專(zhuān)利名稱(chēng)：：日本血吸蟲(chóng)重組多表位抗原及其表達(dá)、純化方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物基因，具體涉及日本血吸蟲(chóng)重組多表位抗原及其表達(dá)、純化方法與在制備日本血吸蟲(chóng)病免疫預(yù)防疫苗和診斷試劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：日本血吸蟲(chóng)病是一種重要的人獸共患寄生蟲(chóng)病。由于中間宿主釘螺難以消滅及血吸蟲(chóng)重復(fù)感染現(xiàn)象嚴(yán)重，單靠藥物治療不能控制血吸蟲(chóng)病流行和最終消滅血吸蟲(chóng)病，因此抗血吸蟲(chóng)病疫苗研究已經(jīng)成為血防科研工作的重點(diǎn)之一。至今已有上百個(gè)血吸蟲(chóng)抗原基因被克隆和鑒定，不少于30種血吸蟲(chóng)基因重組抗原疫苗和核酸疫苗用于動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)，一些基因工程苗也取得了一定的保護(hù)效果。但由于血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體大，抗原性復(fù)雜，單一抗原誘導(dǎo)的保護(hù)效果不夠理想。表位(印itope)又稱(chēng)抗原決定簇，是指決定某抗原物質(zhì)抗原特異性的化學(xué)基團(tuán)。T細(xì)胞和B細(xì)胞表面均存在特異性抗原受體，能識(shí)別相應(yīng)的抗原表位，根據(jù)表位設(shè)計(jì)疫苗，包括合成肽疫苗、多價(jià)基因工程疫苗及表位核酸疫苗，是疫苗設(shè)計(jì)的一種新途徑?？乖募庸ぞ褪翘烊坏鞍踪|(zhì)抗原在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過(guò)蛋白酶水解，轉(zhuǎn)變成和組織相容性復(fù)合物(MHC)分子相結(jié)合的肽段的過(guò)程，加工后的抗原被轉(zhuǎn)送至細(xì)胞表面以抗原肽—MHC相結(jié)合的形式進(jìn)入三元體被免疫細(xì)胞識(shí)別，被稱(chēng)為抗原呈遞。依照抗原加工呈遞原理可以人工預(yù)測(cè)、篩選抗原表位，而且研究人員已經(jīng)根據(jù)此原理設(shè)計(jì)了計(jì)算機(jī)應(yīng)用程序和數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)預(yù)測(cè)抗原加工呈遞過(guò)程并進(jìn)行抗原表位篩選，構(gòu)建多表位基因工程抗原疫苗或核酸疫苗，期望其可增強(qiáng)單一抗原的免疫原性，并誘導(dǎo)更高的免疫保護(hù)效果。表位是疫苗設(shè)計(jì)和免疫識(shí)別的基礎(chǔ)，因此，加強(qiáng)日本血吸蟲(chóng)抗原表位研究，利用重組多表位抗原進(jìn)行聯(lián)合免疫或設(shè)計(jì)含多個(gè)表位的基因工程重組抗原疫苗或核酸疫苗，是一條值得探索的提高疫苗保護(hù)力的途徑。曰本血吸蟲(chóng)病診斷方法主要有病原診斷和免疫診斷兩種。牛、羊等大家畜的病原診斷方法目前應(yīng)用較多的是尼龍篩淘洗集卵結(jié)合糞便毛蚴孵化法，該法結(jié)果可靠，但檢出率低、花費(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng)。現(xiàn)有的家畜血吸蟲(chóng)病血清學(xué)診斷方法的應(yīng)用提高了診斷方法的敏感性，但特異性、重復(fù)性等還不夠穩(wěn)定。應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)，尋找更為理想的診斷抗原，對(duì)提高血清學(xué)診斷方法的敏感性、特異性將有很大的幫助。本發(fā)明應(yīng)用生物信息學(xué)方法和基因工程技術(shù)研制的重組多價(jià)核酸疫苗pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28和重組多表位抗原pGEX-BSJGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28在小鼠免疫實(shí)驗(yàn)中獲得了較好的免疫保護(hù)效果，重組多表位抗原在牛日本血吸蟲(chóng)病診斷中具有較高的敏感性和特異性，表明該種多表位重組抗原和核酸疫苗的研制方法及其產(chǎn)物具有較高的應(yīng)用價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于研究設(shè)計(jì)日本血吸蟲(chóng)重組多表位抗原的表達(dá)和純化以及在制備日本血吸蟲(chóng)病免疫預(yù)防疫苗和診斷試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種日本血吸蟲(chóng)重組多表位抗原。所述日本血吸蟲(chóng)重組多表位抗原編碼核苷酸片段具有如下核酸序列和相應(yīng)的蛋白序列-1)BSjGCP-BSj23核酸序列(見(jiàn)序列表SEQID4)atgcgaattggatatgagggtctaccacgtgatcaatggccaaaagtgattcattggaat60ctacatgcacgtgacggtattatctgggtattagatggtctattgaaatgtccggaaaaa120ctttgcccattacttgctgaagatgttgattattattctagaatgactggtgctctggaa180aatccaaacgaggaaataacggcaaccatggatsagatacaaacgtcattccattgttgt240ggagtcaaaggtccagacgattataaagggaatgtgccagcatcatgtaaagaagggcaa300gaagtttatgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattcttgaaacgcaac354BSjGCP-BSj23GlySerMetArg蛋白序列(見(jiàn)序列表SEQlieGlyTyrGluGlyLeuID9)ProArgAspGin1LysVallieLeuAspGluAsn65CysAsp50GluGly35ValHis20Leu5TrpAsnLeuHisLeuLysCysAspTyrTyrGlulieThrCysGlyValSerCysLysPheSerAla115Glu100PheLys85GlyAla70GlySer55ThrPro40ArgAla25Glu10ArgAspGlylieLysLeuCysMetThrGlyMetAspLysProAspAspGinGluValLeuLysArgTyr105LysTyr90ValLeulie75LysAla60GinPro45Leulie30LeuTrp15TrpProValLeuAlaGluAsnProThrSerPheGlyAsnValGinGlyCysLeu110Pro95SerHis80AlaValAsn1202)BSjGCP-BSj23-BSj28核酸序列(見(jiàn)序列表SEQID5)atgcgaattggatatgagggtctaccacgtgatcaatggccaaaagtgattcattggaat60ctacatgcacgtgacggtattatctgggtattagatggtctattgaaatgtccggaaaaa120ctttgcccattacttgctgaagatgttgattattattctagaatgactggtgctctggaa180aatccaaacgaggaaataacggcaaccatggataagatacaaacgtcattccattgttgt240ggagtcaaaggtccagacgattataaagggaatgtgccagcatcatgtaaagaagggcaa300gaagtttatgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattcttgaaacgcaacgaattc360犯gccaccag站gaaaaagageiaaatctccaaggagatattgaacggtaaagttcccatt420cttctccaagcaatttgtgaaaccttaaaagagtctacaggtaatctgactgtcgga477BSjGCP-BSj23-BSj28蛋白序歹lj:(見(jiàn)序列表SEQID10)GlySerMetArglieGlyTyrGluGlyLeuProArgAspGinTrpPro151015LysVallieHisTrpAsnLeuHisAlaArgAspGlylielieTrpVal202530LeuAspGlyLeuLeuLysCysProGluLysLeuCysProLeuLeuAla354045GluAspValAspTyrTyrSerArgMetThrGlyAlaLeuGluAsnPro505560AsnGluGlulieThrAlaThrMetAspLyslieGinThrSerPheHis65707580CysCysGlyValLysGlyProAspAspTyrLysGlyAsnValProAla859095SerCysLysGluGlyGinGluValTyrValGinGlyCysLeuSerVal100105110PheSerAlaPheLeuLysArgAsnGluPheLysProProGluGluLys115120125GluLyslieSerLysGlulieLeuAsnGlyLysValProlieLeuLeu130135140GinAlalieCysGluThrLeuLysGluSerThrGlyAsnLeuThrVal145150155160GlyLysLeu。本發(fā)明另一目的提供了日本血吸蟲(chóng)重組多表位抗原的表達(dá)和純化方法。本發(fā)明應(yīng)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)和篩選了日本血吸蟲(chóng)抱雌溝蛋白(SjGCP)的抗原表位，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增了日本血吸蟲(chóng)23KDa表膜蛋白(SJ23)，日本血吸蟲(chóng)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Sj28GST)和日本血吸蟲(chóng)抱雌溝蛋白(SjGCP)的各一段富含表位的肽段所對(duì)應(yīng)的編碼核苷酸片段，運(yùn)用基因工程重組技術(shù)將此三種核苷酸片段重組到載體pCMV-script和pGEX-2T中，構(gòu)建了pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28多表位真核表達(dá)質(zhì)粒及pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28原核表達(dá)質(zhì)粒。將真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-BSJGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28純化后直接以肌肉注射的方法免疫昆明系小鼠，分別獲得了14.76%、64.95%減蟲(chóng)率。將重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)并且純化到重組蛋白。本發(fā)明提供的日本血吸蟲(chóng)重組多表位抗原的表達(dá)和純化方法包括以下步驟(1)利用生物信息學(xué)在線分析程序RANKPEP篩選到日本血吸蟲(chóng)抱雌溝蛋白SjGCP'的第539590位肽段的表位集中區(qū)為BSjGCP表位，截取日本血吸蟲(chóng)23KD抗原(Sj23)的大親水區(qū)(LHD-SJ23)作為表位BSj23，選取和曼氏血吸蟲(chóng)Sm28KdGST抗原的第115-153氨基酸肽段對(duì)應(yīng)的Sj28GST肽段為BSj28表位，將三種抗原表位重組成BSjGCP-BSj23和BSjGCP-BSj23-BSj28多表位抗原；(2)根據(jù)上述表位的核酸序列分別設(shè)計(jì)PCR引物，并在兩端加上特異限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增各表位編碼核酸片斷，再利用特異限制性?xún)?nèi)切酶BamHI、XbaI、EcoRI、HindIII依次將編碼BSjGCP、BSj23、BSj28表位抗原的核酸片段定向克隆至真核表達(dá)載體pCMV的多克隆位點(diǎn)區(qū)，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-BSjGCP-BSj23及pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28,并在大腸桿菌DH5a中大量培養(yǎng)，肌肉注射免疫小鼠。(3)將重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-BSjGCP-BSj23及pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28中的編碼BSjGCP-BSj23和BSjGCP-BSj23-BSj28多表位抗原的核酸片段利用特異限制性?xún)?nèi)切酶BamHI、EcoRI、HindIII定向克隆至原核表達(dá)載體pGEX-2T多克隆位點(diǎn)區(qū)，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-BSjGCP-BSj23及pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28;將上述兩種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并用親和層析純化GST融合蛋白的方法純化到日本血吸蟲(chóng)多表位重組蛋白，應(yīng)用重組蛋白制備成疫苗進(jìn)行血吸蟲(chóng)病免疫預(yù)防試驗(yàn)并將重組蛋白作為診斷試劑進(jìn)行牛血吸蟲(chóng)病診斷試驗(yàn)。本發(fā)明又一目的提供了日本血吸蟲(chóng)重組多表位抗原在制備預(yù)防日本血吸蟲(chóng)的免疫預(yù)防疫苗和診斷日本血吸蟲(chóng)的試劑中的應(yīng)用。經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明提供的多表位核酸疫苗pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28在昆明系小鼠中分別獲得了14.76%、64.95%的減蟲(chóng)率。重組多表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28免疫BalB/c小鼠獲得了15.7%、57.99%的減蟲(chóng)率，作為診斷抗原分別獲得了91.0%、89.9%的敏感性和97.8%、93.4%的特異性，可以用于制備診斷血吸蟲(chóng)的試劑。圖1:重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-BSjGCP-BSj23和pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28的構(gòu)建圖2:重組真核表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定M:DL2000Marker,1:BamHI和Hindin酶切后空質(zhì)粒pCMV,2:BamHI和HindIII酶切后的pCMV-BSj23-BSj28，3:BamHI和HindlII酶切后pCMV-BSjGCP-BSj23，4:BamHI和HindIII酶切后pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28圖3:重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-BSjGCP-BSj23和pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28的構(gòu)建圖4:重組質(zhì)粒pGEX-BSjGCP-BSj23的雙酶切鑒定和PCR鑒定分析1、2、5、6:BamHI和EcoRI雙酶切空載pGEX，M:DNAMarker,3:BamHI和EcoRI雙酶切pGEX-BSjGCP-BSj23，4:pGEX-BSjGCP-BSj23PCR鑒定圖5:重組質(zhì)粒pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28的雙酶切鑒定1、2、3、4:BamHI和HindIII雙酶切pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28M:DNAmarker圖6:SDS-PAGE分析IPTG誘導(dǎo)pGEX-BSjGCP-BSJ23/BL21的表達(dá)1:IPTG誘導(dǎo)了6小時(shí)的pGEX/BL21，2:IPTG誘導(dǎo)了6小時(shí)的空宿主菌BL21，3-8:分別為誘導(dǎo)了Oh、2h、4h、6h、8h、10h的pGEX-BSjGCP-BSj23/BL21，M:低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)圖7:融合蛋白pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28時(shí)相表達(dá)的電泳分析1:IPTG誘導(dǎo)了6小時(shí)的空宿主菌BL21;2:IPTG誘導(dǎo)了6小時(shí)的pGEX/BL21;3-8:分別為誘導(dǎo)了Oh、2h、4h、6h、8h、10h的pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28/BL21，M:低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)圖8:SDS-PAGE分析純化的pGEX-BSjGCP-BSj23與pGEX-BSjGCP-BSj23_BSj281:純化的pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28，2:純化的pGEX-BSjGCP-BSj23，M:低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施例l、日本血吸蟲(chóng)多表位重組核酸疫苗構(gòu)建與免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)1、材料1、1質(zhì)粒與菌株真核表達(dá)載體pCMV-script,大腸桿菌DH5a等購(gòu)自上海申能博彩生物技術(shù)公司。1、2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性昆明系小鼠，體重25g，購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1、3日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株尾蚴中國(guó)農(nóng)科院上海獸醫(yī)研究所釘螺室提供。1、5主要試劑氨芐青霉素、卡那霉素、Agarose、Tryptone、酵母提取物、NaCl等購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；DNAMarkerDL2000、dNTPMixture、MgCl2、TaqDNAPloyrose、限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI、HindIII、B柳HI、XbaI、T<DNAligase連接酶等為大連寶生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。DNAAgaroseGelPurificationKit純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等購(gòu)自天為時(shí)代生物有限公司。2、方法2、1抗原表位的預(yù)測(cè)與篩選2、1、1SjGCP表位篩選根據(jù)日本血吸蟲(chóng)SjGCP(GenBankaccessionnumber:AF519183)的編碼基因序列及相應(yīng)的氨基酸序列，在http:〃bio.dfci.harvard.edu/RANKPEP/網(wǎng)站上分析預(yù)測(cè)其線性T細(xì)胞抗原表位，篩選出的表位所對(duì)應(yīng)的編碼核苷酸序列簡(jiǎn)稱(chēng)為BSjGCP。2、1、2Sj23抗原表位選取日本血吸蟲(chóng)23KD抗原(Sj23)的大親水區(qū)(LHD-SJ23)(簡(jiǎn)稱(chēng)BSj23，其對(duì)應(yīng)的編碼核苷酸序列共192bp)構(gòu)建重組的多價(jià)疫苗，抗原表位預(yù)測(cè)表明，該肽段含有多個(gè)T細(xì)胞和B細(xì)胞抗原表位。2、1、3Sj28GST表位參照曼氏血吸蟲(chóng)Sm28KdGST表位分析與鑒定結(jié)果選取，Sm28GST抗原的115-131，140-153肽段為其兩個(gè)重要的T細(xì)胞表位，blast比較發(fā)現(xiàn)Sj28GST與Sm28GST的具有很高的同源性，其115-153肽段與曼氏血吸蟲(chóng)的對(duì)應(yīng)肽段極為相似(相似率為76%)，故本研究中選擇了這一肽段。將所對(duì)應(yīng)的其編碼核苷酸序列簡(jiǎn)稱(chēng)為BSj28(共117bp)。2、2重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-BSjGCP-BSj23和pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28的構(gòu)建根據(jù)表位分析篩選結(jié)果，確定克隆策略(如圖l所示)，分別設(shè)計(jì)引物，以日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA為模板PCR擴(kuò)增目的片段BSjGCP、BSj23和BSj28，并進(jìn)行酶切、連接等基因重組，將各表位片段重組到pCMV-script載體中，構(gòu)建pCMV-BSJGCP-BSj23和pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28重組真核表達(dá)質(zhì)粒。根據(jù)日本血吸蟲(chóng)抱雌溝蛋白(GCP)539590位氨基酸的編碼核苷酸序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，在BSjGCP的上游引物BSjGCP(叩)5'端加上限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和啟動(dòng)密碼子ATG,在BSjGCP下游引物BSjGCP(down)5'端加上限制性酶切位點(diǎn)XbaI，具體如下BSjGCP(up)5，-AATAGGATCCATGCGAATTGGATATG-3，，BSjGCP(down)5,-GCGCTCTAGAATAATAATCAACATCTTCAG-3，;根據(jù)日本血吸蟲(chóng)Sj23大親水區(qū)編碼核苷酸序列分別設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，在LHD-SJ23上游引物BSj23(up)5'端加上限制性酶切位點(diǎn)XbaI，在BSj23下游引物BSj23(down)的5'端加上限制性酶切位點(diǎn)EcoRI，具體如下；BSj23(up)5，-AATA3HA^ATGACTGGTGCTCTGGA-3',BSj23(down)5，-CGCGGAATTCGTTGCGTTTTAAG-3，根據(jù)日本血吸蟲(chóng)Sj28GST的115153區(qū)段氨基酸的編碼核苷酸序列分別設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，在BSj28上游引物BSj28(叩)5'端加上限制性酶切位點(diǎn)EcoRI，在BSj28下游引物BSj28(down)5'端加上限制性酶切位點(diǎn)HindIII及終止密碼子，具體如下BSj28(up)5，-CGGCGAATTCAAGCCACCAGAAGAA-3，，BSj28(down)5，-ATTAAAGCTTCTATCCGACAGTCAGATTA-3'。所有引物的5'端添上四個(gè)保護(hù)性堿基，由基康生物公司合成。根據(jù)下列PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系Template(日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA)mi,10XPCRBuffer5W，MgCl23W，dNTP(2.5mM)扭l，PCRprimer(20pmol/l4)各0.5l4，TaKaRaTaqpolyrase(5uM)，滅菌去離子水35.5Pl加至總體積50W。PCR擴(kuò)增條件如下:預(yù)變性，94°C5分鐘;按94。C變性45秒，BSjGCP55。C、BSj2353°C、BSj2857t:各復(fù)性45秒；72'C延長(zhǎng)反應(yīng)1分，共擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，再于72'C延長(zhǎng)反應(yīng)10分鐘,最后將PCR產(chǎn)物保存于4'C，進(jìn)行瓊脂糖水平電泳觀察PCR產(chǎn)物。按天為時(shí)代生物有限公司DNAAgaroseGelPurificationKit純化、回收試劑盒的操作手冊(cè)進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收純化。最后將DNA溶解于30WTE或水。利用上述PCR引物兩側(cè)和pCMV-script載體中的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，用特異限制性?xún)?nèi)切酶BamHI、XbaI、EcoRI、HindIII將上述表位的DNA片斷依次克隆進(jìn)pCMV-script載體，構(gòu)建pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28重組真核表達(dá)質(zhì)粒。首先用BamHI、XbaI將BSjGCP表位DNA片斷和pCMV-script載體酶切，用^DNAligase將兩者重組連接，制備pCMV-BSjGCP重組質(zhì)粒。然后用XbaI、EcoRI將BSj23表位DNA片斷和pCMV-BSjGCP重組質(zhì)粒酶切，用T《DNAligase將兩者重組連接，制備pCMV-BSjGCP-BSj23重組質(zhì)粒。最后用EcoRI、Hind11I將BSj28表位DNA片斷和pCMV-BSjGCP-BSj23重組質(zhì)粒酶切，用T4DNA1igase將兩者重組連接，制備pCMV-BSjGCP-BSJ23-BSj28重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a。最后將重組質(zhì)粒用酶切鑒定，并將陽(yáng)性克隆送上?；瞪锕緶y(cè)序。2、3動(dòng)物免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)2、3、1大量制備重組質(zhì)粒和空載體大量培養(yǎng)含pCMV-BSjGCP-BSj23和pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28重組質(zhì)粒和空載體pCMV-script的大腸桿菌，按照上海天為時(shí)代生物有限公司的質(zhì)粒抽提試劑盒方法，大量制備重組質(zhì)粒pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28和pCMV-script載體，紫外分光光度計(jì)分別測(cè)量?jī)煞N質(zhì)粒的A^和A^，并計(jì)算出純度和含量，-2(TC保存。2、3、2免疫和攻擊感染30只昆明系小鼠分三個(gè)組，每組10只，每只小鼠在后腿肌肉部位分別多點(diǎn)注射pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28重組質(zhì)?；騪CMV-script空載體各50Pg，每隔兩周免疫一次，共免疫三次。第三次免疫后第三周，試驗(yàn)鼠經(jīng)腹部皮膚感染日本血吸蟲(chóng)尾呦(40土1)條。2、3、3計(jì)算減蟲(chóng)率攻擊感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴42天后，剖殺小鼠，沖蟲(chóng)計(jì)數(shù)，按照公式減蟲(chóng)率=(對(duì)照組平均檢獲成蟲(chóng)數(shù)-實(shí)驗(yàn)組平均檢獲成蟲(chóng)數(shù))+對(duì)照組平均檢獲成蟲(chóng)數(shù)X100X，計(jì)算減蟲(chóng)率。3、結(jié)果3、1抗原表位分析結(jié)果3、1、1SjGCP的抗原表位分析結(jié)果根據(jù)日本血吸蟲(chóng)SjGCP(GenBankaccessionnumber:AF519183)的編碼基因序列及相應(yīng)的氨基酸序列，在http:〃bio.dfci.harvard.edu/RANKPEP/網(wǎng)站上分析預(yù)測(cè)其線性T細(xì)胞抗原表位，以不同大小的TAP肽段作為條件選擇參數(shù)，分析結(jié)果表明在該蛋白的C端集中著對(duì)人類(lèi)HLA-ALL具有較好結(jié)合效率的抗原肽。進(jìn)一步進(jìn)行MHCI類(lèi)分子結(jié)合的普適性分析和結(jié)合特異性分析，結(jié)果顯示該蛋白的539548位，578590位的肽段具有較好的參與抗原呈遞的特性，適合作為表位，另外在這兩個(gè)肽段之間被篩選出來(lái)的肽段也較多，并且分值較高，如553562位的肽段。結(jié)果表明在SjGCP的539590位的肽段(其編碼核苷酸序列共156bp)是一個(gè)潛在的表位集中區(qū)。因此優(yōu)先選擇了該肽段作為研究的表位之一。具體序列(見(jiàn)序列表SEQID6)如下MRIGYEGLPRDQWPKVIHWNLHARDGIIWVLDGLLKCPEKLCPLLAEDVDYY對(duì)應(yīng)的核苷酸序列(見(jiàn)序列表SEQID1)為acgtgacggtattatctgggtattagatggtctattgaaatgtccggaaaaactttgcccattacttgctgaagatgttgattattat3、1、2BSj23的抗原表位分析及序列截取日本血吸蟲(chóng)23KD抗原(Sj23)的大親水區(qū)(LHD-SJ23)作為BSj23序列(見(jiàn)序列表SEQID7)MTGALENPNEEITATMDKIQTSFHCCGVKGPDDYKG證ASCKEGQEVYVQGCLSVFSAFLKRN對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為(見(jiàn)序列表SEQID2)ccattgttgtggagtcaaaggtccagacgattataaagggaatgtgccagcatcatgtaaagaagggcaagaagtttatgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattcttgaaacgcaac3、1、3BSj28的抗原表位分析及序列截取和曼氏血吸蟲(chóng)Sm28KdGST抗原的第115-153氨基酸肽段對(duì)應(yīng)的Sj28GST肽段為BSj28表位序列(見(jiàn)序列表SEQID8):KPPEEKEKISKEILNGKVPILLQAICETLKESTGNLTVG對(duì)應(yīng)的核苷酸序列(見(jiàn)序列表SEQID3)為Aagccaccagaaga朋aagagaaaatctcceiaggagatattgaacggtaaagttcccattcttctccaagcaatttgtgaaaccttaaaagagtctacaggtaatctgactgtcgga3、2多表位重組質(zhì)粒的構(gòu)建將BSjGCP和BSj23表位的核苷酸序列用限制性?xún)?nèi)切酶連接，序列如下(見(jiàn)序列表SEQID4)AAGCTT相應(yīng)的氨基酸序列為(見(jiàn)序列表SEQID9)ATMDKIQTSFHCCGVKGPDDYKGNVPASCKEGQEVYVQGCLSVFSAFLKRNKL將BSjGCP、BSj23和BSj28表位的核苷酸序列用限制性?xún)?nèi)切酶連接，序列如下:(見(jiàn)序列表SEQID5)AAGCAATTTGTGAAACCTTAAAAGAGTCTACAGGTAATCTGACTGTCGGAAAGCTT對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為(見(jiàn)序列表SEQID10)GSMRIGYEGLPRDQWPKVIHWNLHARDGIIWVLDGLLKCPEKLCPLLAEDVDYYSRMTGALENPNEEITATMDKIQTSFHCCGVKGPDDYKGNVPASCKEGQEVYVQGCLSVFSAFLKRNEFKPPEEKEKISKEILNGKVPILLQAICETLKESTGNLTVGKL三種重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后，分別出現(xiàn)了約300bp,340bp,500bp左右大小的DNA條帶,表明為正確重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定為重組正確(見(jiàn)圖2)。3、4動(dòng)物免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)小鼠于攻擊感染42天后剖殺、沖蟲(chóng)計(jì)數(shù)，pCMV空載體對(duì)照組平均蟲(chóng)荷數(shù)為17.75，pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28試驗(yàn)組平均蟲(chóng)荷數(shù)分別為15.13、6.25，和對(duì)照組相比其減蟲(chóng)率分別為14.76%、64.95%。其中三價(jià)重組質(zhì)粒試驗(yàn)組的蟲(chóng)荷數(shù)明顯低于對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示差異非常顯著(P<0.01)(見(jiàn)表l)。表l:動(dòng)物免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實(shí)施例2、日本血吸蟲(chóng)多表位重組抗原的表達(dá)、純化與免疫預(yù)防實(shí)驗(yàn)1、材料1、1質(zhì)粒與菌株原核表達(dá)載體pGEX-2T，大腸桿菌DH5a，BL21等購(gòu)自上海申能博彩生物技術(shù)公司。1、2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c系小鼠雄性，6周齡，購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1、3閂本血吸蟲(chóng)尾蚴由中國(guó)農(nóng)科院上海家畜寄生蟲(chóng)病研究所釘螺室提供。1、4酶類(lèi)及其它相關(guān)試劑氨芐青霉素、IPTG、X-gal、谷胱甘肽、尿素等購(gòu)自上海生工生物工程公司。DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker等購(gòu)自天為時(shí)代生物公司，蛋白重折疊試劑盒購(gòu)自普飛生物公司。Ta^DNA聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI、Xbal、HindIII、BamHI購(gòu)自TaKaRa公司?？捡R斯亮蘭R250為Fluka進(jìn)口分裝。氯仿、異丙醇等生化試劑購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。2、方法2、1重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-BSjGCP-BSj23和pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28的構(gòu)建分別以前述BSjGCP(叩)和BSj23(down)或BSjGCP(up)和BSj28(down)為引物，以質(zhì)粒pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28為模板，應(yīng)用PCR擴(kuò)增目的DNA片斷BSjGCP-BSj23和BSjGCP-BSj23-BSj28。(如圖3所示)DNA片斷BSjGCP-BSj23的引物BSjGCP(叩)5'-AATAGGATCCCATGCGAATTGGATATG-3，，BSj23(down)5'-CGCGgMIieGTTGCGTTTTAAG-3，DNA片斷BSjGCP-BSj23-BSj28的引物BSjGCP(up):5'-AATAGGATCCCATGCGAATTGGATATG-3，，BSj28(down):5'-ATTAAAGCTTTCCGACAGTCAGATTA-3，；PCR反應(yīng)體系同前，94'C預(yù)變性5分鐘；按94。C變性45秒，56。C復(fù)性45秒，72'C延長(zhǎng)反應(yīng)1分，共擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，再于72。C延長(zhǎng)反應(yīng)10分鐘，最后將PCR產(chǎn)物保存于4。C，進(jìn)行瓊脂糖水平電泳觀察PCR產(chǎn)物。按天為時(shí)代生物有限公司DNAAgaroseGelPurificationKit純化回收試劑盒的操作手冊(cè)進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收純化。最后將DNA溶解于30riTE或水。用BamHI、EcoRI將表位BSjGCP-BSj23的DNA片斷和pGEX-2T載體酶切，用^DNAligase重組連接，構(gòu)建pGEX-BSjGCP-BSj23重組質(zhì)粒。用BamHI、HindIII將表位BSjGCP-BSj23-BSj28的DNA片斷和pGEX-2T載體酶切，用T,DNAligase將兩者重組連接，構(gòu)建pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28重組組質(zhì)粒(如圖3所示)，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a。然后將重組質(zhì)粒用酶切、PCR鑒定，并將陽(yáng)性克隆送上?；瞪锕緶y(cè)序。2、2重組多表位質(zhì)粒pGEX-BSjGCP-BSj23和pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28的誘導(dǎo)表達(dá)將陽(yáng)性重組多表位質(zhì)粒pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28分別轉(zhuǎn)化BU感受態(tài)細(xì)胞。將含重組質(zhì)粒的陽(yáng)性菌按l.0%接種入一定量的含50^/1111氨卞青霉素的2YT培養(yǎng)液中，37。C劇烈振搖4小時(shí)，加入IPTG至終濃度lmmol/ml，37。C誘導(dǎo)表達(dá)0、2、4、6、8、IO小時(shí)，各取出lml細(xì)菌培養(yǎng)物于Eppendorf管；10000rpm離心lmin，去掉LB上清培養(yǎng)液。在離心沉淀的菌體中加入2X上樣緩沖液5(mi，(1朋2050^，在混勻器上超聲裂解后于沸水中煮3到5分鐘后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用考馬氏亮藍(lán)對(duì)SDS-PAGE電泳膠進(jìn)行染色，室溫?fù)u動(dòng)染色4小時(shí)以上。脫色后，對(duì)凝膠進(jìn)行掃描，分析其分子量和表達(dá)狀況。2、3重組多表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28的純化將前述鑒定的菌株過(guò)夜培養(yǎng)，第二天按W的量加入200ml液體LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)3h后，加入IPTG誘導(dǎo)6h。4°C,1000r/min離心收集菌體。將收集的菌體在一7(TC冰箱和室溫反復(fù)凍融5次。超聲裂解破碎細(xì)胞10次(10sec/次)，4°C5000g離心15min，分別取離心后的沉淀和上清樣品，以SDS-PAGE電泳分析重組蛋白的溶解性。根據(jù)novagen蛋白重折疊試劑盒預(yù)處理包涵體蛋白，進(jìn)行復(fù)性處理，并進(jìn)一步按Amersham公司提供的GlutathioneS印harose4B親和層析方法進(jìn)行pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28重組蛋白的純化。純化后的重組蛋白用PBS透析去除小分子，經(jīng)SDA-PAGE分析和蛋白含量測(cè)定后，用PBS稀釋至一定濃度，于-2(TC保存?zhèn)溆谩?、4動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)2、4、1免疫將6—7周齡BALB/c系小鼠分成4組，每組6只。其中三個(gè)試驗(yàn)組分別應(yīng)用重組多表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28與福氏佐劑結(jié)合進(jìn)行免疫(每只鼠每次注射抗原50Pg)，每?jī)芍苊庖咭淮危裁庖呷?。試?yàn)設(shè)兩個(gè)對(duì)照組分別為空白對(duì)照組和佐劑對(duì)照組，分別注射福氏佐劑和PBS。2、4、2攻擊感染第三次免疫后二周試驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠經(jīng)腹部皮膚感染日本血吸蟲(chóng)尾呦40條。感染42天后，剖殺小鼠，沖蟲(chóng)計(jì)數(shù)，按照公式減蟲(chóng)率=(對(duì)照組平均檢獲成蟲(chóng)數(shù)_實(shí)驗(yàn)組平均檢獲成蟲(chóng)數(shù))+對(duì)照組平均檢獲成蟲(chóng)數(shù)X100X計(jì)算減蟲(chóng)率。3、結(jié)果3、1多表位重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建利用PCR和限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)BamHI、EcoRI、HindIII，將BSjGCP-BSj23、BSjGCP-BSj23-BSj28表位目的核苷酸片段亞克隆入載體pGEX-2T中，PCR、酶切鑒定重組的原核表達(dá)質(zhì)粒均出現(xiàn)了與預(yù)期大小一致的DNA片段(見(jiàn)圖4、5)。對(duì)陽(yáng)性克隆的菌落小量液體培養(yǎng)后，將菌液樣本送上?；瞪锕緶y(cè)序，結(jié)果證實(shí)含多表位的核苷酸序列編碼閱讀框正確。3、2融合蛋白pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果將含重組質(zhì)粒pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28的BL21大腸桿菌于含50Mg/ml氨卞青霉素的2YT培養(yǎng)液中振搖培養(yǎng)，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)O、2、4、6、8、IO小時(shí)，分別取細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果表明，禾BpGEX/BL21或BL21空宿主菌相比，pGEX-BSjGCP-BSJ23/BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后不同時(shí)相的菌液均有預(yù)期大小的特異目的蛋白(約39KDa)條帶出現(xiàn)，在誘導(dǎo)6小時(shí)后其表達(dá)量達(dá)到最高水平(見(jiàn)圖6)。SDS-PAGE電泳分析誘導(dǎo)后pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28/BL21不同時(shí)間的菌液樣品表明也有預(yù)期大小的目的蛋白(接近45KDa)條帶出現(xiàn)，在誘導(dǎo)6小時(shí)后重組蛋白的表達(dá)量達(dá)到最高水平，8小時(shí)j^達(dá)量開(kāi)始下降(見(jiàn)圖7)。3、3融合蛋白純化結(jié)果分別大量培養(yǎng)菌株BL21/pGEX-BSjGCP-BSj23、BL21/pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28，IPTG誘導(dǎo)后，離心收集菌體，反復(fù)凍融、超聲裂解破碎細(xì)菌，SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28重組蛋白均以包涵體表達(dá)。按novagen蛋白重折疊試劑盒預(yù)進(jìn)行復(fù)性處理，并進(jìn)一步用親和層析方法純化。如圖8所示，經(jīng)過(guò)純化得到了純度較高的重組蛋白。3、4動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)小鼠于攻擊感染42天后剖殺、沖蟲(chóng)計(jì)數(shù)，空白對(duì)照組、佐劑對(duì)照組、pGEX-BSJGCP-BSj23免疫組、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28免疫組的平均蟲(chóng)荷數(shù)分別為21.83、19、18.4和9.17，和對(duì)照組相比兩個(gè)試驗(yàn)組的減蟲(chóng)率分別為15.7%(P〉0.05)和57.99%(P<0.01)(見(jiàn)表2)。表2動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實(shí)施例3、重組多表位抗原用于診斷牛血吸蟲(chóng)病研究試驗(yàn)1、材料1、1抗原重組多表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28，根據(jù)前述的方法制備。-20°(:保存?zhèn)溆谩?、2血清水牛血吸蟲(chóng)病陽(yáng)性血清采自云南省日本血吸蟲(chóng)病疫區(qū)放牧水牛。采集前由當(dāng)?shù)孬F醫(yī)對(duì)目標(biāo)水牛的糞便根據(jù)國(guó)標(biāo)法進(jìn)行糞便毛蚴孵化法檢査以診斷水牛曰本血吸蟲(chóng)病，將糞檢陽(yáng)性水牛的血清作為日本血吸蟲(chóng)病陽(yáng)性血清，共有189份，92份陰性血清采自血吸蟲(chóng)病非疫區(qū)河南的健康牛血清，分離血清保存于-20。C備用。取健康水牛血清50份混合后作水牛標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。1、3明膠、TMB等購(gòu)自天為時(shí)代生物公司，兔抗牛IgG購(gòu)自普飛生物公司，其它生化試劑購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司。'2、方法2、1ELISA法檢測(cè)水牛日本血吸蟲(chóng)病陰、陽(yáng)性血清分別應(yīng)用重組多表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28作為抗原(15Pg/ml)以間接ELISA法檢測(cè)水牛血清。主要步驟如下'2、2抗原(15^g/ml)用pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋后包被96孔酶標(biāo)板，抗原稀釋度按預(yù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行，每孔加100ul，4'C過(guò)夜。用PBST洗二次，每次5min。2、3用3%明膠37。C封閉3hr，每孔加150y1。結(jié)束后用PBST洗三次，每次5min。2、4加l:IOO稀釋的待檢血清，每份血清加二孔，每孔100ul，37。C作用lhr，每次試驗(yàn)都設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照孔。結(jié)束后用PBS洗四次，每次5min。2、5加HRP標(biāo)記的兔抗牛IgG,每孔100ul，37'C作用45min。結(jié)束后用PBST洗四次，每次5min。2、6加TMB/檸檬酸緩沖液顯色，每孔75ul，37"C作用10min左右。每孔加20u12M硫酸終止反應(yīng)。2、7于450nM測(cè)0D值，計(jì)算平均OD值。2、8結(jié)果判斷把待檢血清的平均0D值大于和等于標(biāo)準(zhǔn)陰性血清的平均0D值+2倍標(biāo)準(zhǔn)差的，判斷為陽(yáng)性，小于的判斷為陰性。3、結(jié)果以重組表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28作為診斷抗原，應(yīng)用間接ELISA法檢測(cè)疫區(qū)189份水牛血清和92份健康牛血清，結(jié)果pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28三價(jià)表位抗原的敏感性和特異性分別為89.9%、93.4%，pGEX-BSjGCP-BSj23二價(jià)表位抗原的敏感性和特異性比三價(jià)稍高，分別為91.0%、97.8%(見(jiàn)表3)。表3重組表位抗原檢測(cè)水牛血吸蟲(chóng)病結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>從以上結(jié)果看出，以二價(jià)表位重組抗原pGEX-BSjGCP-BSj23作為診斷抗原，獲得的平均OD值、對(duì)陽(yáng)性牛的檢出率和對(duì)健康牛的陰性符合率都最高，可以看出pGEX-BSjGCP-BSj23有潛力發(fā)展成為一種新的、特異、敏感的血吸蟲(chóng)病診斷抗原。同時(shí)由于基因重組抗原可以大量生產(chǎn)制備，易于產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化和診斷技術(shù)的規(guī)范化。列及相應(yīng)的蛋白序列:SEQID1:日本血吸蟲(chóng)抱雌溝蛋白表位核酸序列atgcgaattggat已tgagggtctaccacgtgatcaatggccaaaagtgattcattggaat60ctacatgcacgtgacggtattatctgggtattagatggtctattgaaatgtccggaaaaa120ctttgcccattacttgctgaagatgttgattattat156SEQID2:日本血吸蟲(chóng)23KD抗原表位核酸序列atgactggtgctctggaaaatcc犯acgaggaaataacggcaaccatggataagatacaa60acgtcattccattgttgtggagtcaaaggtccagacgattataaagggaatgtgccagca120tcatgtaaagaagggcaagaagtttatgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattc180ttgaaacgcaac192SEQID3:日本血吸蟲(chóng)28KD谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶抗原表位核酸序列aagccsccagaaga已a(bǔ)aagagaaaatctccaaggagatattgaacggtaaagttcccatt60cttctccaagcaatttgtgaaaccttaaaagagtctax;aggtaatctgactgtcgga117SEQID4:日本血吸蟲(chóng)抱雌溝蛋白-23KD抗原重組表位核酸序列atgcgaattggatatgagggtctaccacgtgatc犯tggcca犯agtgattcattggaat60ctacatgcacgtgacggtattatctgggtattagatggtctattgaaatgtccgg犯aaa120ctttgcccattacttgctgaagatgttgattattattctagaatgactggtgctctggeia180aatccaaacgaggaaataacggcaaccatggat犯gatacaaacgtcattccattgttgt240ggagtcasaggtccagacgattataaagggaatgtgccagcatcatgtaaag犯gggcaa300gaagtttatgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattcttgaaacgcaac354SEQID5:日本血吸蟲(chóng)抱雌溝蛋白-23KD抗原-28KD谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶抗原重組表位核酸序列atgcgaattggatatg鄉(xiāng)gtctaccacgtgstc犯tggcC犯肌gtg3ttcattggaat60ctacatgcacgtg3Cggt3ttatctgggtatt3gatggtctattga犯tgtccggaaaaa120ctttgcccattacttgctgaa_gatgttgattattattctagaatgactggtgctctggaa180aatccaaacgagga犯taacggcaaccatggataagatacaaacgtc已ttccattgttgt240ggagtc犯aggtccagacgattataaagggaatgtgccagc已tcatgt已a(bǔ)300ga已gttt3tgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattcttgaaacgcaacg33ttc360犯gCC3CC3ggaaaatctcctgaacggtaaagttcccatt420cttctccaagcaatttgtgaaaccttaaaagagtctacaggta已tctgactgtcgg3477SEQID6:日本血吸蟲(chóng)抱雌溝蛋白表位蛋白序列MetArglieGlyTyrGluGlyLeuProArgAspGinTrpProLysVal151015lieHisTrpAsnLeuHisAlaArgAspGlylielieTrpValLeuAsp202530GlyLeuLeuLysCysProGluLysLeuCysProLeuLeuAlaGluAsp354045ValAspTyrTyr50SEQID7:日本血吸蟲(chóng)23KD抗原表位蛋白序列MetThrGlyAlaLeuGluAsnProAsnGluGlulieThrAlaThrMet151015AspLyslieGinThrSerPheHisCysCysGlyValLysGlyProAsp202530AspTyrLysGlyAsnValProAlaSerCysLysGluGlyGinGluVal354045TyrValGinGlyCysLeuSerValPheSerAlaPheLeuLysArgAsn505560SEQID8:日本血吸蟲(chóng)28KD谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶抗原表位蛋白序列LysProProGluGluLysGluLyslieSerLysGlulieLeuAsnGly1510.15LysValProlieLeuLeuGinAlalieCysGluThrLeuLysGluSer202530ThrGlyAsnLeuThrValGly35SEQIDGlySer1LysValLeuAspGluAsp50AsnGlu65CysCysSerCysPheSer9:日本血吸蟲(chóng)抱雌溝蛋白MetArglieGlyTyrGlu-23KD抗原重組表位蛋白序列GlyLeuProArgAspGinTrplieHis20GlyLeu35ValAsp5TrpGlyValLysGlu100AlaPhe115Lys85GlyAsnLeuHisLeuLysCysTyrTyrGlulieThrAla70GlySer55ThrPro40ArgLeuLysArgAsn120Ala25GluGinGluValTyr105Lys10ArgProAspAspAspGlylieLysLeuCysMetThrGlyMetAspLysTyr90ValLeulie75LysAla60GinPro45Leulie30Leu15TrpProValLeuAlaGluAsnProThrSerPheGlyAsnValGinGlyCysLeu110Pro95SerHis80AlaValSEQID10:日本血吸蟲(chóng)抱雌溝蛋白-23KD抗原-28KD谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶抗原重組表位蛋白序列GlySerMetArglieGlyTyrGluGlyLeuProArgAspGinTrpPro151015LysVallieHisTrpAsnLeuHisAlaArgAspGlylielieTrpVal202530LeuAspGlyLeuLeuLysCysProGluLysLeuCysProLeuLeuAla354045GluAspValAspTyrTyrSerArgMetThrGlyAlaLeuGluAsnPro505560AsnGluGlulieThrAlaThrMetAspLyslieGinThrSerPheHis65707580CysCysGlyValLysGlyProAspAspTyrLysGlyAsnValProAla859095SerCysLysGluGlyGinGluValTyrValGinGlyCysLeuSerVal100105110PheSerAlaPheLeuLysArgAsnGluPheLysProProGluGluLys115120125GluLyslieSerLysGlulieLeuAsnGlyLysValProlieLeuLeu130135140GinAlalieCysGluThrLeuLysGluSerThrGlyAsnLeuThrVal145150155160GlyLysLeu2權(quán)利要求1、一種日本血吸蟲(chóng)重組多表位抗原，其特征在于所述多表位表原為BSjGCP-BSj23，它由日本血吸蟲(chóng)23KD抗原表位和日本血吸蟲(chóng)抱雌溝蛋白抗原表位重組組成，具有如下核酸序列和相應(yīng)的蛋白序列BSjGCP-BSj23核酸序列atgcgaattggatatgagggtctaccacgtgatcaatggccaaaagtgattcattggaat60ctacatgcacgtgacggtattatctgggtattagatggtctattgaaatgtccggaaaaa120ctttgcccattacttgctgaagatgttgattattattctagaatgactggtgctctggaa180aatccaaacgaggaaataacggcaaccatggataagatacaaacgtcattccattgttgt240ggagtcaaaggtccagacgattataaagggaatgtgccagcatcatgtaaagaagggcaa300gaagtttatgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattcttgaaacgcaac354BSjGCP-BSj23蛋白序列GlySerMetArgIleGlyTyrGluGlyLeuProArgAspGlnTrpPro151015LysValIleHisTrpAsnLeuHisAlaArgAspGlyIleIleTrpVal202530LeuAspGlyLeuLeuLysCysProGluLysLeuCysProLeuLeuAla354045GluAspValAspTyrTyrSerArgMetThrGlyAlaLeuGluAsnPro505560AsnGluGluIleThrAlaThrMetAspLysIleGlnThrSerPheHis65707580CysCysGlyValLysGlyProAspAspTyrLysGlyAsnValProAla859095SerCysLysGluGlyGlnGluValTyrValGlnGlyCysLeuSerVal100105110PheSerAlaPheLeuLysArgAsnLysLeu115120。2、一種日本血吸蟲(chóng)重組多表位抗原，其特征在于所述多表位抗原為BSjGCP-BSj23-BSj28，它由日本血吸蟲(chóng)23KD抗原表位、日本血吸蟲(chóng)抱雌溝蛋白抗原表位和日本血吸蟲(chóng)28KD谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶抗原表位重組組成，具有如下核酸序列和相應(yīng)的蛋白序列BSjGCP-BSj23-BSj28核酸序列atgcgaattggatatgagggtctaccacgtgatcaatggccaaaagtgattcattggaat60ctacatgcacgtgacggtattatctgggtattagatggtctattgaaatgtccggaaaaa120ctttgcccattacttgctgaagatgttgattattattctagaatgactggtgctctggaa180aatccaaacgaggaaataacggcaaccatggataagatacaaacgtcattccattgttgt240ggagtcaaaggtccagacgattataaagggaatgtgccagcatcatgtaaagaagggcaa300gaagtttatgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattcttgaaacgcaacgaattc360aagccaccagaagaaaaagagaaaatctccaaggagatattgaacggtaaagttcccatt420cttctccaagcaatttgtgaaaccttaaaagagtctacaggtaatctgactgtcgga477BSjGCP-BSj23-BSj28蛋白序列GlySerMetArglieGlyTyrGluGlyLeuProArgAspGinTrpProLysVallieHisTrpAsnLeuHisAlaArgAspGlylielieTrpValLeuAspGlyLeuLeuLysCysProGluLysLeuCysProLeuLeuAlaGluAspValAspTyrTyrSerArgMetThrGlyAlaLeuGluAsnProAsnGluGlulieThrAlaThrMetAspLyslieGinThrSerPheHisCysCysGlyValLysGlyProAspAspTyrLysGlyAsnValProAlaSerCysLysGluGlyGinGluValTyrValGinGlyCysLeuSerVal(100105110PheSerAlaPheLeuLysArgAsnGluPheLysProProGluGluLys(115120125GluLyslieSerLysGlulieLeuAsnGlyLysValProlieLeuLeu(130135140GinAlalieCysGluThrLeuLysGluSerThrGlyAsnLeuThrVal145150155160GlyLysLeu。3、一種權(quán)利要求1或2所述日本血吸蟲(chóng)重組多表位抗原的表達(dá)、純化方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)利用生物信息學(xué)在線分析程序RANKPEP篩選到日本血吸蟲(chóng)抱雌溝蛋白SjGCP的第539590位肽段的表位集中區(qū)為BSjGCP表位，截取日本血吸蟲(chóng)23KD抗原SJ23的大親水區(qū)LHD-SJ23作為表位BSj23,選取和曼氏血吸蟲(chóng)Sm28KdGST抗原的第115-153氨基酸肽段對(duì)應(yīng)的Sj28GST肽段為BSj28表位，將三種抗原表位重組成BSjGCP-BSj23或BSjGCP-BSj23-BSj28多表位抗原；(2)根據(jù)上述表位的核酸序列分別設(shè)計(jì)PCR引物，并在兩端加上特異限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增各表位編碼核酸片斷，再利用特異限制性?xún)?nèi)切酶BamHI、XbaI、EcoRI、HindIII依次將編碼BSjGCP、BSj23、BSj28表位抗原的核酸片段定向克隆至真核表達(dá)載體pCMV的多克隆位點(diǎn)區(qū)，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-BSjGCP-BSj23或pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28;(3)將重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-BSjGCP-BSj23及pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28中的編碼BSjGCP-BSj23和BSjGCP-BSj23-BSj28多表位抗原的核酸片段利用特異限制性?xún)?nèi)切酶BamHI、EcoRI、HindIII定向克隆至原核表達(dá)載體pGEX-2T多克隆位點(diǎn)區(qū)，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-BSjGCP-BSj23或pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28;將上述兩種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并用親和層析純化GST融合蛋白的方法純化到日本血吸蟲(chóng)多表位重組蛋白pGEX-BSjGCP-BSj23或pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28。4、一種如權(quán)利要求1或2所述的日本血吸蟲(chóng)重組多表位抗原在制備日本血吸蟲(chóng)病免疫預(yù)防疫苗中的應(yīng)用。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述制備免疫預(yù)防疫苗時(shí)，使用的重組蛋白是帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述制備的免疫預(yù)防疫苗為日本血吸蟲(chóng)重組多表位抗原的DNA疫苗。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于制備所述免疫預(yù)防疫苗時(shí)，使用的宿主菌為大腸桿菌DH5a，真核表達(dá)質(zhì)粒為pCMV-script。8、一種如權(quán)利要求1或2所述的日本血吸蟲(chóng)重組多表位抗原在制備診斷日本血吸蟲(chóng)病的試劑中的應(yīng)用。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于制備所述診斷試劑時(shí)，使用的重組蛋白為帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了日本血吸蟲(chóng)重組多表位抗原BSjGCP-BSj23和BSjGCP-BSj23-BSj28的基因序列和表達(dá)、純化方法及在制備日本血吸蟲(chóng)病免疫預(yù)防疫苗和診斷試劑中的應(yīng)用。重組多表位核酸疫苗pCMV-BSjGCP-BSj23和pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28在昆明系小鼠中分別獲得了14.76％、64.95％的減蟲(chóng)率。重組多表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23和pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28免疫BalB/c小鼠獲得了15.7％、57.99％的減蟲(chóng)率，作為診斷抗原分別獲得了91.0％、89.9％的敏感性和97.8％、93.4％的特異性。文檔編號(hào)C07K14/435GK101624422SQ20081004038公開(kāi)日2010年1月13日申請(qǐng)日期2008年7月9日優(yōu)先權(quán)日2008年7月9日發(fā)明者傅志強(qiáng),劉金明,周偉芳,朱傳剛,浩李,林矯矯,石耀軍,章登吉,珂陸申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所