專利名稱：牛日本血吸蟲病抗體檢測試紙條的制備及其應(yīng)用方法
牛日本血吸蟲病抗體檢測試紙條的制備及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及家畜寄生蟲病的診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及牛日本血吸蟲病抗體檢測試紙條的制備及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
血吸蟲病是人畜共患的寄生蟲病。當(dāng)前我國尚有7省( 自治區(qū))100多個縣未達(dá)到血吸蟲病的傳播控制標(biāo)準(zhǔn)。牛是血吸蟲病的重要傳染源。由于受長江季節(jié)性洪水等自然因素及人畜流動頻繁等社會因素的影響，近年來我國血吸蟲病疫情又出現(xiàn)了反復(fù)，患病的人畜增加。我國一直來均將血吸蟲病列為動物疫病監(jiān)測及檢疫的重要對象。因此，對調(diào)運(yùn)家畜的血吸蟲病的過境檢疫、對現(xiàn)疫區(qū)家畜的血吸蟲病普查及對歷史上曾經(jīng)發(fā)生過血吸蟲病流行區(qū)的牲畜的監(jiān)測是一項(xiàng)長期而艱巨的任務(wù)。因此，研究家畜血吸蟲病快速檢測的方法對防制和消滅血吸蟲病具有重要意義。目前診斷家畜血吸蟲病的方法主要有糞孵血吸蟲毛蝴法、ELISA法、IHA法和金標(biāo)免疫滲濾法。糞孵毛蝴法只有在動物感染血吸蟲后5周以上才能糞孵出血吸蟲毛蝴，并且糞便中的蟲卵數(shù)量有波動，輕度感染的病畜尤易漏檢，且用糞孵法檢測一個樣品需耗時(shí)5 6個小時(shí)，隨著勞動力工資大幅上漲，該法在家畜血吸蟲病的普查中已很少被采用。ELISA方法操作繁瑣、時(shí)間長、酶試劑難以保存、影響因素多，檢測需專用儀器設(shè)備、試驗(yàn)中使用的某些材料易造成環(huán)境污染，對人健康有害。IHA穩(wěn)定性較差，敏感性不如ELISA法，實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間也較長。ELISA法和IHA法都不能滿足現(xiàn)場檢疫的要求。金標(biāo)免疫滲濾法具有檢測速度快、操作簡便不需特殊儀器等特點(diǎn)，適合于血吸蟲病的現(xiàn)場檢疫、診斷和普查。但其診斷試劑為液體，穩(wěn)定性較差，保存要求高(需4°C冰箱保存)，保存期短(僅6個月)，試劑及反應(yīng)板體積大，郵寄和航空運(yùn)輸受限，增加了保存、運(yùn)輸費(fèi)用及運(yùn)輸所需的時(shí)間。金標(biāo)免疫層析法可以克服金標(biāo)免疫滲濾法的這些缺點(diǎn)。國內(nèi)有數(shù)家單位對人血吸蟲病金標(biāo)免疫層析法進(jìn)行過研究，但由于各種原因都沒有批量生產(chǎn)和實(shí)踐中推廣開來。從理論上分析，膠體金與抗原或抗體的結(jié)合均是通過正負(fù)電荷的靜電引力結(jié)合在一起的。這種結(jié)合的牢固程度容易受溶液PH值和其他離子強(qiáng)度的影響，因此其最適pH范圍往往很小，檢測的可重復(fù)性較差。膠體金與抗原或抗體的結(jié)合還可能被血液中或試劑中加入的稱作為穩(wěn)定劑的其它蛋白與膠體金之間競爭性結(jié)合的影響，使試劑較快失效或者出現(xiàn)假陽性?？梢哉f這是金標(biāo)方法本身具有的局限性。從理論上說，通過共價(jià)鍵使分子之間結(jié)合的牢固程度要強(qiáng)于由靜電引力結(jié)合的強(qiáng)度。乳球免疫層析技術(shù)正是繼免疫膠體金技術(shù)后新近發(fā)展起來的一種以共價(jià)鍵結(jié)合為特點(diǎn)的免疫標(biāo)記新技術(shù)。本發(fā)明的檢測試劑為乳膠微球標(biāo)記的兔抗黃水牛IgG抗體，乳膠微球與兔抗黃水牛IgG抗體之間以共價(jià)鍵結(jié)合，所以該復(fù)合物穩(wěn)定性好，且乳膠微球的直徑比膠體金大10 20倍，信號強(qiáng)度大，可提高試劑的靈敏度和陽性樣本的檢出率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是，針對牛日本血吸蟲病ELISA和IHA診斷法存在操作步驟多、速度慢、不能滿足現(xiàn)場檢疫需求，和金標(biāo)免疫滲濾法檢測試劑系液體，保存期較短，不能空運(yùn)或郵寄等缺陷，為牛日本血吸蟲病的診斷、檢疫和普查提供一種敏感、特異、安全、穩(wěn)定性好、信號強(qiáng)度大，且為固體狀態(tài)、沒有污染的檢測試紙條，及在5 15分鐘內(nèi)即可完成的快速，簡便的檢測方法。本發(fā)明的原理是采用有機(jī)化學(xué)方法使紅色或其它顏色的聚苯乙烯乳膠微球羧基化后，使兔抗黃水牛IgG抗體蛋白的胺基與乳膠微球的羧基形成共價(jià)鍵，使該染色乳膠微球標(biāo)記的兔抗黃水牛IgG抗體的結(jié)合物作為檢測試劑(免疫探針)；再將該液狀的乳膠微球-兔抗黃水牛IgG抗體結(jié)合物以噴霧法使之吸附在聚脂膜上，經(jīng)烘干成固體狀的免疫探針干片；另以硝酸纖維素膜作為層析膜，并用劃膜噴金儀在該膜的不同位置上畫出血吸蟲卵可溶性抗原和羊抗兔IgG抗體兩條直線，分別作為檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線);然后按照樣品墊、免疫探針干片、層析膜和吸水濾紙的順序，以頭尾部分重疊的形式裝配在PVC基板上，再貼上箭頭標(biāo)簽?zāi)z膜與手柄標(biāo)簽?zāi)z膜后，用切條機(jī)按設(shè)定寬度裁切后即成牛日本血吸蟲病抗體檢測試紙條。
檢測時(shí)，將待檢稀釋血清滴在試紙條的樣品墊上(或?qū)⒙懵兜臉悠穳|插入待檢稀釋血清中10s)，血清液通過毛細(xì)管作用流經(jīng)免疫探針干片，將吸附在聚酯膜上的乳膠微球-兔抗黃水牛IgG抗體結(jié)合物溶解成游離狀，如果血樣中存在有牛抗血吸蟲抗體(即陽性牛血樣)，則該血樣中的抗體將會與部分游離狀的乳膠微球-兔抗黃水牛IgG抗體結(jié)合物相結(jié)合，形成?？寡x抗體-兔抗黃水牛IgG抗體-乳膠微球的三聯(lián)紅色或其它顏色的復(fù)合物后，并沿著硝酸纖維素膜繼續(xù)向前移行，當(dāng)這種紅色或其它顏色的復(fù)合物移行到預(yù)先錨固著血吸蟲抗原的檢測線(T線)上時(shí)，該血吸蟲抗原將會與復(fù)合物中的?？寡x抗體相結(jié)合，而形成更大的四聯(lián)復(fù)合物而使T線呈顯紅色或其它顏色的條帶；而剩余的未與牛抗血吸蟲抗體相結(jié)合的游離狀乳膠微球-兔抗黃水牛IgG抗體結(jié)合物將繼續(xù)往前移行，當(dāng)與錨固在硝酸纖維素膜上的羊抗兔IgG抗體質(zhì)控線(C線)相遇時(shí)，便形成羊抗兔IgG抗體-兔抗黃水牛IgG抗體-乳膠微球的三聯(lián)紅色復(fù)合物,使C線呈現(xiàn)紅色條帶；如果血樣中不存在?？寡x抗體(即陰性牛血樣)，則就不能形成?？寡x抗體-兔抗黃水牛IgG抗體-乳膠微球的三聯(lián)復(fù)合物，而單純的乳膠微球-兔抗黃水牛IgG抗體結(jié)合物是不能與T線上的血吸蟲抗原相結(jié)合的，所以檢測線(T線)不能呈現(xiàn)紅色或其它顏色的條帶，而只有質(zhì)控線(C線)仍呈顯紅色或其它顏色的條帶；如果檢測線與質(zhì)控線均沒有出現(xiàn)紅色條帶，則說明該試紙條已失效或者檢測操作有誤。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)I、一種檢測牛日本血吸蟲病抗體的試紙條，該試紙條由部件樣品墊、免疫探針干片、層析膜、吸水紙、PVC基板及箭頭標(biāo)簽?zāi)z膜與手柄標(biāo)簽?zāi)z膜組合而成；其中，免疫探針干片是以紅色或其它顏色羧基化聚苯乙烯乳膠微球的羧基，與兔抗黃水牛IgG抗體蛋白的胺基形成共價(jià)鍵結(jié)合物后作為免疫探針的檢測試劑液吸附于聚脂膜后制成；層析膜是以硝酸纖維素膜為膜基，用劃膜噴金機(jī)將血吸蟲卵可溶性抗原和羊抗兔IgG抗體分別在該膜上畫出檢測T線和質(zhì)控C線而成；先將上述前四部件按頭尾部分重疊粘合裝配在PVC基板上，再將箭頭標(biāo)簽?zāi)z膜粘貼在免疫探針干片上，另將手柄標(biāo)簽?zāi)z膜粘貼在吸水紙上后，用切條機(jī)按設(shè)定寬度裁切后即成牛日本血吸蟲病抗體檢測試紙條。
2、一種制備牛日本血吸蟲病抗體檢測試紙條的方法，該方法按以下步驟進(jìn)行(I)免疫探針干片的制備包括I)兔抗黃水牛IgG的制備①黃水牛IgG的制備采集健康黃牛、水牛血液,分別分離血清后取血清各5ml混合，加等量O. 85%NaCl，用30%硫酸銨沉淀法提取黃水牛IgG，沉淀的黃水牛IgG用原血清體積2倍量的O. 85%NaCl溶解，再用35%硫酸銨沉淀法重復(fù)提取2次，最后用5ml O. 85%NaCl溶解離心沉淀的黃水牛IgG，用透析法除去溶液中的NH4+及SO/—后，再用蒸餾水稀釋或?qū)⑼肝龃湃隤EG中濃縮的方法，調(diào)節(jié)蛋白濃度至10mg/ml后，于_20°C密封貯存?zhèn)溆?；②黃水牛IgG免疫兔將黃水牛IgG與弗氏完全佐劑按體積3:7比例制成油乳劑，按黃水牛IgG 6mg/只兔用量，對體重2. 5kg的健康雄性家兔，在兔頸部皮下和兔雙側(cè)后足 踱墊皮下注射進(jìn)行首次免疫；后除用弗氏不完全佐劑替代弗氏完全佐劑外，再按上述同樣配比、方法，每隔兩周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，共進(jìn)行三次；第4次后10天，取耳靜脈少量血分離血清，用瓊脂擴(kuò)散法測定免疫血清效價(jià)，當(dāng)血清效價(jià)> 1:64時(shí)，即可心臟大量釆血、分離血清后，備用；③兔抗黃水牛IgG抗體的制備取兔抗黃水牛IgG血清10ml，以35%硫酸銨沉淀法提取兔抗黃水牛IgG抗體，以2倍于血清量的O. 85%NaCl溶解沉淀的兔抗黃水牛IgG抗體，如此反復(fù)提取3次后，將第3次硫酸銨沉淀的兔抗黃水牛IgG抗體的離心沉淀物以5mlO. 85%NaCl溶解，用透析法除去溶液中的NH4+及S042_ ;在蛋白測定儀上測定兔抗黃水牛IgG抗體蛋白含量后，用PH7. 200. IM的硼酸緩沖液稀釋或?qū)⑼肝龃湃隤EG中濃縮的方法，將蛋白濃度調(diào)節(jié)至4mg/ml后，于_20°C密封貯存?zhèn)溆茫?)乳膠微球的洗滌將直徑200nm紅色或其它顏色的聚苯乙烯乳膠微球液，在10000rpm，4°C條件下離心lOmin，去上清液，沉淀物用高純水還原為原體積，用超聲波分散沉淀的乳膠微球成為均勻懸浮液后，再用上述相同的方法重復(fù)離心、重懸浮I 2次；3)乳膠微球羧基的激活將pH6. 50. Imol MES, 10%帶色乳膠微球的懸液，20mg/mL的EDC .HCl和20mg/mL的NHS,按體積9:2:1:0. 75 ^比例混合、反應(yīng)2hr ;然后在IIOOOrpm
4°C條件下離心25min，除去上清液，沉淀物以所用帶色乳膠體積5倍量的pH7. 200. IM的硼酸緩沖液重懸，以超聲波擊打還原成均勻的懸浮液；用垂直混合儀混合15min，在IlOOOrpm, 4 °C條件下離心25min除去上清液，沉淀物以所用帶色乳膠體積2. 5倍量的PH7. 200. IM的硼酸緩沖液重懸，以超聲波擊打還原成均勻的懸浮液，即為羧基活化的乳膠微球；4)乳膠微球標(biāo)記兔抗黃水牛IgG抗體往裝有羧基活化乳膠微球懸浮液的離心管中加入等體積以PH7. 200. IM的硼酸緩沖液稀釋成蛋白濃度為I 4mg/mL的兔抗黃水牛IgG抗體，在垂直混合儀上混合反應(yīng)2hr以上；再加入總體積十分之一量的20%BSA振蕩反應(yīng)lhr，反應(yīng)后的混合物以IlOOOrpm 4°C離心25min，除去上清液，沉淀物以含酪蛋白O. 2% O. 5%、蔗糖 5% 10%、NaN3 O. 02% O. 05% 的 ρΗ7· 20. 05Μ Tris-HCl 緩沖液構(gòu)成的封閉液原體積重懸，超聲波擊打還原成均勻的懸浮液，在垂直混合儀上混合15min,再次以IlOOOrpm 4°C離心25min，除去上清液，沉淀物以相當(dāng)于乳膠微球懸浮液和兔抗黃水牛IgG抗體兩者總體積75%的同上封閉液重懸，超聲波擊打還原成均勻的懸浮液，該液即為紅色或其它顏色的免疫探針檢測試劑液；
5)免疫探針干片的制備將上述的免疫探針檢測試劑液用劃膜噴金機(jī)以2
5μ 1/cm的流速噴涂在已經(jīng)過含酪蛋白O. 2% O. 5%，蔗糖5% 10%，NaN3O. 02% O. 05%, Tween-200. 2% O. 5%的pH7. 20. 05M Tris-HCl緩沖液構(gòu)成的聚酯膜處理液預(yù)處理后的長300mmX寬8. 5mm的聚酯膜上，經(jīng)37°C，Ihr烘干，即為免疫探針干片；(2)層析膜的制備I)血吸蟲卵可溶性抗原的制備按體重2. 5 3kg的健康新西蘭兔，每只接種血吸蟲尾蝴2000條，實(shí)驗(yàn)感染兔于接種后45日屠宰取肝臟，分離和純化血吸蟲蟲卵，經(jīng)冷凍干燥后研磨破碎，用O. 85%NaCl溶液配成3% 5%懸浮液，2 8°C浸泡3日，再反復(fù)凍融10次，冰浴超聲波破碎30min, 10000r/min離心lhr,取上清液,裝透析袋,用pH7. 00. OlM PB透析16小時(shí)，每隔4小時(shí)換透析液I次，透析結(jié)束后，以IOOOOrp離心60min，上清液即為血吸蟲卵可溶性抗原；檢測其蛋白含量后，用PH8. 2 8. 50. 05M TBS稀釋至I 7mg/mL濃度，即可用于層析膜上檢測T線的繪制； 2)羊抗兔IgG的制備①兔IgG的制備以心臟采血法采集健康新西蘭兔的血液,分離血清,取兔血清IOml，再加IOml O. 85%NaCl混勻，用35%硫酸銨沉淀法提取兔IgG，反復(fù)沉淀提取3次，沉淀物用5ml O. 85%NaCl溶解后，用透析法除去硫酸銨，并在蛋白測定儀上測定兔IgG的蛋白含量;②羊抗兔IgG抗體的制備用弗氏佐劑將兔IgG溶液配制成lmg/ml,用超聲波制成乳濁液；按照每千克體重2mg的劑量皮下注射免疫羊，每間隔2周，再用弗氏不完全佐劑和兔IgG制備成相同濃度的乳濁液，以相同劑量與方法免疫羊，第3次免疫后IOd頸靜脈采血分離血清，以瓊脂免疫擴(kuò)散法測定血清中羊抗兔IgG抗體效價(jià)> 1:32以上時(shí)，即可大量采集羊血并制取血清；分離羊抗兔IgG抗體先用30%硫酸銨沉淀法提取粗羊抗兔IgG抗體一次，再用45%硫酸銨沉淀法提取2次，離心沉淀物用5ml O. 85%NaCl溶解，用透析法除去溶液中的NH4+及S042-，3000rpm離心30min，檢測上清液蛋白含量后，用pH8. 2 8. 50. 05M TBS將上清液稀釋成O. I 2mg/mL的濃度，即可用于層析膜上質(zhì)控C線的繪制；3)檢測線和質(zhì)控線的制作將長25mmX寬300mm的硝酸纖維素膜放在劃膜噴金機(jī)的操作平臺上，在該機(jī)1#泵的試劑瓶中加入血吸蟲卵可溶性抗原，2#泵的試劑瓶中加入羊抗兔IgG，以I 3 μ 1/cm的流速，在硝酸纖維素膜上劃出檢測T線和質(zhì)控C線，兩線相距5 6mm,置室內(nèi)晾干即為層析膜；(3)樣品墊的制備將23mmX300mm玻璃纖維膜在由含酪蛋白O. 01% O. 05%,蔗糖 5% 10%、NaN30 . 02% O. 05% 和 Tween-200. 2% O. 5% 的 ρΗ7· 20. 04MTris_HCl 緩沖液構(gòu)成的樣品墊處理液中浸泡lhr，取出，37°C烘干即成；(4)吸水紙的制備CH37吸水紙裁成長300mmX寬28mm的紙條，置37°C烘干即成；(5) PVC基板的制備PVC板其結(jié)構(gòu)為三層，第一層為保護(hù)紙，第二層為不干膠，第三層為PVC基板；在保護(hù)紙上刻有三條刻痕，分別位于距離一側(cè)長邊的20mm、27mm和53mm處；將PVC板按長300mmX寬80mm規(guī)格裁剪后備用；(6)標(biāo)簽?zāi)z膜的制備用不干膠貼紙印制而成；其中，I)箭頭標(biāo)簽?zāi)z膜其規(guī)格為長300mmX寬18mm，在距一側(cè)長邊Imm處印有一條直線，在該直線的上方，每隔1.3_印有一條“一MAX”字樣，箭頭與直線垂直；指示試紙條樣品墊可浸入待測溶液的最大深度不得超過這條直線；2)手柄標(biāo)簽?zāi)z膜其規(guī)格為長303mmX寬30mm，綠底白字，與長邊呈15°夾角印有4列“SjAb”字樣，SjAb為Schistosoma japonicum Antibody的縮寫，表示該試紙條用于檢測日本血吸蟲抗體，該部位為試紙條拿取時(shí)的手柄部位；(7)試紙條各部件的組裝、切條、包裝和貯存I)試紙條各部件的組裝試紙條以長300mmX寬80mm的PVC為基板，依次將300_X 23_的樣品墊、300mm X 8. 5mm的免疫探針干片、300_X 25_的層析膜及300mmX 28mm的吸水紙，按頭尾各有I 2mm的重疊連接、粘貼在帶不干膠面的PVC基板上；再在吸水墊的尾部與免疫探針干片上粘貼上箭頭標(biāo)簽?zāi)z膜；另在樣品墊上粘貼上手柄標(biāo)簽?zāi)z膜；各部件壓平，粘貼牢固即成試紙條大卡；
2)切條將試紙條大卡放在切條機(jī)上,按3mm寬度連續(xù)切割，即成寬3mmX長80mm的試紙條；3)包裝與貯存試紙條抽檢合格后，按包裝規(guī)格要求裝入鋁箔袋中，放入I小包干燥劑后，封口，即成產(chǎn)品；在2 8°C保存，有效期為12個月。3、應(yīng)用試紙條檢測牛日本血吸蟲病抗體的方法，該方法按以下步驟進(jìn)行(I)血清稀釋液的配制將Na2HP04、KH2PO4, NaCl與蒸餾水按重量體積O. 199g O. 082g Ig 200ml比例混合，37 40°C水浴加熱溶解、冷卻后即成血清稀釋液；(2)待檢牛血清的稀釋將待檢牛血清與血清稀釋液按體積I: I 2比例混合稀釋；(3)檢測操作吸取稀釋的待檢血清O. 05ml滴在平放的試紙條的樣品墊上，或?qū)⒃嚰垪l的樣品墊端插入待檢稀釋血清中至箭頭標(biāo)簽?zāi)z膜所印的直線條15s后，平放在操作臺面上；(4)結(jié)果判定5 15min后觀察結(jié)果，檢測T線和質(zhì)控C線均呈現(xiàn)紅色或其它顏色的同色條帶，則判為陽性；僅質(zhì)控C線呈現(xiàn)I條紅色或其它顏色的條帶，則判為陰性；檢測T線和質(zhì)控C線均不呈現(xiàn)條帶，則說明該試紙條已失效或試驗(yàn)操作有誤。本發(fā)明的有益效果是(I)用本發(fā)明試紙條檢測牛血吸蟲病無需復(fù)雜儀器和專門知識技能，操作簡便、快捷,5 15min就可得出結(jié)果。(2)本發(fā)明試紙條體積小、重量輕、全固態(tài)，可方便郵寄或航空托運(yùn)。(3)試紙條有效期可達(dá)I年以上，比免疫金標(biāo)滲濾法檢測試劑的保存期長。(4)本發(fā)明試紙條的檢測特異性與IHA和ELISA方法相當(dāng)，重復(fù)性好，適合于工廠
化生產(chǎn)。(5)本發(fā)明用黃、水牛IgG免疫兔以制備兔抗黃水牛IgG抗體，與單純使用黃牛IgG免疫兔的方法相比，①產(chǎn)生的兔抗黃水牛IgG抗體效價(jià)高4倍(l:64vs I : 16)，兔抗黃水牛IgG抗體效價(jià)高可以相對減少用量，降低成本使用黃、水牛IgG免疫兔制備的兔抗黃水牛IgG抗體可以提高血吸蟲陽性水牛血清中抗體檢測的敏感性。用兔抗黃牛IgG抗體制備的試紙條檢測實(shí)驗(yàn)感染血吸蟲尾蝴49天的2倍稀釋水牛血清，呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，檢測3倍稀釋血清只呈現(xiàn)弱陽性反應(yīng)(+)，但用兔抗黃水牛IgG抗體制備的試紙條檢測同樣3倍稀釋血清，卻呈現(xiàn)強(qiáng)陽性反應(yīng)(+++)。所以用本發(fā)明的兔抗黃水牛IgG抗體制備免疫探針試劑液比使用通常的兔抗黃牛IgG抗體更具優(yōu)勢。

圖I貼標(biāo)簽?zāi)z膜前試紙條的結(jié)構(gòu)示意2貼標(biāo)簽?zāi)z膜后試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖 其中，I樣品墊、2免疫探針干片、3層析膜、4吸水紙、5PVC基板、6檢測T線、7質(zhì)控C線、8箭頭標(biāo)簽?zāi)z膜、9手柄標(biāo)簽?zāi)z膜本發(fā)明以圖2作為摘要附圖。
實(shí)施方式通過以下實(shí)施例和試驗(yàn)例并結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實(shí)施例I :(檢測牛日本血吸蟲病抗體試紙條的制備I)I試紙條的制備I. I免疫探針干片制備I. I. I兔抗黃水牛IgG的制備⑴黃水牛IgG的提?、贌o菌操作采集健康黃牛及水牛血液，分別分離血清。②取黃牛及水牛血清各5ml混合，再加IOml O. 85%NaCl混勻，逐滴加入飽和硫酸銨(SAS) 8. 6ml使之達(dá)到30%飽和度，邊加邊攪拌，并用濃氨水調(diào)節(jié)pH值至7. O,置4°C過夜，取出室溫平衡lhr，以3000r/min離心30min，棄上清，沉淀物加入20ml O. 85%NaCl溶解。再逐滴加入SAS 10. 8ml使之達(dá)到35%飽和度，邊加邊攪拌，用濃氨水調(diào)節(jié)pH值至
7.0，置4°C 3hr后取出，室溫平衡lhr，以3000r/min離心30min，棄上清，沉淀物加入20ml0.85%NaCl溶解。用35%飽和度硫酸銨再重復(fù)提取一次。離心后沉淀物用5ml O. 85%NaCl溶解后，裝入直徑2cm的透析袋透析內(nèi)密封。③在4°C條件下進(jìn)行透析，開始先用蒸餾水透析8小時(shí)，換液4次，再用O. OlmolPH7. O磷酸鹽緩沖液(PB)透析6小時(shí)，換液2次，以除去NH4+及S042。透析后的黃水牛IgG即可達(dá)到免疫兔的純度要求。④用紫外分光光度法測得黃水牛IgG蛋白質(zhì)濃度為5. 3mg/ml, PEG濃縮調(diào)整為
10mg/mlο⑵黃水牛IgG免疫兔①試驗(yàn)動物選體重2. 5kg健康雄性家兔2只。②黃水牛IgG的乳化首免的油乳劑由黃水牛IgG與弗氏完全佐劑按3:7比例混合，超聲波擊打使之乳化，直至將黃水牛IgG油乳劑滴于冷水表面，能較長時(shí)間保持完整而不分散，即可應(yīng)用。2-4免的油乳劑由黃水牛IgG與弗氏不完全佐劑按3:7比例制成。③免疫首次免疫在兔頭頸部皮下、兔雙側(cè)后足踱墊皮下各注射黃水牛Ig乳劑4ml (黃水牛IgG的蛋白總量為12mg)，兩周后，每周用黃水牛IgG加強(qiáng)免疫I次，免疫黃水牛IgG的蛋白總量為12mg。如次重復(fù)3次，末次免疫10天后，耳靜脈取少量血，分離出血清，用瓊脂擴(kuò)散法測定免疫血清的效價(jià)，待血清效價(jià)達(dá)I :64或以上時(shí)即心臟采血，分離血清。⑶兔抗黃水牛IgG抗體的提?、偃⊥每裹S水牛IgG血清IOml，加入等量的O. 85%NaCl混勻，逐滴加入SAS10. 8ml使之達(dá)到35%飽和度，邊加邊攪拌，并用濃氨水調(diào)節(jié)pH值至7. 0，置4°C過夜后取出，室溫平衡I小時(shí)，以3000rpm離心30min，棄上清，沉淀物加入20ml O. 85%NaCl溶解。置40C 3hr后取出，室溫平衡lhr，逐滴加入SAS10. 8ml使之達(dá)到35%飽和度，邊加邊攪拌，用濃氨水調(diào)節(jié)PH值至7. 0，置4°C 3hr后取出，室溫平衡I小時(shí)，以35%飽和度硫酸銨再重復(fù)提取一次，離心后沉淀物用5ml O. 85%NaCl溶解后，裝入直徑2cm的透析袋內(nèi)。⑷透析提純透析在4 °C下進(jìn)行，開始先用蒸餾水透析8小時(shí)，換液4次，再用
O.Olmol pH7. O磷酸鹽緩沖液(PB)透析6小時(shí)，換液2次，以除去NH4+及SO42' (5)蛋白含量測定用紫外分光光度法測得兔抗黃水牛IgG的蛋白質(zhì)濃度為5. Omg/ml，用pH7. 20. IM硼酸緩沖液稀釋成含蛋白4mg/ml，-20°C貯存?zhèn)溆谩?.1.2試劑配制(I) IN NaOH 稱取 NaOH 2. OOOg,蒸餾水定容至 50ml。⑵pH6. 50. Imol MES稱取MES O. 4881g,蒸餾水定容至25ml，滴加IN NaOH使溶液pH達(dá)到6. 5。(3) 20mg/ml NHS 稱取 NHS O. 050g,加蒸餾水 2. 5ml 溶解。(4) 20mg/ml EDC · HCl 稱取 EDC · HCl O. 050g,加蒸餾水 2. 5ml 溶解(5)0. IM硼酸溶液稱取硼酸O. 6183g，用蒸餾水定容至100ml。(6) O. 025M硼砂溶液稱取硼砂O. 4767g，用蒸餾水定容至50ml。(7) ρΗ7· 20. IM硼酸緩沖液取O. Imol硼酸溶液95ml加O. 025mol硼砂溶液5ml混
八
口 ο(8) O. 2M Tris 稱取 Tris 12. 114g,用蒸餾水定容至 500ml。(9) O. IN HCl吸取12N濃鹽酸4. 167ml，放入容量瓶，用蒸餾水定容至500ml(10) O. 05M Tris-HCl 緩沖液①ρΗ7· 20. 05Μ Tris-HCl 緩沖液取 O. 2Μ Tris 25ml 加 O. IN HCl 45ml 混合，再加蒸餾水至100ml。②ρΗ8· 20. 05Μ Tris-HCl 緩沖液取 O. 2Μ Tris 25ml 加 O. IN HCl 22. 5ml 混合，再加蒸餾水至100ml。(11) pH7. 2 封閉液稱取酪蛋白 O. 500g、蔗糖 5. 00g、NaN3O. 020g 全部放入 IOOmlPH7. 20. 05M Tris-HCl緩沖液中，37 40°C水浴加熱至完全溶解。即成含酪蛋白O. 5%，蔗糖5%，NaN3O. 02%的ρΗ7· 20. 05Μ Tris-HCl緩沖液構(gòu)成的封閉液。(12) 2. Omg/ml兔抗黃水牛IgG抗體吸取兔抗黃水牛IgG (5mg/ml) 8ml加入到12mlpH7. 20. 05mol硼酸緩沖液中混合均勻。(13) 20%BSA溶液稱取進(jìn)口 BSA 2. OOOg,用IOml蒸餾水溶解。I. I. 3乳膠微球標(biāo)記兔抗黃水牛IgG結(jié)合物的制備⑴乳膠微球的洗漆紅色乳膠微球，直徑300nm,在IOOOOrpm, 4 °C條件下離心IOmin,去上清液，沉淀用適量的高純水還原為原體積，用超聲波分散沉淀的乳膠微球，使之成為均勻的懸浮液，再用上述相同的參數(shù)重復(fù)洗滌(即離心及重懸浮)I 2次。
⑵取I. 5ml塑料離心管24支，往每支離心管中加入O. 9ml pH6. 50. ImolMES, O. 2ml紅色乳膠微球，混合均勻。再加入O. Iml EDC · HCl (20mg/ml)和O. 075mlNHS (20mg/ml)混合均勻。⑶在垂直混合儀上振蕩混合2hr。(4) 10000rpm，4°C，離心lOmin，去上清，每支離心管的沉淀用Iml pH7. 20. IM硼酸緩沖液重懸，超聲波(2sX5次)勻質(zhì)。在垂直混合儀上振蕩混合15min。(5)重復(fù)⑷的操作，只是每支離心管的沉淀用O. 5ml硼酸緩沖液重懸。(6)往每支離心管中加入蛋白含量lmg/ml的兔抗黃水牛IgGO. 5ml,在垂直混合儀上振蕩混合2hr。(7)往每支離心管中加入20%BSA O. Iml,在垂直混合儀上振蕩混合lhr。 (8) IlOOOrpm, 4°C，離心25min，去上清，每支離心管的沉淀用Iml封閉液重懸，超聲波(2sX5次)勻質(zhì)。在垂直混合儀上振蕩混合15min。(9)重復(fù)(7)的操作，只是每支離心管的沉淀用0. 75ml pH7. 2封閉液重懸。超聲波(2sX5次)勻質(zhì)。最后得到的不透明紅色懸浮液即為乳膠微球標(biāo)記的兔抗黃水牛IgG結(jié)合物，即免疫探針檢測試劑液。I. I. 4免疫探針干片的制備I. I. 4. I 聚酯膜處理液的配制 0. 2M Tris 125ml,0. IN HCl 225ml,酪蛋白 2. 5g,蔗糖25g，NaN3O. Ig混合，37°C水浴溶解，再加入吐溫-201. Oml攪拌均勻，加蒸餾水至500ml混合均勻，即成含酪蛋白0. 5%，蔗糖5%, NaN3O. 02%,吐溫-200. 2%的ρΗ7· 20. 05Μ Tris-HCl緩沖液構(gòu)成的聚酯膜處理液。I. I. 4. 2聚酯膜的預(yù)處理將聚酯膜切成300mmX 17mm的小條，放入聚酯膜處理液中浸泡4hr，取出平放在搪瓷盆中，37°C烘干，裝入封口塑料袋中，置4 8°C冰箱中冷藏保存?zhèn)溆?。I. I. 4. 3免疫探針干片制作用劃膜噴金機(jī)將乳膠微球標(biāo)記兔抗黃水牛IgG結(jié)合物以5μ Ι/cm的流速噴涂在已處理過的聚酯膜上，每條聚酯膜(300mmX17mm)以縱向中心線為軸，對稱地噴2條乳膠微球標(biāo)記兔抗黃水牛IgG結(jié)合物條帶，37 °C烘干，切成300mmX8. 5mm的小條，則成免疫探針干片。將免疫探針干片密封在塑料袋中，置4 8°C冰箱中冷臧保存，備用。I. 2層析膜的制備I. 2. I血吸蟲抗原的制備I. 2. I. I血吸蟲蟲卵的制備I. 2. I. I. I血吸蟲尾蝴接種兔將保存在4°C冰箱中的日本血吸蟲陽性釘螺，用前取出200個，置25°C室溫I 2hr后，放在裝有脫氯水的IOOml燒杯內(nèi)逸放尾蝴。兔腹部剃毛，使皮膚裸露。用接種環(huán)小心在液面挑取液體，置于載玻片上，在顯微鏡下對尾蝴計(jì)數(shù)后，將有尾蝴的載玻片貼于兔(體重2. 5 3kg的健康新西蘭兔)腹部皮膚暴露處5 IOmin,完成感染，每只兔感染尾蝴約2000條。I. 2. I. I. 2血吸蟲蟲卵的分離將感染45d的兔取出肝臟，除去膽囊、膽管、血管及結(jié)締組織，用4°C預(yù)冷的l%NaCl洗凈血污，將肝臟剪成碎塊，加l%NaCl, —并倒入搗碎機(jī)內(nèi)快速搗碎(8000rpm)搗碎過程分4次,間隔進(jìn)行,每次搗2min,停2min。搗碎的肝臟加l%NaCl稀釋，用60、80、100和120目的標(biāo)準(zhǔn)篩過濾。濾液再用260目尼龍網(wǎng)過濾。將尼龍網(wǎng)上蟲卵粗提物用l%NaCl洗脫。將洗脫液倒入50ml的消毒離心管內(nèi)，以3500rpm離心lmin，棄去上、中層，下層金黃色蟲卵反復(fù)用l%NaCl洗滌，離心，直至看不到灰褐色的肝組織為止。將獲得的蟲卵再用尼龍絹(140、260目)重疊過濾，除去殘留的肝組織細(xì)胞，260孔尼龍絹上物，經(jīng)離心沉淀反復(fù)除去白褐色絮狀物，即得純凈的血吸蟲卵。將純凈蟲卵分裝于I. 5ml Eppendorf管中，12000r/min離心30s,以進(jìn)一步去除蟲卵中的水分。I. 2. I. I. 2血吸蟲蟲卵的干燥和保存將蟲卵置平血中，用冷凍干燥機(jī)凍干。密封，置-20°C保存。I. 2. I. 2血吸蟲抗原的提?、湃⊙x蟲卵Ig先用玻璃勻衆(zhòng)器研磨30min,再加少量O. 85%NaCl研磨30min,然后配成3%懸液，置4°C冰箱浸泡3d，-200C反復(fù)凍融10次，冰浴超聲裂解30min (400W)， 13000rpm離心lhr，取上清即成未透析血吸蟲可溶性抗原I。-20°C保存，或者直接進(jìn)行下一步處理。⑵將⑴步驟離心沉淀物用5ml O. 85%NaCl重懸，冰浴超聲裂解IOmin (400W)，垂直混合儀上作用15min, IOOOOrpm離心lhr,取上清即為未透析血吸蟲可溶性抗原2。⑶取血吸蟲蟲卵Ig先用玻璃勻衆(zhòng)器研磨30min,再加少量O. 85%NaCl研磨30min,然后配成3%懸液，置4°C冰箱浸泡3d，_20°C反復(fù)凍融10次，冰浴超聲裂解30min(400W)，10000r/min離心lhr,取上清即成未透析血吸蟲可溶性抗原3。I. 2. I. 3血吸蟲抗原的透析取血吸蟲抗原適量，裝入透析袋，用pH7. 00. OlM PB透析16hr，每隔4hr換透析液I次，透析結(jié)束后，以10000r/min離心60min,上清液即為已透析血吸蟲抗原。測蛋白含量后，或按體積定量分裝，放_20°C保存，或按蛋白量定量分裝，凍干，-20°C保存?zhèn)溆?，或直接配制生產(chǎn)用抗原。I. 2. I. 4抗原蛋白含量測定(蛋白測定儀的測定原理相同，已實(shí)現(xiàn)程序化和微量化測定)隨機(jī)取已透析血吸蟲抗原3瓶，用pH7. 00. OlmolPB作為稀釋液和空白對照，于紫外分光光度計(jì)測定吸收值(A28CI&A26CI)。按公式蛋白含量(mg/ml)=(I. 45 X A280-O. 74 X A260) X稀釋倍數(shù)，計(jì)算每Iml抗原的蛋白含量，取平均值。I. 2. I. 5生產(chǎn)用血吸蟲抗原的配制I. 2. I. 5. I抗原稀釋液的配制(I) O. 2mol Tris溶液配制稱取Tris 2. 4228g，蒸餾水定容至100ml，即為O. 2MTris溶液。(2) O. IN HCl溶液配制吸取分析純濃鹽酸4. 167ml，蒸餾水定容至500ml。(3) ρΗ8· 20. 05Μ TBS 緩沖液配制 O. 2Μ Tris 溶液 25ml 和 O. IN HCl 22. 5ml 混合，加入NaCl O. 85g,溶解,再用蒸懼水加至IOOml即成。I. 2. I. 5. 2生產(chǎn)用血吸蟲抗原的配制根據(jù)透析處理后抗原蛋白的含量，用pH8. 20. 05M TBS緩沖液將已透析的抗原稀釋成含蛋白lmg/ml的生產(chǎn)用抗原。I. 2. 2羊抗兔IgG的制備
I. 2. 2. I 兔 IgG 的制備⑴兔血清的制備按無菌操作要求，用心臟采血法采集健康新西蘭肉兔的血液，分
離血清。⑵兔IgG的提取取兔血清10ml，再加IOml O. 85%NaCl混勻，逐滴加入SAS 10. 8ml使之達(dá)到35%飽和度，邊加邊攪拌，并用濃氨水調(diào)節(jié)pH值至7. 0，置4°C過夜后取出，室溫平衡I小時(shí)，以3000rpm離心30min，棄上清，沉淀物加入20ml O. 85%NaCl溶解。再用35%飽和度硫酸銨同法沉淀2次。只是4°C靜置時(shí)間改為3hr。第3次離心后沉淀物用5ml O. 85%NaCl溶解后，裝入直徑2cm的透析袋透析內(nèi)。⑶透析提純透析于4°C條件下進(jìn)行，開始先用蒸餾水透析8小時(shí)，換液4次，再用PH7. 00. OlM磷酸鹽緩沖液(PB)透析6小時(shí)，換液2次，以除去以除去NH4+及SO廣。⑷蛋白濃度測定用蛋白測定儀測得兔IgG蛋白質(zhì)濃度為7. 7mg/ml，用PEG濃縮后·調(diào)整為10mg/ml。_20°C保存?zhèn)溆?。I. 2. 2. 2 兔 IgG 免疫羊⑴實(shí)驗(yàn)動物選健康雄性波爾山羊2只，體重20kg/只。 (2)兔IgG的乳化首免兔IgG油乳劑由兔IgG與弗氏完全佐劑按3:7比例乳化，冰浴超聲波擊打至將兔IgG油乳劑滴于冷水表面，較長時(shí)間保持完整而不分散，即可應(yīng)用。2-4免的IgG油乳劑由兔IgG與弗氏不完全佐劑按3:7比例制備。⑶免疫首次免疫在羊頭頸部皮下、羊雙側(cè)后足踱墊皮下各注射兔IgG油乳劑
6.4ml (兔IgG的蛋白含量為19. 2mg)，兩周后，每2周用兔IgG加強(qiáng)免疫I次，免疫兔IgG的蛋白總量為19. 2mg。如此重復(fù)3次，末次免疫8天后，耳靜脈取少量血，分離出血清，用瓊脂擴(kuò)散法測定免疫血清的效價(jià)，待血清效價(jià)達(dá)1:32時(shí)即可釆血，分離血清。即為含羊抗兔IgG的血清。I. 2. 2. 3羊抗兔IgG的提?、叛蚩雇肐gG提取取羊抗兔IgG血清10ml，再加IOml O. 85%NaCl混勻，逐滴加入SAS 8.6ml使之達(dá)到30%飽和度，邊加邊攪拌，并用濃氨水調(diào)節(jié)pH值至7. O，置4°C過夜后取出，室溫平衡I小時(shí)，以3000rpm離心30min，棄上清，沉淀物加入20ml O. 85%NaCl溶解。再逐滴加入SAS16. 4ml使之達(dá)到45%飽和度，邊加邊攪拌，用濃氨水調(diào)節(jié)pH值至7. O,置40C 3hr后取出，室溫平衡lhr，以3000rpm離心30min，棄上清，沉淀物加入20ml O. 85%NaCl溶解。再用45%飽和度硫酸銨提取一次，離心后沉淀物用5ml O. 85%NaCl溶解后，裝入直徑2cm的透析袋透析內(nèi)。⑵透析提純透析于4°C條件下進(jìn)行，開始先用蒸餾水透析8hr，換水4次，再用pH7. 00. OlM磷酸鹽緩沖液(PB)透析6hr,換液2次。透析液3000rpm離心30min取上清液。即為羊抗兔IgG抗體溶液。⑶蛋白濃度測定用紫外分光光度法測得羊抗兔IgG抗體的蛋白質(zhì)濃度為IOmg/ml, -20°C貯存?zhèn)溆?。I. 2. 2. 4生產(chǎn)用羊抗兔IgG的配制⑴羊抗兔IgG稀釋液的配制羊抗兔IgG稀釋液與抗原稀釋液相同，配制方法見
1.2. 1. 5. I ο⑵生產(chǎn)用羊抗兔IgG的配制
O. 5mg/ml羊抗兔IgG的配制蛋白含量lOmg/ml的羊抗兔IgG O. 5ml與ρΗ8· 20. 05MTBS緩沖液9. 5ml混合即成。I. 2. 3硝酸纖維素膜的裁剪和貼片選用的硝酸纖維素膜為伊能膜業(yè)有限公司的YN120BLF膜，先將膜裁剪成300mmX 25mm的小段，取PVC底板(300mmX80mm)，揭去中間一條保護(hù)紙，露出不干膠層，將硝酸纖維素膜有塑料膜背襯的一面粘貼在PVC底板上。1.2.4在硝酸纖維素膜上劃出T線和C線將稀釋后的血吸蟲抗原和羊抗兔IgG抗體用劃膜噴金機(jī)以3 μ 1/cm的流速，在已粘貼在PVC底板上的硝酸纖維素膜中間劃檢測T線和質(zhì)控C線，其中血吸蟲抗原劃在靠近將來粘貼免疫探針干片一側(cè)，羊抗兔IgG抗體劃在靠近粘貼吸水紙一側(cè)，兩條線相距5 6mm ο1.2. 5烘膜與保存將已劃好T線和C線的硝酸纖維素膜連同底板置室內(nèi)晾干，裝入密封塑料袋中置4 8°C冰箱中保存?zhèn)溆?。I. 3樣品墊的制作I. 3. I樣品墊處理液的配制I. 3. I. 1ρΗ7. 2 樣品墊處理液 O. 2M Tris IOOml, O. IN HCl 180ml,酪蛋白 O. 250g,蔗糖25. OOOg, NaN3O. IOOg混合，37°C水浴溶解，再加入I. Oml吐溫-20攪拌均勻，加蒸餾水至500ml混合均勻，即成含酪蛋白O. 5%,蔗糖5%, NaN3O. 02%,吐溫-200. 2%的ρΗ7· 20. 04ΜTris-HCl緩沖液構(gòu)成的樣品墊處理液。I. 3. 2樣品墊的制作將玻璃纖維素膜切成23mmX300mm小條，用樣品墊處理液浸泡lhr，取出，在37°C烘箱中烘干，即成樣品墊。I. 4吸水紙的制作將吸水紙(型號CH37)裁剪成28mmX300mm的小條，在37°C烘箱中烘干即成。I. 5標(biāo)簽?zāi)z膜的制作I. 5. I箭頭標(biāo)簽?zāi)z膜的制作箭頭標(biāo)簽?zāi)z膜是一種300mmX 18mm的不干膠粘貼紙,在距一條長邊Imm處有一條直線，緊挨著這條直線，每隔I. 3mm印有“一MAX”字樣，箭頭與直線垂直。其作用，一方面是指示試紙條插入待檢樣品液的最大深度；另一方面是保護(hù)免疫探針干片不被污染。I. 5. 2手柄標(biāo)簽?zāi)z膜的制作綠色標(biāo)簽保護(hù)貼紙由300mmX30mm的不干膠粘貼紙印制，與短邊呈15°角，印有4排綠底白字的“SjAb”字樣，表示用于檢測血吸蟲抗體，并保護(hù)吸水紙?jiān)谑帜萌r(shí)免受污染。I. 6試紙條大卡的組裝I. 6. I取2. 2步驟已粘貼好層析膜的PVC底板，揭掉PVC板邊上寬度最大的一塊保護(hù)紙，露出不干膠層，將吸水紙粘貼上去，使之與層析膜重疊約I 2mm。I. 6. 2取手柄標(biāo)簽?zāi)z膜，揭去保護(hù)紙，露出不干膠層，將它粘貼在吸水紙上。I. 6. 3揭掉PVC板上層析膜邊上一小條保護(hù)紙，露出不干膠層，將免疫探針干片(300mmX8. 5mm)粘貼在PVC板的不干膠上,使免疫探針干片與層析膜重疊約1_。I. 6. 4揭掉PVC板上在免疫探針干片邊上的保護(hù)紙，露出不干膠層，將預(yù)處理過的樣品墊粘貼上去，使之與聚酯膜重疊約I 2mm。I. 6. 5取箭頭標(biāo)簽?zāi)z膜粘貼在免疫探針干片和與之相鄰的部分樣品墊上，使保護(hù)膜的空白側(cè)緊貼在層析膜邊緣重疊約1_，箭頭側(cè)緊貼樣品墊，免疫探針干片完全被標(biāo)簽?zāi)z膜覆蓋，各部件壓平壓實(shí)即組成大卡。I. 7切條、包裝和貯存1.7. I 切條將試紙條大卡用切條機(jī)切成80mmX3mm的試紙條，即為本發(fā)明的牛日本血吸蟲病抗體檢測試紙條。1.7. 2 包裝1.7. 3試紙條的包裝 80mmX 3mm的試紙條按10條/包、20條/包或50條/包的規(guī)格，用鋁箔袋密封包裝。I. 7. 4 貯存試紙條在2 8°C貯存，有效期為12個月。15 30°C室溫貯存，有效期為6個月。實(shí)施例2 (檢測牛日本血吸蟲病抗體試紙條的制備2)I試紙條的制作⑴免疫探針干片制備同實(shí)施例I中I. 1，但有5處不同①使用300nm藍(lán)色乳膠微球。②在乳膠微球標(biāo)記時(shí)所用兔抗黃水牛IgG蛋白含量為2mg/ml。③封閉液配制稱取酪蛋白O. 500g、蔗糖10. OOOg、NaN3O. 020g全部放入IOOmlPH7. 20. 05M Tris-HCl緩沖液中，37 40°C水浴加熱至完全溶解。即配制成含酪蛋白O. 5%，蔗糖10%，NaN3O. 02%的pH7. 20. 05M Tris-HCl緩沖液構(gòu)成的封閉液。④聚酯膜處理液配制O. 2M Tris 125ml,O. IN HCl 225ml,酪蛋白2. 500g，蔗糖50. OOOg, NaN3O. IOOg混合，37 °C水浴溶解，再加入吐溫-201. 5ml攪拌均勻，加蒸餾水至500ml混合均勻。即配制成含酪蛋白0. 5%,蔗糖10%，NaN3O. 02%,吐溫-200. 3%的ρΗ7· 20. 05ΜTris-HCl緩沖液構(gòu)成的聚酯膜處理液。⑤將乳膠微球標(biāo)記兔抗黃水牛IgG結(jié)合物噴涂在已處理過的聚酯膜上時(shí)，劃膜噴金機(jī)設(shè)定的流速為4 μ 1/cm。⑵層析膜的制備同實(shí)施例I中I. 2，但有數(shù)處不同①稀釋抗原和羊抗兔IgG抗體的緩沖液為pH8. 50. 05M TBS緩沖液，配制方法為0. 2mol Tris溶液25ml和0. IN HCl 15ml混合，加入NaCl 0. 850g，溶解，再用蒸餾水加至IOOml即成。②劃線用血吸蟲蟲卵抗原的蛋白含量為3mg/ml。③劃線用羊抗兔IgG抗體的蛋白含量為0. lmg/ml ο④血吸蟲蟲卵抗原和羊抗兔IgG抗體的劃膜流速均為2 μ 1/cm。⑤樣品墊處理液的配制0. 2M Tris 100ml,0. IN HCl 180ml，酪蛋白0. 250g，蔗糖50. OOOg, NaN3O. Ig混合，37°C水浴溶解，再加入I. Oml吐溫-20攪拌均勻，加蒸餾水至500ml混合均勻。即配制成含酪蛋白0. 5%,蔗糖10%，NaN3O. 02%,吐溫-200. 2%的pH7. 20. 04MTris-HCl緩沖液構(gòu)成的樣品墊處理液。
其余如樣品墊制備、吸水紙制備、試紙條大卡的組裝和切條等制作步驟均與實(shí)施例I相同。實(shí)施例3 (檢測牛日本血吸蟲病抗體試紙條的制備3)I試紙條的制作⑴免疫探針干片制備冋實(shí)施例I中I. I，但有4處不冋①在乳膠微球標(biāo)記時(shí)所用兔抗黃水牛IgG蛋白含量為3mg/ml。②封閉液配制稱取酪蛋白O. 300g、蔗糖5. OOOg、NaN3O. 030g全部放入IOOmlPH7. 20. 05M Tris-HCl緩沖液中，37 40°C水浴加熱至完全溶解。即配制成含酪蛋白O. 3%，蔗糖5%，NaN3O. 03%的pH7. 20. 05M Tris-HCl緩沖液構(gòu)成的封閉液。③聚酯膜處理液配制O. 2M Tris. 125ml,O. IN HCl 225ml,酪蛋白I. 500g,蔗糖 25. OOOg, NaN3O. 150g混合，37 °C水浴溶解，再加入吐溫-202. Oml攪拌均勻，加蒸餾水至500ml混合均勻。即配制成含酪蛋白0. 3%,蔗糖5%，NaN3O. 03%,吐溫-200. 4%的pH7. 20. 05MTris-HCl緩沖液構(gòu)成的聚酯膜處理液。④將乳膠微球標(biāo)記兔抗黃水牛IgG結(jié)合物噴涂在已處理過的聚酯膜上時(shí)，劃膜噴金機(jī)設(shè)定的流速為3 μ 1/cm。⑵層析膜的制備同實(shí)施例I中I. 2，但有數(shù)處不同①稀釋抗原和羊抗兔IgG抗體的緩沖液為pH8. 50. 05M TBS緩沖液，配制方法見實(shí)施例2。②劃線用血吸蟲蟲卵抗原的蛋白含量為5mg/ml。③劃線用羊抗兔IgG抗體的蛋白含量為lmg/ml。④血吸蟲蟲卵抗原和羊抗兔IgG抗體的劃膜流速均為I μ 1/cm。⑤樣品墊處理液的配制0. 2M Tris 100ml,0. IN HCl 180ml，酪蛋白0. 150g，蔗糖25. OOOg, NaN3O. 250g混合，37°C水浴溶解，再加入2. Oml吐溫-20攪拌均勻，加蒸餾水至500ml混合均勻。即配制成含酪蛋白0. 03%,蔗糖5%，NaN3O. 05%,吐溫-200. 4%的pH7. 20. 04MTris-HCl緩沖液構(gòu)成的樣品墊處理液。其余如樣品墊制備、吸水紙制備、試紙條大卡的組裝和切條等制作步驟均與實(shí)施例I相同。實(shí)施例4:(檢測牛日本血吸蟲病抗體試紙條的制備4)I試紙條的制作⑴免疫探針干片制備同實(shí)施例I中I. 1，但有5處不同①使用200nm藍(lán)色乳膠微球。②在乳膠微球標(biāo)記時(shí)所用兔抗黃水牛IgG蛋白含量為4mg/ml。③封閉液配制稱取酪蛋白0. 200g、蔗糖10. 000g、NaN3O. 050g全部放入IOOmlPH7. 20. 05M Tris-HCl緩沖液中，37 40°C水浴加熱至完全溶解。即配制成含酪蛋白0. 2%，蔗糖10%，NaN3O. 05%的pH7. 20. 05M Tris-HCl緩沖液構(gòu)成的封閉液。④聚酯膜處理液配制0. 2M Tris 125ml,0. IN HCl 225ml,酪蛋白l.OOOg，蔗糖50. 000g, NaN3O. 250g混合，37°C水浴溶解，再加入吐溫-202. 5ml攪拌均勻，加蒸餾水至500ml混合均勻。即配制成含酪蛋白0. 2%,蔗糖10%，NaN3O. 05%,吐溫-200. 5%的ρΗ7· 20. 05ΜTris-HCl緩沖液構(gòu)成的聚酯膜處理液。。
⑤將乳膠微球標(biāo)記兔抗黃水牛IgG結(jié)合物噴涂在已處理過的聚酯膜上時(shí)，劃膜噴金機(jī)設(shè)定的流速為2 μ 1/cm。⑵層析膜的制備同實(shí)施例I中I. 2，但有數(shù)處不同①稀釋抗原和羊抗兔IgG抗體的緩沖液為pH8. 50. 05M TBS緩沖液，配制方法見實(shí)施例2。②劃線用血吸蟲蟲卵抗原的蛋白含量為7mg/ml。③劃線用羊抗兔IgG抗體的蛋白含量為2mg/ml。④血吸蟲蟲卵抗原和羊抗兔IgG抗體的劃膜流速均為I μ 1/cm。⑤樣品墊處理液的配制O. 2M Tris 100ml,O. IN HCl 180ml,酪蛋白O. 050g，蔗 糖50. OOOg, NaN3 O. 250g混合，37 °C水浴溶解，再加入2. 5ml吐溫-20攪拌均勻，加蒸餾水至500ml混合均勻。即配制成含酪蛋白O. 01%,蔗糖10%，NaN3O. 05%,吐溫-200. 5%的PH7. 20. 04M Tris-HCl緩沖液構(gòu)成的樣品墊處理液。其余如樣品墊制備、吸水紙制備、試紙條大卡的組裝和切條等制作步驟均與實(shí)施例I相同。實(shí)施例5 (應(yīng)用試紙條檢測牛日本血吸蟲病抗體的方法)I待檢血清I. I血吸蟲陽性牛血清實(shí)驗(yàn)感染血吸蟲尾蝴1000 1500條感染35 49d的2頭牛血清6份，湖北自然感染血吸蟲并經(jīng)糞孵確診的牛血清4份。I. 2血吸蟲陰性牛血清采自血吸蟲非疫區(qū)浙江金華健康牛血清10份，實(shí)驗(yàn)感染錐蟲牛血清5份，自然感染肝片吸蟲病牛血清5份。2試紙條本試驗(yàn)所用試紙條為實(shí)施例2工藝參數(shù)制備的試紙條。3檢測步驟3. I血清稀釋液的配制將Na2HP04、KH2PO4, NaCl與蒸餾水按重量體積O. 199g O. 082g Ig 200ml比例混合，37 40°C水浴加熱溶解、冷卻后即成血清稀釋液；(2)待檢牛血清的稀釋取I. 5ml塑料離心管60支，編號，其中30支離心管每管加入血清稀釋液O. 05ml，另30支管加入血清稀釋液O. Iml,每支離心管中再加入待檢血清
O.05ml，將待檢牛血清與血清稀釋液分別按體積I: I和1:2比例混合稀釋；(3)檢測操作取試紙條60支，平放在操作臺上，吸取稀釋后的待檢血清O. 05ml滴在試紙條的樣品墊上；(4)結(jié)果判定5 15min后觀察結(jié)果，無論是待檢牛血清與血清稀釋液按體積I: I或1:2比例稀釋，6份實(shí)驗(yàn)感染血吸蟲病牛血清和4份自然感染牛血清，試紙條的檢測T線和質(zhì)控C線均呈現(xiàn)藍(lán)色條帶，判為陽性；而10份非疫區(qū)健康牛血清、5份錐蟲病牛血清和5份肝片吸蟲病牛血清，僅在試紙條的質(zhì)控C線位置呈現(xiàn)I條藍(lán)色條帶，故判為陰性。本試驗(yàn)測試的試紙條按照試紙條的使用方法檢測和判斷結(jié)果，能夠正確地檢測出血吸蟲病陽性牛血清，未見與錐蟲病、肝片吸蟲病牛血清有交叉反應(yīng)。試驗(yàn)例I :(試紙條的敏感性試驗(yàn))I試紙條本試驗(yàn)所用試紙條為實(shí)施例3工藝參數(shù)制備的試紙條。2待檢血清樣品用血吸蟲尾蝴感染10頭健康黃牛，每頭感染尾蝴500 1000條，于感染前(Od)和感染后不同時(shí)間采血，制備血清。3檢測操作待檢血清用血清稀釋液(配方見“應(yīng)用試紙條檢測牛日本血吸蟲病抗體的方法”)2倍稀釋，吸取O. 05ml稀釋血清滴加到試紙條的樣品墊上，進(jìn)行免疫層析反應(yīng)。5 15min根據(jù)T線和C線位置顯現(xiàn)的顏色判定陰陽性，2條紅線判陽性，I條紅線判陰性。4檢測結(jié)果見表I。表I試紙條的敏感性檢測情況表
感染Iy驗(yàn)感￥血吸蟲病巧I:編-'
□數(shù) 1丨2丨3|4丨5丨6|7丨8|9|10 λ 一一 一一 一一 一一 I 一一·
_H--1--1--1--1--1--1--1----—
* I I___一______
■----:................................:—二--'^二--^ ^--1................................1--
yu4-一I—一一_ 一
乙 O丁τI
35 + + + + + + + + I + ~ +
42 + + + + + + + + I + ~~~~~ +
49 + + + + + + + + I + +結(jié)果，試紙條檢測感染前10頭牛血清，全部為陰性反應(yīng)。檢驗(yàn)感染后28d牛血清，有2頭牛血清檢出陽性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)感染35d 49d的10頭牛血清全部檢出血吸蟲抗體(檢出率100%)。據(jù)另外的試驗(yàn)，IHA法能夠檢出實(shí)驗(yàn)感染血吸蟲35d以及35d以上的血樣。說明試紙條的敏感性與IHA法相似或略高。但I(xiàn)HA法檢測一個樣品約需I 2hr，而用試紙條檢測，操作更簡單，5 15分鐘就能得出結(jié)果。試驗(yàn)例2 (試紙條的特異性試驗(yàn))I試紙條本試驗(yàn)所用試紙條為實(shí)施例I工藝參數(shù)制備的試紙條。2待檢血清樣品非疫區(qū)健康牛血清20份；血吸蟲病陽性牛血清40份，其中實(shí)驗(yàn)感染血吸蟲尾蝴35 49d牛血清20份，自然感染血吸蟲并經(jīng)糞孵毛蝴法證實(shí)陽性的牛血清20份；自然感染東畢吸蟲，并經(jīng)糞檢確診的牛血清20份；自然感染肝片吸蟲，經(jīng)糞檢蟲卵法證實(shí)的奶牛血清15份；實(shí)驗(yàn)感染錐蟲牛血清15份。3檢測操作與結(jié)果判定見“應(yīng)用試紙條檢測牛日本血吸蟲病抗體的方法”。4檢測結(jié)果見表2。表2試紙條的特異性檢測情況表
血吸蟲病 ~東Ψ吸蟲病 U I—片吸蟲病 I； ,-I1 /I - rfl >+- /作,...Ir/4- rfrl ,/(,… 維蟲病牛血洽健康牛血 + -
牛血沾牛血沾牛血浦
ft ft 率數(shù)數(shù)率數(shù)數(shù)率數(shù)數(shù)率數(shù)數(shù)率(份)(份)(%)(份)(份)(%)(份)(份)(%)(份)(份)(%)(份)(份)(%)~4040IOO 20OO 15O O InO O20O(Γ~用試紙條檢測實(shí)驗(yàn)感染和自然感染血吸蟲病40頭牛血清，均為陽性反應(yīng)。檢測東畢吸蟲、肝片吸蟲、錐蟲病牛和健康牛的血清，均為陰性反應(yīng)。說明該試紙條有較強(qiáng)的特異性，在所檢測的樣品中未見與其他寄生蟲病有交叉反應(yīng)。試驗(yàn)例3 :(試紙條批內(nèi)批間可重復(fù)性試驗(yàn))I試紙條本試驗(yàn)所用試紙條的批次為20091103、20091105、20091109、20091111、20091113。按照實(shí)施例2工藝參數(shù)制備。只是制作T線的血吸蟲抗原，前2批所用血吸蟲可溶性抗原是由5%蟲卵懸液開始制備，而后3批可溶性抗原是由3%蟲卵懸液開始制備。用于劃線時(shí)的濃度均稀釋成含蛋白3mg/ml。其他制備條件均相同。2待檢血清血吸蟲病陽性血清50份(實(shí)驗(yàn)感染血吸蟲尾蝴500 1000條35 49d的牛血清30份，湖北、四川等疫區(qū)自然感染血吸蟲并經(jīng)糞孵法證實(shí)的牛血清20份)，血吸蟲病陰性牛血清80份(浙江金華、衢州等地牛血清60份，采自浙江富陽屠宰場來自吉林、山東等省黃牛血清20份)。3檢測操作待檢血清前4次重復(fù)用血清稀釋液作2倍稀釋，第5次重復(fù)血清稀釋液作3倍稀釋，加樣量為O. 05ml。各批次的試紙條重復(fù)檢測5次，比較檢測結(jié)果，觀察試紙條批內(nèi)批間檢測結(jié)果的可重復(fù)性。4檢測結(jié)果測定結(jié)果總結(jié)在表3中。表3試紙條的批間和批內(nèi)的重復(fù)性測定結(jié)果情況表
權(quán)利要求
1.一種檢測牛日本血吸蟲病抗體的試紙條，其特征在于該試紙條由部件樣品墊、免疫探針干片、層析膜、吸水紙、PVC基板及箭頭標(biāo)簽?zāi)z膜與手柄標(biāo)簽?zāi)z膜組合而成；其中，免疫探針干片是以紅色或其它顏色羧基化聚苯乙烯乳膠微球的羧基，與兔抗黃水牛IgG抗體蛋白的胺基形成共價(jià)鍵結(jié)合物后作為免疫探針的檢測試劑液吸附于聚脂膜后制成；層析膜是以硝酸纖維素膜為膜基，用劃膜噴金機(jī)將血吸蟲卵可溶性抗原和羊抗兔IgG抗體分別在該膜上畫出檢測T線和質(zhì)控C線而成；先將上述前四部件按頭尾部分重疊粘合裝配在PVC基板上，再將箭頭標(biāo)簽?zāi)z膜粘貼在免疫探針干片上，另將手柄標(biāo)簽?zāi)z膜粘貼在吸水紙上后，用切條機(jī)按設(shè)定寬度裁切后即成牛日本血吸蟲病抗體檢測試紙條。
2.一種制備權(quán)利要求I所述牛日本血吸蟲病抗體檢測試紙條的方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行 (O免疫探針干片的制備包括 1)兔抗黃水牛IgG的制備 ①黃水牛IgG的制備采集健康黃牛、水牛血液,分別分離血清后取血清各5ml混合，加等量O. 85% NaCl，用30%硫酸銨沉淀法提取黃水牛IgG，沉淀的黃水牛IgG用原血清體積2倍量的O. 85% NaCl溶解，再用35%硫酸銨沉淀法重復(fù)提取2次，最后用5ml O. 85% NaCl溶解離心沉淀的黃水牛IgG，用透析法除去溶液中的NH4+及SO/—后，再用蒸餾水稀釋或?qū)⑼肝龃湃隤EG中濃縮的方法，調(diào)節(jié)蛋白濃度至10mg/ml后，于_20°C密封貯存?zhèn)溆茫? ②黃水牛IgG免疫兔將黃水牛IgG與弗氏完全佐劑按體積3:7比例制成油乳劑，按黃水牛IgG 6mg/只兔用量，對體重2. 5kg的健康雄性家兔，在兔頸部皮下和兔雙側(cè)后足踱墊皮下注射進(jìn)行首次免疫；后除用弗氏不完全佐劑替代弗氏完全佐劑外，再按上述同樣配t匕、方法，每隔兩周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，共進(jìn)行三次；第4次后10天，取耳靜脈少量血分離血清，用瓊脂擴(kuò)散法測定免疫血清效價(jià)，當(dāng)血清效價(jià)> 1:64時(shí)，即可心臟大量釆血、分離血清后，備用; ③兔抗黃水牛IgG抗體的制備取兔抗黃水牛IgG血清10ml，以35%硫酸銨沉淀法提取兔抗黃水牛IgG抗體，以2倍于血清量的O. 85% NaCl溶解沉淀的兔抗黃水牛IgG抗體，如此反復(fù)提取3次后，將第3次硫酸銨沉淀的兔抗黃水牛IgG抗體的離心沉淀物以5ml O. 85%NaCl溶解，用透析法除去溶液中的NH4+及S042_ ;在蛋白測定儀上測定兔抗黃水牛IgG抗體蛋白含量后，用PH7. 20 O. IM的硼酸緩沖液稀釋或?qū)⑼肝龃湃隤EG中濃縮的方法，將蛋白濃度調(diào)節(jié)至4mg/ml后，于-20°C密封貯存?zhèn)溆茫? 2)乳膠微球的洗滌將直徑200nm紅色或其它顏色的聚苯乙烯乳膠微球液，在10000rpm, 4°C條件下離心lOmin，去上清液，沉淀物用高純水還原為原體積，用超聲波分散沉淀的乳膠微球成為均勻懸浮液后，再用上述相同的方法重復(fù)離心、重懸浮I 2次； 3)乳膠微球羧基的激活將pH6.5 O. Imol MES, 10%帶色乳膠微球的懸液，20mg/mL的EDC · HCl和20mg/mL的NHS,按體積9:2:1:0. 75 ^比例混合、反應(yīng)2hr ;然后在11000 rpm4°C條件下離心25min，除去上清液，沉淀物以所用帶色乳膠體積5倍量的pH7. 20 O. IM的硼酸緩沖液重懸，以超聲波擊打還原成均勻的懸浮液；用垂直混合儀混合15min，在11000rpm,4°C條件下離心25min除去上清液,沉淀物以所用帶色乳膠體積2. 5倍量的pH7. 20O. I M的硼酸緩沖液重懸，以超聲波擊打還原成均勻的懸浮液，即為羧基活化的乳膠微球； 4)乳膠微球標(biāo)記兔抗黃水牛IgG抗體往裝有羧基活化乳膠微球懸浮液的離心管中加入等體積以pH7. 20 O. IM的硼酸緩沖液稀釋成蛋白濃度為I 4mg/mL的兔抗黃水牛IgG抗體,在垂直混合儀上混合反應(yīng)2hr以上；再加入總體積十分之一量的20%BSA振蕩反應(yīng)lhr，反應(yīng)后的混合物以11000 rpm 4°C離心25min，除去上清液，沉淀物以含酪蛋白O. 2% O. 5%、蔗糖 5% 10%、NaN3 O. 02% O. 05% 的 ρΗ7· 2 O. 05Μ Tris-HCl 緩沖液構(gòu)成的封閉液原體積重懸，超聲波擊打還原成均勻的懸浮液，在垂直混合儀上混合15min,再次以IlOOOrpm 4°C離心25min,除去上清液,沉淀物以相當(dāng)于乳膠微球懸浮液和兔抗黃水牛IgG抗體兩者總體積75%的同上封閉液重懸，超聲波擊打還原成均勻的懸浮液，該液即為紅色或其它顏色的免疫探針檢測試劑液；· 5)免疫探針干片的制備將上述的免疫探針檢測試劑液用劃膜噴金機(jī)以2 5μ 1/cm的流速噴涂在已經(jīng)過含酪蛋白O. 2% O. 5%，蔗糖5% 10%，NaN3 O. 02% O. 05%, Tween-20O. 2% O. 5%的pH7. 2 O. 05M Tris-HCl緩沖液構(gòu)成的聚酯膜處理液預(yù)處理后的長300mmX寬8. 5mm的聚酯膜上，經(jīng)37°C，Ihr烘干，即為免疫探針干片； (2)層析膜的制備 1)血吸蟲卵可溶性抗原的制備按體重2.5 3kg的健康新西蘭兔，每只接種血吸蟲尾蝴2000條，實(shí)驗(yàn)感染兔于接種后45日屠宰取肝臟，分離和純化血吸蟲蟲卵，經(jīng)冷凍干燥后研磨破碎，用O. 85%NaCl溶液配成3% 5%懸浮液，2 8°C浸泡3日，再反復(fù)凍融10次，冰浴超聲波破碎30min, 10000r/min離心lhr,取上清液,裝透析袋,用pH7. O O. OlM PB透析16小時(shí)，每隔4小時(shí)換透析液I次，透析結(jié)束后，以IOOOOrp離心60min，上清液即為血吸蟲卵可溶性抗原；檢測其蛋白含量后，用PH8. 2 8. 5 O. 05M TBS稀釋至I 7mg/mL濃度，即可用于層析膜上檢測T線的繪制； 2)羊抗兔IgG的制備 ①兔IgG的制備以心臟采血法采集健康新西蘭兔的血液,分離血清,取兔血清10ml，再加IOml O. 85% NaCl混勻，用35%硫酸銨沉淀法提取兔IgG，反復(fù)沉淀提取3次，沉淀物用5ml O. 85% NaCl溶解后，用透析法除去硫酸銨，并在蛋白測定儀上測定兔IgG的蛋白含量； ②羊抗兔IgG抗體的制備用弗氏佐劑將兔IgG溶液配制成lmg/ml,用超聲波制成乳濁液；按照每千克體重2mg的劑量皮下注射免疫羊，每間隔2周，再用弗氏不完全佐劑和兔IgG制備成相同濃度的乳濁液，以相同劑量與方法免疫羊，第3次免疫后IOd頸靜脈采血分離血清，以瓊脂免疫擴(kuò)散法測定血清中羊抗兔IgG抗體效價(jià)> 1:32以上時(shí)，即可大量采集羊血并制取血清； 分離羊抗兔IgG抗體先用30%硫酸銨沉淀法提取粗羊抗兔IgG抗體一次,再用45%硫酸銨沉淀法提取2次，離心沉淀物用5ml O. 85% NaCl溶解，用透析法除去溶液中的NH4+及S042-，3000rpm離心30min，檢測上清液蛋白含量后，用pH8. 2 8. 5 O. 05M TBS將上清液稀釋成O. I 2mg/mL的濃度，即可用于層析膜上質(zhì)控C線的繪制； 3)檢測線和質(zhì)控線的制作將長25mmX寬300mm的硝酸纖維素膜放在劃膜噴金機(jī)的操作平臺上，在該機(jī)1#泵的試劑瓶中加入血吸蟲卵可溶性抗原，2#泵的試劑瓶中加入羊抗兔IgG，以I 3 μ 1/cm的流速，在硝酸纖維素膜上劃出檢測T線和質(zhì)控C線，兩線相距5 6mm，置室內(nèi)晾干即為層析膜； (3)樣品墊的制備將23mmX300mm玻璃纖維膜在由含酪蛋白O. 01% O. 05%，蔗糖5% 10%、NaN3 O. 02% O. 05% 和 Tween-20 O. 2% O. 5% 的 ρΗ7· 2 O. 04Μ Tris-HCl 緩沖液構(gòu)成的樣品墊處理液中浸泡lhr，取出，37°C烘干即成； (4)吸水紙的制備CH37吸水紙裁成長300mmX寬28mm的紙條，置37°C烘干即成； (5)PVC基板的制備PVC板其結(jié)構(gòu)為三層，第一層為保護(hù)紙，第二層為不干膠，第三層為PVC基板；在保護(hù)紙上刻有三條刻痕，分別位于距離一側(cè)長邊的20mm、27mm和53mm處；將PVC板按長300mmX寬80mm規(guī)格裁剪后備用； (6)標(biāo)簽?zāi)z膜的制備用不干膠貼紙印制而成；其中， 1)箭頭標(biāo)簽?zāi)z膜其規(guī)格為長300mmX寬18mm，在距一側(cè)長邊Imm處印有一條直線，在該直線的上方，每隔I. 3mm印有一條“一MAX”字樣，箭頭與直線垂直；指示試紙條樣品墊可浸入待測溶液的最大深度不得超過這條直線； 2)手柄標(biāo)簽?zāi)z膜其規(guī)格為長303mmX寬30mm，綠底白字，與長邊呈15°夾角印有4列“SjAb”字樣，SjAb為Schistosoma japonicum Antibody的縮寫，表示該試紙條用于檢測日本血吸蟲抗體，該部位為試紙條拿取時(shí)的手柄部位； (7)試紙條各部件的組裝、切條、包裝和貯存 O試紙條各部件的組裝試紙條以長300mmX寬80mm的PVC為基板，依次將300mmX 23mm的樣品墊、300mmX 8. 5mm的免疫探針干片、300mmX 25mm的層析膜及300mm X 28mm的吸水紙，按頭尾各有I 2_的重疊連接、粘貼在帶不干膠面的PVC基板上；再在吸水墊的尾部與免疫探針干片上粘貼上箭頭標(biāo)簽?zāi)z膜；另在樣品墊上粘貼上手柄標(biāo)簽?zāi)z膜；各部件壓平，粘貼牢固即成試紙條大卡； 2)切條將試紙條大卡放在切條機(jī)上，按3mm寬度連續(xù)切割，即成寬3mmX長80mm的試紙條； 3)包裝與貯存試紙條抽檢合格后，按包裝規(guī)格要求裝入鋁箔袋中，放入I小包干燥劑后，封口，即成產(chǎn)品；在2 8°C保存，有效期為12個月。
3.應(yīng)用權(quán)利要求I所述試紙條檢測牛日本血吸蟲病抗體的方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行 (1)血清稀釋液的配制將Na2HPO4,KH2PO4,NaCl與蒸餾水按重量體積O. 199g O. 082g Ig 200ml比例混合，37 40°C水浴加熱溶解、冷卻后即成血清稀釋液； (2)待檢牛血清的稀釋將待檢牛血清與血清稀釋液按體積I:I 2比例混合稀釋； (3)檢測操作吸取稀釋的待檢血清O.05ml滴在平放的試紙條的樣品墊上，或?qū)⒃嚰垪l的樣品墊端插入待檢稀釋血清中至箭頭標(biāo)簽?zāi)z膜所印的直線條15s后，平放在操作臺面上； (4)結(jié)果判定5 15min后觀察結(jié)果，檢測T線和質(zhì)控C線均呈現(xiàn)紅色或其它顏色的同色條帶，則判為陽性；僅質(zhì)控C線呈現(xiàn)I條紅色或其它顏色的條帶，則判為陰性；檢測T線和質(zhì)控C線均不呈現(xiàn)條帶，則說明該試紙條已失效或試驗(yàn)操作有誤。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種牛日本血吸蟲病抗體檢測試紙條的制備及其應(yīng)用方法，屬于動物寄生蟲病診斷技術(shù)領(lǐng)域。試紙條由樣品墊、免疫探針干片、層析膜、吸水紙、PVC基板及箭頭標(biāo)簽?zāi)z膜與手柄標(biāo)簽?zāi)z膜組合而成。免疫探針干片是以聚苯乙烯乳膠微球的羧基與兔抗牛IgG抗體蛋白的胺基形成共價(jià)鍵結(jié)合物后吸附于聚脂膜后制成；層析膜是以錨固在硝酸纖維素膜上的血吸蟲可溶性抗原為檢測線、羊抗兔IgG抗體為質(zhì)控線制成；可快速檢測牛血清中的血吸蟲抗體，操作簡便，結(jié)果直觀、準(zhǔn)確?？蓮V泛用于牛血吸蟲病的診斷、普查和檢疫。
文檔編號G01N33/558GK102944675SQ20121044299
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月7日
發(fā)明者盧福莊, 張雪娟, 顧昀, 付媛, 季敬余, 馮尚連, 俞國喬, 楊玉煥, 周煜, 陽愛國, 董國棟, 郭莉, 毛光瓊, 石團(tuán)員 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院