專利名稱：一種由生物催化轉(zhuǎn)化甘油制備1,3－丙二醇和二羥基丙酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種由生物催化轉(zhuǎn)化甘油制備1，3-丙二醇和二羥基丙酮的方法。
背景技術(shù)：
1，3-丙二醇(1，3-propanediol，1，3-PD)是一種重要的化工原料，它可直接作為抗凍劑、多種增塑劑、洗滌劑、防腐劑和乳化劑的合成原料，它也用于食品、化妝品和制藥等行業(yè)。其最主要的用途是作為聚酯、聚醚和聚氨酯等高分子材料的單體。以1，3-PD為單體合成的聚對苯二甲酸-1，3-丙二醇酯(polytrimethyleneterephthalate，PTT)較之以乙二醇為單體合成的聚乙烯對苯二酸酯(polyethylene terephthalate，PET)具有許多更優(yōu)良的特性，如優(yōu)異的回彈性(伸長20％后取消外力可完全恢復(fù)原狀)、染色性(既無需像PET那樣借助載體來染色，也不必像尼龍那樣用添加劑做染色后處理)、抗污性、抗紫外、臭氧和氮氧化合物的著色性，以及抗內(nèi)應(yīng)力、低水吸附、低靜電、良好的生物降解、可循環(huán)利用等，1，3-PD在地毯、工程塑料、服裝面料等領(lǐng)域倍受青睞。由于以1，3-PD為原料生產(chǎn)的聚酯既提高了產(chǎn)品性能，又減輕了環(huán)境污染，因此，1，3-PD的生產(chǎn)和應(yīng)用成為當(dāng)前國際上合成纖上維材料開發(fā)的熱點(diǎn)。
目前，國際上1，3-PD生產(chǎn)方法主要有三種(1)1995年德國Degussa公司開發(fā)的丙烯醛水合加氫法；(2)1996年荷蘭Shell公司開發(fā)的環(huán)氧乙烷氫甲?；?；(3)2002年美國DuPont公司開發(fā)的葡萄糖微生物發(fā)酵法。由于丙烯醛本身也是一種重要的有機(jī)中間體，成本較高，而且屬劇毒易燃易爆物品，難以儲存和運(yùn)輸；環(huán)氧乙烷法設(shè)備投資大，技術(shù)難度高，催化劑體系復(fù)雜，制作工藝苛刻，配位體劇毒，而且這兩種化學(xué)法所用的最初原料都是愈來愈貧乏的石油資源，研究以可再生資源為原料、污染程度低的生物法生產(chǎn)1，3-PD引起人們更高度的重視。為此，以研究、開發(fā)和經(jīng)銷化學(xué)品聞名于世的美國DuPont公司與Genencor公司聯(lián)合研究以葡萄糖為原料發(fā)酵法生產(chǎn)1，3-PD的新技術(shù)，歐共體國家自1993年以來在第三、四和五個框架計(jì)劃中連續(xù)大力資助德國生物技術(shù)研究中心開展甘油轉(zhuǎn)化為1，3-PD的研究(甘油是葡萄糖酒精發(fā)酵或動植物脂肪加工的副產(chǎn)物，可視為可再生資源)。我國目前已有大連理工大學(xué)、清華大學(xué)、廣西大學(xué)和華僑大學(xué)等高校開展生物法生產(chǎn)1，3-PD的研究。但是用微生物發(fā)酵時，細(xì)胞的生長和存活需要消耗底物，使得產(chǎn)物得率難于提高，以至于(1)以甘油為碳源的1，3-PD的理論得率僅為59.5％；(2)用代謝工程菌生產(chǎn)1，3-PD，產(chǎn)物對葡萄糖得率的最高水平為51％；(3)使用腸道細(xì)菌將甘油厭氧歧化為1，3-PD的最高水平為55％。可見，用微生物發(fā)酵法提高1，3-PD得率的潛力已經(jīng)很有限，如何進(jìn)一步提高1，3-PD的得率關(guān)系到生物法工業(yè)化生產(chǎn)1，3-PD的競爭力。
1，3-二羥基丙酮(1，3-Dihydroxyacetone，DHA)，簡稱二羥基丙酮，是最簡單的酮糖，易溶于水及乙醇、丙酮、乙醚等有機(jī)溶劑。二羥基丙酮分子中含有三個官能團(tuán)，即兩個羥基和一個酮基，化學(xué)性質(zhì)活潑，廣泛參與諸如聚合、縮合等各種化學(xué)反應(yīng)，是一種重要的醫(yī)藥、化學(xué)合成中間體和食品添加劑，得到廣泛的實(shí)際應(yīng)用。如作為合成鞣劑、乳化劑、增塑劑、酸醇型樹脂和抗X射線劑的中間體。二羥基丙酮也是一個重要的多功能試劑，如能最有效地還原丁二烯-苯乙烯復(fù)合物，能有效地催化甲醛到羥醛、羥酮的縮合反應(yīng)。目前以淀粉質(zhì)原料(可再生資源)發(fā)酵法甘油生產(chǎn)二羥基丙酮。1，3-PD市場價格在約為8000元/噸左右，而二羥基丙酮的價格約為12萬元/噸，利潤空間和市場潛力很大。國內(nèi)目前對二羥基丙酮作為化工原料和醫(yī)藥中間體，后續(xù)開發(fā)的產(chǎn)品種類很多，而且這些產(chǎn)品的市場容量也很大。國內(nèi)目前對二羥基丙酮的需求量已經(jīng)達(dá)到1000噸/年以上，預(yù)計(jì)隨著生產(chǎn)成本的降低，需求量將會進(jìn)一步擴(kuò)大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種由生物催化轉(zhuǎn)化甘油制備1，3-丙二醇和二羥基丙酮的方法，以便提高產(chǎn)品得率。
本發(fā)明的解決方案是通過酶耦合催化輔酶再生法胞外有氧條件下，轉(zhuǎn)化甘油、3-羥基丙醛生成二羥基丙酮和1，3-丙二醇。
酶耦合催化輔酶再生方法是利用細(xì)胞自身甘油歧化途徑，即利用甘油脫氫酶GDH將甘油還原成二羥基丙酮所產(chǎn)生的輔酶NADH(還原型輔酶I)，使1，3-丙二醇氧化還原酶PDOR將3-羥基丙醛氧化成1，3-丙二醇和再生所需的輔酶NAD+(氧化型輔酶I)，同時生產(chǎn)1，3-丙二醇和二羥基丙酮。
在甘油轉(zhuǎn)化為1，3-PD的氧化途徑中，甘油在依賴于NAD+的甘油脫氫酶的作用下形成二羥基丙酮，再在二羥基丙酮激酶的作用下，生成二羥基丙酮磷酸，然后進(jìn)入糖酵解途徑，這一代謝過程是以甘油為底物生長的微生物的共同代謝途徑，為微生物生長提供ATP和NADH；在還原途徑中，甘油在以維生素B12為輔酶的甘油脫水酶的作用下生成3-羥基丙醛，然后在依賴于NADH的1，3-丙二醇氧化還原酶的作用下形成1，3-PD；還原途徑所需的NADH由氧化途徑提供，整個過程伴隨著輔酶I的再生。
上述微生物為克雷伯肺炎桿菌屬。
上述微生物為梭菌屬的丁酸梭狀芽孢桿菌。
本發(fā)明與國內(nèi)外1，3-PD領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀相比，本發(fā)明創(chuàng)新之處在于，利用細(xì)胞自身的甘油代謝途徑，在國內(nèi)外率先構(gòu)建具有兩種酶連續(xù)催化、一種輔酶同時再生的胞外有氧條件下甘油、3-羥基丙醛合成1，3-丙二醇和二羥基丙酮多酶耦合催化體系，此方法可大大提高產(chǎn)品得率。


圖1是輔酶再生的酶耦聯(lián)法生產(chǎn)DHA和1，3-PD的示意圖。
符號說明Gly——甘油；DHA——二羥基丙酮；3-HPA——3-羥基丙醛；1，3-PD——1，3-丙二醇；GDH——甘油脫氫酶； GDHt——甘油脫水酶；PDOR——1，3-丙二醇氧化還原酶； NADH——還原型輔酶I；NAD+——氧化型輔酶I。
具體實(shí)施例菌種選擇現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)幾種能以甘油為底物發(fā)酵生產(chǎn)1，3-PD的菌種，但還沒有發(fā)現(xiàn)可以利用其它有機(jī)物質(zhì)為底物生產(chǎn)1，3-PD的自然菌。到目前為止，能夠生產(chǎn)1，3-PD的菌株主要有腸道細(xì)菌中的克雷伯肺炎桿菌屬(Klebsiella pneumoniae)、產(chǎn)氣克雷伯菌屬(Klebsiellaaerogenes)、腸細(xì)菌屬(Enterobacter agglomerans)、弗氏檸檬菌(Citrobacter freundii)以及乳桿菌屬的短乳桿菌(Lactobacillibrevis)和布氏乳桿菌(Lactobacilli buchneri)、梭菌屬的丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridia butyricum)和巴氏梭狀芽孢桿菌(Clostridia pasteuianum)等。其中K.pneumoniae、C.butyricum和C freundii具有較高的1，3-PD轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)能力，是研究得比較多的三種菌。C.butyricum具有良好的1，3-PD耐受力，但是該菌屬于嚴(yán)格厭氧菌，培養(yǎng)條件苛刻。K.pneumoniae和C.butyricum屬兼性厭氧菌，雖然屬于病原菌，但實(shí)驗(yàn)所用菌株較為溫和，在實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)未見有其致病的報(bào)道，因此是比較適宜的1，3-PD生產(chǎn)菌。
參見圖1所示，本發(fā)明通過酶耦合催化輔酶再生法胞外有氧條件下，轉(zhuǎn)化甘油、3-羥基丙醛生成二羥基丙酮和1，3-丙二醇。本發(fā)明利用細(xì)胞自身甘油歧化途徑，即利用甘油脫氫酶(GDH)將甘油還原成二羥基丙酮所產(chǎn)生的輔酶NADH，解決1，3-丙二醇氧化還原酶(PDOR)將3-羥基丙醛氧化成1，3-丙二醇所需的輔酶再生問題，同時生產(chǎn)1，3-丙二醇和二羥基丙酮。
本發(fā)明的代謝途徑是在甘油轉(zhuǎn)化為1，3-PD的氧化途徑中，甘油在依賴于NAD+的甘油脫氫酶(glycerol dehydrogenase，GDH，EC1.1.1.6)的作用下形成二羥基丙酮(dihydroxyacetone，DHA)，再在二羥基丙酮激酶(dihydroxyacetone kinase，DhaK，EC 2.7.1.29)的作用下，生成二羥基丙酮磷酸(digydroxyacetonephosphate，DHAP)，然后進(jìn)入糖酵解途徑，這一代謝過程是以甘油為底物生長的微生物的共同代謝途徑，為微生物生長提供ATP和NADH。在還原途徑中，甘油在以維生素B12為輔酶的甘油脫水酶(glycerol dehydratase，GDHt，EC 4.2.1.30)的作用下生成3-羥基丙醛(3-hydroxypropionaldehyde，3-HPA)，然后在依賴于NADH的1，3-丙二醇氧化還原酶(1，3-propanediol oxidoreductase，PDOR，EC 1.1.1.202)的作用下形成1，3-PD。還原途徑所需的NADH由氧化途徑提供，整個過程伴隨著輔酶I的再生。
本發(fā)明的具體制備包括菌的培養(yǎng)方法、酶的制備方法、分析方法及酶耦合催化方法。
培養(yǎng)方法50mL種子培養(yǎng)基置于250mL三角瓶，接入1mL經(jīng)過活化、保存于LB培養(yǎng)基的菌液，37℃、120r/min旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)24h，得到種子液。5L發(fā)酵罐裝入3L發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度37C、pH7.0、轉(zhuǎn)速200r/min以及接種量5％條件下，培養(yǎng)20h。
酶的制備方法發(fā)酵液于6500r/min、1℃下離心30min，收集菌體，用50mmol/L、pH 8.4的Tris-HCl緩沖液洗滌兩次，按2g濕菌體懸浮于1mL上述緩沖溶液中(含有2mmol/L二硫蘇糖醇，DTT)的比例制備菌懸液，所得菌懸液保存在-20℃的冰箱中。
-20℃保存的菌懸液室溫下活化，將裝有10mL菌懸液的15mL離心管置于冰浴中，細(xì)胞破碎儀探頭置于液面下1cm，功率400W，超聲3秒，間歇2秒，超聲時間12min。破碎后的懸浮液，于13000r/min、1℃下離心30min，上清液為無細(xì)胞抽提液，用于酶活力分析和酶純化。
DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析取6mL無細(xì)胞抽提液上樣到已被50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.4，含2mmol/L二硫代蘇糖醇)充分平衡的DEAE Sepharose Fast Flow 1mL預(yù)裝柱，采用10個柱體積0-1mol/L KCl線性梯度洗脫，流速1mL/min，分部收集(1mL/管)，測定各管GDH、PDOR酶活。
Blue Sepharose CL-6B親和層析合并經(jīng)離子交換洗脫具有較高GDH、PDOR酶活力的洗脫液，上樣到Blue Sepharose CL-6B層析柱(1.6cm×4cm)，用10個柱體積0-2mmol/L NAD+線性梯度洗脫，流速2mL/min，分部收集(4mL/管)，測定各管酶活。
分析方法GDH、PDOR活力測定GDH、PDOR酶活力用初速度法測定。1.5mLGDH酶活力分析反應(yīng)液含有30mmol/L(NH4)2SO4、0.2mol/L甘油、2mmol/L NAD、1μmol/L Fe(NH4)2(SO4)2、0.1mol/L碳酸鉀緩沖溶液(pH12.0)。45℃條件下，加入適量酶液啟動反應(yīng)，紫外分光光度計(jì)340nM波長下測定吸光度變化(NADH形成)。PDOR酶活力測定以1，3-PD為底物(碳酸鉀緩沖溶液pH9.5)，其余同GDH酶活測定。酶活力定義為在上述條件下，每分鐘還原1μmol底物的酶量為1個單位。酶的比活力為每mg蛋白所含酶的單位數(shù)(U/mg)。
蛋白質(zhì)含量測定采用Bradford法測定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
Gly、3-HPA、1，3-PD和DHA的含量測定反應(yīng)液樣品(2mL)在10000r/min下離心5min，取上清液進(jìn)樣。色譜柱Bio-Rad公司Aminex HPX-87H離子交換柱(7.8mm i.d.×300mm)，流動相為水∶乙腈＝65∶35(含0.001N H2SO4)溶液，流速為0.5mL/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量20μL，示差折光檢測器檢測。
酶耦合催化方法反應(yīng)在水浴恒溫反應(yīng)器(45℃)中進(jìn)行，30mL反應(yīng)液的組成為Gly 20.7mmol/L，3-HPA 20.7mmol/L，NAD+2mmol/L，GDH 4.68U/mL，PDOR 4.55U/mL，50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.4)。加入NAD+啟動反應(yīng)。按時取樣0.5mL，經(jīng)沸水浴加熱10min，10000r/min離心5min，取上清液用高效液相色譜分析反應(yīng)液組成。
本發(fā)明具體實(shí)施時，培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基(g/L)胰蛋白胨，10.0；酵母浸膏，5.0；NaCl，10.0，pH7.0。
種子培養(yǎng)基(g/L)甘油，20.0；K2HPO4，3.4；KH2PO4，1.3；(NH4)2SO4，2.0；MgSO4·7H2O，0.2；酵母浸膏，1.0；CaCO3，2.0；FeSO4·7H2O，5.0×10-3；CaCl2，2.0×10-3；微量元素A，2.0ml/L。
微量元素A組成(g/L)ZnCl2，0.07；MnCl2·4H2O，0.1；H3BO3，0.06；CoCl2·6H2O，0.2；CuCl2·2H2O，0.02；NiCl2·6H2O，0.025；Na2MoO4·2H2O，0.035。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)采用第三章培養(yǎng)基優(yōu)化后條件，即甘油，30.0；KCl，1.6；NH4Cl，6.7；CaCl2·2H2O，0.28；酵母浸膏，2.8；pH7.0。
分批反應(yīng)在45℃恒溫水浴中進(jìn)行，反應(yīng)液的組成為20.7mmol/L甘油，20.7mmol/L 3-HPA，2mmol/L NAD+，GDH 4.68U/mL，PDOR4.55U/mL，50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.4)。加入NAD+啟動反應(yīng)。240min之后反應(yīng)，底物和產(chǎn)物濃度幾乎不再變化，結(jié)果如表1。從表1可看出，分批操作條件下，GDH和PDOR偶合催化反應(yīng)得率都已接近理論得率1mol/mol，說明輔酶NAD+在有氧條件下可有效實(shí)現(xiàn)自行再生。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在胞外有氧條件下，通過酶催化輔酶再生法，可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化甘油、3-HPA制備DHA和1，3-PD。
表1 分批操作條件下GDH和PDOR偶合催化反應(yīng)結(jié)果

作為原料之一的3-羥基丙醛制備3-羥基丙醛(3-HPA)在化學(xué)工業(yè)上具有很高的應(yīng)用價值。它是一種有效的抗菌劑，可作為食品防腐劑或治療輔助劑。3-HPA還是許多工業(yè)有機(jī)化合物的前體，如丙烯酸、丙烯醛、1，3-丙二醇等。目前工業(yè)上主要通過環(huán)氧乙烷羰基合成或丙烯醛水合法生產(chǎn)3-HPA，但是3-HPA穩(wěn)定性差，合成后作為中間體隨即參與下一步反應(yīng)，3-HPA純度低，組分復(fù)雜，因此迄今為止還沒有商品化的3-HPA純品。本發(fā)明通過克雷伯桿菌利用甘油有氧發(fā)酵制備，得到純度、穩(wěn)定性較好的3-羥基丙醛。
權(quán)利要求
1.一種由生物催化轉(zhuǎn)化甘油制備1，3-丙二醇和二羥基丙酮的方法，其特征在于通過酶耦合催化、輔酶再生，轉(zhuǎn)化甘油生成二羥基丙酮和1，3-丙二醇。
2.如權(quán)利要求1所述之一種由生物催化轉(zhuǎn)化甘油制備1，3-丙二醇和二羥基丙酮的方法，其特征在于酶耦合催化輔酶再生方法是利用細(xì)胞自身甘油歧化途徑，即利用甘油脫氫酶GDH將甘油還原成二羥基丙酮所產(chǎn)生的還原型輔酶I NADH，使1，3-丙二醇氧化還原酶PDOR將3-羥基丙醛氧化成1，3-丙二醇和再生所需的氧化型輔酶INAD+，同時生產(chǎn)1，3-丙二醇和二羥基丙酮。
3.如權(quán)利要求1所述之一種由生物催化轉(zhuǎn)化甘油制備1，3-丙二醇和二羥基丙酮的方法，其特征在于在甘油轉(zhuǎn)化為1，3-PD的氧化途徑中，甘油在依賴于NAD+的甘油脫氫酶的作用下形成二羥基丙酮；在還原途徑中，甘油在以維生素B12為輔酶的甘油脫水酶的作用下生成3-羥基丙醛，然后在依賴于NADH的1，3-丙二醇氧化還原酶的作用下形成1，3-PD；還原途徑所需的NADH由氧化途徑提供。
4.如權(quán)利要求2、3所述之一種由生物催化轉(zhuǎn)化甘油制備1，3-丙二醇和二羥基丙酮的方法，其特征在于甘油脫氫酶、甘油脫水酶、1，3-丙二醇氧化還原酶來源于微生物。
5.如權(quán)利要求4所述之一種由生物催化轉(zhuǎn)化甘油制備1，3-丙二醇和二羥基丙酮的方法，其特征在于微生物為腸道細(xì)菌中的克雷伯肺炎桿菌屬、產(chǎn)氣克雷伯菌屬、腸細(xì)菌屬、弗氏檸檬菌、乳桿菌屬的短乳桿菌和布氏乳桿菌、梭菌屬的丁酸梭狀芽孢桿菌、巴氏梭狀芽孢桿菌和基因工程菌等。
6.如權(quán)利要求2所述之一種由生物催化轉(zhuǎn)化甘油制備1，3-丙二醇和二羥基丙酮的方法，其特征在于3-羥基丙醛來源于甘油發(fā)酵或化學(xué)合成。
全文摘要
本發(fā)明公開一種由生物催化轉(zhuǎn)化甘油制備1，3－丙二醇和二羥基丙酮的方法，是通過酶耦合催化、輔酶再生法轉(zhuǎn)化甘油、3－羥基丙醛生成二羥基丙酮和1，3－丙二醇。此方法大大提高了產(chǎn)品得率。
文檔編號C12R1/225GK1840668SQ20061003813
公開日2006年10月4日 申請日期2006年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月27日
發(fā)明者方柏山, 陳宏文 申請人:華僑大學(xué)