專利名稱：用于解除煙曲霉毒素的毒性的微生物及其用途、用于解除煙曲霉毒素的毒性的方法和包 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于解除煙曲霉毒素(Fumonisin)和煙曲霉毒素衍生物的毒性的微生物，以及細(xì)菌或酵母以單獨(dú)或者兩種或更多種株系相組合的形式在解除食物和/或飼料中的煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物的毒性中的用途，還涉及使用微生物來解除煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物的毒性的方法，以及用于使真菌毒素特別是煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物失活的飼料添加劑。
包括許多不同毒素的真菌毒素在現(xiàn)代食物和飼料工業(yè)中產(chǎn)生了越來越多的問題，因?yàn)殡S后被加工成食物或飼料或者直接給動(dòng)物喂食的許多植物以各種濃度受到各種各樣的毒素的侵害，這樣，除了必須檢測(cè)各種毒素外，還必須采用或發(fā)現(xiàn)用于相應(yīng)毒素的解毒或降解的有效且無害的方法。
一種獲得無毒素的植物的方法是嘗試培養(yǎng)所謂的抗特定毒素的轉(zhuǎn)基因植物，或通過使用“經(jīng)基因操作的”植物來獲得食物，所述食物由于相應(yīng)植物對(duì)所述毒素的抗性而不含有這些毒素。
除了極其復(fù)雜和麻煩外，該方法在全世界許多國家中并不是毫無爭議的，并且一直在努力尋找使植物解毒的其他方法。
特別是在玉米中經(jīng)常碰到的且在攝取所述玉米后導(dǎo)致嚴(yán)重?fù)p害的毒素是煙曲霉毒素或煙曲霉毒素衍生物，雖然其在實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)中可被已知的微生物降解，然而，對(duì)于所述毒素，迄今還未發(fā)現(xiàn)能夠在不同的毒素濃度下和在不同的營養(yǎng)環(huán)境中進(jìn)行此類降解的微生物。此外，已知的微生物需要超過24小時(shí)的相當(dāng)長的時(shí)間來進(jìn)行該降解，這樣在工業(yè)或商業(yè)規(guī)模上使用此類微生物是不現(xiàn)實(shí)的。
和食物或飼料中的真菌毒素相關(guān)的另一個(gè)問題在于，由于制備了越來越多的包含多種谷物或谷物品種的混合飼料或食物，多種真菌毒素將在同一種食物或飼料中同時(shí)存在，并且所述真菌毒素的有意義的或靶向的降解顯得十分必要。此外，重新的研究證實(shí)，所述毒素在相互之間可顯示出組合的相互作用，該相互作用可進(jìn)一步加強(qiáng)單種毒素的有害效應(yīng)。例如在1996年，Harvey報(bào)導(dǎo)了，煙曲霉毒素和脫氧瓜萎鐮菌醇在豬中的協(xié)同作用。此外，認(rèn)為大多數(shù)例如可在飼料中包含的毒素將在動(dòng)物中導(dǎo)致免疫抑制作用，這歸因于真菌毒素的同時(shí)出現(xiàn)。
因而，本發(fā)明目的在于提供用于解除煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物的毒性的微生物，所述微生物一方面能夠極快地降解所述毒素，另一方面，除了該快速降解外，還能在各種各樣營養(yǎng)物濃度存在的情況下進(jìn)行所述降解。最后，本發(fā)明目的是提供微生物或微生物組合，除煙曲霉毒素外，所述微生物或微生物組合還能夠單獨(dú)地或組合地降解其他毒素，從而獲得無毒素的飼料，特別是當(dāng)使用各種各樣的飼料植物時(shí)。
為實(shí)現(xiàn)該目的，根據(jù)本發(fā)明提供了用于解除煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物的毒性的微生物，其中使用在單步驟或多步驟反應(yīng)中將煙曲霉毒素酶促轉(zhuǎn)化成脫氨基代謝物的具有解除毒性作用的細(xì)菌或酵母，所述細(xì)菌或酵母選自可歸類于鞘氨醇單胞菌科(Sphingomonadaceae)這一分類單位的株系DSM 16254和DSM 15257、可歸類于根瘤菌目(Rhizobiales)這一分類單位的株系DSM 16255、可歸類于微桿菌科(Microbacteriaceae)這一分類單位的株系DSM16256、可歸類于根瘤菌科(Rhizobiaceae)這一分類單位的株系DSM16253、可歸類于產(chǎn)堿菌科(Alcaligenaceae)這一分類單位的株系DSM 16252和畢赤酵母屬物種(Pichia sp.)DSM 16562。上述微生物不僅能夠在單步驟或多步驟反應(yīng)中將煙曲霉毒素酶促轉(zhuǎn)化成脫氨基代謝物，而且還能在極其短的時(shí)間內(nèi)和還在復(fù)雜的環(huán)境例如飼料或食物存在的情況下，即在多種或各種各樣碳源存在的情況下，特別是在營養(yǎng)物供給過多的情況下，進(jìn)行該過程。
逐個(gè)地，可如下來概述所述微生物。在用正向引物27對(duì)16S rDNA進(jìn)行部分測(cè)序(序列長度689bp)后將株系DSM 16254歸類為鞘氨醇單胞菌科這一分類單位。部分16S rDNA序列具有下列堿基序列1 GAACGCTGGS GGCATGCCTA ACACATGCAA GTCGAACGAA GTCTTCGGAC TTAGTGGCGC61 ACGGGTGCGT AACGCGTGGG AATCTGCCCT TGGGTACGGA ATAACTCAGA GAAATTTGTG121 CTAATACCGT ATAATGTCTT CGGACCAAAG ATTTATCGCC CAAGGATGAG CCCGCGTAAG181 ATTAGCTAGT TGGTGGGGTA AAGGCCCACC AAGGCGACGA TCTTTAGCTG GTCTGAGAGG241 ATGATCAGCC ACACTGGGAC TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTGGGG301 AATATTGGAC AATGGGCGAA AGCCTGATCC AGCAATGCCG CGTGAGTGAT GAAGGCCCTA361 GGGTTGTAAA GCTCTTTTAC CCGGGATGAT AATGACAGTA CCGGGAGAAT AAGCTCCGGC421 TAACTCCGTG CCAGCAGCCG CGGTAATACG GAGGGAGCTA GCGTTGTTCG GAATTACTGG481 GCGTAAAGCG CGCGTAGGCG GTTTTTCAAG TCAGAGGTGA AAGCCCGGGG CTCAACCCCG541 GAATTGCCTT TGAAACTGGA AGACTTGAAT CTTGGAGAGG TCAGTGGAAT TCCGAGTGTA601 GAGGCGAAAT TCGTAGATAT TCGGAAGAAC ACCAGTGGCG AAGGCGACTG ACTGGACAAG661 ATTGACGCTG AGGTGCGAAA GCGTGGGGA其中所述微生物是革蘭氏陰性的，并形成小的小桿狀體，所述小桿狀體主要以單個(gè)細(xì)胞存在，和部分地構(gòu)成絲狀鏈結(jié)構(gòu)。
在16S rDNA的部分測(cè)序(用反向引物30，獲得的序列長度426bp)后，株系DSM 16257同樣屬于鞘氨醇單胞菌科這一分類單位。結(jié)果得到下列序列1 GATCCTGGCT CAGAACGAAC GCTGGCGGCA TGCCTAACAC ATGCAAGTCG AACGAAGTCT61 TCGGACTTAG TGGCGCACGG GTGCGTAACG CGTGGGAATC TGCCCTTGGG TACGGAATAA121 CTCAGAGAAA TTTGTGCTAA TACCGTATAA TGACTTCGGT CCAAAGATTT ATCGCCCAAG181 GATGAGCCCG CGTAAGATTA GCTAGTTGGT GGGGTAAAAG CCTACCAAGG CGACGATCTT241 TAGCTGGTCT GAGAGGATGA TCAGCCACAC TGGGACTGAG ACACGGCCCA GACTCCTACG301 GGAGGCAGCA GTGGGGAATA TTGGACAATG GGCGAAAGCC TGATCCAGCA ATGCCGCGTG361 AGTGATGAAG GCCCTAGGGT TGTAAAGCTC TTTTACCCGG GATGATAATG ACAGTACCGG421 GAGAAT該微生物形成絕大多數(shù)以長的絲狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列的小的小桿狀體。
在用正向引物27對(duì)16S rDNA進(jìn)行部分測(cè)序后，DSM 16255提供了下列720bp長的序列
1 ACGCTGGCGG CAGGCTTAAC ACATGCAAGT CGAACGGTCT CTTCGGAGGC AGTGGCAGAC61 GGGTGAGTAA TGCATGGGAA TCTACCGTTC TCTACGGAAT AACTCAGGGA AACTTGTGCT121 AATACCGTAT ACGCCCTTTT GGGGAAAGAT TTATCGGAGA ATGATGAGCC CATGTTGGAT181 TAGCTAGTTG GTAGGGTAAA GGCCTACCAA GGCGACGATC CATAGCTGGT CTGAGAGGAT241 GATCAGCCAC ACTGGGACTG AGACACGGCC CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTGGGGAA301 TATTGGACAA TGGGCGCAAG CCTGATCCAG CCATGCCGCG TGAGTGATGA AGGCCCTAGG361 GTTGTAAAGC TCTTTCACCG GTGAAGATAA TGACGGTAAC CGGAGAAGAA GCCCCGGCTA421 ACTTCGTGCC AGCAGCCGCG GTAATACGAA GGGGGCTAGC GTTGTTCGGA TTTACTGGGC481 GTAAAGCGCA CGTAGGCGGA CTTTTAAGTC AGGGGTGAAA TCCCGGGGCT CAACCCCGGA541 ACTGCCTTTG ATACTGGAAG TCTTGAGTAT GGAAGAGGTA AGTGGAATTG CGAGTGTAGA601 GGTGAAATTC GTAGATATTC GCAGGAACAC CAGTGGCGAA GGCGGCTTAC TGGTCCATTA661 CTGACGCTGA GGTGCGAAAG CGTGGGGGAG CAAACAGGAT TAGATACCCT GGTAGTCCAC該微生物屬于根瘤菌目這一分類單位，是革蘭氏陰性的，并且主要以單個(gè)細(xì)胞的形式形成小的小桿狀體。
微生物DSM 16256可歸類于微桿菌科這一分類單位。使用正向引物27對(duì)16S rDNA所進(jìn)行的部分測(cè)序提供了下列706pb長的序列1 GAACGCTGGC GGCGTGCTTA ACACATGCAA GTCGAACGAT GAAGCTGGAG CTTGCTCTGG61 TGGAAGAGTG GCGAACGGGT GAGTAACACG TGAGTAACCT GCCCCAGACT CTGGGATAAG121 CGCTGGAAAC GGCGTCTAAT ACTGGATATG ACCCCTACAG GCATCTGTTG GGGGTGGAAA181 GATTTATCGG TCTGGGATGG GCTCGCGGCC TATCAGCTAG ATGGTGAGGT AACGGCTCAC241 CATGGCGACG ACGGGTAGCC GGCCTGAGAG GGTGACCGGC CACACTGGGA CTGAGACACG301 GCCCAGACTC CTACGGGAGG CAGCAGTGGG GAATATTGCA CAATGGGCGA AAGCCTGATG361 CAGCAACGCC GCGTGAGGGA TGACTGCCTT CGGGTTGTAA ACCTCTTTTA GTAGGGAAGA421 AGCGAAAGTG ACGGTACCTG CAGAAAAAGC ACCGGCTAAC TACGTGCCAG CAGCCGCGGT481 AATACGTAGG GTGCAAGCGT TGTCCGGAAT TATTGGGCGT AAAGAGCTCG TAGGCGGCTT541 GTCGCGTCTG CTGTGAAAAC CCGAGGCTCA ACCTCGGGCC TGCAGTGGGT ACGGGCAGGC601 TAGAGTGCGG TAGGGGAGAT TGGAATTCCT GGTGTAGCGG TGGAATGCGC AGATATCAGG661 AGGAACACCG ATGGCGAAGG CAGATCTCTG GGCCGCTACT GACGCT該微生物是革蘭氏陽性的，并具有小而短的小桿狀體，所述桿狀體部分地以鏈狀細(xì)胞聯(lián)合體排列。
在16S rDNA的部分測(cè)序(反向引物530，序列長度392bp)后，DSM 16253屬于根瘤菌科這一分類單位。所述序列如下
1 TCCTGGCTCA GAACGAACGC TGGCGGCAGG CTTAACACAT GCAAGTCGAG CGCCCCGCAA61 GGGGAGCGGC AGACGGGTGA GTAACGCGTG GGAATCTACC GAGCCCTGCG GAATAGCTCC121 GGGAAACTGG AATTAATACC GCATACGCCC TACGGGGGAA AGATTTATCG GGGTTTGATG181 AGCCCGCGTT GGATTAGCTA GTTGGTGGGG TAAAGGCCTA CCAAGGCGAC GATCCATAGC241 TGGTCTGAGA GGATGATCAG CCACATTGGG ACTGAGACAC GGCCCAAACT CCTACGGGAG301 GCAGCAGTGG GGAATATTGG ACAATGGGCG CAAGCCTGAT CCAGCCATGC CGCGTGAGTG361 ATGAAGGCCC TAGGGTTGTA AAGCTCTTTC AC所述微生物是革蘭氏陰性的，并具有主要作為單個(gè)細(xì)胞存在的小的小桿狀體。
微生物DSM 16252可歸類于產(chǎn)堿菌科這一分類單位。16S rDNA的部分測(cè)序提供了具有下列核苷酸序列的476bp長的DNA片段1 TCCTGGCTCA GATTGAACGC TAGCGGGATG CCTTACACAT GCAAGTCGAA CGGCAGCACG61 GACTTCGGTC TGGTGGCGAG TGGCGAACGG GTGAGTAATG TATCGGAACG TGCCTAGTAG121 CGGGGGATAA CTACGCGAAA GCGTAGCTAA TACCGCATAC GCCCTACGGG GGAAAGCAGG181 GGATCGCAAG ACCTTGCACT ATTAGAGCGG CCGATATCGG ATTAGCTAGT TGGTGGGGTA241 ACGGCTCACC AAGGCGACGA TCCGTAGCTG GTTTGAGAGG ACGACCAGCC ACACTGGGAC301 TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTGGGG AATTTTGGAC AATGGGGGAA361 ACCCTGATCC AGCCATCCCG CGTGTGCGAT GAAGGCCTTC GGGTTGTAAA GCACTTTTGG421 CAGGAAAGAA ACGTCATGGG CTAATACCCC GTGAAACTGA CGGTACCTGC AGAATA所述微生物是革蘭氏陰性的，并具有小而直的小桿狀體，所述小桿狀體部分地以塊狀的多細(xì)胞聯(lián)合體存在。
DSM 16562，即畢赤酵母屬物種，呈示出橢圓形的、相對(duì)較小的酵母細(xì)胞，其單個(gè)地而不以細(xì)胞聯(lián)合體存在。
逐個(gè)地，可證明，盡管這些微生物相互之間相對(duì)不同，但除了能夠極快地解除毒性外，還共同具有甚至在復(fù)雜的環(huán)境中快速且可靠地進(jìn)行煙曲霉毒素的該解毒過程的特性。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面，以粉末、液體或凝膠的形式來穩(wěn)定細(xì)菌或酵母，由此提供能夠在任何時(shí)候用于各自用途的穩(wěn)定產(chǎn)品。
與本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面相應(yīng)地，以無細(xì)胞提取物或粗提物的形式使用所述細(xì)菌或酵母，由此可快速且可靠地制備可用的微生物產(chǎn)品。
為了盡可能完全地從食物或飼料中除去毒素，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面，用本發(fā)明的微生物可以解除除了煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物之外的至少一種其他真菌毒素的毒性，所述其他真菌毒素選自玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素或赭曲毒素。逐個(gè)地，已證明本發(fā)明的微生物能夠解除至少一種其他毒素的毒性，其中該解毒過程可和煙曲霉毒素的解毒過程一樣快速且有效地完成。因此，通過提供所述微生物，可完全降解食物或飼料特別是食物或飼料混合物中的大多數(shù)毒素而無需任何其他添加劑，從而獲得高價(jià)值的、無毒素的食物或飼料。
本發(fā)明還涉及細(xì)菌或酵母以單獨(dú)或者兩種或更多種株系相組合的形式在解除食物和/或飼料中的煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物的毒性中的用途，所述細(xì)菌或酵母選自可歸類于鞘氨醇單胞菌科這一分類單位的株系DSM 16254和DSM 15257、可歸類于根瘤菌目這一分類單位的株系DSM 16255、可歸類于微桿菌科這一分類單位的株系DSM16256、可歸類于根瘤菌科這一分類單位的株系DSM 16253、可歸類于產(chǎn)堿菌科這一分類單位的株系DSM 16252和畢赤酵母屬物種DSM16562。通過使用本發(fā)明的微生物，不僅可以完全解除食物和/或飼料中的煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物的毒性，而且，除了所述微生物能夠在提供過量碳供給的培養(yǎng)基中進(jìn)行解毒外，所述微生物還能夠在極其短的時(shí)間內(nèi)實(shí)施該解毒過程。此外，通過使用上述微生物，還可以解除除了煙曲霉毒素外的至少一種其他真菌毒素的毒性，所述其他真菌毒素選自玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素或赭曲毒素。通過此類用途，特別是在混合飼料或用于人消費(fèi)的混合的谷物產(chǎn)品中，可以保證借助于本發(fā)明的微生物，將幾種存在于谷物中的毒素安全且快速地降解。
為了進(jìn)一步使所述降解完全，根據(jù)本發(fā)明使用由細(xì)菌和/或酵母組成的混合培養(yǎng)物來解除真菌毒素的毒性。通過使用混合培養(yǎng)物，使得能夠定向抗擊大多數(shù)在同一種食物或飼料或飼料混合物中同時(shí)存在的毒素，從而可獲得所述毒素的完全解毒。此外，通過此類用途，第一次能夠安全地防止或阻止由于幾種真菌毒素種類的同時(shí)存在而導(dǎo)致的不希望的協(xié)同作用的發(fā)生。
此外，通過使用本發(fā)明的微生物，使得能夠降解濃度非常低的各種各樣的真菌毒素，特別是100μg/kg至500mg/kg，優(yōu)選地250μg/kg至25mg/kg的煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物，10μg/kg至10mg/kg，優(yōu)選地40μg/kg至2mg/kg的玉米赤霉烯酮或玉米赤霉烯酮衍生物，1μg/kg至2mg/kg，優(yōu)選地10μg/kg至750μg/kg的黃曲霉毒素，1μg/kg至2mg/kg，優(yōu)選地5μg/kg至500μg/kg的赭曲毒素，由此，除了通過使用本發(fā)明的微生物可解除各種各樣的毒素的毒性外，還可確保極低濃度的所述毒素也受到攻擊和降解，迄今為止，使用常規(guī)的微生物做到這點(diǎn)仍是非常困難的，雖然并不是完全不可能的。
為了盡可能地完全解除例如在混合飼料中包含的所有毒素的毒性，將本發(fā)明的用途進(jìn)一步發(fā)展到這樣的程度，即使用額外地包含至少一種其他細(xì)菌或酵母的組合或混合培養(yǎng)物來解除真菌毒素，特別是煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物、玉米赤霉烯酮或玉米赤霉烯酮衍生物、赭曲毒素、單端孢菌毒素和/或黃曲霉毒素的毒性，所述其他細(xì)菌或酵母選自鞘氨醇單胞菌屬物種(Sphingomonas sp.)DSM 14170和DSM 14167、Stenotrophomonas nitritreducens DSM 14168、寡養(yǎng)單胞菌屬物種(Stenotrophomonas sp.)DSM 14169、Ralstonia eutrophaDSM 14171、真桿菌屬物種(Eubacterium sp.)DSM 14197、Trichosporonmycotoxinivorans DSM 14153、隱球酵母屬物種(Cryptococcus sp.)DSM 14154、Rhodotorula yarrowii DSM 14155、粘性絲孢酵母(Trichosporon mucoides)DSM 14156、Trichosporon dulcitum DSM14162或真桿菌DSM 11798。通過使用額外地包含至少一種特別是適合于降解單端孢菌毒素、玉米赤霉烯酮或玉米赤霉烯酮衍生物、黃曲霉毒素或赭曲毒素的其他細(xì)菌或酵母的組合或混合培養(yǎng)物，除了本發(fā)明微生物的解毒作用(即煙曲霉毒素的降解)外，能夠?qū)⑵鋵?duì)于其他毒素的降解能力擴(kuò)展到這樣的程度，即通過定向使用幾種微生物使得能夠一起地和相互獨(dú)立地快速且完全地降解可能存在于飼料中的所有毒素。
在使用本發(fā)明的微生物來解除煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物的毒性的方法中，基本上如此進(jìn)行，即在單步驟或多步驟反應(yīng)中以特定微生物數(shù)目將飼料中的煙曲霉毒素酶促降解成脫氨基代謝物。根據(jù)進(jìn)一步方面，優(yōu)選地在基本培養(yǎng)基中或在具有過量營養(yǎng)物供給和碳源的復(fù)雜環(huán)境中，在含水的條件下進(jìn)行所述解毒過程。這樣的方法控制允許本發(fā)明的微生物用于這樣的方法，即在所述方法中直接在飼料中進(jìn)行解毒而不考慮可提供給所述微生物使用的碳的量。這是特別重要的，因?yàn)榻^大部分迄今已知的微生物只能在基本培養(yǎng)基或不具有提高的碳供給的環(huán)境中顯示其解毒作用，這使得大部分已知的微生物由于過量的碳供給而不適合直接在食物和飼料中使用。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的進(jìn)一步方面，如此控制所述方法，即在15分鐘至12小時(shí)，特別是15分鐘至2小時(shí)內(nèi)施行所述方法。在此類方法控制的情況下，一個(gè)方面能夠確保在食物或飼料中存在的所有真菌毒素特別是煙曲霉毒素被降解，另一方面，不僅可降解真菌毒素，而且可在這樣短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行所述降解，從而使得能夠大規(guī)模地而不僅僅在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上應(yīng)用該方法。
如果，與本發(fā)明方法的一個(gè)進(jìn)一步方面相應(yīng)地，使用額外地包含至少一種其他細(xì)菌或酵母的組合或混合培養(yǎng)物來解除真菌毒素，特別是煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物、玉米赤霉烯酮或玉米赤霉烯酮衍生物、赭曲毒素、單端孢菌毒素和/或黃曲霉毒素的毒性，那么除了降解煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物和降解能夠另外地被本發(fā)明微生物降解的真菌毒素之外，如此控制所述方法，即通過使用定向選擇的微生物來實(shí)現(xiàn)食物和/或飼料的完全解毒，所述其他細(xì)菌或酵母選自鞘氨醇單胞菌屬物種DSM 14170和DSM 14167、Stenotrophomonasnitritreducens DSM 14168、寡養(yǎng)單胞菌屬物種DSM 14169、Ralstoniaeutropha DSM 14171、真桿菌屬物種DSM 14197、Trichosporonmycotoxinivorans DSM 14153、隱球酵母屬物種DSM 14154、Rhodotorula yarrowii DSM 14155、粘性絲孢酵母DSM 14156、Trichosporon dulcitum DSM 14162或真桿菌DSM 11798。
為了可靠地完全實(shí)施所述消毒過程，與本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面相應(yīng)地，為了使食物和/或飼料解毒，將所述微生物各以0.01重量％至1.5重量％，特別是0.05重量％至0.7重量％的量與所述食物和/或飼料混合。
最后，本發(fā)明包括用于使真菌毒素特別是煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物失活的飼料添加劑，其特征在于，所述飼料添加劑以2×108/kg飼料添加劑至2×1015/kg飼料添加劑，特別是1×109/kg飼料添加劑至5×1012/kg飼料添加劑的微生物數(shù)目包含權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的微生物。通過使用以2×108/kg飼料添加劑至2×1015/kg飼料添加劑的微生物數(shù)目包含所述微生物的飼料添加劑，確保了，所有能夠被本發(fā)明微生物降解的煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物被完全解毒，此外還可以降解所有能夠被本發(fā)明微生物降解的其他毒素。
為了將所述降解擴(kuò)展至可只部分地或不完全地被本發(fā)明微生物降解的真菌毒素，將所述飼料添加劑進(jìn)一步發(fā)展至額外地包含至少一種其他細(xì)菌或酵母以解除真菌毒素特別是煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物、玉米赤霉烯酮或玉米赤霉烯酮衍生物、赭曲毒素、單端孢菌毒素和/或黃曲霉毒素的毒性，所述其他細(xì)菌或酵母選自鞘氨醇單胞菌屬物種DSM 14170和DSM 14167、Stenotrophomonas nitritreducensDSM 14168、寡養(yǎng)單胞菌屬物種DSM 14169、Ralstonia eutropha DSM14171、真桿菌屬物種DSM 14197、Trichosporon mycotoxinivorans DSM14153、隱球酵母屬物種DSM 14154、Rhodotorula yarrowii DSM 14155、粘性絲孢酵母DSM 14156、Trichosporon dulcitum DSM 14162或真桿菌DSM 11798。因而，通過幾種微生物的定向組合，成功地完全降解了在同一飼料中的所有毒素，從而能夠可靠地避免特別是在食物或飼料中的幾種毒素的協(xié)同作用。
與本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面相應(yīng)地，本發(fā)明的飼料添加劑適合用于使飼料或動(dòng)物消化道中的煙曲霉毒素B1、B2、B3和煙曲霉毒素衍生物，玉米赤霉烯酮，玉米赤霉烯醇(Zearalenol)，玉米赤霉烯酮-糖苷，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M1，脫氧瓜萎鐮菌醇(DON)，T-2毒素，HT-2毒素，瓜萎鐮菌醇，Monoacetoxyscirpenol，Diacetoxyscirpenol，木霉菌醇，疣孢菌素，Rorodin，乙酰基脫氧瓜萎鐮菌醇，異木霉菌素，羥基異木霉菌素，Calonectrin，T-2四醇，T-2三醇，脫乙?；虑巡＄牭毒┐?，新茄病鐮刀菌烯醇，乙?；虑巡＄牭毒┐?，孢子絲菌醇(Sporotrichiol)，Trichotriol，接骨木鐮菌醇和大鐮刀孢菌素和/或赫曲毒素A、B、C、D失活。
在下面，將通過實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，其中，在實(shí)施例1中顯示了煙曲霉毒素B1以恒定的毒素濃度在基本培養(yǎng)基中降解的時(shí)間過程，在實(shí)施例2中顯示了煙曲霉毒素B1在不同毒素濃度的情況下的降解，在實(shí)施例3中顯示了煙曲霉毒素B1在復(fù)合培養(yǎng)基中的降解，在實(shí)施例4中顯示了煙曲霉毒素B1在食物和飼料中的降解，在實(shí)施例5中顯示了使用本發(fā)明的微生物來降解赫曲毒素，和在實(shí)施例6中顯示了使用本發(fā)明的微生物混合物而進(jìn)行的喂養(yǎng)試驗(yàn)。
實(shí)施例1當(dāng)毒素濃度為2mg/l的煙曲霉毒素B1時(shí)，基本培養(yǎng)基中的煙曲霉毒素B1的降解或解毒對(duì)于該試驗(yàn)，使用微生物DSM 16254和DSM 16257及用作對(duì)照的株系斯平尼弗外瓶柄霉(Exophiala spinifera)DSM 1217。
在所有情況中，在需氧條件下于25℃進(jìn)行溫育。在一般培養(yǎng)基中于存在50mg/l的煙曲霉毒素B1的情況下進(jìn)行微生物的培養(yǎng)，以使得能夠也許可能誘導(dǎo)解除煙曲霉毒素B1的毒性的酶。
從

圖1中可見，在1小時(shí)的溫育后，株系DSM 16254和DSM 16257已100％地轉(zhuǎn)化了煙曲霉毒素B1，而對(duì)照酵母株系斯平尼弗外瓶柄霉在24小時(shí)的溫育時(shí)間后僅能夠轉(zhuǎn)化將近41％的毒素。因此，本發(fā)明的微生物不僅能夠在基本培養(yǎng)基中極快地解除煙曲霉毒素B1的毒性，而且該解毒作用可100％地發(fā)生。
圖2顯示，在相同的試驗(yàn)設(shè)置(即基本培養(yǎng)基和2mg/l的毒素濃度)下，株系DSM 16254、DSM 16256、DSM 16252、DSM 16257以及作為對(duì)照的酵母株系斯平尼弗外瓶柄霉DSM 1217隨時(shí)間進(jìn)程的轉(zhuǎn)化。這些降解試驗(yàn)已清楚地顯示，本發(fā)明的微生物極快地進(jìn)行降解，且在許多情況下即在DSM 16254、DSM 16257、DSM 16252、DSM 16256的情況下甚至達(dá)到100％，這在使用對(duì)照微生物DSM 1217時(shí)是不可能的。
實(shí)施例2在不同毒素濃度情況下，煙曲霉毒素B1的降解用DSM 16254、DSM 16257和DSM 16256以及作為對(duì)照的酵母株系斯平尼弗外瓶柄霉DSM 1217進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)。所用的毒素濃度是2、10、50、100和500mg/l煙曲霉毒素B1。在需氧條件下于25℃進(jìn)行溫育。在溫育這些體系5小時(shí)后顯示結(jié)果，因?yàn)檫@樣的溫育時(shí)間是關(guān)于飼料中煙曲霉毒素的解毒的在實(shí)踐上重要的時(shí)期。圖3顯示了該試驗(yàn)的結(jié)果。微生物DSM 16254能夠在所有濃度范圍內(nèi)100％地降解煙曲霉毒素B1，微生物DSM 16257只能夠在100mg/l煙曲霉毒素B1的濃度范圍內(nèi)達(dá)到96％的降解，DSM 16256能夠在2mg/l的濃度時(shí)達(dá)到100％的降解，在10mg/l的濃度時(shí)達(dá)到超過50％的降解，在50mg/l和100mg/l的濃度時(shí)分別達(dá)到35％和25％的降解。與斯平尼弗外瓶柄霉DSM 1217的比較顯示，在該微生物的情況下，特別是當(dāng)毒素濃度極低時(shí)，存在極差的降解能力，在10mg/l時(shí)DSM 1217具有最佳活性，降解了大約30％的煙曲霉毒素B1。從該比較中表明，本發(fā)明的微生物在所有濃度范圍內(nèi)均優(yōu)于DSM 1217，并且特別是在低毒素濃度的情況下100％的降解是可能的，迄今為止，這對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的微生物來說是不可能的。
實(shí)施例3在復(fù)合培養(yǎng)基中煙曲霉毒素B1的降解在該試驗(yàn)中研究了在高營養(yǎng)物濃度存在的情況下也在復(fù)合培養(yǎng)基中所述微生物解除煙曲霉毒素B1的毒性的能力。在復(fù)合培養(yǎng)基中進(jìn)行微生物的培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基包含5g/l的來自肉提取物的蛋白胨和3g/l的添加有兩種不同濃度即10mg/l和100mg/l的煙曲霉毒素B1的肉提取物。通過在需氧條件下于25℃所進(jìn)行的72小時(shí)溫育的開始和結(jié)束時(shí)比較所述體系中的毒素濃度來確定轉(zhuǎn)化率。在兩種情況中，在培養(yǎng)基中存在10mg/l的煙曲霉毒素B1的情況下都獲得了煙曲霉毒素B1的100％的解毒或100％的降解。此外，在存在100mg/l煙曲霉毒素B1的情況下，在兩種情況中也都達(dá)到了100％的解毒。用該試驗(yàn)可以清楚地證明，本發(fā)明的微生物適合用于在復(fù)合培養(yǎng)基(即具有提高的營養(yǎng)物供給的培養(yǎng)基)中降解煙曲霉毒素。
實(shí)施例4在食物和飼料中煙曲霉毒素B1的降解再次使用微生物DSM 16254和DSM 16257以嘗試降解在啤酒、玉米糝和小麥糝中毒素濃度為10mg/l的煙曲霉毒素B1。在培養(yǎng)所述微生物后，收獲微生物，將其重懸浮于含有毒素的緩沖液中，隨后立即與相應(yīng)的食品或飼料一起進(jìn)行溫育。在所有情況下，煙曲霉毒素B1的降解率為100％，從而可以清楚地證明，本發(fā)明的微生物能夠在飼料或食物中100％地降解煙曲霉毒素。
實(shí)施例5本發(fā)明的微生物對(duì)其他真菌毒素的降解在該情況下，將赫曲毒素A用作示例性的真菌毒素。使用株系DSM16254、DSM 16255、DSM 16256和DSM 16257。在需氧緩沖液中存在400μg/l赫曲毒素A的情況下進(jìn)行赫曲毒素的降解，將其溫育120小時(shí)。株系DSM 16255在2小時(shí)后已顯示95％的解毒，在24小時(shí)后，株系DSM 16254和株系DSM 16255都已100％地解除了赫曲毒素A的毒性，在48小時(shí)后可以確定，對(duì)于DSM 16256也已達(dá)到90％的解毒，在120小時(shí)后，株系DSM 16257也已100％地解除了赫曲毒素A的毒性。
實(shí)施例6使用不同微生物的組合或混合培養(yǎng)物來使具有真菌毒素的食物或飼料完全解毒的喂養(yǎng)試驗(yàn)仔豬試驗(yàn)I在該試驗(yàn)中，將株系DSM 16254和DSM 14153用作添加劑。所述添加劑具有1×1012KBE/kg添加劑的總微生物數(shù)目。試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為42天。將動(dòng)物分為4組，每組24只動(dòng)物。對(duì)照組(KG)接受未受污染的無飼料添加劑的標(biāo)準(zhǔn)飼料。毒素組(TG)接受添加有500ppb赫曲毒素A、250ppb玉米赤霉烯酮和1,500ppb煙曲霉毒素B1的飼料。試驗(yàn)組1(VG1)和試驗(yàn)組2(VG2)各接受相同的添加有毒素的飼料，但試驗(yàn)組1具有0.5kg添加劑，試驗(yàn)組2具有1kg添加劑。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，獲得下列結(jié)果。
仔豬試驗(yàn)II在該試驗(yàn)中，將DSM 16254、DSM 11798和DSM 14153用作添加劑。所述添加劑具有2.5×1012KBE/kg添加劑的總微生物數(shù)目。試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為42天。將動(dòng)物分為4組，每組19只動(dòng)物。毒素組(TG)接受添加有1.1ppm脫氧瓜萎鐮菌醇和2ppm煙曲霉毒素B1但不包含添加劑的飼料。試驗(yàn)組1(VG1)、試驗(yàn)組2(VG2)和試驗(yàn)組3(VG3)各接受相同的添加有毒素的飼料，但試驗(yàn)組1具有0.5kg添加劑，試驗(yàn)組2具有1kg添加劑，試驗(yàn)組3具有2kg添加劑。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，獲得下列結(jié)果。
仔豬試驗(yàn)III在該試驗(yàn)中，將株系DSM 16254用作添加劑。所述添加劑具有1×1011KBE/kg添加劑的總微生物數(shù)目。試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為42天。將動(dòng)物分為2組，每組30只動(dòng)物。毒素組(TG)接受添加有4.5ppm煙曲霉毒素B1的飼料。試驗(yàn)組接受相同的添加有毒素的飼料，但具有0.5kg添加劑。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，獲得下列結(jié)果。
雛雞(Broiler)試驗(yàn)I在該試驗(yàn)中，將株系DSM 16254用作添加劑。所述添加劑具有2.5×1011KBE/kg添加劑的總微生物數(shù)目。將動(dòng)物分為2組，每組140,000只動(dòng)物。毒素組(TG)接受添加有300ppb黃曲霉毒素和2ppm煙曲霉毒素的飼料。試驗(yàn)組接受相同的添加有毒素的飼料，但具有1kg添加劑/噸飼料。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，獲得下列結(jié)果。
雛雞試驗(yàn)II在該實(shí)驗(yàn)中，將株系DSM 16254和DSM 11798用作添加劑。所述添加劑具有4×1011KBE/kg添加劑的總微生物數(shù)目。將動(dòng)物分為3組，每組260只動(dòng)物。對(duì)照組接受未受污染的飼料。毒素組(TG)接受添加有3.5ppm煙曲霉毒素和1.8ppm T-2毒素的飼料。試驗(yàn)組接受相同的添加有毒素的飼料，但具有1kg添加劑/噸飼料。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，獲得下列結(jié)果。
PCT申請(qǐng)PCT/AT2005/00453的附件申請(qǐng)人Erber Aktiengesellschaft等人根據(jù)專利合作條約實(shí)施細(xì)則第13條之二第4款的列表所有在本PCT申請(qǐng)PCT/AT2005/00453中提到的微生物都保藏在DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH(德意志微生物保藏中心)，Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，Deutschland(DE)。
權(quán)利要求
1.用于解除煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物的毒性的微生物，其中使用在單步驟或多步驟反應(yīng)中將煙曲霉毒素酶促轉(zhuǎn)化成脫氨基代謝物的具有解除毒性作用的細(xì)菌或酵母，所述細(xì)菌或酵母選自可歸類于鞘氨醇單胞菌科這一分類單位的株系DSM 16254和DSM 15257、可歸類于根瘤菌目這一分類單位的株系DSM 16255、可歸類于微桿菌科這一分類單位的株系DSM 16256、可歸類于根瘤菌科這一分類單位的株系DSM16253、可歸類于產(chǎn)堿菌科這一分類單位的株系DSM 16252和畢赤酵母屬物種DSM 16562。
2.權(quán)利要求1的微生物，其特征在于，以粉末、液體或凝膠的形式來穩(wěn)定所述細(xì)菌或酵母。
3.權(quán)利要求1或2的微生物，其特征在于，以無細(xì)胞提取物或粗提取物的形式使用所述細(xì)菌或酵母。
4.權(quán)利要求1、2或3的微生物，其特征在于，所述細(xì)菌或酵母除了解除煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物的毒性之外，還解除至少一種選自玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素或赭曲毒素的其他真菌毒素的毒性。
5.細(xì)菌或酵母以單獨(dú)或者兩種或更多種株系相組合的形式在解除食物和/或飼料中的煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物的毒性中的用途，所述細(xì)菌或酵母選自可歸類于鞘氨醇單胞菌科這一分類單位的株系DSM16254和DSM 15257、可歸類于根瘤菌目這一分類單位的株系DSM 16255、可歸類于微桿菌科這一分類單位的株系DSM 16256、可歸類于根瘤菌科這一分類單位的株系DSM 16253、可歸類于產(chǎn)堿菌科這一分類單位的株系DSM 16252和畢赤酵母屬物種DSM 16562。
6.權(quán)利要求5的用途，其特征在于，所述細(xì)菌或酵母另外還用于解除至少一種選自玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素或赭曲毒素的其他真菌毒素的毒性。
7.權(quán)利要求5或6的用途，其特征在于，使用細(xì)菌和/或酵母的混合培養(yǎng)物來解除真菌毒素的毒性。
8.權(quán)利要求5、6或7的用途，所述用途為用于對(duì)低濃度的真菌毒素，特別是100μg/kg至500mg/kg，優(yōu)選地250μg/kg至25mg/kg的煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物，10μg/kg至10mg/kg，優(yōu)選地40μg/kg至2mg/kg的玉米赤霉烯酮或玉米赤霉烯酮衍生物，1μg/kg至2mg/kg，優(yōu)選地10μg/kg至750μg/kg的黃曲霉毒素，1μg/kg至2mg/kg，優(yōu)選地5μg/kg至500μg/kg的赭曲毒素，進(jìn)行解毒。
9.權(quán)利要求5至8中任一項(xiàng)的用途，其特征在于，使用額外地包含至少一種其他細(xì)菌或酵母的組合或混合培養(yǎng)物來解除真菌毒素，特別是煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物、玉米赤霉烯酮或玉米赤霉烯酮衍生物、赭曲毒素、單端孢菌毒素和/或黃曲霉毒素的毒性，來解除共同出現(xiàn)的真菌毒素，特別是煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物、玉米赤霉烯酮或玉米赤霉烯酮衍生物、黃曲霉毒素或赭曲毒素的毒性，所述其他細(xì)菌或酵母選自鞘氨醇單胞菌屬物種DSM 14170和DSM 14167、Stenotrophomonas nitritreducens DSM 14168、寡養(yǎng)單胞菌屬物種DSM14169、Ralstonia eutropha DSM 14171、真桿菌屬物種DSM 14197、Trichosporon mycotoxinivorans DSM 14153、隱球酵母屬物種DSM14154、Rhodotorula yarrowii DSM 14155、粘性絲孢酵母DSM 14156、Trichosporon dulcitum DSM 14162或真桿菌DSM 11798。
10.使用權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的微生物來解除煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物的毒性的方法，其包括以103/g飼料至108/g飼料，特別是2×104/g飼料至5×106/g飼料的微生物數(shù)目，在單步驟或多步驟反應(yīng)中將飼料中的煙曲霉毒素酶促轉(zhuǎn)化成脫氨基代謝物。
11.權(quán)利要求10的方法，其特征在于，在基本培養(yǎng)基中或在具有過量營養(yǎng)物供給和碳源的復(fù)雜環(huán)境中，在含水的條件下進(jìn)行所述解毒過程。
12.權(quán)利要求10或11的方法，其特征在于，在15分鐘至12小時(shí)內(nèi)，特別是在15分鐘至2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行所述解毒過程。
13.權(quán)利要求10、11或12的方法，其特征在于，將至少一種選自玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素或赭曲毒素的其他真菌毒素轉(zhuǎn)化成無毒的降解產(chǎn)物。
14.權(quán)利要求10至13中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，使用額外地包含至少一種其他細(xì)菌或酵母的組合或混合培養(yǎng)物來解除真菌毒素，特別是煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物、玉米赤霉烯酮或玉米赤霉烯酮衍生物、赭曲毒素、單端孢菌毒素和/或黃曲霉毒素的毒性，所述其他細(xì)菌或酵母選自鞘氨醇單胞菌屬物種DSM 14170和DSM 14167、Stenotrophomonas nitritreducens DSM 14168、寡養(yǎng)單胞菌屬物種DSM14169、Ralstonia eutropha DSM 14171、真桿菌屬物種DSM 14197、Trichosporon mycotoxinivorans DSM 14153、隱球酵母屬物種DSM14154、Rhodotorula yarrowii DSM 14155、粘性絲孢酵母DSM 14156、Trichosporon dulcitum DSM 14162或真桿菌DSM 11798。
15.權(quán)利要求10至13中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，為了使食物和/或飼料解毒，將所述微生物各以0.01重量％至1.5重量％，特別是0.05重量％至0.7重量％的量與所述食物和/或飼料混合。
16.用于使真菌毒素特別是煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物失活的飼料添加劑，其特征在于，所述飼料添加劑以2×108/kg飼料添加劑至2×1015/kg飼料添加劑，特別是1×109/kg飼料添加劑至5×1012/kg飼料添加劑的微生物數(shù)目包含權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的微生物。
17.權(quán)利要求16的飼料添加劑，其特征在于，其額外地包含至少一種其他細(xì)菌或酵母以解除真菌毒素特別是煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物、玉米赤霉烯酮或玉米赤霉烯酮衍生物、赭曲毒素、單端孢菌毒素和/或黃曲霉毒素的毒性，所述其他細(xì)菌或酵母選自鞘氨醇單胞菌屬物種DSM 14170和DSM 14167、Stenotrophomonas nitritreducens DSM14168、寡養(yǎng)單胞菌屬物種DSM 14169、Ralstonia eutropha DSM 14171、真桿菌屬物種DSM 14197、Trichosporon mycotoxinivorans DSM 14153、隱球酵母屬物種DSM 14154、Rhodotorula yarrowii DSM 14155、粘性絲孢酵母DSM 14156、Trichosporon dulcitum DSM 14162或真桿菌DSM11798。
18.權(quán)利要求16或17的飼料添加劑的用途，所述用途為用于使飼料或動(dòng)物消化道中的煙曲霉毒素B1、B2、B3和煙曲霉毒素衍生物，玉米赤霉烯酮和玉米赤霉烯酮衍生物，玉米赤霉烯醇，玉米赤霉烯酮-糖苷，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M1，脫氧瓜萎鐮菌醇(DON)，T-2毒素，HT-2毒素，瓜萎鐮菌醇，Monoacetoxyscirpenol，Diacetoxyscirpenol，木霉菌醇，疣孢菌素，Rorodin，乙酰基脫氧瓜萎鐮菌醇，異木霉菌素，羥基異木霉菌素，Calonectrin，T-2四醇，T-2三醇，脫乙?；虑巡＄牭毒┐迹虑巡＄牭毒┐?，乙酰基新茄病鐮刀菌烯醇，孢子絲菌醇，Trichotriol，接骨木鐮菌醇和大鐮刀孢菌素和/或赫曲毒素A、B、C、D失活。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于解除煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物的毒性的微生物，以及細(xì)菌或酵母以單獨(dú)或者兩種或更多種株系相組合的形式在解除食物和/或飼料中的煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物的毒性中的用途，還涉及使用微生物來解除煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物的毒性的方法，以及用于使真菌毒素特別是煙曲霉毒素和煙曲霉毒素衍生物失活的飼料添加劑。
文檔編號(hào)A23L1/015GK101056541SQ200580039126
公開日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2005年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月16日
發(fā)明者G·沙特茲瑪瑞, M·陶貝爾, E·維克魯, E-M·班德 申請(qǐng)人:愛爾伯股份公司