日本血吸蟲重組抗原及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種日本血吸蟲重組抗原，該重組抗原包含：日本血吸蟲磷酸甘油酸激酶的SEQ?ID?NO.1所示氨基酸序列。本發(fā)明還公開了該日本血吸蟲重組抗原的制備方法及其在制備預(yù)防或治療血吸蟲病的疫苗或藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的日本血吸蟲重組抗原，在小鼠免疫實(shí)驗(yàn)中可誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗重組抗原的特異性IgG、IgG1和IgG2a抗體并能達(dá)到一個較高的水平，動物保護(hù)實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)了34.5％的減蟲率和32.2％的減卵率，表明該重組抗原適于作為抗血吸蟲病候選疫苗，具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】日本血吸蟲重組抗原及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種日本血吸蟲重組抗原及其制備方法 和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 日本血吸蟲病是一種重要的人獸共患寄生蟲病。雖然我國在血吸蟲病的防治上已 經(jīng)取得了巨大成就，但是由于中間宿主釘螺難以消滅及血吸蟲重復(fù)感染現(xiàn)象嚴(yán)重，全面控 制血吸蟲病傳播的前景仍不容樂觀。批喹酮自問世以來，以其高效、低毒、使用方便、價(jià)格低 廉等優(yōu)點(diǎn)在血吸蟲病臨床治療和防治工作中得到廣泛應(yīng)用，并成為目前治療血吸蟲病的唯 一藥物。然而，近年來在曼氏血吸蟲上已經(jīng)有了吡喹酮抗性蟲株的報(bào)道，耐藥蟲株的出現(xiàn)引 起了人們的不安與高度關(guān)注。因此，加強(qiáng)抗血吸蟲高效疫苗的開發(fā)和新藥物靶標(biāo)的篩選顯 得格外重要。
[0003] 在中國，日本血吸蟲可以天然感染40余種哺乳動物，然而東方田鼠是目前為止發(fā) 現(xiàn)的唯一一種日本血吸蟲在其體內(nèi)不能夠發(fā)育完全的哺乳動物?；蛐酒夹g(shù)分析不同宿 主即抗性宿主東方田鼠、非適宜宿主大鼠和適宜宿主BALB/c小鼠來源的10d日本血吸蟲童 蟲的基因差異表達(dá)情況，鑒定出一些基因在不同宿主來源的l〇d蟲體中呈現(xiàn)差異表達(dá)，其 中在東方田鼠來源蟲體中顯著低表達(dá)的基因與血吸蟲生長發(fā)育、新陳代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與發(fā) 育進(jìn)程相關(guān)。推測這些基因可能與血吸蟲的生長發(fā)育密切相關(guān)，可以作為潛在的疫苗或者 藥物靶標(biāo)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
[0004] 血吸蟲盡管寄生在含氧豐富的血液中，但其能量主要來源于糖酵解過程。目前一 般認(rèn)為，血吸蟲所需的能量主要通過糖酵解途徑獲得。磷酸甘油酸激酶（PGK)是糖酵解的 關(guān)鍵酶，也是每種生物得以生存的必需酶，該酶的缺乏可引起生物體代謝等功能的紊亂。 PGK是一個單體的、高度柔曲性的糖酵解酶，主要由兩個球形的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，在與底物結(jié)合 的過程中發(fā)生顯著的構(gòu)相改變，最終發(fā)生催化效應(yīng)。PGK存在于所有的有機(jī)生命中，在整個 進(jìn)化過程中，它的序列是高度保守的。二硫化物還原酶功能是磷酸甘油酸激酶的另一個重 要的功能，在生物體內(nèi)可以觸發(fā)血管抑制因子-血管他丁的釋放，從而間接的影響腫瘤的 生長。在長有纖維瘤的實(shí)驗(yàn)鼠身上，血漿PGK水平提高；給實(shí)驗(yàn)鼠施用PGK，會提高血漿血 管他丁的水平，抑制腫瘤的生長。此外，磷酸甘油酸激酶還可調(diào)控尿激酶型的纖溶酶原激活 受體的表達(dá)，引起腫瘤耐藥。同時還具有影響哺乳類細(xì)胞核內(nèi)DNA復(fù)制和修補(bǔ)以及刺激病 毒RNA的合成等生物學(xué)功能。
[0005] 糖酵解途徑廣泛存在于大腸桿菌、酵母、細(xì)菌以及人類等生物，但是對日本血吸蟲 磷酸甘油酸激酶的研究在國內(nèi)外報(bào)道甚少，僅僅報(bào)道克隆了該基因序列，并未對其蛋白的 特性等進(jìn)行較為深入的研究。對其酶學(xué)活性、蛋白的蟲體定位以及作為疫苗候選抗原保護(hù) 效果評估等研究在國內(nèi)外都未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室在對日本血吸蟲童蟲在不同敏感宿主體內(nèi) 差異表達(dá)蛋白研究的基礎(chǔ)上，選擇與糖酵解途徑有關(guān)的磷酸甘油酸激酶開展研究，發(fā)現(xiàn)該 基因在血吸蟲易感宿主小鼠來源的蟲體中高表達(dá)，而在血吸蟲非易感宿主大鼠來源的蟲體 中表達(dá)明顯降低，說明該酶可能是影響血吸蟲生長發(fā)育的關(guān)鍵分子，加強(qiáng)該酶的生物學(xué)功 能等研究，可為篩選血吸蟲疫苗候選分子和新的藥物靶標(biāo)提供新思路。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決目前缺乏抗血吸蟲高效疫苗的技術(shù)問題，提供一種日本血吸蟲重組 抗原，該重組抗原包含日本血吸蟲磷酸甘油酸激酶（SjPGK)的SEQ ID NO. 1所示氨基酸序 列，具有良好的免疫原性，適于作為抗血吸蟲病候選疫苗。
[0007] 此外，還需要提供一種上述日本血吸蟲重組抗原的制備方法和應(yīng)用。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] 在本發(fā)明的一個方面，提供了一種日本血吸蟲重組抗原，該重組抗原包含：日本血 吸蟲磷酸甘油酸激酶的SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列。
[0010] 本發(fā)明的日本血吸蟲重組抗原，還包含由部分載體序列表達(dá)的具有幾個組氨酸的 標(biāo)簽序列，該標(biāo)簽序列僅是便于后續(xù)的重組抗原蛋白的純化。
[0011] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種日本血吸蟲重組抗原基因，該重組抗原基因 包含：編碼SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的日本血吸蟲磷酸甘油酸激酶基因序列。
[0012] 優(yōu)選的，所述日本血吸蟲重組抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0013] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種包含編碼SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的日 本血吸蟲磷酸甘油酸激酶基因的重組載體。
[0014] 優(yōu)選的，所述重組載體的空載體為原核表達(dá)載體pET28a (+)，所述日本血吸蟲磷酸 甘油酸激酶基因插入在空載體pET28a(+)的BamH I和Xho I兩個酶切位點(diǎn)之間。
[0015] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種包含上述重組載體的宿主細(xì)胞。
[0016] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述日本血吸蟲重組抗原的制備方法，包括 以下步驟：
[0017] 構(gòu)建含日本血吸蟲磷酸甘油酸激酶基因的重組表達(dá)載體；
[0018] 將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌宿主細(xì)胞；
[0019] 培養(yǎng)包含重組表達(dá)載體的大腸桿菌宿主細(xì)胞，并在合適條件下，誘導(dǎo)該重組表達(dá) 載體表達(dá)日本血吸蟲磷酸甘油酸激酶；
[0020] 純化重組表達(dá)的日本血吸蟲磷酸甘油酸激酶。
[0021] 在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例中，構(gòu)建含日本血吸蟲磷酸甘油酸激酶基因的重組表 達(dá)載體，具體包括以下步驟：利用生物信息學(xué)進(jìn)行在線分析，找出編碼日本血吸蟲磷酸甘油 酸激酶（SjPGK)的核苷酸片段；根據(jù)該SjPGK核酸序列設(shè)計(jì)PCR引物，并在兩端加上特異 限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增核酸片斷，再利用特異限制性內(nèi)切酶BamH I、Xh〇I將編碼 SjPGK抗原的核酸片段定向克隆至原核表達(dá)載體pET28a (+)的多克隆位點(diǎn)區(qū)，構(gòu)建重組原 核表達(dá)質(zhì)粒 pET28a (+) -SjPGK。
[0022] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種包含上述日本血吸蟲重組抗原的抗血吸蟲疫 苗。
[0023] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種能與上述日本血吸蟲重組抗原特異性結(jié)合的 抗體。
[0024] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述日本血吸蟲重組抗原的應(yīng)用，用于制備 預(yù)防或治療血吸蟲病的疫苗或藥物。
[0025] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述重組載體在制備磷酸甘油酸激酶產(chǎn)品中 的應(yīng)用。
[0026] 本發(fā)明日本血吸蟲重組抗原，在小鼠免疫實(shí)驗(yàn)中可誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗重組抗原 的特異性IgG、IgGl和IgG2a抗體并且能達(dá)到一個較高水平，動物保護(hù)實(shí)驗(yàn)分別誘導(dǎo)34. 5 % 的減蟲率和32. 2%的減卵率，表明該重組蛋白具有發(fā)展為抗血吸蟲病候選疫苗及新藥靶的 潛力，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0028] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)_SjPGK的雙酶切鑒定圖；
[0029] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例1的實(shí)時定量PCR分析SjPGK在不同發(fā)育階段血吸蟲內(nèi)的差 異表達(dá)圖；
[0030] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例1實(shí)時定量PCR分析SjPGK在不同宿主來源蟲體中的相對表 達(dá)量圖；
[0031] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例1重組蛋白SjPGK表達(dá)時相分析圖；
[0032] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例1重組蛋白SjPGK表達(dá)和純化結(jié)果圖；
[0033] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例2不同濃度的3-PGA對rSjPGK催化速度的影響圖；
[0034] 圖7是本發(fā)明實(shí)施例2不同的pH對rSjPGK活性的影響圖；
[0035] 圖8是本發(fā)明實(shí)施例2不同溫度對rSjPGK活性的影響圖；
[0036] 圖9是本發(fā)明實(shí)施例3重組蛋白rSjPGK抗原性分析結(jié)果圖；
[0037] 圖10是本發(fā)明實(shí)施例4抗rSjPGK特異性IgG、IgGl和IgG2a抗體水平的檢測結(jié) 果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 下列實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)條件，如《精編分子生物 學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》（F.M.奧斯伯，R.E.金斯頓，J.G.塞德曼等主編，馬學(xué)軍，舒躍龍的譯.北京： 科學(xué)出版社，2004)中所述的方法進(jìn)行。
[0039] 本發(fā)明在小鼠來源童蟲高表達(dá)、大鼠來源童蟲低表達(dá)的基因芯片結(jié)果的基礎(chǔ)上 對日本血吸蟲磷酸甘油酸激酶進(jìn)行生物信息學(xué)分析，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得日本血吸 蟲磷酸甘油酸激酶（SjPGK)的核苷酸片段，運(yùn)用基因工程重組技術(shù)將核苷酸片段重組 到載體pET28a⑴中，構(gòu)建了 pET28a (+) -S jPGK原核表達(dá)質(zhì)粒。將重組原核表達(dá)質(zhì)粒 pET28a (+) -SjPGK轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)并且純化到重組蛋白。
[0040] 本發(fā)明應(yīng)用生物信息學(xué)方法和基因工程技術(shù)獲得的重組蛋白rSjPGK，運(yùn)用紫外分 光光度計(jì)連續(xù)檢測法，通過檢測NADH的減少量來測定重組蛋白的酶活力。試驗(yàn)結(jié)果表明重 組蛋白的比活力為125U/mg，相對于底物3-PGA的米氏常數(shù)Km值為2. 69mmol/L，當(dāng)pH在 8-9之間，溫度在30-35°C之間，該重組蛋白酶活性最高并且在小鼠免疫實(shí)驗(yàn)中可誘導(dǎo)小鼠 體內(nèi)的抗重組抗原的特異性IgG、IgGl和IgG2a抗體并且能達(dá)到一個較高的水平，動物保護(hù) 實(shí)驗(yàn)分別誘導(dǎo)34. 5%的減蟲率和32. 2%的減卵率，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明重組抗原誘 導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體在殺傷蟲體中起到了一定的作用，也預(yù)示該重組蛋白具有發(fā)展為抗血 吸蟲病候選疫苗及新藥靶的潛力，應(yīng)用價(jià)值廣闊。
[0041] 實(shí)施例1日本血吸蟲重組抗原的表達(dá)和純化
[0042] 1.方法
[0043] 1. 1重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0044] 根據(jù)NCBI登錄號為FN322120. 1的SiPGK的基因序列，設(shè)計(jì)引物，上游引物：5' -T AGGATCCATGGGITTGTCGAAGCTCAG-3'（SEQ ID N0. 3,含 BamH I 酶切位點(diǎn)）；下游引物：5'-TC TCTCGAGTTAGTGAGCATCCGTAAG-3'（SEQ ID N0.4,含Xho I 酶切位點(diǎn)）。以日本血吸蟲 42 天 蟲體的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增其含有0RF的cDNA片段，反應(yīng)組成如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種日本血吸蟲重組抗原，其特征在于，該重組抗原包含：日本血吸蟲磷酸甘油酸 激酶的SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列。
2. -種日本血吸蟲重組抗原基因，其特征在于，該重組抗原基因包含：編碼SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的日本血吸蟲磷酸甘油酸激酶基因序列。
3. -種重組載體，其特征在于，包含編碼SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的日本血吸蟲磷 酸甘油酸激酶基因。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體的空載體為原核表達(dá) 載體pET28a (+)，所述日本血吸蟲磷酸甘油酸激酶基因插入在空載體pET28a (+)的BamH I 和Xho I兩個酶切位點(diǎn)之間。
5. -種包含權(quán)利要求4所述重組載體的宿主細(xì)胞。
6. -種權(quán)利要求1所述日本血吸蟲重組抗原的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 構(gòu)建含日本血吸蟲磷酸甘油酸激酶基因的重組表達(dá)載體； 將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌宿主細(xì)胞； 培養(yǎng)包含重組表達(dá)載體的大腸桿菌宿主細(xì)胞，并在合適條件下，誘導(dǎo)該重組表達(dá)載體 表達(dá)日本血吸蟲磷酸甘油酸激酶； 純化重組表達(dá)的日本血吸蟲磷酸甘油酸激酶。
7. -種抗血吸蟲疫苗，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述日本血吸蟲重組抗原。
8. -種能與權(quán)利要求1所述日本血吸蟲重組抗原特異性結(jié)合的抗體。
9. 權(quán)利要求1所述日本血吸蟲重組抗原的應(yīng)用，其特征在于，用于制備預(yù)防或治療血 吸蟲病的疫苗或藥物。
10. 權(quán)利要求3所述重組載體在制備磷酸甘油酸激酶產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K39/00GK104099309SQ201310130648
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月15日
【發(fā)明者】林矯矯, 黃莉妮, 洪煬, 傅志強(qiáng), 張旻, 韓艷輝, 王馨茁, 李長健, 曹曉丹, 伍妙梨, 郭小勇, 韓倩, 劉艷濤, 馬帥 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所