗體作為診斷試劑，檢測到血清中SJ16蛋白。使用方法為將生物樣品與克隆抗體接 觸，并檢測是否產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而判斷是否感染。四、應(yīng)用于制備日本血吸蟲病的治療藥物
在本發(fā)明的研究過程中，我們觀察到，所涉及的這些活性蛋白及多肽片段有減蟲 和減卵的作用；可以用于制備治療日本血吸蟲病的藥物。即該藥物由SJ16蛋白、其活性片 段或其同一性為70%以上的功能性變體制備。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有以下優(yōu)點(diǎn)和創(chuàng)新第一，本發(fā)明首次提出將SJ16蛋白應(yīng)用于血吸蟲病診斷，制備診斷試劑。該方法 不但可以區(qū)分血吸蟲的既往或現(xiàn)行感染，且檢測靈敏度高，具有確切的早期診斷價值。第二，本發(fā)明首次提出將SJ16應(yīng)用于血吸蟲病的疫苗制備及治療藥物制備。第三，本發(fā)明提供的新型免疫抑制劑來源于病原體生物資源，具有極其廣闊的市 場空間和較好的社會、經(jīng)濟(jì)效益。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1根據(jù)日本血吸蟲SJ16基因序列設(shè)計引物，經(jīng)PCRDESIGN軟件分析，由上海生工生 物工程公司合成，引物Pl為5，GCCATATGAACATGACTTTAATTAAC，引入NdeI酶切位點(diǎn)；引物P2 為 5，ACTTAATACTTTGTAGAATTCGAACCjIA HindIII 酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增出全長 SJ16 基因。實(shí)施例2SJ16全長的表達(dá)和鑒定及純化利用所設(shè)計的一對引物(P1、P2)成功擴(kuò)增。將其克隆到PGEX-4T-1載體上，挑 取篩選到的pGEX-4T-l-Sjl6-l重組質(zhì)粒的DNA，以其為模板，用Pl、P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 獲取的特異性條帶；雙酶切驗(yàn)證其大小與預(yù)期序列一致；將所篩選的重組質(zhì)粒送TaKaRa 公司測序，測序結(jié)果無誤。獲得的重組質(zhì)粒確實(shí)為pGEX-4T-l-Sjl6-l重組質(zhì)粒。將 PGEX-4T-1-SJ16-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，15% SDS-PAGE電泳顯示在 分子量約46kDa處出現(xiàn)一明顯蛋白條帶，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌在誘導(dǎo)前后以及重組質(zhì)粒工程菌 在誘導(dǎo)前后均無此條帶的出現(xiàn)，表明此蛋白條帶可能為目的蛋白條帶。菌體裂解上清上亦 有此蛋白條帶的出現(xiàn)，顯示該蛋白為可溶性表達(dá)。將裂解上清經(jīng)過GST親和層析柱，經(jīng)過 thrombin酶酶切以后，可以得到分子量為19kDa左右的單一蛋白。pGEX-4T BL21轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導(dǎo)后出現(xiàn)一分子量約為26kDa明顯表達(dá)帶，此為GST蛋 白。pGEX-4T-l轉(zhuǎn)化的BL 21-DE3菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，較誘導(dǎo)前于約40Da出現(xiàn)一條明顯的融 合蛋白表達(dá)條帶。免疫印跡分析，該蛋白能特異地被抗GST抗體(1 500稀釋)識別，于 約40Da位置有一條條帶，pGEX24T-l轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導(dǎo)于約26kDa處有一條條帶為pGEX_4T_l 轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)GST蛋白能特異地被抗GST抗體識別。ST柱親和層析純化。實(shí)施例3SJ16-1、SJ16-2、Sj 16-3 的表達(dá)和鑒定。根據(jù)SJ16-1的蛋白序列直接合成相應(yīng)的DNA序列，命名為SJ16-1序列。根據(jù) SJ16-2、SJ16-3之間引入柔性臂(-GGAGGA-)，使SJ16-2、SJ16-3融合；再根據(jù)其蛋白序列設(shè) 計相應(yīng)的核酸序列。分別將其克隆到PGEX-4T-1載體上，挑取篩選到的pGEX-4T-l-Sjl6-l、 pGEX-4T-l-Sjl6-2、pGEX-4T-l-Sjl6_3重組質(zhì)粒的DNA,以其為模板，用相應(yīng)引物進(jìn) 行PCR擴(kuò)增獲取的特異性條帶；雙酶切驗(yàn)證其大小與預(yù)期序列一致；將所篩選的重組 質(zhì)粒送TaKaRa公司測序，測序結(jié)果無誤。獲得的重組質(zhì)粒確實(shí)為pGEX_4T_ 1 -Sj 16-1、pGEX-4T-l-Sj 16-2-3 重組質(zhì)粒。將 pGEX_4T-l-Sjl6-l、pGEX-4T-l_Sj 16-2-3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 的工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，15% SDS-PAGE電泳顯示其分別在分子量約40kDa、84kDa處 出現(xiàn)一明顯蛋白條帶，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌在誘導(dǎo)前后以及重組質(zhì)粒工程菌在誘導(dǎo)前后均無此 條帶的出現(xiàn)，表明此蛋白條帶可能為目的蛋白條帶。菌體裂解上清上亦有此蛋白條帶的出 現(xiàn)，顯示該蛋白為可溶性表達(dá)。將裂解上清經(jīng)過GST親和層析柱，經(jīng)過thrombin酶酶切以 后，可以得到分子量為14kDa、36kDa左右的單一蛋白pGEX-4T-l轉(zhuǎn)化的BL21-D E3菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，較誘導(dǎo)前于約40kDa、84kDa出現(xiàn) 一條明顯的融合蛋白表達(dá)條帶。免疫印跡分析，該蛋白能特異地被抗GST抗體(1 500稀 釋)識別，于約40kDa、84kDa位置有一條條帶，pGEX24T 21轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導(dǎo)于約26kDa處有 一條條帶為PGEX-4T-1轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)GST蛋白能特異地被抗GST抗體識別。GST柱親 和層析純化。實(shí)施例4SJ16單克隆抗體的制備純化SJ16抗原50 μ g加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射純種BALB/C小鼠免疫3_4次， 末次加強(qiáng)免疫3天后，取脾融合；取108脾淋巴細(xì)胞懸液備用。取對數(shù)生長骨髓瘤細(xì)胞離 心；取得X107細(xì)胞備用。選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞制備飼養(yǎng)細(xì)胞層，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1X105/ ml備用。進(jìn)行細(xì)胞融合。將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1 10比例混合，用無血清不完全培養(yǎng) 液洗1次；90s內(nèi)加入37°C預(yù)溫的Iml 45% PEG(分子量4000)溶液，。37°C水浴作用90s ； 加37度預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用，每隔2min分別加入lml、2ml、3ml、4ml、5ml 和6ml ；離心，去上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸。將上述細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng) 細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，每孔加100μ 1。培養(yǎng)板置37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用SJ16蛋白進(jìn)行ELISA檢測，篩選出陽性雜交瘤細(xì)胞。篩選出的陽性細(xì)胞株進(jìn)行 單克隆抗體制備。實(shí)施例5制備SJ16單克隆抗體，然后以SJ16單克隆抗體用ELISA方法檢測感染血吸蟲動 物血清；平行實(shí)驗(yàn)對照為M r 31 000/32 000抗原單克隆抗體。以血吸蟲尾蚴免疫小鼠， 每組動物各8只，感染45天后殺鼠取的血清，SJ16單克隆抗體ELISA檢測，陽性檢出率為 92. 1% ；M r 31 000/32 000抗原單克隆抗體檢出率52. 3%，無假陽，無交叉。SJ16單克隆抗體檢出靈敏度和特異性比M r 31 000/32 000高。兩者相比有統(tǒng)計 學(xué)意義。實(shí)施例6SJ16-1核酸疫苗保護(hù)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了 DNA疫苗SJ16-1，并且加不同的佐劑用肌肉注射法分別免疫昆明鼠及 BALB/c小鼠，與對照組相比，裸露DNA誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了 Sjl6-1特異性抗體，并對日本血吸蟲 的攻擊感染顯示了一定的保護(hù)效果。成蟲減少率為45.7%，肝卵EPG減少率為40. 1%，腸 卵減少率為37. 4%，肝臟表面結(jié)節(jié)也明顯的減少，統(tǒng)計學(xué)分析有顯著性意義。實(shí)施例7SJ16-1、SJ16-2、Sj 16-3 蛋白疫苗保護(hù)實(shí)驗(yàn)
重組蛋白Sjl6-1、Sj 16-2, Sjl6_3分別與等量FCA混合，皮下注射免疫BALB/c 小鼠(以FCA作對照)，與PBS注射對照組相比，免疫組減蟲率達(dá)42.9%，肝卵減少率為 44.9%，腸卵減少率為40.3%。統(tǒng)計學(xué)上差異有顯著性。上述結(jié)果提示Sjl6-1、Sjl6-2、 Sjl6-3蛋白可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生明顯的抗日本血吸蟲攻擊感染的保護(hù)力。實(shí)施例8:SJ16蛋白功能性變體疫苗保護(hù)實(shí)驗(yàn)通過序列分析，將SJ16-1定點(diǎn)突變，得到新的功能性變體，其序列MK VTPIIF AVFCVVGGMTLITGTTLEQGPHPSEKDMELVYIDAEYEKE AGLKSICNEIKRSFREDLGM KM LDVAKI L。通過定點(diǎn)技術(shù)，得到相應(yīng) 的核酸序列，并重組克隆到pET-32a載體，構(gòu)建了重組蛋白SJ16-lt。將重組蛋白Sjl6_lt 與等量FCA混合，皮下注射免疫BALB/c小鼠(以FCA作對照)，與PBS注射對照組相比，免 疫組減蟲率達(dá)44. 9%，肝卵減少率為50. 2%，腸卵減少率為43. 3%。統(tǒng)計學(xué)上差異有顯著 性。上述結(jié)果提示Sjl6-lt蛋白可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生明顯的抗日本血吸蟲攻擊感染的保護(hù)力。
權(quán)利要求
一種SJ16重組蛋白，其特征在于該蛋白組成多肽序列包含SJ16蛋白或SJ16蛋白的活性片段SEQ ID NO1或SEQ ID NO2或SEQ ID NO3序列或與上述蛋白具有70％以上同一性的功能性變體中的一種或幾種。
2.如權(quán)利要求1所述的重組蛋白，其特征在于所述功能性變體的同一性為80%以上。
3.—種重組多肽，其特征在于該重組多肽包含權(quán)利要求1所述的任一蛋白氨基酸片 段的數(shù)量為10以上。
4.一種多核苷酸，其特征在于該核苷酸包含權(quán)利要求1所述的任何一種蛋白的核酸 序列。
5.一種如權(quán)利要求4所述的多核苷酸的載體，其特征在于該載體含有權(quán)利要求4所 述的核酸序列。
6.一種抗體，其特征在于該抗體由權(quán)利要求1所述的重組蛋白制備。
7.權(quán)利要求1所述的重組蛋白在制備血吸蟲病診斷試劑中的應(yīng)用，該診斷試劑包括權(quán) 利要求6所述的抗體。
8.權(quán)利要求1所述的重組蛋白在制備血吸蟲病疫苗中的應(yīng)用，該疫苗由權(quán)利要求1所 述的重組蛋白制備。
9.權(quán)利要求1所述的重組蛋白在制備治療血吸蟲病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一系列SJ16重組蛋白及其在制備血吸蟲病疫苗、診斷試劑、治療藥物中的應(yīng)用技術(shù)。包括由SJ16蛋白分離得到活性片段SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3，通過蛋白重組得到系列同一性70％以上的功能性變體。進(jìn)一步將上述蛋白應(yīng)用于制備血吸蟲病疫苗、診斷試劑、治療藥物。本發(fā)明是首次提出將SJ16蛋白應(yīng)用于血吸蟲病診斷制備診斷試劑，該方法不但可以區(qū)分血吸蟲的既往或現(xiàn)行感染，且檢測靈敏度高，具有確切的早期診斷價值。也是首次提出將SJ16應(yīng)用于血吸蟲病的疫苗和治療藥物的制備。而且，本發(fā)明提供的新型免疫抑制劑來源于病原體生物資源，具有極其廣闊的市場空間和較好的社會、經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號A61K39/00GK101985468SQ20101050178
公開日2011年3月16日 申請日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
發(fā)明者劉靈輝, 卞國武, 呂志躍, 吳忠道, 孫希, 楊琳琳, 胡少敏, 阮志燕 申請人:中山大學(xué)