專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種抗日本血吸蟲(chóng)藥物作用靶標(biāo)和藥物篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用生物信息技術(shù)、計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)和分子生物學(xué)方法篩選藥物，具體地，涉及抗日本血吸蟲(chóng)感染的藥物作用靶標(biāo)及依此進(jìn)行分子和細(xì)胞水平的藥物篩選方法。
背景技術(shù)：
：化療是控制血吸蟲(chóng)病患病率的重要措施之一。自高效低毒的抗血吸蟲(chóng)藥物吡喹酮廣泛應(yīng)用以來(lái)，血吸蟲(chóng)病的化療有了突破性進(jìn)展，實(shí)施周期性群體化療已成為血吸蟲(chóng)病控制的重要手段。然而，目前對(duì)五種感染人體的血吸蟲(chóng)均有效的藥物僅吡喹酮一種，長(zhǎng)期反復(fù)使用同一化學(xué)藥物控制寄生蟲(chóng)感染，有可能導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生。最近，有報(bào)道顯示在實(shí)驗(yàn)室已成功地用吡喹酮誘導(dǎo)曼氏血吸蟲(chóng)產(chǎn)生了抗性，埃及和塞內(nèi)加爾的現(xiàn)場(chǎng)研究也顯示了吡喹酮的極低治愈率，提示似乎已產(chǎn)生吡喹酮抗性。雖然到目前為止動(dòng)物實(shí)驗(yàn)尚未發(fā)現(xiàn)吡喹酮誘導(dǎo)日本血吸蟲(chóng)產(chǎn)生抗性，但是研究抗性產(chǎn)生機(jī)理和應(yīng)對(duì)策略，以及積極研制新型的后備藥物勢(shì)在必行。此外，吡喹酮是一個(gè)對(duì)血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)有效而對(duì)童蟲(chóng)無(wú)效的治療藥物，雖可降低人群的感染率，但不能防止重復(fù)感染。我國(guó)在七十年代末和八十年代初發(fā)現(xiàn)青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯具有抗血吸蟲(chóng)的作用，該類(lèi)藥物對(duì)各個(gè)蟲(chóng)期的血吸蟲(chóng)均有一定效果，特別是對(duì)血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)有很強(qiáng)的殺滅作用，已于二十世紀(jì)末被發(fā)展成為預(yù)防血吸蟲(chóng)病的藥物。蒿甲醚和青蒿琥酯的問(wèn)世為血吸蟲(chóng)病的早期治療提供了條件，但殺成蟲(chóng)的效果不佳。因此，WHO/TDR于2002年提出要發(fā)展一個(gè)治療血吸蟲(chóng)病(抗血吸蟲(chóng)成蟲(chóng))的新藥，而且最好是既具有殺滅成蟲(chóng)又有殺童蟲(chóng)的效果的新藥。目前，雖然國(guó)內(nèi)外已有部分實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始進(jìn)行抗血吸蟲(chóng)新藥的研究，但尚無(wú)理想的二線(xiàn)侯選藥物的報(bào)道。有多種原因制約了抗血吸蟲(chóng)新藥的研制，其中包括現(xiàn)有抗血吸蟲(chóng)藥物的作用靶點(diǎn)仍然不明確，藥物殺蟲(chóng)的分子機(jī)制仍不清楚，傳統(tǒng)的藥物篩選方法不適合于高通量的新藥篩選等。因此，專(zhuān)家認(rèn)為抗日本血吸蟲(chóng)新藥的研究需要技術(shù)創(chuàng)新，新的藥物靶點(diǎn)的發(fā)掘?qū)⒂兄诳谷毡狙x(chóng)新藥的開(kāi)發(fā)。藥物作用靶標(biāo)包括受體、酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、DNA、RNA等。在基因組時(shí)代，藥物研究首先將是藥物靶標(biāo)的鑒定與確證，隨后以藥物作用靶標(biāo)為基礎(chǔ)，篩選或設(shè)計(jì)與靶標(biāo)結(jié)構(gòu)互補(bǔ)結(jié)合從而激活或抑制靶標(biāo)介導(dǎo)的生理生化過(guò)程，具有治療作用的藥物先導(dǎo)化合物。這種基于藥物作用靶標(biāo)的結(jié)構(gòu)的新藥發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)技術(shù)，將有助于高效、快速地進(jìn)行新藥研究，并且有助于提高藥物作用的特異性。人們已將過(guò)氧化物酶、酪氨酸激酶、硫氧還_谷胱甘肽還原酶以及核酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶作為藥物作用靶標(biāo)做了大量的研究。但將日本血吸蟲(chóng)腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SjANT)作為藥物作用靶標(biāo)還未見(jiàn)報(bào)道。迄今為止，人們對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染機(jī)制的研究還很不充分，為了降低感染率和死亡率，臨床上迫切需要能夠預(yù)防和/或治療日本血吸蟲(chóng)感染的特效藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種可用于篩選治療和/或預(yù)防日本血吸蟲(chóng)感染的藥物的藥物作用靶標(biāo)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種所述藥物作用靶標(biāo)的構(gòu)建方法。本發(fā)明的再一個(gè)目的就是提供一種利用所述藥物作用靶標(biāo)篩選治療和/或預(yù)防日本血吸蟲(chóng)感染的藥物的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種篩選治療和/或預(yù)防日本血吸蟲(chóng)感染藥物的藥物作用靶標(biāo)，所述的靶標(biāo)含有日本血吸蟲(chóng)腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SjANT)功能區(qū)域，所述的SjANT氨基酸序列為KFKELYADFRLPKKPTP*所述的功能區(qū)域選自以下的一個(gè)或多個(gè)10GLSFAENFLLSGAAAVIAKTAAAPIERVKLLVQN81LPNCLRYFPTQALNFAFKDKVKSAF113YLVSFYK謂SGGTAGALSLVFVYSLDYARTRLAN183FVISCFGIIVYRGFYFGLYDTL215VAISFCLGYGVTVTSGLISYPIDTIRR匪276AGANILRGVAGAGVLAGFD。在另一優(yōu)選例中，所述的靶標(biāo)為含有日本血吸蟲(chóng)腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SjANT)和二磷酸腺苷(ADP)相互作用活性位點(diǎn)的SjANT功能區(qū)域，或含有日本血吸蟲(chóng)腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SjANT)和蒼術(shù)苷或羧基蒼術(shù)苷相互作用活性位點(diǎn)的SjANT功能區(qū)域。在另一優(yōu)選例中，所述的靶標(biāo)含有SjANT氨基酸序列中的以下位點(diǎn)ALA24，ALA27，LYS28，ALA31，ALA32，GLU35，LYS38，LEU39，P簡(jiǎn)2，ASN83，ARG86，TYR87，THR90，GLN91，ASN94，LYS98，VALIOI，LYS102，SER123，GLY124，ALA127，GLY128，SER131，LEU132，VAL135，LEU138，ASP139，ARG142，SER186，GLY189，ILE190，TYR193，ARG194，TYR197，PHE198，TYR223，THR226，VAL227，GLY230，LEU231，SER233，TYR234，ILE236，ASP237，ARG240，ARG241，ALA276，ASN279，ILE280，ARG282，GLY283，VAL284，GLY286，ALA287，和LEU290。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種如上所述的藥物作用靶標(biāo)的構(gòu)建方法，所述的構(gòu)建方法包括步驟(1)用同源蛋白模建方法構(gòu)建SjANT的三維結(jié)構(gòu)；(2)根據(jù)SjANT與ADP、蒼術(shù)苷或羧基蒼術(shù)苷相互結(jié)合的區(qū)域，確定藥物作用活性位點(diǎn)。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種用如上所述的藥物作用靶標(biāo)篩選治療和/或預(yù)防日本血吸蟲(chóng)感染的藥物的方法，所述的篩選方法包括步驟(a)測(cè)定候選物與模建的SjANT對(duì)接的能量，選出能量打分高的化合物；(b)將步驟(a)得到的獲選化合物進(jìn)行與SjANT對(duì)接結(jié)合能力的評(píng)價(jià)，選出結(jié)合能力強(qiáng)的化合物；(c)將步驟(b)得到的獲選化合物與來(lái)源于人的腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ANT)進(jìn)行對(duì)接結(jié)合能力的評(píng)價(jià)，并同步驟(b)中所得到的對(duì)接能力進(jìn)行比較，選出兩者差異小于5-20kJ/mol的化合物。在另一優(yōu)選例中，所述的篩選方法包括步驟(a)從SjANT結(jié)構(gòu)出發(fā)測(cè)定候選物與蛋白對(duì)接的能量，選出能量打分高的化合物；(b)對(duì)步驟(a)得到的獲選化合物進(jìn)行分子類(lèi)藥性評(píng)價(jià)后，將步驟(a)得到的獲選化合物進(jìn)行與SjANT對(duì)接結(jié)合能力的評(píng)價(jià)，選出結(jié)合能力強(qiáng)的化合物；(c)采用從步驟(a)到步驟(b)的方法和模板模建人ANT的結(jié)構(gòu)，采用Glide產(chǎn)生對(duì)接構(gòu)象后將步驟(b)得到的獲選化合物針對(duì)人和日本血吸蟲(chóng)兩個(gè)不同的靶標(biāo)進(jìn)行結(jié)合自由能打分，選出對(duì)SjANT結(jié)合自由能打分低而對(duì)人ANT結(jié)合自由能打分高的化合物。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟(d)獲選化合物的體外抗血吸蟲(chóng)活性測(cè)試。在另一優(yōu)選例中，在步驟(c)中選出兩者差異小于7-15kJ/mol的化合物。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種抑制如上所述的靶標(biāo)的生物功能的制劑，所述的抑制劑是與靶標(biāo)SjANT活性位點(diǎn)(功能區(qū)域)互補(bǔ)，并阻斷所述SjANT和ADP結(jié)合、或阻斷所述SjANT和蒼術(shù)苷或其衍生物結(jié)合的有機(jī)分子化合物或多肽化合物或寡糖化合物或單克隆抗體或核苷類(lèi)化合物；優(yōu)選所述的抑制劑為有機(jī)化合物或多肽。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種如上所述的抑制劑在制備治療和/或預(yù)防日本血吸蟲(chóng)感染的藥物中的應(yīng)用。據(jù)此，本發(fā)明提供了一種篩選治療和/或預(yù)防日本血吸蟲(chóng)感染的藥物的藥物作用靶標(biāo)及其構(gòu)建方法，并提供了利用所述靶標(biāo)獲得能夠預(yù)防和/或治療日本血吸蟲(chóng)感染的特效藥物的方法。圖1顯示了SjANT(目標(biāo)蛋白)和牛ANT(模板蛋白)的同源性高以及經(jīng)過(guò)聯(lián)配的序列，圖中Hl、H2、H3、H4、H5、H6、hl2、h34、h56所代表的條帶表示a螺旋，包括:H1-H6是SjANT中6個(gè)跨膜a螺旋；hl2是連接Hl、H2的較短螺旋，h34是連接H3、H4的較短螺旋，h56是連接H5、H6的較短螺旋。構(gòu)成活性位點(diǎn)的氨基酸以五角星標(biāo)識(shí)，它們分布在Hl-H6上。圖2是模建結(jié)構(gòu)的Ramachandran圖。圖3顯示了SjANT的三維結(jié)構(gòu)模型。圖4顯示了虛擬篩選流程圖。圖5是SjANT的氨基酸序列。具體實(shí)施例方式發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)了SjANT同底物(ADP)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特征，并以此作為藥物作用靶標(biāo)篩選可以治療和/或預(yù)防日本血吸蟲(chóng)感染的藥物，從而完成了本6發(fā)明。藥物作用靶標(biāo)是指疾病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中能夠在最關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)上起決定作用的關(guān)鍵功能生物大分子，包括細(xì)胞膜受體、蛋白酶、激素與細(xì)胞因子、離子通道、DNA、RNA、核受體等?，F(xiàn)代藥物研究的核心是以藥物作用靶標(biāo)為基礎(chǔ)，篩選或設(shè)計(jì)與靶標(biāo)結(jié)構(gòu)互補(bǔ)、能夠激動(dòng)或拮抗靶標(biāo)介導(dǎo)的生物功能，具有治療作用的藥物先導(dǎo)物。這種基于機(jī)理和結(jié)構(gòu)的新藥物發(fā)現(xiàn)和選擇性地阻斷疾病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中最關(guān)鍵的病理環(huán)節(jié)，研發(fā)出高效低毒副作用的特異性藥物。本發(fā)明提供的用于篩選治療和/或預(yù)防日本血吸蟲(chóng)感染藥物的藥物作用靶標(biāo)是在日本血吸蟲(chóng)細(xì)胞生理活動(dòng)中起關(guān)鍵作用的、具有雙重功能的蛋白SjANT，SjANT的氨基酸序列為如下(如圖5所示)KFKELYADFRLPKKPTP*這些氨基酸組成3個(gè)重復(fù)的結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域都有兩個(gè)跨膜螺旋，螺旋問(wèn)的親水肽鏈突出到線(xiàn)粒體基質(zhì)內(nèi)，而相鄰結(jié)構(gòu)域兩個(gè)跨膜螺旋問(wèn)的親水肽鏈突出到內(nèi)膜的胞漿側(cè)。六個(gè)跨膜螺旋的軸向均與膜的垂直方向相交形成一定角度，且螺旋問(wèn)也相互傾斜，它們共同形成了一個(gè)桶狀結(jié)構(gòu)；桶狀結(jié)構(gòu)的中心是一個(gè)圓錐體樣的深坑，形成了ADP的結(jié)合位點(diǎn)，向外敞開(kāi)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SjANT的六個(gè)跨膜a螺旋的氨基酸序列如下表所示(見(jiàn)圖l):<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本發(fā)明提供的藥物作用耙標(biāo)是在SjANT/ADP三維復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，SjANT和ADP相互作用的SjANT蛋白功能區(qū)域，所述的功能區(qū)域選自以下的一個(gè)或多個(gè)10GLSFAENFLLSGAAAVIAKTAAAPIERVKLLVQN81LPNCLRYFPTQALNFAFKDKVKSAF113YLVSFYKNVVSGGTAGALSLVFVYSLDYARTRLAN183FVISCFGIIVYRGFYFGLYDTL215VAISFCLGYGVTVTSGLISYPIDTIRR匪276AGANILRGVAGAGVLAGFD;較佳地，所述的靶標(biāo)是在SjANT和ADP相互作用的活性位點(diǎn)，所述的活性位點(diǎn)由SjANT氨基酸序列中的下述氨基酸構(gòu)成ALA24，ALA27,LYS28,ALA31,ALA32,GLU35,LYS38,LEU39,PR082,ASN83，ARG86，TYR87，THR90，GLN91，ASN94，LYS98，VALIOI，LYS102,SER123,GLY124,ALA127,GLY128,SER131,LEU132,VAL135,LEU138,ASP139,ARG142,SER186,GLY189,ILE190,TYR193,ARG194,TYR197,PHE198,TYR223,THR226,VAL227,GLY230,LEU231,SER233,TYR234，ILE236，ASP237，ARG240，ARG241，ALA276，ASN279，ILE280，ARG282，GLY283，VAL284，GLY286，ALA287，禾PLEU290。本發(fā)明用同源蛋白模建的方法構(gòu)建了SjANT的三維結(jié)構(gòu)，用分子模擬方法計(jì)算了SjANT與羧基蒼術(shù)苷的相互作用，構(gòu)建了SjANT與羧基蒼術(shù)苷復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，確立了SjANT和羧基蒼術(shù)苷相互作用的區(qū)域；針對(duì)SjANT和羧基蒼術(shù)苷相互結(jié)合的區(qū)域，用計(jì)算機(jī)模擬篩選方法搜尋了化合物數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)所測(cè)定的對(duì)接能量和對(duì)接結(jié)合能力，獲得具有抑制SjANT活性的化合物，并用體外試驗(yàn)對(duì)所篩選得到的化合物做進(jìn)一步的確證。1、腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(adeninenucleotidetransporter,ANT)又被稱(chēng)作ADP/ATPcarrier(AAC)，它屬于線(xiàn)粒體載體家族，由核基因編碼，在胞漿中合成，然后運(yùn)輸?shù)骄€(xiàn)粒體內(nèi)膜。ANT是線(xiàn)粒體內(nèi)膜最豐富的蛋白質(zhì)，表面有ATP和ADP的結(jié)合位點(diǎn)。在生理狀態(tài)下，ANT作為一個(gè)反向轉(zhuǎn)運(yùn)載體把胞漿的ADP轉(zhuǎn)運(yùn)到線(xiàn)粒體基質(zhì)，而把線(xiàn)粒體基質(zhì)ATPase合成的ATP轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿，并且一個(gè)ATP交換一個(gè)ADP;在某些特殊環(huán)境下，當(dāng)呼吸鏈?zhǔn)茏?，ANT會(huì)把ADP轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿而把ATP轉(zhuǎn)運(yùn)到線(xiàn)粒體基質(zhì)從而導(dǎo)致嚴(yán)重的代謝障礙。另外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在一些腫瘤細(xì)胞中，ANT2的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于A(yíng)NT1和ANT3，因此認(rèn)為ANT2的功能偏向于把ATP轉(zhuǎn)運(yùn)到線(xiàn)粒體基質(zhì)而把ADP轉(zhuǎn)運(yùn)到胞槳從而阻止有氧呼吸的進(jìn)行。ANT是以電發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)形式轉(zhuǎn)運(yùn)腺苷酸；ANT轉(zhuǎn)運(yùn)是耗能的主動(dòng)過(guò)程；ANT本身也是一種酶，其轉(zhuǎn)運(yùn)功能遵循米.曼氏方程式；ANT只轉(zhuǎn)運(yùn)自然形式的ADP和ATP，并不能轉(zhuǎn)運(yùn)AMP/GTP等，也不能轉(zhuǎn)運(yùn)和其它離子螫合的ADP/ATP，即ANT具有高度特異性.轉(zhuǎn)運(yùn)體的特異性是因?yàn)榈孜锝Y(jié)合位點(diǎn)不同造成的。ANT有兩種構(gòu)象C態(tài)和m態(tài)。只有當(dāng)ANT的構(gòu)象在C態(tài)和m態(tài)之間交互變換，底物的結(jié)合位點(diǎn)分別朝向胞漿或線(xiàn)粒體基質(zhì)時(shí)，ADP和ATP才能交換。米酵菌酸(bongkrekicacid，BA)能競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于A(yíng)NT的線(xiàn)粒體基質(zhì)面使其構(gòu)象處于m態(tài)，而蒼術(shù)苷(atractyloside，Atr)及其衍生物羧基蒼術(shù)苷(carboxyatractyloside，Catr)競(jìng)爭(zhēng)性與非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合于A(yíng)NT的胞漿面使其構(gòu)象處于c態(tài)，從而抑制ADP/ATP的交換。ANT還參與PTP的形成，與細(xì)胞調(diào)亡有關(guān)。PTP是橫跨在線(xiàn)粒體內(nèi)外膜接觸部位的非特異性通道，是個(gè)多聚蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)，主要包括外膜的VDAC、內(nèi)膜的ANT以及線(xiàn)粒體基質(zhì)的CyP。生理狀態(tài)下，PTP—般是關(guān)閉的，有時(shí)呈現(xiàn)開(kāi)、關(guān)交替的狀態(tài)，以調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體和胞漿之間物質(zhì)的流動(dòng)以及氧化還原平衡。但在凋亡過(guò)程下，PTP非特異性開(kāi)放，而且呈持續(xù)開(kāi)放狀態(tài)，造成分子量小于1.5kDa的物質(zhì)通過(guò)PTP流入胞漿，從而導(dǎo)致膜電位喪失、線(xiàn)粒體腫脹以及外膜斷裂，最終引起一些可溶性促凋亡蛋白如細(xì)胞色素C釋放，細(xì)胞不可逆地凋亡。ANT不僅是構(gòu)成PTP的重要成分，而且對(duì)于凋亡過(guò)程中線(xiàn)粒體膜通透性的調(diào)節(jié)起著重要作用。ANT的配體與PTP的開(kāi)放密切相關(guān)。天然核苷酸中只有ANT底物(ADP、dADP、ATP)能與PTP互相作用。ADP通過(guò)降低鈣觸發(fā)位點(diǎn)對(duì)Ca2+的敏感性而抑制PTP開(kāi)放。米酵菌酸能使ANT構(gòu)象處于m態(tài)從而抑制PTP開(kāi)放，而蒼術(shù)苷使ANT構(gòu)象處于c態(tài)從而激活PTP，誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。目前認(rèn)為c態(tài)是PTP開(kāi)放所必需的，因此，米酵菌酸和蒼術(shù)苷是細(xì)胞凋亡模型中PTP的特異性抑制劑和激動(dòng)劑。氧化劑、蒼術(shù)苷、Bax、鈣離子誘導(dǎo)非特異性通道的形成，而低pH、ADP、Bc12和米酵菌酸起抑制作用。由于蒼術(shù)苷能特異性地激活PTP的形成，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此我們模擬蒼術(shù)苷與ANT的結(jié)合虛擬篩選得到的小分子化合物也有望達(dá)到誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。本發(fā)明進(jìn)行了SjANT的進(jìn)一步的序列比較和結(jié)構(gòu)模建。序列分析表明，SjANT和牛ANT同源性較高，運(yùn)用計(jì)算機(jī)模塊進(jìn)行結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，并對(duì)于得到的結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)從而得到SjANT的三維結(jié)構(gòu)。結(jié)合已有的牛ANT晶體結(jié)構(gòu)和大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)論，發(fā)明人推斷羧基蒼術(shù)苷與牛ANT的結(jié)合位點(diǎn)同底物結(jié)合位點(diǎn)基本重疊；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，SjANT的由下述氨基酸構(gòu)成的活性位點(diǎn)也是可以和羧基蒼術(shù)苷結(jié)合的區(qū)域ALA24，ALA27，LYS28，ALA31，ALA32，GLU35，LYS38，LEU39，PR082，ASN83，ARG86，TYR87，THR90，GLN91，ASN94，LYS98，VALIOI，LYS102，SER123，GLY124，ALA127，GLY128，SER131，LEU132，VAL135，LEU138，ASP139，ARG142，SER186，GLY189，ILE190，TYR193，ARG194，TYR197，PHE198，TYR223，THR226，VAL227，GLY230，LEU231，SER233，TYR234，ILE236，ASP237，ARG240，ARG241，ALA276，ASN279，ILE280，ARG282，GLY283，VAL284，GLY286，ALA287，禾PLEU290。本發(fā)明的另一方面涉及根據(jù)確定的藥物作用靶標(biāo)，在此基礎(chǔ)上，用虛擬篩選方法獲得了阻斷SjANT與ADP結(jié)合的候選物，經(jīng)體外動(dòng)物試驗(yàn)測(cè)試，篩選出靶標(biāo)生物功能抑制劑。靶標(biāo)生物功能抑制劑為與靶標(biāo)SjANT功能區(qū)域結(jié)合、并阻斷所述SjANT和ADP結(jié)合的有機(jī)化合物或多肽化合物或寡糖化合物或單克隆抗體或核苷類(lèi)化合物。本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說(shuō)明書(shū)所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說(shuō)明書(shū)中所揭示的各個(gè)特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說(shuō)明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1、首次發(fā)現(xiàn)了可同底物ADP結(jié)合的SjANT的功能區(qū)域，并揭示了其結(jié)構(gòu)序列；2、建立了篩選治療和/或預(yù)防日本血吸蟲(chóng)感染的藥物的藥物作用耙標(biāo)；3、所建立的靶標(biāo)可用于有效篩選治療和/或預(yù)防日本血吸蟲(chóng)感染的藥物；4、篩選得到了一系列有效治療和/或預(yù)防日本血吸蟲(chóng)感染的藥物。9下面將結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則所有的百分比和份數(shù)按重量計(jì)。除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1SjANT分子模擬以SjANT蛋白序列(UniProtAC:Q5DFR4)為提問(wèn)序歹lj，用BLASTP對(duì)PDB蛋白庫(kù)進(jìn)行搜索。按照同源性的高低及蛋白的性質(zhì)，選取了ADT1—B0VIN(PDBID為10KC)為模板進(jìn)行結(jié)構(gòu)模建。目標(biāo)蛋白和模板蛋白的序列一致性為53%，表明模建具有很大的可靠性。利用InsightII(Version2000)/Homology(購(gòu)自AccelrysSoftwareInc)模塊中的多重聯(lián)配的方法進(jìn)行序列聯(lián)配，然后經(jīng)過(guò)手動(dòng)調(diào)節(jié)得到合理的序列聯(lián)配(圖l)，在聯(lián)配的基礎(chǔ)上，采用Insightll/Homology中的模塊進(jìn)行結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。對(duì)于得到的結(jié)構(gòu)，采用PR0CHECK進(jìn)行評(píng)價(jià)，主要是評(píng)價(jià)鍵長(zhǎng)、鍵角和二面角是否合理，其結(jié)果以Ramachandran圖(圖2)的形式給出。結(jié)果顯示模板晶體結(jié)構(gòu)與模建結(jié)構(gòu)的指標(biāo)相近，說(shuō)明模建結(jié)構(gòu)合理，最終模型如圖3所示。實(shí)施例2確定耙標(biāo)在實(shí)施例1所獲得的模型蛋白結(jié)構(gòu)以后，根據(jù)牛ANT晶體結(jié)構(gòu)中CATR的結(jié)合位置，確定虛擬篩選所需的活性位點(diǎn)，以下氨基酸構(gòu)成了SjANT的活性位點(diǎn)ALA24，ALA27,LYS28，ALA31.ALA32，GLU35，LYS38，LEU39，PR082，ASN83，ARG86，TYR87，THR90，GLN91，ASN94，LYS98，VALIOI，LYS102,SER123,GLY124,ALA127,GLY128,SER131,LEU132,VAL135,LEU138,ASP139,ARG142,SER186,GLY189,ILE190,TYR193,ARG194,TYR197,PHE198,TYR223,THR226，VAL227，GLY230，LEU231，SER233，TYR234，ILE236，ASP237，ARG240，ARG241，ALA276，ASN279,ILE280,ARG282,GLY283,VAL284,GLY286,ALA287,LEU290。實(shí)施例3虛擬篩選對(duì)包括39萬(wàn)多個(gè)小分子的SPECS化合物庫(kù)進(jìn)行了虛擬篩選。虛擬篩選流程如圖4。首先采用Schr5dingerGlide(購(gòu)自Schr6dinger,LLC)對(duì)SPECS化合物庫(kù)進(jìn)行了第一輪篩選。我們從SjANT模建結(jié)構(gòu)出發(fā)，蛋白結(jié)合位點(diǎn)質(zhì)心由模板結(jié)構(gòu)中配體的質(zhì)心來(lái)定義，網(wǎng)格邊界尺寸選擇為20A，這樣產(chǎn)生的空間網(wǎng)格將包含結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)接打分方法為SP，保留能量打分最好的10，000個(gè)分子進(jìn)入第二輪篩選。第二輪篩選使用Glide的匪GBSA打分進(jìn)行評(píng)價(jià)。匪GBSA打分是在原有對(duì)接構(gòu)象的基礎(chǔ)上，對(duì)結(jié)合能力更準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)參數(shù)，它綜合考慮了原子間相互作用能和水分子的溶劑效應(yīng)。通過(guò)這輪篩選后，有653個(gè)小分子進(jìn)入下一輪。第三輪篩選中，我們將小分子與來(lái)源于人的ANT蛋白模型進(jìn)行對(duì)接，將小分子與人ANT蛋白(來(lái)源于SwissModel)對(duì)接構(gòu)象的匪GBSA打分與第二輪所得的匪GBSA打分進(jìn)行比較，選擇打分差異負(fù)于-10kJ/mo1的結(jié)構(gòu)作為虛擬篩選的最終結(jié)果。這樣的篩選策略，有助于提高潛在活性化合物的選擇性，而同時(shí)減少毒副作用。這一輪篩選得到122個(gè)化合物。實(shí)施例4抗日本血吸蟲(chóng)活性化合物體外篩選實(shí)驗(yàn)材料和方法1.寄生蟲(chóng)日本血吸蟲(chóng)尾蚴(安徽株)，購(gòu)自中國(guó)CDC寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制中心2.宿主昆明鼠，體重在18-22g之間，購(gòu)自上海動(dòng)物中心。3.動(dòng)物的接種與蟲(chóng)體的收集接種采用腹部感染的方法。將小鼠用橡皮筋固定于木板上，然后用電梯刀將其腹部毛剔凈。每只鼠感染80-100頭尾蚴。收蟲(chóng)經(jīng)尾呦感染32-38天的小鼠采用剪斷頸動(dòng)脈放血的方法處死，然后利用冰冷的加有肝素的生理鹽水經(jīng)胸主動(dòng)脈灌注，收集成蟲(chóng)。4.藥物的配置將實(shí)施例3篩選得到的化合物作為受試樣品，均采用匿S0于37t:溶解，配制成原藥液，備用；藥物要現(xiàn)用現(xiàn)配。5.成蟲(chóng)的體外培養(yǎng)將pH為7.2-7.4間的衡氏鹽平衡液配制成含20%熱滅活的小牛血清，300iu/ml青霉素，300ug/ml鏈霉素以及0.25ug/mL兩性霉素的培養(yǎng)基。在24孔培養(yǎng)板中加入現(xiàn)配的培養(yǎng)基，按2mL/孔，然后，將充分洗凈的合抱蟲(chóng)體置入培養(yǎng)板，每孔兩對(duì)蟲(chóng)。將板置于含5%C02，37t:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)30分鐘，待蟲(chóng)體穩(wěn)定后，將受測(cè)化合物按不同的濃度梯度加入培養(yǎng)板的孔中。加藥前要從培養(yǎng)基中吸取出相應(yīng)的的加藥體積，以確保每孔的終體積為2mL。每塊板均需設(shè)置空白對(duì)照，包括純培養(yǎng)基空白對(duì)照以及用藥組最大劑量的匿SO對(duì)昭。6.藥效觀(guān)察分別在加藥后4，12，24，48，72小時(shí)，于倒置顯微鏡下觀(guān)察蟲(chóng)體的活動(dòng)能力以及形態(tài)生理結(jié)構(gòu)上的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)體外72h連續(xù)用藥培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，受試的96種化合物中，大部分化合物對(duì)蟲(chóng)體的生存以及生理形態(tài)并無(wú)顯著影響，而其中三個(gè)，其代號(hào)分別A03、A05和B22，其結(jié)構(gòu)如下所示，效果明顯，殺蟲(chóng)效果具有明顯的劑量依賴(lài)性，其體外殺蟲(chóng)效果如表1所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注+++:表示蟲(chóng)體生長(zhǎng)形態(tài)良好，活動(dòng)能力最佳++:表示蟲(chóng)體表面有少量空泡，活動(dòng)被抑制+:表示蟲(chóng)表有大量空泡、破損嚴(yán)重，雌蟲(chóng)尾部腫脹，蟲(chóng)體攣縮+_:蟲(chóng)體偶有擺動(dòng)，吸盤(pán)扔有活動(dòng)，體表空泡破損嚴(yán)重，-:蟲(chóng)體在兩分鐘內(nèi)不動(dòng)。死亡<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>對(duì)于這三個(gè)化合物，在加藥后的4小時(shí)內(nèi)，蟲(chóng)體不論是在形態(tài)結(jié)構(gòu)還是活動(dòng)能力上均與對(duì)照組的相差無(wú)幾。而在4-24h內(nèi)，用藥組的蟲(chóng)體的體表首先出現(xiàn)變化，主要表現(xiàn)為有細(xì)小空泡出現(xiàn)，且其活動(dòng)能力減弱，活動(dòng)僵直，不能靈活自如。作用明顯的藥物在4-24h的時(shí)間段內(nèi)蟲(chóng)體表面出現(xiàn)大面積的空泡以及嚴(yán)重的皮損，此時(shí)的雄蟲(chóng)往往表現(xiàn)為收縮，局部腫脹等，而相對(duì)于雄蟲(chóng)，雌蟲(chóng)的變化不太明顯，一般表現(xiàn)為活動(dòng)能力減弱，卵黃腺渾濁以及身體的局部腫脹等。24h以后，體表已發(fā)生變化損傷的蟲(chóng)體，其受損程度進(jìn)一步加劇，到48h時(shí)，大劑量組蟲(chóng)體已經(jīng)死亡。直至72h，蟲(chóng)體在觀(guān)察的兩分鐘內(nèi)無(wú)活動(dòng)，基本都死亡。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。權(quán)利要求一種篩選治療和/或預(yù)防日本血吸蟲(chóng)感染藥物的藥物作用靶標(biāo)，所述的靶標(biāo)含有日本血吸蟲(chóng)腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SjANT)功能區(qū)域，所述的SjANT氨基酸序列為MGEGGKEIKGLSFAENFLLSGAAAVIAKTAAAPIERVKLLVQNQDEMIKQGRLDKPYTGVIDCTMRTFRHEGILPFWRGNLPNCLRYFPTQALNFAFKDKVKSAFKQNKDDPYLVSFYKNVVSGGTAGALSLVFVYSLDYARTRLANDNKSAKKGGTREFNGLIDVYAKTFKSDGIVGLYRGFVISCFGIIVYRGFYFGLYDTLKPIFLGPDAGVAISFCLGYGVTVTSGLISYPIDTIRRRMMMTSGQAVKYKSSIHCAAQIMKNEGPMSFMKGAGANILRGVAGAGVLAGFDKFKELYADFRLPKKPTP*所述的功能區(qū)域選自以下的一個(gè)或多個(gè)10GLSFAENFLLSGAAAVIAKTAAAPIERVKLLVQN81LPNCLRYFPTQALNFAFKDKVKSAF113YLVSFYKNVVSGGTAGALSLVFVYSLDYARTRLAN183FVISCFGIIVYRGFYFGLYDTL215VAISFCLGYGVTVTSGLISYPIDTIRRRMM276AGANILRGVAGAGVLAGFD。2.如權(quán)利要求1所述的藥物作用靶標(biāo)，其特征在于，所述的靶標(biāo)為含有日本血吸蟲(chóng)腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SjANT)和二磷酸腺苷(ADP)相互作用活性位點(diǎn)的SjANT功能區(qū)域，或含有日本血吸蟲(chóng)腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SjANT)和蒼術(shù)苷或羧基蒼術(shù)苷相互作用活性位點(diǎn)的SjANT功能區(qū)域。3.如權(quán)利要求1或2任一所述的藥物作用靶標(biāo)，其特征在于，所述的靶標(biāo)含有SjANT氨基酸序列中的以下位點(diǎn)ALA24,ALA27,LYS28,ALA31,ALA32,GLU35,LYS38,LEU39,PR082,ASN83,ARG86,TYR87,THR90，GLN91，ASN94，LYS98，VALIOI，LYS102,SER123,GLY124,ALA127,GLY128,SER131,LEU132，VAL135，LEU138，ASP139，ARG142，SER186，GLY189，ILE190,TYR193,ARG194,TYR197,PHE198,TYR223,THR226,VAL227,GLY230,LEU231,SER233,TYR234,ILE236,ASP237,ARG240,ARG241，ALA276，ASN279，ILE280，ARG282，GLY283，VAL284，GLY286，ALA287，禾PLEU290。4.一種如權(quán)利要求1所述的藥物作用靶標(biāo)的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的構(gòu)建方法包括步驟(1)用同源蛋白模建方法構(gòu)建SjANT的三維結(jié)構(gòu)；(2)根據(jù)SjANT與ADP、蒼術(shù)苷或羧基蒼術(shù)苷相互結(jié)合的區(qū)域，確定藥物作用活性位點(diǎn)。5.—種用如權(quán)利要求l所述的藥物作用靶標(biāo)篩選治療和/或預(yù)防日本血吸蟲(chóng)感染的藥物的方法，其特征在于，所述的篩選方法包括步驟(a)測(cè)定候選物與模建的SjANT對(duì)接的能量，選出能量打分高的化合物；(b)將步驟(a)得到的獲選化合物進(jìn)行與SjANT對(duì)接結(jié)合能力的評(píng)價(jià)，選出結(jié)合能力強(qiáng)的化合物；(c)將步驟(b)得到的獲選化合物與來(lái)源于人的腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ANT)進(jìn)行對(duì)接結(jié)合能力的評(píng)價(jià)，并同步驟(b)中所得到的對(duì)接能力進(jìn)行比較，選出兩者差異小于5-20kJ/mo1的化合物。6.如權(quán)利要求5所述的篩選方法，其特征在于，所述的方法包括步驟(a)從SjANT結(jié)構(gòu)出發(fā)測(cè)定候選物與蛋白對(duì)接的能量，選出能量打分高的化合物；(b)對(duì)步驟(a)得到的獲選化合物進(jìn)行分子類(lèi)藥性評(píng)價(jià)后，將步驟(a)得到的獲選化合物進(jìn)行與SjANT對(duì)接結(jié)合能力的評(píng)價(jià)，選出結(jié)合能力強(qiáng)的化合物；(c)采用從步驟(a)到步驟(b)的方法和模板模建人ANT的結(jié)構(gòu)，采用Glide產(chǎn)生對(duì)接構(gòu)象后將步驟(b)得到的獲選化合物針對(duì)人和日本血吸蟲(chóng)兩個(gè)不同的靶標(biāo)進(jìn)行結(jié)合自由能打分，選出對(duì)SjANT結(jié)合自由能打分低而對(duì)人ANT結(jié)合自由能打分高的化合物。7.如權(quán)利要求5所述的篩選方法，其特征在于，所述的方法還包括步驟(d)獲選化合物的體外抗血吸蟲(chóng)活性測(cè)試。8.如權(quán)利要求5所述的篩選方法，其特征在于，在步驟(c)中選出兩者差異小于7-15kJ/mol的化合物。9.一種抑制如權(quán)利要求1所述的靶標(biāo)的生物功能的制劑，其特征在于，所述的抑制劑是與耙標(biāo)SjANT活性位點(diǎn)互補(bǔ)，并阻斷所述SjANT和ADP結(jié)合、或阻斷所述SjANT和蒼術(shù)苷或其衍生物結(jié)合的有機(jī)分子化合物或多肽化合物或寡糖化合物或單克隆抗體或核苷類(lèi)化合物；優(yōu)選所述的抑制劑為有機(jī)化合物或多肽。10.—種如權(quán)利要求9所述的抑制劑在制備治療和/或預(yù)防日本血吸蟲(chóng)感染的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種篩選治療和/或預(yù)防日本血吸蟲(chóng)感染藥物的藥物作用靶標(biāo)，所述的靶標(biāo)為含有日本血吸蟲(chóng)腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SjANT)和二磷酸腺苷(ADP)相互作用的活性位點(diǎn)。本發(fā)明還公開(kāi)了所述靶標(biāo)的構(gòu)建方法及其用途。文檔編號(hào)A61K39/395GK101776680SQ20081003765公開(kāi)日2010年7月14日申請(qǐng)日期2008年5月20日優(yōu)先權(quán)日2008年5月20日發(fā)明者馮正,唐赟,孫勝?gòu)?qiáng),張浩冰,徐斌,曹志偉,李亦學(xué),楊忠,肖樹(shù)華,胡薇,莫筱瑾,鄧王平,陳宇綜,高振霆申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制所;華東理工大學(xué);上海生物信息技術(shù)研究中心