專(zhuān)利名稱(chēng)：用于預(yù)測(cè)對(duì)氯氮平治療的應(yīng)答性的生物標(biāo)記的制作方法
專(zhuān)利說(shuō)明用于預(yù)測(cè)對(duì)氯氮平治療的應(yīng)答性的生物標(biāo)記 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明一般涉及生物樣品的體外分析，更具體地，涉及對(duì)患者樣品分析對(duì)氯氮平施用的應(yīng)答性的生物標(biāo)記。
相關(guān)技術(shù)描述 精神分裂癥是幾種最嚴(yán)重的精神病之一，其特征是在腦的多個(gè)區(qū)域間的心理功能障礙。Freedman R，N. Engl.J.Med.349(18)1738-49(2003)。在精神分裂癥中自殺或者企圖自殺的比例比在一般群體明顯更大，占這些患者中死亡的約10％。精神分裂癥中自殺的危險(xiǎn)因素是復(fù)雜的，包括遺傳因素和環(huán)境因素。還報(bào)導(dǎo)了遺傳和環(huán)境因素之間的相互作用。Caspi A等人，Science 301(5631)386-9(2003)。許多研究表明遺傳成分占該危險(xiǎn)的約70％。Freedman R，N. Engl.J.Med.349(18)1738-49(2003)。然而，精神分裂癥似乎不是單基因的，并且已經(jīng)復(fù)制了與該疾病連鎖的許多染色體基因座。基因如5-羥色胺受體和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的一些單核苷酸多態(tài)性已經(jīng)與對(duì)精神分裂癥的增加的易感性關(guān)聯(lián)。有趣的是，這些多態(tài)性還似乎對(duì)藥物應(yīng)答有影響。
當(dāng)前的臨床研究已經(jīng)表明非典型的抗精神病藥物氯氮平(CLOZARIL或者LEPONEX，Novartis Pharmaceutical Corporation，East Hanover，NJ，USA)可以顯著減小精神分裂癥和有關(guān)的精神病分裂情感性障礙患者中的自殺率。見(jiàn)Meltzer等人，Arch.Gen.Psychiatry，6082-91(2003)；公布的PCT申請(qǐng)WO 2004/074513。一個(gè)多中心的、隨機(jī)化的國(guó)際性2年研究比較了在認(rèn)為有自殺的高度危險(xiǎn)的患者中用氯氮平對(duì)比奧氮平治療的患者中的自殺行為。Meltzer HY，J.Clin.Psychiatry 60 Suppl1247-50(1999))；Meltzer HY等人，Arch.Gen.Psychiatry 60(1)82-91(2003)；Potkin SG等人，Biol.Psychiatry 54(4)444-52(2003)；VandenberghDJ等人，Genomics 14(4)1104(1992)；Grunhage F等人，Mol.Psychiatry5(3)275(2000)。該研究斷定，自殺行為(包括自殺企圖)、由于自殺念頭而入院、需要救護(hù)干預(yù)、需要用抗抑郁劑、抗焦慮劑或者催眠藥伴隨治療在用氯氮平治療的患者中都顯著較少。
導(dǎo)致自殺性(suicidality)減少的最可能的機(jī)制是氯氮平的優(yōu)秀的抗精神病功效和內(nèi)在的抗抑郁活性。在2002年12月，美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)氯氮平(CLOZARIL)用于治療患有精神分裂癥或者有慢性危險(xiǎn)的分裂情感性障礙的患者中的反復(fù)自殺行為。CLOZARIL是第一種批準(zhǔn)用于該用途的藥物。此外，已經(jīng)證明CLOZARIL/LEPONEX能夠改善認(rèn)知功能。
然而，仍然存在準(zhǔn)確預(yù)測(cè)給定患者中有多大可能性的自殺行為這種困難且通常易出錯(cuò)的任務(wù)。對(duì)氯氮平治療的應(yīng)答的個(gè)體間差異是顯著的。不是所有患者都能從氯氮平受益。一些患者對(duì)該療法有不利反應(yīng)，而其他患者不能足夠地應(yīng)答。盡管可以利用多種不同的藥物類(lèi)別，但是約30-50％的患者沒(méi)有對(duì)急性治療足夠應(yīng)答，不管標(biāo)準(zhǔn)精神病藥療法的最初選擇如何。Freedman R，N. Engl.J.Med.349(18)1738-49(2003))；Meltzer HY，Ann.N.Y. Acad.Sci.93244-58；討論58-60；(2001)。此外，在過(guò)去，沒(méi)有客觀的測(cè)試可以幫助預(yù)測(cè)這種行為?，F(xiàn)在擁有了經(jīng)證明在減小這些嚴(yán)重患病的患者中的自殺危險(xiǎn)中更有效的藥療法，已經(jīng)越來(lái)越重要的是醫(yī)生有用來(lái)預(yù)測(cè)自殺或者自毀行為的可能性的客觀且可靠的方法。藥物應(yīng)答下面遺傳因子的鑒定是分子醫(yī)學(xué)研究的最有希望的領(lǐng)域。從而，需要用來(lái)幫助臨床醫(yī)生作出該困難且重要的決定的客觀測(cè)試。
發(fā)明概述 本發(fā)明通過(guò)提供在可能患有或者懷疑患有包括精神分裂癥的精神病的個(gè)體中預(yù)測(cè)自殺行為的危險(xiǎn)的生物標(biāo)記和方法而回答了該需求。本發(fā)明提供了生物標(biāo)記，其(1)是有用的疾病標(biāo)記；(2)可以用于得到對(duì)疾病發(fā)病機(jī)理的更好的理解；和(3)可以區(qū)分患者群體中氯氮平應(yīng)答者與氯氮平非應(yīng)答者。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括確定個(gè)體的多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1基因(DAT1基因；SLC6A3基因)的3’-非翻譯區(qū)(UTR)中存在的可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)的形式。SLC6A3基因位于染色體5p15.3上。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括對(duì)個(gè)體中存在的SLC6A3基因(DAT1基因)的兩種拷貝確定外顯子9(Exon 9)上多態(tài)性位點(diǎn)59 A→G的核苷酸對(duì)的身份。多態(tài)性59 A→G在GenBank序列號(hào)AF119117.1中的41370位(SEQ ID NO2)。(SEQ IDNO1提供了GenBank序列號(hào)AF119117.1的41341-41401位的序列)。
這些核苷酸變異可以導(dǎo)致多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異常表達(dá)，從而影響其功能。SLC6A3基因中的9個(gè)或者更少的重復(fù)已經(jīng)與該基因的弱表達(dá)相關(guān)。59 A→G多態(tài)性(SEQ ID NO2)導(dǎo)致外顯子9的異常剪接，因此得到異常的、可檢測(cè)的RNA。具有該多態(tài)性的患者中該基因的多肽產(chǎn)物可以改變，其形成了該多態(tài)性的血試驗(yàn)法的基礎(chǔ)，從而提供了對(duì)患者中自殺可能性的估計(jì)。
因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了確定SLC6A3基因座上患者的基因型的方法和在處于或者可能處于自殺或者自毀行為危險(xiǎn)的患者中預(yù)測(cè)自殺或者自毀行為的危險(xiǎn)的方法中使用該信息的方法。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在發(fā)生或者有危險(xiǎn)發(fā)生1型事件的患者的治療期間，預(yù)測(cè)1型事件發(fā)生的可能性的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了確定SLC6A3基因的3’-UTR處患者的基因型的方法，其包括(a)從患者得到體液或者其他組織的樣品，和(b)為患者的血液或者組織中存在的SLC6A3基因的兩種拷貝確定VNTR多態(tài)性的數(shù)目。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了確定SLC6A3外顯子9基因座上患者的基因型的方法，其包括(c)為患者的血液或者組織中存在的SLC6A3基因的兩種拷貝確定GenBank序列檢索參考號(hào)AF119117.1(GenBank Sequence Accession Reference No.AF119117.1)中41370位上SLC6A3外顯子9 A59G(rs6347)中多態(tài)性位點(diǎn)上核苷酸對(duì)的身份，其中(i)如果兩個(gè)核苷酸對(duì)都是AT，那么將該患者分類(lèi)為AA；(ii)如果一個(gè)核苷酸對(duì)是AT，一個(gè)是GC，那么該患者分類(lèi)為GA；和(iii)如果兩個(gè)核苷酸都是GC，那么該患者分類(lèi)為GG。在另一實(shí)施方案中，如上述進(jìn)行基因型確定，其中(a)如果所述患者分類(lèi)為AA，那么可以認(rèn)為它們處于危險(xiǎn)類(lèi)別I(Category I)，和(b)如果所述患者分類(lèi)為GA，那么可以認(rèn)為它們處于危險(xiǎn)類(lèi)別II，和(c)如果所述患者分類(lèi)為GG，那么可以認(rèn)為它們處于危險(xiǎn)類(lèi)別III。
在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了利用SLC6A3多態(tài)性的替代標(biāo)記做出上述決定的方法。該方法包括在發(fā)生或者有危險(xiǎn)發(fā)生1型事件的患者的治療期間，預(yù)測(cè)1型事件的可能性。在一個(gè)實(shí)施方案中，該生物標(biāo)記是SLC6A3基因的3’-UTR中VNTR多態(tài)性的數(shù)目的存在的替代(無(wú)論9個(gè)或者更少的重復(fù)或者10個(gè)或者更多的重復(fù))。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括對(duì)所述患者中是否存在SLC6A3外顯子9 A59G多態(tài)性的替代標(biāo)記做出決定，其中，(a)如果所述替代標(biāo)記表明所述患者將被分類(lèi)為AA，那么認(rèn)為他們處于危險(xiǎn)類(lèi)別I，并且(b)如果所述替代標(biāo)記表明所述患者將被分類(lèi)為GA，那么認(rèn)為他們處于危險(xiǎn)類(lèi)別II，和(c)如果所述替代標(biāo)記表明所述患者將被分類(lèi)為GG，那么認(rèn)為他們處于危險(xiǎn)類(lèi)別III。
從而，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，還提供了基于將治療的患者的SLC6A3基因的多態(tài)性的知識(shí)，確定治療決定的方法。根據(jù)該信息，可以使用在所選的藥療法和確?；颊甙踩璧挠^察程度方面都最合適的方式治療個(gè)體。例如，在中等和高危險(xiǎn)類(lèi)別的個(gè)體在醫(yī)院和作為門(mén)診病人都接受增加水平的觀察。見(jiàn)Modestin J等人，J.Clin.Psychiatry 66(4)534-8(April 2005)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療處于或者可能處于自殺或者自毀行為危險(xiǎn)的個(gè)體的方法，其包括(a)測(cè)定所述患者體液或者組織中SLC6A3基因表達(dá)產(chǎn)物的存在，其中(i)如果發(fā)現(xiàn)SLC6A3基因表達(dá)產(chǎn)物的濃度表明高危險(xiǎn)的、或者至少中等危險(xiǎn)的基因型，那么用氯氮平而不是任何其他類(lèi)似藥物治療患者，并且更嚴(yán)重的考慮是在治療期間送個(gè)體住院或者提供自殺預(yù)防手段；和(ii)如果SLC6A3基因表達(dá)產(chǎn)物的濃度表明將認(rèn)為該個(gè)體為低危險(xiǎn)類(lèi)別，那么患者監(jiān)護(hù)將不必對(duì)患者如此打擾。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，上面的決定將通過(guò)測(cè)試SLC6A3基因的基因表達(dá)產(chǎn)物(多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[DAT1])的存在和親和性或者濃度來(lái)進(jìn)行，所述測(cè)試通過(guò)測(cè)量多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合潛力(DATBP)來(lái)實(shí)現(xiàn)。這將使得必須使用[11C]RTI-32，其是一種正電子成像術(shù)(PET)成像放射性配體，該配體對(duì)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是高度選擇的。見(jiàn)Wilson，DaSilva & Houle，J.Label. Comp.Radiopharm.，34759-765(1994)；和Wilson，DaSilva & Houle，Nucl.Med.Biol.，23(2)141-146(1996)。
在另一實(shí)施方案中，上面的決定將依賴(lài)于使用[123I]-β-CIT單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)化斷層顯像(SPECT)技術(shù)作為測(cè)定DATBP的備選方法。見(jiàn)Neumeister等人，Psychol. Med.31(8)1467-1473(2001)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療處于或者可能處于自殺或者自毀行為危險(xiǎn)的個(gè)體的方法，其包括(a)檢測(cè)對(duì)應(yīng)于SLC6A3基因的mRNA表達(dá)水平；(b)檢測(cè)對(duì)應(yīng)于來(lái)自低危險(xiǎn)患者的SLC6A3基因的變體的mRNA表達(dá)水平；和(c)比較上面(a)和(b)中檢測(cè)的mRNA水平，其中(i)如果(a)存在，那么知道該患者為中或者高危險(xiǎn)類(lèi)別，并且將采取合適的預(yù)防措施。這些預(yù)防措施包括，但不限于，升高水平的觀察，包括住院，和相對(duì)于相似類(lèi)型的其他藥療法，優(yōu)先使用氯氮平；和(ii)如果檢測(cè)到(a)并且沒(méi)有檢測(cè)到(b)，那么認(rèn)為患者處于高危險(xiǎn)類(lèi)別，在治療期間采取甚至更嚴(yán)格的上述類(lèi)型的預(yù)防措施。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了選擇受試者以包括在臨床研究中的方法，所述臨床研究包括但不限于，自殺、抗抑郁或者抗精神病藥療法的研究，包括確定個(gè)體中存在的SLC6A3基因，其中基于所示的危險(xiǎn)類(lèi)別，將個(gè)體包括在該研究中或者排除在該研究之外。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是用于對(duì)處于或者可能處于自殺或者自毀行為危險(xiǎn)的個(gè)體確定治療策略的試劑盒。該試劑盒包括測(cè)量SLC6A3基因表達(dá)產(chǎn)物水平所需的材料。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該試劑盒將含有通過(guò)DATBP的測(cè)量來(lái)測(cè)試SLC6A3基因(DAT1)的基因表達(dá)產(chǎn)物的存在和親和性或者濃度所需的材料。這將使得必須使用[11C]RTI-32，其是對(duì)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有高度選擇性的一種PET成像放射性配體。見(jiàn)Wilson，DaSilva & Houle(1994)，上文；和Wilson，DaSilva & Houle(1996)，上文。
此外，試劑盒將含有適于包含所需的材料和來(lái)自所述個(gè)體的體液樣品的容器，其中可以測(cè)定DATBP的水平，該試劑盒還包括該試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。這些說(shuō)明書(shū)將包括試劑盒的正確使用和解釋結(jié)果的正確方式，以及根據(jù)用該試劑盒測(cè)試的個(gè)體的具體情況對(duì)患者管理的建議。
在另一實(shí)施方案中，上面的試劑盒將依賴(lài)于使用[123I]-β-CIT SPECT技術(shù)作為測(cè)定DATBP的備選方法。見(jiàn)Neumeister等人(2001)，上文。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是用于對(duì)處于或者可能處于自殺或者自毀行為危險(xiǎn)的個(gè)體確定治療策略的試劑盒，其包含(a)能夠識(shí)別并結(jié)合到SLC6A3基因的mRNA表達(dá)產(chǎn)物的多核苷酸；(b)適于含有所述多核苷酸和從所述個(gè)體得到的體液樣品的容器，其中所述多核苷酸可以接觸SLC6A3mRNA(如果存在)；(c)檢測(cè)所述多核苷酸與SLC6A3 mRNA的組合的手段；(d)確定mRNA是否來(lái)自低度危險(xiǎn)、中度危險(xiǎn)或者高度危險(xiǎn)的個(gè)體的基因組的手段；和(e)試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于確定處于或者可能處于自殺或者自毀行為危險(xiǎn)的個(gè)體對(duì)多種藥物，包括但不限于，氯氮平，包括但不限于CLOZARIL的應(yīng)答性的方法，其包括(a)為該個(gè)體中存在的SLC6A3基因的兩種拷貝確定SLC6A3基因的多態(tài)性，其與表明個(gè)體是否為如上述的低危險(xiǎn)、中危險(xiǎn)或者高危險(xiǎn)個(gè)體的SLC6A的基因的多態(tài)性連鎖不平衡(LD)；和(b)基于與所指出的多態(tài)性連鎖不平衡的SLC6A3基因的區(qū)域，將個(gè)體分配到一個(gè)危險(xiǎn)組。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于鑒定患者在SLC6A3基因的VNTR基因座多態(tài)性位點(diǎn)的多態(tài)性模式的試劑盒，所述試劑盒包含用于確定SLC6A3基因的VNTR基因座多態(tài)性位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性模式的手段。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于鑒定患者在外顯子9 A59G上SLC6A3多態(tài)性位點(diǎn)的多態(tài)性模式的試劑盒，所述試劑盒包含用于確定外顯子9 A59G處SLC6A3多態(tài)性位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性模式的手段。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒，其還包含DNA樣品收集手段。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是用于鑒定SLC6A3基因的mRNA表達(dá)的試劑盒，所述試劑盒包含用于測(cè)定SLC6A3基因的mRNA產(chǎn)物的手段。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是試劑盒，其中用于測(cè)定SLC6A3基因的mRNA產(chǎn)物的手段包含能夠結(jié)合SLC6A3基因的mRNA表達(dá)產(chǎn)物的多核苷酸。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于鑒定患者的SLC6A3基因表達(dá)產(chǎn)物濃度或者水平的試劑盒，其包含用于以區(qū)分G變異基因型和A原始基因型的方式檢測(cè)SLC6A3基因的多肽表達(dá)產(chǎn)物的濃度的手段。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒，其還包含用于收集體液樣品的手段。
本發(fā)明的其他實(shí)施方案提供了治療需要此類(lèi)治療的處于或者可能處于自殺或者自毀行為危險(xiǎn)的個(gè)體的方法，選擇包括在藥療法的臨床研究中的受試者的方法，或者用于確定治療期間自殺或者自毀行為的可能性的方法，其中所述方法在活體外(ex vivo)進(jìn)行。
在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，提供了試劑盒，如上述任意試劑盒，但是其檢測(cè)SLC6A3多態(tài)性的替代標(biāo)記。這種替代標(biāo)記可以通過(guò)任意上述方法檢測(cè)，如通過(guò)諸如檢測(cè)替代標(biāo)記基因組的mRNA或者通過(guò)檢測(cè)替代標(biāo)記的多肽基因表達(dá)產(chǎn)物來(lái)進(jìn)行。替代標(biāo)記的存在或者缺失將用于根據(jù)它與目的SLC6A3多態(tài)性的已知的關(guān)聯(lián)做出上面的決定。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了實(shí)施例1中氯氮平治療組中白種人的時(shí)序檢驗(yàn)(log ranktest)分析的結(jié)果。
圖2顯示了實(shí)施例1中氯氮平治療組中整個(gè)群體的時(shí)序檢驗(yàn)分析的結(jié)果。
圖3顯示了奧氮平治療組中白種人的時(shí)序檢驗(yàn)分析的結(jié)果。
圖4顯示了奧氮平治療組中整個(gè)群體的時(shí)序檢驗(yàn)分析的結(jié)果。
圖5顯示了氯氮平治療組中具有9種或者更少重復(fù)等位基因的白種人與具有10種或者更多重復(fù)等位基因的至少一種拷貝的白種人的比較。
圖6顯示了氯氮平治療組中具有9種或者更少重復(fù)等位基因的所有受試者與具有10種或者更多重復(fù)等位基因的至少一種拷貝的所有受試者的比較。
圖7顯示了奧氮平治療組中具有9種或者更少重復(fù)等位基因的白種人與具有10種或者更多重復(fù)等位基因的至少一種拷貝的白種人的比較。
圖8顯示了奧氮平治療組中具有9種或者更少重復(fù)等位基因的所有受試者與具有10種或者更多重復(fù)等位基因的至少一種拷貝的所有受試者的比較。
優(yōu)選實(shí)施方案描述 下面提供用于本說(shuō)明書(shū)的某些術(shù)語(yǔ)的定義。其他術(shù)語(yǔ)的定義可以見(jiàn)美國(guó)能源部科學(xué)局人類(lèi)基因組計(jì)劃(U.S.Department of Energy，Office ofScience， Human Genome Project(http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human Genome/glossary/))提供的詞匯。在本發(fā)明的實(shí)踐中，使用分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA中的許多常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)是公知的并且分別在例如Current Protocols inMolecular Biology，Vols.I-III，Ausubel，ed.(1997)；Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)；DNA CloningAPractical Approach，Vols.I and II，Glover D，ed.(1985)；OligonucleotideSynthesis，Gait，ed.(1984)；Nucleic Acid Hybridization，Hames & Higgins，Eds.(1985)；Transcription and Translation，Hames & Higgins，eds.(1984)；Animal Cell Culture，F(xiàn)reshney，ed.(1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press，1986)；Perbal，APractical Guide to Molecular Cloning；theseries，Methods in Enzymol.(Academic Press，Inc.，1984)；Gene TransferVectors for Mammalian Cells，Miller和Calos，Eds.(Cold Spring HarborLaboratory，NY，1987)；和Methods in Enzymology，Vols.154和155，Wuand Grossman，和Wu，Eds.中解釋。本文引用的所有專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利和文獻(xiàn)參考都完整引入本文作為參考。
從而，在一方面，本發(fā)明提供了確定處于或者可能處于自殺或者自毀行為危險(xiǎn)的個(gè)體在治療期間將發(fā)生自殺行為的可能性的方法。這些方法包括確定患者中多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因DAT1(SLC6A3)的基因型或者單元型，特別是SLC6A3多態(tài)性的存在或者缺失。
如果不存在多態(tài)性并且兩個(gè)等位基因都含有A，那么將該患者分類(lèi)為類(lèi)別I，其特征是此類(lèi)患者在治療期間有相對(duì)較低危險(xiǎn)的自殺行為。該類(lèi)別意在代表自殺或者自毀行為的危險(xiǎn)程度，本領(lǐng)域技術(shù)人員將基于患者在那時(shí)的精神狀態(tài)、既往史、家族史、患者疾病的性質(zhì)和歷史和自殺的已知的危險(xiǎn)因素，如藥物濫用的存在等等，對(duì)該患者估計(jì)所述危險(xiǎn)程度。
如果多態(tài)性存在于一個(gè)等位基因上但是不存在于另一個(gè)等位基因上，因此，該患者具有AG基因型，那么將該患者分類(lèi)為類(lèi)別II，其特征是該患者在治療期間有相對(duì)較高危險(xiǎn)的自殺行為。如果患者對(duì)于所述多態(tài)性是純合的，具有基因型GG，那么將該患者置于類(lèi)別III，其特征是該患者在治療期間有最高的相對(duì)危險(xiǎn)的自殺行為。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“類(lèi)別I”、“類(lèi)別II”和“類(lèi)別III”是指?jìng)€(gè)體在治療期間將變得自殺性或者以自毀方式行為，即將發(fā)生1型事件的危險(xiǎn)的相對(duì)水平。這些類(lèi)別的特征在于所述危險(xiǎn)從類(lèi)別I增加到類(lèi)別II并且進(jìn)一步增加到類(lèi)別III。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解的，個(gè)體將發(fā)生自殺或者自毀行為的危險(xiǎn)的預(yù)測(cè)或者評(píng)估受到大量不確定性的影響。本文所用的危險(xiǎn)類(lèi)別意在反映與基線危險(xiǎn)相比，增加危險(xiǎn)的相對(duì)水平。該基線危險(xiǎn)將是本領(lǐng)域技術(shù)人員基于患者在那時(shí)的精神狀態(tài)、既往史、家族史、患者疾病的性質(zhì)和歷史和自殺的已知的危險(xiǎn)因素，如共同不健康(co-morbid)藥物濫用的存在等等，對(duì)該患者估計(jì)的危險(xiǎn)?；€危險(xiǎn)將組成“類(lèi)別I”危險(xiǎn)評(píng)估。類(lèi)別II危險(xiǎn)組中的患者將預(yù)期在給定時(shí)間內(nèi)具有相對(duì)更大危險(xiǎn)發(fā)生1型事件。該增加的危險(xiǎn)可以是類(lèi)別I患者的危險(xiǎn)的1.5、2.0、3.0或者4.0倍。類(lèi)別III患者將具有最高危險(xiǎn)發(fā)生1型事件，并且該增加的危險(xiǎn)為類(lèi)別I中的患者的3.0、4.0、5.0或者更高倍數(shù)。該增加的危險(xiǎn)將反映在在給定的時(shí)間內(nèi)患者參與自殺或者自毀行為或者經(jīng)歷1型事件的可能性更大。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“自殺企圖”是指?jìng)€(gè)體由于故意的意圖或者作為對(duì)內(nèi)在強(qiáng)迫性沖動(dòng)的反應(yīng)或者混亂的想法而做出的行動(dòng)，該行動(dòng)使他或者她處于死亡的高度危險(xiǎn)中。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“1型事件”定義為重要的自殺企圖或者由于迫切自殺危險(xiǎn)而發(fā)生的住院，包括但不限于，升高水平的監(jiān)護(hù)，或者如自殺監(jiān)護(hù)委員會(huì)(Suicide Monitoring Board)所證實(shí)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“額外自殺/自毀行為預(yù)防措施”指護(hù)理人員或者其他人為了減小個(gè)體損害或者殺死他/她自己的可能性而采取的任何行動(dòng)。這包括，但不限于，下面的任一種或者全部增加觀察頻率、住院或者出院，即增加就診的頻率或者警告家屬或者朋友照顧該個(gè)體，住院可以包括增加觀察頻率，即，5分鐘檢查代替15分鐘檢查，或者對(duì)患者持續(xù)觀察(視線接觸)或者接近持續(xù)觀察(臂長(zhǎng)視線接觸)或者將患者限制在他們的房間中或者觀察室(quite room)或者移走鋒利或者危險(xiǎn)的物品以防止患者接觸或者在極端情況下將患者送入精神病院。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“氯氮平”將指藥物氯氮平(8-氯-11-(4-甲基-1-哌嗪基)-5H-二苯并[be][1，4]二氮雜)并且指其鹽或者酯的任一種，并且將包括但不限于，商品名藥物CLOZARIL或者LEPONEX，NovartisPharmaceutical Corporation，East Hanover，NJ。
該多態(tài)性的檢測(cè)可以用于確定或者預(yù)測(cè)給定患者在治療期間將變得自殺性的可能性。該多態(tài)性可以直接檢測(cè)或者通過(guò)檢測(cè)多態(tài)性變異基因的特征性mRNA或者通過(guò)檢測(cè)體液或者組織中該基因的多肽(蛋白質(zhì))表達(dá)產(chǎn)物的存在來(lái)檢測(cè)。多肽表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)水平可以用于確定該患者對(duì)于所述多態(tài)性是雜合的還是純合的，可以通過(guò)與正常人，即已知沒(méi)有所述多態(tài)性的個(gè)體的對(duì)照組進(jìn)行比較來(lái)確定。
SLC6A3基因表達(dá)產(chǎn)物水平取決于許多因素，包括個(gè)體的目前生理狀況、環(huán)境、藥療法、上游因素和內(nèi)在的遺傳因素，像影響啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、剪接位點(diǎn)和外顯子剪接增強(qiáng)子位點(diǎn)的功能的多態(tài)性。
然而，可能測(cè)量SLC6A3基因表達(dá)產(chǎn)物的水平。用于測(cè)試SLC6A3基因(DAT1)的基因表達(dá)產(chǎn)物的存在和親和性或者濃度的一種公開(kāi)的方法是通過(guò)測(cè)量DATBP。較低的DATBP可能與較高水平的抑郁和自殺性有關(guān)。[11C]RTI-32是PET成像放射性配體，其對(duì)于多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有高度選擇性。見(jiàn)Wilson，DaSilva&Houle(1994)，上文；和Wilson，DaSilva&Houle(1996)，上文；Seeman，Receptor Tables，Vol.2，″Drug DissociationConstants For Neuroreceptors and Transporters″，Schizophrenia Research(Toronto，1993)；Guttman等人，Neurology，48(6)1578-1583(1997)；和Carroll等人，J.Med.Chem.，38(2)379-388(1995)。
該P(yáng)ET成像放射性配體，即[11C]RTI-32 PET可用于檢測(cè)DATBP。見(jiàn)Meyer等人，Neuroreport，12(18)4121-4125(2001)。
在備選實(shí)施方案中，DATBP還可以通過(guò)[123I]-β-CIT SPECT技術(shù)測(cè)定。見(jiàn)Neumeister等人(2001)，上文。
一旦對(duì)每個(gè)基因型組確定了平均值和平均“正常”水平，那么將為每個(gè)基因型組確定SLC6A3基因產(chǎn)物水平的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
這些水平將用作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。將使用PET技術(shù)或者SPECT技術(shù)測(cè)量給定患者中多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平。
不同對(duì)照組中所測(cè)量的SLC6A3基因表達(dá)產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照水平將與給定患者中SLC6A3基因表達(dá)產(chǎn)物的測(cè)量水平比較。該基因表達(dá)產(chǎn)物可以是與該特定基因型組或者該基因型組的多肽基因表達(dá)產(chǎn)物有關(guān)的特征性mRNA?？梢愿鶕?jù)與給定組的對(duì)照水平比較，測(cè)量水平有多么相似，將患者分類(lèi)或者分配到具體基因型組。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在這些決定的做出中存在一定程度的不確定性。因此，對(duì)照組水平的標(biāo)準(zhǔn)差將用于做出概率確定并且本發(fā)明的方法將可以應(yīng)用于多種基于概率的基因型組確定。從而，例如并且不作為限制，在一個(gè)實(shí)施方案中，如果SLC6A3基因表達(dá)產(chǎn)物的測(cè)量水平落入任何對(duì)照組的平均值的2.5倍標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)，那么可以將該個(gè)體分配到該基因型組。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如果SLC6A3基因表達(dá)產(chǎn)物的測(cè)量水平落入任何對(duì)照組的平均值的2.0倍標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)，那么可以將該個(gè)體分配到該基因型組。在再一個(gè)實(shí)施方案中，如果SLC6A3基因表達(dá)產(chǎn)物的測(cè)量水平落入任何對(duì)照組的平均值的1.5倍標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)，那么該個(gè)體可以分配到該基因型組。在再一個(gè)實(shí)施方案中，如果SLC6A3基因表達(dá)產(chǎn)物的測(cè)量水平為任何對(duì)照組的平均值的1.0倍或者更小的標(biāo)準(zhǔn)差，那么該個(gè)體可以分配到該基因型組。
從而，該方法將允許使用不同的概率程度決定特定患者將置于哪一組，并且這種分配到一種基因型組將決定該個(gè)體將被置于的危險(xiǎn)類(lèi)別。
從而，在第一方面，本發(fā)明提供了確定個(gè)體在治療期間將變得自殺性的可能性的方法。這些方法包括 (a)確定SLC6A3基因的基因型或者單元型；和 (b)基于SLC6A3基因中一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性變體的存在或者缺失決定危險(xiǎn)類(lèi)別。
SLC6A3基因位于染色體5p15.3上。
該多態(tài)性的檢測(cè)可以用于確定或者預(yù)測(cè)該個(gè)體在治療期間將經(jīng)歷自殺或者自毀行為的可能性。此外，該多態(tài)性可以直接檢測(cè)或者通過(guò)檢測(cè)與更常見(jiàn)的SLC6A3基因型相比，多態(tài)性變異基因的特征性mRNA，或者通過(guò)檢測(cè)個(gè)體身體組織或者體液中SLC6A3基因的多肽表達(dá)產(chǎn)物的濃度來(lái)檢測(cè)。
用于檢測(cè)和測(cè)量mRNA水平和多肽基因表達(dá)產(chǎn)物水平的方法是本領(lǐng)域公知的并且包括使用核苷酸微陣列和多肽檢測(cè)方法，包括質(zhì)譜儀和/或抗體檢測(cè)和定量技術(shù)。還參見(jiàn)Human Molecular Genetics，第二版.TomStrachan & Andrew Read.(John Wiley and Sons，Inc.Publication，NY，1999)。
此外，體液或者組織中SLC6A3基因的多肽(蛋白質(zhì))表達(dá)產(chǎn)物的濃度的檢測(cè)可以用于確定所述多態(tài)性的存在或者缺失，并且所述多肽表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)水平可以用于決定該多態(tài)性是以純合還是雜合狀態(tài)存在，因此確定該個(gè)體的危險(xiǎn)類(lèi)別。
因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是通過(guò)鑒定SLC6A3基因的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物的存在和濃度，來(lái)確定患者中所述多態(tài)性的存在或者缺失的方法。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了確定個(gè)體在治療期間自殺或者自毀行為的危險(xiǎn)類(lèi)別和開(kāi)發(fā)合適的治療策略的方法。這些方法包括測(cè)量對(duì)應(yīng)于SLC6A3基因的更常見(jiàn)的變體，即位點(diǎn)59的A的mRNA對(duì)比以G代替A這種較不常見(jiàn)的多態(tài)性變體的mRNA的量和比率。在該實(shí)施方案中，用患者的體液或者身體組織的樣品確定兩種mRNA的比率。如果所有mRNA都來(lái)自A變體，那么患者在治療期間將較少可能發(fā)生自殺行為(危險(xiǎn)類(lèi)別1)。如果所有mRNA都來(lái)自G變體，那么患者在治療期間將更可能發(fā)生自殺行為(危險(xiǎn)類(lèi)別III)。然而，如果發(fā)現(xiàn)兩種類(lèi)型的mRNA，那么患者對(duì)于該多態(tài)性是雜合的并且將預(yù)期自殺行為的可能性是中等的(危險(xiǎn)類(lèi)別II)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易認(rèn)識(shí)到，除了本文公開(kāi)的特定多態(tài)性，與所述多態(tài)性連鎖不平衡(LD)的任何多態(tài)性都可以作為替代標(biāo)記，其與它所LD的單核苷酸多態(tài)性(SNP)一樣指出對(duì)相同藥物或者療法的應(yīng)答性。因此，本說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的與SNP LD的任何SNP都可以使用并且意在包括在本發(fā)明的方法中。
為了確定氯氮平是否比相比較的抗精神病藥物在降低自殺性方面更有效，已經(jīng)進(jìn)行了前矚性、隨機(jī)化的平行組研究以評(píng)估在已知處于自殺的高度危險(xiǎn)中的精神分裂癥和分裂情感患者中，用氯氮平治療期間與用奧氮平(ZYPREXIATM)治療相比，自殺性的危險(xiǎn)性。
為了發(fā)現(xiàn)遺傳變異和自殺性或者藥物應(yīng)答之間的潛在關(guān)聯(lián)，進(jìn)行了IV期臨床研究中的藥物遺傳學(xué)研究。該研究著眼于編碼藥物靶標(biāo)、相關(guān)酶或者轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因以及涉及腦功能或者認(rèn)為與精神分裂癥有關(guān)的基因中的多態(tài)性是否與臨床試驗(yàn)過(guò)程中研究的功效的臨床參數(shù)相關(guān)聯(lián)。特別研究了1型事件的發(fā)生和到達(dá)1型事件發(fā)生的時(shí)間。
檢查了與藥物靶標(biāo)有關(guān)或者認(rèn)為與精神分裂癥有關(guān)的基因中的多態(tài)性以鑒定可能與治療應(yīng)答或者臨床試驗(yàn)結(jié)果有關(guān)的遺傳因素。如上述，觀察到多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1基因(SLC6A3或者DAT1)的外顯子9上的多態(tài)性和1型事件之間的高度顯著的關(guān)聯(lián)(p＝0.0001)。
該IV期試驗(yàn)的主要目的是比較用氯氮平(CLOZARIL/LEPONEX)對(duì)比奧氮平(ZYPREXATM)治療的精神分裂癥患者中的自殺危險(xiǎn)，如通過(guò)如下步驟測(cè)量 1)從基線直到第一次顯著的自殺企圖或者由于迫切的自殺危險(xiǎn)而住院并且包括增加的監(jiān)護(hù)水平的時(shí)間；或者 2)從自殺性嚴(yán)重性的臨床總體印象(Clinical Global Impression ofSeverity of Suicidality)中基線的改變。
第二個(gè)目標(biāo)是自殺相關(guān)的 1)以闡明氯氮平治療的患者中與ZYPREXIATM-治療的患者相比，自殺念頭的強(qiáng)度減弱；和 2)以闡明氯氮平治療的患者中與ZYPREXIATM-治療的患者相比，防止自殺所需的救護(hù)干預(yù)的次數(shù)減少。
來(lái)自該臨床試驗(yàn)的四百零二(402)名個(gè)體同意按照地區(qū)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行的藥物遺傳學(xué)研究。在試驗(yàn)地點(diǎn)從患者收集15mL血液。由Covance(Indianapolis，USA)使用PUREGENETM DNA分離試劑盒(PUREGENETM DNA Isolation Kit)(D50K)根據(jù)生產(chǎn)商的推薦提取DNA。見(jiàn) http://www.gentra.com/purification chemistries/puregene protocols.asp？pid＝1。
基因型分型.通過(guò)兩種不同方法鑒定單核苷酸多態(tài)性(SNP)。ThirdWave Technologies，Inc.(Madison，WI，USA)開(kāi)發(fā)了一系列SNP，而其他組從公共數(shù)據(jù)庫(kù)(Public Databases)開(kāi)發(fā)。利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)，如PubMed、OMIM、SNP Consortium，Locus Link、dbSNP和Japanese SNP數(shù)據(jù)庫(kù)。開(kāi)發(fā)了關(guān)于SNP的信息。候選基因是與藥物靶標(biāo)有關(guān)或者認(rèn)為與疾病的病因有關(guān)的基因。
設(shè)計(jì)用于基因型分型的探針組并由Third Wave Technologies，Inc合成。使用INVADER測(cè)定法(Third Wave Technologies，Inc)根據(jù)生產(chǎn)商的推薦在室內(nèi)對(duì)60ng基因組DNA進(jìn)行基因型分型。見(jiàn)Lyamichev等人，Nat.Biotechnol.，17(3)292-296(1999)；和Ryan等人，Mol. Diagn.，4(2)135-144(1999)。
統(tǒng)計(jì)分析.哈迪-溫伯格平衡(HWE)的偏離.該研究中使用來(lái)自共400名患者的數(shù)據(jù)。用精確檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)評(píng)估從HWE的可能的偏離。哈迪-溫伯格定律指出在隨機(jī)交配的大群體中等位基因頻率從世代到另一世代不發(fā)生改變。從HWE的偏離將表明兩種可能性之一 1)基因型分型誤差；或者 2)多態(tài)性和所研究的群體之間的關(guān)聯(lián)。
在第二種情況下，如果特定基因型與疾病病因有關(guān)，那么將比預(yù)期的更頻繁地觀察到特定多態(tài)性。
基因型和臨床表型之間的相關(guān)性.對(duì)于每種分析的SNP，基因型分類(lèi)為說(shuō)明性變量的時(shí)序檢驗(yàn)用于確定在不同基因型類(lèi)別間的臨床結(jié)果是否存在顯著差異。僅僅次要等位基因頻率≥5％的SNP用于分析中。對(duì)于給定SNP，如果在所研究的群體中發(fā)現(xiàn)純合基因型的頻率≤10％，那么將稀少的純合個(gè)體與雜合個(gè)體合并后用于分析。
在顯著結(jié)果存在下，用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型(Cox Proportional Hazardsmodel)估計(jì)基因型類(lèi)別的風(fēng)險(xiǎn)比。Bonferroni校正法(BonferroniCorrection)用于調(diào)節(jié)多重檢驗(yàn)。用統(tǒng)計(jì)程序SAS版本8.2(SAS，Cary，NC)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用GOLDTM軟件包進(jìn)行LD分析。見(jiàn)Abecasis &Cookson，Bioinformatics，16(2)182-183(2000)。Fisher精確檢驗(yàn)用于病例對(duì)照研究。
基因型分型群體的代表性性質(zhì).為了確定基因型分型的群體對(duì)于整個(gè)臨床試驗(yàn)群體的代表性如何，比較了基因型分型的和非基因型分型的群體之間的人口統(tǒng)計(jì)和1型事件的發(fā)生率。
遺傳變異和1型事件之間的關(guān)聯(lián)研究.在表1中給出了治療組間個(gè)體的分布。由于藥物遺傳學(xué)研究的受限制的參加或者缺少基因型結(jié)果，用于每種基因型的樣本的實(shí)際數(shù)目可以更少。 表1 基因型分型的和總體研究組間治療組中患者數(shù)目的分布 22種候選基因中的分開(kāi)的四十三(43)種多態(tài)性初步確定了基因型。在這些多態(tài)性中，23種多態(tài)性顯示出在研究群體中罕見(jiàn)的等位基因頻率≥5％并用于分析。對(duì)于研究的每種多態(tài)性，進(jìn)行了存活分析?；蛐皖?lèi)別作為說(shuō)明性參數(shù)的時(shí)序檢驗(yàn)用于檢查不同基因型類(lèi)別中到達(dá)1型事件的時(shí)間的差異。如上述，發(fā)現(xiàn)了到達(dá)1型事件的時(shí)間和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC6A3基因(也稱(chēng)作DAT1)的外顯子9中的同義多態(tài)性(外顯子9 A59G)之間的顯著關(guān)聯(lián)(p＝0.0001)。對(duì)多重檢驗(yàn)進(jìn)行Bonferroni校正后，所調(diào)整的p值為0.0041。在外顯子9中鑒定的編碼序列變體對(duì)應(yīng)于A→G替代。在該研究中，具有GA和GG基因型的個(gè)體與具有AA基因型的個(gè)體相比有更高的1型事件發(fā)生率。特別地，具有GG基因型的個(gè)體似乎更容易經(jīng)歷1型事件。表2列出了對(duì)于不同基因型組，經(jīng)歷1型事件的個(gè)體數(shù)。
表2 不同基因型組中1型事件頻率的比較 為了定量三個(gè)基因型組之間的差異，用外顯子9 A59G多態(tài)性和治療作為說(shuō)明性變量進(jìn)行Cox比例風(fēng)險(xiǎn)檢驗(yàn)，治療作為分層變量(stratificationvariable)(見(jiàn)表3)。沒(méi)有觀察到顯著的治療-基因型相互作用(p＝0.6044)。
表3 外顯子9 A59G多態(tài)性對(duì)1型事件的影響的存活分析結(jié)果總結(jié) 通過(guò)本發(fā)明方法可以治療的狀況.其中通過(guò)使用本發(fā)明的方法或化合物可以評(píng)估自殺行為或者自毀行為的危險(xiǎn)的病理心理(精神病)狀況的實(shí)例包括，但不限于，見(jiàn)Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，4thEd.(American Psychiatric Association(APA)，Washington，DC，1994)(DSM-IVTM)，其中記載了這些疾病的具體定義和完整臨床描述和診斷標(biāo)準(zhǔn)。
精神分裂性障礙 精神分裂癥，緊張型，亞慢 精神分裂癥，緊張型，慢性性的，(295.21) 的(295.22) 精神分裂癥，緊張型，亞慢 精神分裂癥，緊張型，慢性，性，急性加重(295.23) 急性加重(295.24) 精神分裂癥，緊張型，緩和 精神分裂癥，緊張型，未指(295.55) 定的(295.20) 精神分裂癥，錯(cuò)亂型，亞慢 精神分裂癥，錯(cuò)亂型，慢性性的(295.11) 的(295.12) 精神分裂癥，錯(cuò)亂型，亞慢 精神分裂癥，錯(cuò)亂型，慢性性的，急性加重(295.13) 的，急性加重(295.14) 精神分裂癥，錯(cuò)亂型，緩和 精神分裂癥，錯(cuò)亂型，未指(295.15) 定的(295.10) 精神分裂癥，偏執(zhí)型，亞慢 精神分裂癥，偏執(zhí)型，慢性性的(295.31) 的(295.32) 精神分裂癥，偏執(zhí)型，亞慢 精神分裂癥，偏執(zhí)型，慢性性的，急性加重(295.33) 的，急性加重(295.34) 精神分裂癥，偏執(zhí)型，緩和 精神分裂癥，偏執(zhí)型，未指(295.35) 定的(295.30) 精神分裂癥，未分化型，亞 精神分裂癥，未分化型，慢慢性的(295.91) 性的(295.92) 精神分裂癥，未分化型，亞 精神分裂癥，未分化型，慢慢性的，急性加重(295.93) 性的，急性加重(295.94) 精神分裂癥，未分化型，緩 精神分裂癥，未分化型，未和(295.95) 指定的(295.90) 精神分裂癥，殘留型，亞慢 精神分裂癥，殘留型，慢性性的(295.61) 的(295.62) 精神分裂癥，殘留型，亞慢 精神分裂癥，殘留型，慢性性的，急性加重(295.63) 的，急性加重(295.94) 精神分裂癥，殘留型，緩和 精神分裂癥，殘留型，未指(295.65) 定的(295.60) 妄想性(偏執(zhí)性)障礙 短暫的反應(yīng)性精神病(297.10) (298.80) 精神分裂樣障礙(295.40) 分裂情感性障礙(295.70) 感應(yīng)性精神病(297.30) 精神障礙NOS(非典型精神病)(298.90) 情感障礙 重型抑郁性障礙，嚴(yán)重的精 情緒惡劣(300.4)神病特征(296.33) 抑郁癥NOS(311) 雙相性I精神障礙，單次躁狂性發(fā)作，嚴(yán)重精神病特征 (296.23) 雙相性I精神障礙，最近輕 雙相性I精神障礙，最近狂癥躁狂發(fā)作(296.43) 躁發(fā)作，嚴(yán)重精神病特征(296.43) 雙相性I精神障礙，混合型 雙相性I精神障礙，最近抑最近發(fā)作，嚴(yán)重精神病特征郁性發(fā)作，嚴(yán)重精神病特征 (296.63)(296.53) 雙相性I精神障礙，未指定 雙相性II精神障礙(296.89)的最近發(fā)作(296.89) 循環(huán)情感性障礙(301.13) 雙相性精神障礙NOS(366) 由于一般醫(yī)學(xué)狀況導(dǎo)致的情情感障礙NOS(296.90)感障礙(Mood Disorder Due to General MedicalCondition)(293.83) 行為障礙，孤獨(dú)攻擊性類(lèi)型行為障礙，未分化類(lèi)型(312.00)(312.90) 圖雷特精神障礙(307.23) 慢性運(yùn)動(dòng)或發(fā)聲性抽動(dòng)障礙(307.22) 短時(shí)抽搐性障礙(307.21) 抽動(dòng)障礙NOS(307.20) 應(yīng)用精神活性作用物質(zhì)所致精神障礙 酒精戒斷性譫妄(291.00) 酒精性幻覺(jué)癥(291.30) 與酒精中毒有關(guān)的酒精癡呆苯丙胺或者類(lèi)似作用的擬交(291.20)感神經(jīng)中毒(305.70) 苯丙胺或者類(lèi)似作用的擬交苯丙胺或者類(lèi)似作用的擬交感神經(jīng)譫妄(292.81) 感神經(jīng)妄想性精神障礙(292.11) 大麻性妄想性精神障礙可卡因中毒(305.60)(292.11) 可卡因性譫妄(292.81)可卡因妄想性精神障礙 (292.11) 致幻劑性幻覺(jué)癥(305.30) 致幻劑性妄想性精神障礙 (292.11) 致幻劑引起的心境障礙 致幻劑后-致幻劑知覺(jué)障礙 (292.84) (292.89) 苯環(huán)利定(PCP)或類(lèi)似作用苯環(huán)利定(PCP)或類(lèi)似作用的芳基環(huán)己胺中毒(305.90) 的芳基環(huán)己胺譫妄(292.81) 應(yīng)用精神活性作用物質(zhì)所致精神障礙(續(xù).) 苯環(huán)利定(PCP)或類(lèi)似作用苯環(huán)利定(PCP)或類(lèi)似作用的芳基環(huán)己胺妄想性障礙 的芳基環(huán)己胺心境障礙(292.84)(292.11) 苯環(huán)利定(PCP)或類(lèi)似作用其他的或者未指定的精神活的芳基環(huán)己胺器質(zhì)性精神紊亂 性物質(zhì)中毒(305.90)NOS(292.90) 其他的或者未指定的精神活 其他的或者未指定的精神活性物質(zhì)譫妄(292.81) 性物質(zhì)癡呆(292.82) 其他的或者未指定的精神活 其他的或者未指定的精神活性物質(zhì)妄想性障礙(292.11) 性物質(zhì)幻覺(jué)癥(292.12) 其他的或者未指定的精神活 其他的或者未指定的精神活性物質(zhì)心境障礙(292.84) 性物質(zhì)焦慮障礙(292.89) 其他的或者未指定的精神活 其他的或者未指定的精神活性物質(zhì)人格障礙(292.89) 性物質(zhì)器質(zhì)性精神紊亂NOS (292.90) 器官障礙 譫妄(293.00) 癡呆(294.10) 器質(zhì)性妄想性障礙293.81) 器質(zhì)性幻覺(jué)癥(293.82) 器質(zhì)性心境障礙(293.83) 器質(zhì)性焦慮障礙(294.80) 器質(zhì)性人格障礙(310.10) 器質(zhì)性精神紊亂(294.80)強(qiáng)迫癥(300.30) 創(chuàng)傷后精神緊張性障礙 廣泛性焦慮癥(300.02)(309.89) 焦慮障礙NOS(300.00) 身體變形性精神障礙 (300.70) 病疑或者疑病性神經(jīng)癥 軀體化障礙(300.81)(300.70) 未分化的軀體型疼痛障礙軀體型疼痛障礙NOS (300.70) (300.70) 間歇性暴發(fā)性精神障礙 偷竊狂(312.32)(312.34) 病理性賭博(312.31)縱火狂(312.33) 拔毛發(fā)狂(312.39) 沖動(dòng)控制障礙OS(312.39) 人格障礙 偏執(zhí)狂樣的(301.00)精神分裂樣的(301.20) Schizotypal(301.22) 反社會(huì)的(301.70) 邊緣(301.83) 說(shuō)明書(shū)中術(shù)語(yǔ)“精神病”意在包括所有形式的精神病，如器質(zhì)性精神病、藥物造成的精神病、阿爾茨海默相關(guān)的精神病和與其他精神障礙有關(guān)的精神病或者相關(guān)狀況，如偏執(zhí)狂樣的人格障礙，等等。
術(shù)語(yǔ)“精神分裂癥”和“精神分裂癥樣”疾病包括所有類(lèi)型的此類(lèi)疾病，例如，緊張型、錯(cuò)亂型、偏執(zhí)型、未分化型和殘留型精神分裂癥，和與此類(lèi)疾病有關(guān)的所有狀況，包括其陽(yáng)性和陰性癥狀。
SNP的鑒定和表征.許多不同的技術(shù)可以用于鑒定和表征SNP，包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、通過(guò)變性高效液相層析(DHPLC)進(jìn)行異源雙鏈分析、直接DNA測(cè)序和計(jì)算機(jī)方法。見(jiàn)Shi，Clin.Chem.，47164-172(2001)。由于公共數(shù)據(jù)庫(kù)中序列信息資源，可以用計(jì)算工具通過(guò)與給定基因的獨(dú)立提交的序列(cDNA或者基因組序列)比對(duì)在計(jì)算機(jī)芯片上(in silico)鑒定SNP。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到的SNP和通過(guò)計(jì)算機(jī)芯片上的方法得到的SNP的比較表明SNPFinder(http://Ipgws.nci.nih.gov:82/perl/snp/snp_cgi.pl)發(fā)現(xiàn)的候選SNP的55％也已經(jīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)。見(jiàn)Cox，Boillot & Canzian，Hum.Mutal.，17(2，)141-150(2001)。然而，這些計(jì)算機(jī)芯片上方法只能發(fā)現(xiàn)27％的真實(shí)SNP。
最常見(jiàn)的SNP分型方法當(dāng)前包括雜交、引物延伸和切割方法。這些方法的每一種必須連接到合適的檢測(cè)系統(tǒng)。檢測(cè)技術(shù)包括熒光極化，見(jiàn)Chen，Levine和Kwok，Genome Res.，9(5)492-499(1999)，焦磷酸釋放的發(fā)光檢測(cè)(pyrosequencing)(見(jiàn)Ahmadiian等人，Anal. Biochem.，280(1)103-110(2000))、基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)-的切割測(cè)定法、DHPLC和質(zhì)譜法(見(jiàn)Shi(2001)，上文；和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,300,076 B1)。其他檢測(cè)和表征SNP的方法在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,297,018 B1和6,300,063 B1中公開(kāi)。上面參考文獻(xiàn)的公開(kāi)完整引入本文作為參考。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，多態(tài)性的檢測(cè)可以通過(guò)所稱(chēng)作的INVADERTM技術(shù)(可從Third Wave Technologies Inc.Madison，WI得到)完成。在該測(cè)定法中，特定上游“侵入者”(invader)寡核苷酸和部分重疊的下游探針當(dāng)結(jié)合到互補(bǔ)DNA模板時(shí)一起形成特定結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)被裂解酶(Cleavase)識(shí)別并在特定位點(diǎn)切割，并且這導(dǎo)致釋放探針寡核苷酸的5’瓣。該片段然后作為合成的二次靶標(biāo)和反應(yīng)混合物中含有的二次熒光標(biāo)記的信號(hào)探針的“侵入者”寡核苷酸。這導(dǎo)致裂解酶對(duì)二級(jí)信號(hào)探針的特異切割。當(dāng)用能夠熒光共振能量轉(zhuǎn)移的染料分子標(biāo)記的該二級(jí)探針被切割時(shí)，產(chǎn)生熒光信號(hào)。裂解酶對(duì)相對(duì)于重疊的DNA序列或者瓣形成的結(jié)構(gòu)有嚴(yán)格要求，并且因此可以用于特異檢測(cè)下游DNA鏈的切割位點(diǎn)的立即上游的單個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配。見(jiàn)Ryan等人(1999)，上文；和Lyamichev等人(1999)，上文，也參加美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,846,717和6,001,567，將它們的公開(kāi)完整引入本文作為參考。
在一些實(shí)施方案中，組合物含有兩種或多種不同標(biāo)記的基因型分型寡核苷酸，其用于同時(shí)探測(cè)在兩個(gè)或多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)上的核苷酸的身份。還預(yù)期引物組合物可以含有兩套或多套等位基因特異的引物對(duì)以允許同時(shí)靶定和擴(kuò)增含有多態(tài)性位點(diǎn)的兩個(gè)或多個(gè)區(qū)域。
本發(fā)明的SLC6A3基因型分型寡核苷酸也可以在固體表面，如微芯片、珠子或者載玻片上固定或者合成。見(jiàn)例如，WO 98/20020和WO 98/20019。此類(lèi)固定化的基因型分型寡核苷酸也可以用于多種多態(tài)性檢測(cè)測(cè)定法，包括，但不限于，探針雜交和聚合酶延伸測(cè)定法。本發(fā)明的固定化的SLC6A3基因型分型寡核苷酸可以包含寡核苷酸的有序陣列，其設(shè)計(jì)成同時(shí)快速篩選DNA樣品中多個(gè)基因中的多態(tài)性。
本發(fā)明的等位基因特異的寡核苷酸(ASO)引物具有3’末端核苷酸，或者優(yōu)選3’次末端核苷酸，其與特定SNP的僅一個(gè)核苷酸互補(bǔ)，從而僅當(dāng)存在含有那個(gè)核苷酸的等位基因存在時(shí)作為聚合酶介導(dǎo)的延伸的引物。本發(fā)明預(yù)期與編碼或者非編碼鏈雜交的ASO引物。用于檢測(cè)SLC6A3基因多態(tài)性的ASO引物可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)開(kāi)發(fā)。
本發(fā)明的其他基因型分型寡核苷酸與位于本發(fā)明鑒定的新的多態(tài)性位點(diǎn)之一的下游的一到幾個(gè)寡核苷酸的目標(biāo)區(qū)雜交。此類(lèi)寡核苷酸用于聚合酶介導(dǎo)的引物延伸方法以檢測(cè)本文描述的新的多態(tài)性之一并且因此此類(lèi)基因型分型寡核苷酸在本文中稱(chēng)作“引物延伸寡核苷酸”。在優(yōu)選實(shí)施方案中，引物延伸寡核苷酸的3’末端是與該多態(tài)性位點(diǎn)緊密相鄰的核苷酸互補(bǔ)的脫氧核苷酸。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含包裝在單獨(dú)容器中的至少兩種基因型分型寡核苷酸。該試劑盒還可以含有其他組分，如包裝在單獨(dú)容器中的雜交緩沖液(其中所述寡核苷酸用作探針)。備選地，當(dāng)寡核苷酸將用于擴(kuò)增靶區(qū)域時(shí)，該試劑盒可以含有包裝在單獨(dú)容器中的聚合酶和反應(yīng)緩沖液，其優(yōu)化用于聚合酶介導(dǎo)的引物延伸，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。
上述寡核苷酸組合物和試劑盒可用于對(duì)個(gè)體中SLC6A3基因進(jìn)行基因型分型和/或單元型分析的方法中。本文所用的術(shù)語(yǔ)“SLC6A3基因型”和“SLC6A3單元型”分別指含有核苷酸對(duì)或者核苷酸的基因型或者單元型，其存在于至少一個(gè)或多個(gè)本文描述的新的多態(tài)性位點(diǎn)中并且可以任選還包括存在于SLC6A3基因中的一個(gè)或多個(gè)額外多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸對(duì)或者核苷酸。所述額外的多態(tài)性位點(diǎn)可以是當(dāng)前已知的多態(tài)性位點(diǎn)或者隨后發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及從個(gè)體分離包含個(gè)體中存在的SLC6A3基因的兩種拷貝或者其片段的核酸混合物，并確定兩種拷貝中一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)上核苷酸對(duì)的身份以將SLC6A3基因型分配給該個(gè)體。如技術(shù)人員容易理解的，個(gè)體中一種基因的兩個(gè)“拷貝”可以是相同等位基因或者可以是不同等位基因。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因型分型方法包括確定每個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)上核苷酸對(duì)的身份。
通常，從個(gè)體的生物樣品，如血液樣品或者組織樣品分離核酸混合物或者蛋白質(zhì)。適宜的組織樣品包括全血、精液、唾液、淚液、尿、糞便物質(zhì)、汗、口腔粘膜涂片、皮膚和特定組織器官如肌肉或者神經(jīng)組織的活組織檢查，和毛發(fā)。核酸混合物可以包含基因組DNA、mRNA或者cDNA，并且在后兩種情況中，生物樣品必須從表達(dá)SLC6A3基因的器官得到。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，mRNA或者cDNA制備物將不用于檢測(cè)位于內(nèi)含子或者5’和3’非轉(zhuǎn)錄區(qū)中的多態(tài)性。如果分離了SLC6A3基因片段，那么其必須含有將進(jìn)行基因型分型的多態(tài)性位點(diǎn)。
單元型分析方法的一個(gè)實(shí)施方案包括從個(gè)體分離包含個(gè)體中存在的SLC6A3基因的兩種拷貝的僅一個(gè)或者其片段的核酸分子，并確定該拷貝中一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)上核苷酸的身份以將SLC6A3單元型分配給該個(gè)體。使用能夠分離SLC6A3基因的兩種拷貝或者其片段的任意方法可以分離核酸，所述方法包括但不限于，上面關(guān)于制備SLC6A3同源基因(isogene)描述的方法之一，定向體內(nèi)克隆為優(yōu)選方法。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解的，任何個(gè)體克隆將僅僅提供個(gè)體中存在的兩個(gè)SLC6A3基因拷貝之一的單元型信息。如果希望為該個(gè)體的其他拷貝提供單元型信息，將需要檢查額外的SLC6A3克隆。通常，將檢查至少5個(gè)克隆使得對(duì)個(gè)體中SLC6A3基因的兩種拷貝都進(jìn)行單元型分析的概率為90％以上。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，鑒定每個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)上的核苷酸。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)鑒定個(gè)體中存在的SLC6A3基因的每個(gè)拷貝中一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)上核苷酸的定相序列(phased sequence)，確定個(gè)體的SLC6A3單元型對(duì)。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，單元型分析方法包括鑒定SLC6A3基因的每種拷貝中每個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)上核苷酸的定相序列。當(dāng)分析該基因的兩種拷貝的單元型時(shí)，優(yōu)選用置于分開(kāi)的容器中的每個(gè)基因拷貝進(jìn)行鑒定步驟。然而，還設(shè)想如果將兩種拷貝分別用不同的標(biāo)簽標(biāo)記，或者可以分別區(qū)分或者是可鑒定的，那么在一些情況中可以在相同容器中進(jìn)行該方法。例如，如果基因的第一種和第二種拷貝用不同的第一種和第二種熒光染料標(biāo)記，并且用第三種不同的熒光染料標(biāo)記的ASO用于測(cè)定多態(tài)性位點(diǎn)，那么檢測(cè)第一種和第三種染料的組合將鑒定第一種基因拷貝中的多態(tài)性，而檢測(cè)第二種和第三種染料的組合將鑒定第二種基因拷貝中的多態(tài)性。
在兩種情況中，通過(guò)直接從SLC6A3基因的一個(gè)或兩種拷貝或者其片段擴(kuò)增含有多態(tài)性位點(diǎn)的靶區(qū)域，并通過(guò)常規(guī)方法測(cè)定擴(kuò)增區(qū)的序列，可以確定多態(tài)性位點(diǎn)上的一個(gè)核苷酸(或者核苷酸對(duì))的身份。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解，在一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)為純合的個(gè)體中，將在該多態(tài)性位點(diǎn)上檢測(cè)到僅一種核苷酸，而如果該個(gè)體對(duì)于該位點(diǎn)是雜合的，那么將檢測(cè)到兩種不同的核苷酸。多態(tài)性可以以直接鑒定，稱(chēng)作肯定型鑒定，或者通過(guò)推斷鑒定，稱(chēng)作否定型鑒定。例如，當(dāng)已知參照群體中SNP為鳥(niǎo)嘌呤或者胞嘧啶時(shí)，對(duì)于在所述位點(diǎn)為純合的個(gè)體，可以肯定地確定該位點(diǎn)為鳥(niǎo)嘌呤或者胞嘧啶，如果該個(gè)體在該位點(diǎn)為雜合的，那么可以確定為鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶。備選地，可以否定地確定該位點(diǎn)不是鳥(niǎo)嘌呤(從而為胞嘧啶/胞嘧啶)或者不是胞嘧啶(從而為鳥(niǎo)嘌呤/鳥(niǎo)嘌呤)。
此外，本文描述的新的多態(tài)性位點(diǎn)的任一個(gè)中存在的等位基因的身份可以間接確定，通過(guò)對(duì)與目的多態(tài)性位點(diǎn)連鎖不平衡的本文中未公開(kāi)的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因型分型，可以進(jìn)行所述間接確定。如果在一個(gè)位點(diǎn)上特定變體的存在增強(qiáng)了在第二個(gè)位點(diǎn)上另一變體的預(yù)測(cè)性，那么可以說(shuō)這兩個(gè)位點(diǎn)連鎖不平衡(LD)。見(jiàn)Stevens，Mol. Diag.，4309-317(1999)。與當(dāng)前公開(kāi)的多態(tài)性位點(diǎn)連鎖不平衡的多態(tài)性位點(diǎn)可以位于該基因的區(qū)域內(nèi)或者本文中未檢查的其他基因組區(qū)域內(nèi)。對(duì)與本文描述的新的多態(tài)性位點(diǎn)LD的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因型分型可以通過(guò)但不限于，上述關(guān)于檢測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)上等位基因的身份的方法的任一種來(lái)進(jìn)行。
可以使用任一種寡核苷酸定向擴(kuò)增方法擴(kuò)增靶區(qū)域，所述方法包括，但不限于，PCR(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,965,188)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)(見(jiàn)Barany等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，88(1)189-193(1991)；和WO90/01069)和寡核苷酸連接測(cè)定法(OLA)(見(jiàn)Landegren等人，Science，2411077-1080(1988))?？捎米鞔祟?lèi)方法中的引物或者探針的寡核苷酸將與含有多態(tài)性位點(diǎn)或者與該多態(tài)性位點(diǎn)相鄰的核酸的區(qū)域特異雜交。通常，所述寡核苷酸長(zhǎng)為10-35個(gè)核苷酸，優(yōu)選地，長(zhǎng)為15-30個(gè)核苷酸。最優(yōu)選地，寡核苷酸長(zhǎng)為20-25個(gè)核苷酸。寡核苷酸的精確長(zhǎng)度將取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)考慮和實(shí)踐的許多因素。
其他已知的核酸擴(kuò)增步驟可以用于擴(kuò)增靶區(qū)域，包括基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,130,238；EP 329,822；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,169,766和PCT專(zhuān)利申請(qǐng)WO 89/06700)和等溫方法。見(jiàn)Walker等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA，89(1)392-396(1992)。
還可以在使用本領(lǐng)域中已知的幾種基于雜交的方法之一在擴(kuò)增之前或者之后測(cè)定目標(biāo)區(qū)域中的多態(tài)性。通常，ASO用于進(jìn)行此類(lèi)方法。ASO可以用作不同標(biāo)記的探針對(duì)，該探針對(duì)的一個(gè)成員顯示出與靶標(biāo)序列的一個(gè)變體完全匹配，另一個(gè)成員顯示出與不同變體的完全匹配。在一些實(shí)施方案中，可以使用一套ASO或者寡核苷酸對(duì)一次檢測(cè)一個(gè)以上的多態(tài)性位點(diǎn)。優(yōu)選地，該套的成員當(dāng)與所檢測(cè)的每個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)雜交時(shí)，相互具有5℃以內(nèi)，更優(yōu)選2℃以內(nèi)的解鏈溫度。
ASO與靶多核苷酸的雜交可以在兩種實(shí)體都在溶液中的情況下進(jìn)行，或者這種雜交可以在當(dāng)所述寡核苷酸或者靶多核苷酸共價(jià)或者非共價(jià)固定到固相支持體時(shí)進(jìn)行。附著可以例如，通過(guò)抗體-抗原相互作用、聚-L-Lys、鏈霉抗生物素蛋白或者親和素-生物素、鹽橋、疏水相互作用、化學(xué)鍵、UV交聯(lián)烘烤等介導(dǎo)。ASO可以直接在固相支持體上合成或者合成后隨后附著到固相支持體。適于用于本發(fā)明檢測(cè)方法的固相支持體包括由硅、玻璃、塑料、紙等等制造的基質(zhì)，其可以形成例如孔(例如，96孔板)、載玻片、片、膜、纖維、芯片、皿和珠。固相支持體可以經(jīng)處理、包被或者衍生以促進(jìn)ASO或者靶核酸的固定化。
通過(guò)含有SLC6A3基因的一種或者兩種拷貝的核酸樣品與核酸陣列和子陣列(如WO 95/11995中描述)雜交，也可以確定個(gè)體的SLC6A3基因的基因型或者單元型。所述陣列將含有一組ASO，它們代表將包括在基因型或者單元型中的每個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。
使用錯(cuò)配檢測(cè)技術(shù)也可以確定多態(tài)性的身份，所述技術(shù)包括，但不限于，RNA酶保護(hù)方法，其使用RNA探針(riboprobes)(見(jiàn)Winter等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，827575(1985)；和Meyers等人，Science，2301242(1985))；和識(shí)別核苷酸錯(cuò)配的蛋白質(zhì)，如大腸桿菌(E. coli)mutS蛋白質(zhì)。見(jiàn)Modrich，Ann.Rev.Genet.，25229-253(1991)。備選地，通過(guò)單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析(見(jiàn)Orita等人，Genomics，5874-879(1989)；Humphries等人，Molecular Diagnosis of Genetic Diseases，Elles，Ed.，pp.321-340(1996))或者變性梯度凝膠電泳(DGGE)可以鑒定變體等位基因。見(jiàn)Wartell，Hosseini & Moran Jr.，Nucl. Acids Res.，18(9)2699-2706(1990)；和Sheffield等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，86232-236(1989)。
聚合酶介導(dǎo)的引物延伸方法也可以用于鑒定多態(tài)性。一些此類(lèi)方法已經(jīng)在專(zhuān)利和科學(xué)文獻(xiàn)中描述并且包括“遺傳位分析”(″Genetic Bit Analysis″)方法(見(jiàn)WO 92/15712)和連接酶-/聚合酶介導(dǎo)的遺傳位分析(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,679,524)。相關(guān)方法公開(kāi)于WO 91/02087、WO 90/09455、WO 95/17676、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,302,509和5,945,283。含有多態(tài)性的延伸的引物可以通過(guò)如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,605,798中描述的質(zhì)譜法檢測(cè)。另一種引物延伸方法是等位基因特異的PCR。見(jiàn)Ruano & Kidd，Nucl. Acids Res.，178392(1989)；Ruano等人，Nucl. Acids Res.，19(24)6877-6882(1991)；PCT專(zhuān)利申請(qǐng)WO 93/22456；和Turki等人，J.Clin.Invest.，951635-1641(1995)。此外，通過(guò)使用如Wallace等人，PCT專(zhuān)利申請(qǐng)WO 89/10414中描述的等位基因特異的引物組同時(shí)擴(kuò)增核酸的多個(gè)區(qū)域，可以研究多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，檢查每個(gè)人種地理組的單元型頻率數(shù)據(jù)以確定其是否與HWE一致。HWE(見(jiàn)Hartl等人，Principles of PopulationGenomics，第三版(Sinauer Associates，Sunderland，MA，1997))公設(shè)，發(fā)現(xiàn)單元型對(duì)H1/H2的頻率為PH-W(H1/H2)，如果H1≠H2，那么PH-W(H1/H2)＝2p(H1)p(H2)，如果H1＝H2，那么PH-W(H1/H2)＝p(H1)p(H2)。觀察的和預(yù)測(cè)的單元型頻率之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異可以是由于一種或多種因素，包括群體組中大量的近交、對(duì)基因的強(qiáng)烈的選擇壓力、抽樣偏差和/或基因型分型方法中的誤差。如果在人種地理組中觀察到從HWE的很大偏離，那么可以增加該組中的個(gè)體數(shù)以觀察該偏差是否由于抽樣偏差。如果更大的樣本量不減小觀察的和預(yù)期的單元型對(duì)頻率之間的差異，那么可以希望考慮使用單元型分析方法對(duì)個(gè)體進(jìn)行單元型分析，所述方法如CLASPERSystemTM技術(shù)(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,866,404)，或者等位基因特異的遠(yuǎn)程PCR。見(jiàn)Michalotos-Beloin等人，Nucl. Acids Res.24(23)4841-4843(1996)。
在用于預(yù)測(cè)SLC6A3單元型對(duì)的該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，分配步驟包括進(jìn)行下面的分析。首先，將每種可能的單元型對(duì)與參照群體中的單元型對(duì)比較。通常，參照群體中僅一個(gè)單元型對(duì)匹配一種可能的單元型對(duì)并且將該對(duì)分配給該個(gè)體。偶然地，參照單元型對(duì)中表示的僅一種單元型與個(gè)體的可能的單元型一致，并且在此類(lèi)情況中，將該個(gè)體分配一種單元型對(duì)，其含有已知的單元型和通過(guò)從可能的單元型對(duì)扣除該已知的單元型得到的新的單元型。在罕見(jiàn)情況中，或者參照群體中沒(méi)有單元型與可能的單元型對(duì)一致，或者備選地，多個(gè)參照單元型對(duì)與可能的單元型對(duì)一致。在此類(lèi)情況中，優(yōu)選使用直接分子單元型分析方法分析個(gè)體的單元型，所述方法為例如CLASPER SystemTM技術(shù)(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,866,404)、SMD或者等位基因特異的遠(yuǎn)程PCR。見(jiàn)Michalotos-Beloin等人(1996)，上文。
本發(fā)明還提供了確定群體中SLC6A3基因型或者SLC6A3單元型的頻率的方法。該方法包括確定群體的每個(gè)成員中存在的SLC6A3基因的基因型或者單元型對(duì)，其中該基因型或者單元型包含在SLC6A3基因的一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)上檢測(cè)到的核苷酸對(duì)或者核苷酸，包括，但不限于，F(xiàn)S63TER多態(tài)性；并計(jì)算在該群體中發(fā)現(xiàn)任何特定基因型或者單元型的頻率。群體可以是參照群體、家庭群體、同性群體、群體組、性狀群體，例如，顯示出目的性狀，如醫(yī)學(xué)狀況或者對(duì)治療性治療應(yīng)答的個(gè)體的組。
在本發(fā)明的另一方面，在參照群體中發(fā)現(xiàn)的SLC6A3基因型和/或單元型的頻率數(shù)據(jù)用于鑒定性狀和SLC6A3基因型或者SLC6A3單元型之間的關(guān)聯(lián)的方法中。該性狀可以是任意可檢測(cè)的表型，包括但不限于，對(duì)疾病的易感性或者對(duì)治療的應(yīng)答。該方法包括得到參照群體中以及顯示出該性狀的群體中關(guān)于目的基因型或者單元型的頻率的數(shù)據(jù)。一個(gè)或兩個(gè)參照和性狀群體的頻率數(shù)據(jù)可以通過(guò)使用上述方法之一通過(guò)群體中每個(gè)個(gè)體的基因型分型或者單元型分析得到。性狀群體的單元型可以直接確定，或者備選地，通過(guò)如上述的預(yù)測(cè)性基因型到單元型方法確定。
在另一實(shí)施方案中，通過(guò)評(píng)估以前確定的頻率數(shù)據(jù)得到參照和/或性狀群體的頻率數(shù)據(jù)，所述頻率數(shù)據(jù)可以是書(shū)面或者電子形式。例如，頻率數(shù)據(jù)可以存在于通過(guò)計(jì)算機(jī)可以訪問(wèn)的數(shù)據(jù)庫(kù)中。一旦得到了頻率數(shù)據(jù)，就可以比較參照和性狀群體中目的基因型或者單元型的頻率。在優(yōu)選實(shí)施方案中，比較群體中觀察到的所有基因型和/或單元型的頻率。如果SLC6A3基因的特定基因型或者單元型在性狀群體中比在參照群體中更頻繁具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，那么預(yù)測(cè)該性狀與該SLC6A3基因型或者單元型關(guān)聯(lián)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)與Bonferoni校正法和/或引導(dǎo)(bootstrapping)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，引導(dǎo)方法多次模擬基因型表型相關(guān)性并計(jì)算顯著性值。當(dāng)分析許多多態(tài)性時(shí)，可以進(jìn)行對(duì)因子的校正以校正可能偶然發(fā)現(xiàn)的顯著關(guān)聯(lián)。關(guān)于用于本發(fā)明方法的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。見(jiàn)Statistical Methods in Biology，Third Edition，Bailey，ed.，CambridgeUniv.Press(1997)；Introduction to Computational Biology，Waterman，ed.，CRC Press(2000)；和Bioinformatics，Baxevanis和Ouellette，eds.，JohnWiley & Sons，Inc.(2001)。
在該方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，目的性狀是患者對(duì)某種治療性治療的臨床反應(yīng)，例如，對(duì)靶定SLC6A3的藥物的反應(yīng)，或者對(duì)醫(yī)學(xué)狀況的治療性治療的反應(yīng)。
如本文所用的術(shù)語(yǔ)“連鎖不平衡”(LD)指一種情形，其中遺傳標(biāo)記的一些組合一起在群體中發(fā)生的頻率比基于它們?cè)诨蚪M中的距離或者僅由于偶然所預(yù)測(cè)的頻率更高或者更低。這可以由于基因組的該區(qū)域中減少的重組或者由于建立者效應(yīng)引起，其中由于一個(gè)標(biāo)記引入該群體，沒(méi)有足夠時(shí)間達(dá)到平衡。
當(dāng)標(biāo)記發(fā)生的比它們應(yīng)該發(fā)生的更頻繁時(shí)，這也可以意味著這些標(biāo)記在基因組上一起接近并且因此傾向于協(xié)同遺傳。在任一種情況下，一種標(biāo)記的存在使得另一種標(biāo)記也存在于特定患者中更可能。在該情況下，患者基因組中這些標(biāo)記之一的存在可以用作其他標(biāo)記的替代標(biāo)記。如果一種標(biāo)記可以比另一種標(biāo)記更容易地檢測(cè)，那么希望檢測(cè)更容易檢測(cè)的標(biāo)記而不是特定目的標(biāo)記。連鎖不平衡的標(biāo)記可以相互有或者沒(méi)有任何功能關(guān)系。幾種標(biāo)記一起遺傳的傾向可以通過(guò)基因座之間的重組百分率來(lái)測(cè)量。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“替代標(biāo)記”指遺傳標(biāo)記如SNP或者特定基因型或者單元型，其傾向于與目的SLC6A3遺傳標(biāo)記一起發(fā)生的頻率比由于偶然預(yù)期的頻率更高。因此，該替代標(biāo)記的檢測(cè)可以用于本發(fā)明的方法中作為目的標(biāo)記也比由于偶然所預(yù)期的更可能存在的指示。如果該關(guān)聯(lián)足夠顯著，那么替代標(biāo)記的檢測(cè)可以用于指出目的標(biāo)記的存在。任一種本發(fā)明的方法也可以利用已經(jīng)表明與目的SLC6A3基因型或者單元型關(guān)聯(lián)發(fā)生的替代標(biāo)記。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，與目的SLC6A3基因型或者單元型LD的可檢測(cè)的基因型或者單元型可以用作替代標(biāo)記。通過(guò)確定SLC6A3基因的特定基因型或者單元型是否在也表明潛在替代標(biāo)記基因型的群體中比在參照群體中以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著率或者量更高的頻率存在，可以發(fā)現(xiàn)與SLC6A3基因型LD的基因型。在這種情況中，預(yù)測(cè)該標(biāo)記基因型與SLC6A3基因型或者單元型關(guān)聯(lián)并且然后所述標(biāo)記基因型可以用作SLC6A3基因型的替代標(biāo)記。在本發(fā)明的多種實(shí)施方案中，如果替代標(biāo)記與目的標(biāo)記一起發(fā)生的可能性高于50％，優(yōu)選高于60％，更優(yōu)選高于70％，甚至更優(yōu)選高于80％，或者在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，高于90％，或者在更優(yōu)選的實(shí)施方案中高于95％，那么所述替代標(biāo)記可以以這種方式使用。
本文所用的“醫(yī)學(xué)狀況”包括但不限于，表現(xiàn)為需要治療的一種或多種生理和/或心理癥狀的任何狀況或者疾病，并且包括以前和新近鑒定的疾病和其他病癥。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“多態(tài)性”將指在群體中以＞1％的頻率存在的任何序列變體。該序列變體也可以以顯著大于1％，如5％或者10％或者以上的頻率存在。而且，該術(shù)語(yǔ)也可以指在個(gè)體中多態(tài)性位點(diǎn)觀察到的序列變異。多態(tài)性包括核苷酸替代、插入、缺失和微衛(wèi)星，并且可以但不是必須導(dǎo)致基因表達(dá)或者蛋白質(zhì)功能的可檢測(cè)的差異。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“臨床應(yīng)答”指下面的任意一種或者全部應(yīng)答、無(wú)應(yīng)答和不利應(yīng)答，即副作用的定量測(cè)量。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“等位基因”將指在特定染色體座位(基因座)上的特定形式的基因或者DNA序列。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“基因型”將指在個(gè)體中一對(duì)同源染色體上基因座中的一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)的核苷酸對(duì)的未定相的5’到3’序列。本文所用的基因型包括完整基因型和/或亞基因型。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”將指任何RNA或者DNA，其可以是未修飾的或者修飾的RNA或者DNA。多核苷酸包括，但不限于，單鏈和雙鏈的DNA、單鏈和雙鏈區(qū)混合的DNA、單鏈和雙鏈RNA，和單鏈和雙鏈區(qū)混合的RNA、包含DNA和RNA的雜合分子，其可以是單鏈的，或者通常地，是雙鏈的或者單鏈和雙鏈區(qū)的混合物。此外，多核苷酸指包含RNA或者DNA或者RNA和DNA的三鏈區(qū)。術(shù)語(yǔ)多核苷酸還包括含有一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的堿基的DNA或者RNA和為了穩(wěn)定性或者其他原因而具有經(jīng)修飾的主鏈的DNA或者RNA。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“單核苷酸多態(tài)性(SNP)”將表示在群體內(nèi)基因組中單個(gè)核苷酸位置上核苷酸變異的發(fā)生。SNP可以發(fā)生在一個(gè)基因內(nèi)或者基因組的基因間區(qū)域內(nèi)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“基因”將表示DNA片段，其含有RNA產(chǎn)物的受調(diào)節(jié)的生物合成的所有信息，包括啟動(dòng)子、外顯子、內(nèi)含子，和其他控制表達(dá)的非翻譯區(qū)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“多肽”將表示包含通過(guò)肽鍵或者經(jīng)修飾的肽鍵相互連接的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的任意多肽，即肽等構(gòu)物(isostere)。多肽指短鏈，通常稱(chēng)作肽、糖肽或者寡聚體，還指更長(zhǎng)的鏈，通常稱(chēng)作蛋白質(zhì)。多肽可以含有不同于20種基因編碼的氨基酸的氨基酸。多肽包括通過(guò)天然過(guò)程，如翻譯后加工，或者通過(guò)本領(lǐng)域公知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾的氨基酸序列。此類(lèi)修飾在基本教科書(shū)中和更詳細(xì)的專(zhuān)著，以及在大部頭研究文獻(xiàn)中詳細(xì)描述。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“多態(tài)性位點(diǎn)”將指基因座內(nèi)的一個(gè)位置，在群體中發(fā)現(xiàn)該位置上的至少兩個(gè)備選序列，其中最頻繁發(fā)生的序列具有不超過(guò)99％的頻率。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“核苷酸對(duì)”將指在來(lái)自個(gè)體的染色體的兩種拷貝上的一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)的核苷酸。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“定相的”(phased)當(dāng)應(yīng)用于基因座中兩個(gè)或多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸對(duì)序列時(shí)，指在該基因座的單個(gè)拷貝上那些多態(tài)性位點(diǎn)中存在的核苷酸組合是已知的。
為了推導(dǎo)對(duì)治療的臨床應(yīng)答和SLC6A3基因型或者單元型之間的相關(guān)性，必須得到關(guān)于接受治療的個(gè)體群體(下文稱(chēng)作“臨床群體”)顯示的臨床應(yīng)答的數(shù)據(jù)。該臨床數(shù)據(jù)可以通過(guò)分析已經(jīng)進(jìn)行的臨床試驗(yàn)的結(jié)果得到和/或者通過(guò)設(shè)計(jì)并實(shí)施一個(gè)或多個(gè)新的臨床試驗(yàn)得到臨床數(shù)據(jù)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“臨床試驗(yàn)”指設(shè)計(jì)用來(lái)收集關(guān)于對(duì)特定治療的應(yīng)答的臨床數(shù)據(jù)的任何研究，并且包括，但不限于，I、II和III期臨床試驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)方法用于定義患者群體和招收受試者。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“基因座”將指染色體或者DNA分子上對(duì)應(yīng)于一個(gè)基因或者生理或者表型特征的位置。
優(yōu)選包括在臨床群體中的個(gè)體已經(jīng)對(duì)目的醫(yī)學(xué)狀況的存在進(jìn)行分級(jí)。當(dāng)患者呈現(xiàn)的癥狀可以由一種以上的潛在狀況引起，并且當(dāng)潛在狀況的治療不相同時(shí)，分級(jí)是重要的。一種情況的實(shí)例是患者由于哮喘或者呼吸道感染而經(jīng)歷呼吸困難。如果兩組都用哮喘藥療法治療，將存在表面上非應(yīng)答者的虛假組，這些非應(yīng)答者實(shí)際上沒(méi)有哮喘。這些人將影響檢測(cè)單元型和治療結(jié)果之間的相關(guān)性的能力。該潛在患者的分級(jí)可以使用標(biāo)準(zhǔn)的體檢或者一種或多種實(shí)驗(yàn)室測(cè)試。備選地，對(duì)于單元型對(duì)與疾病易感性或者嚴(yán)重性之間存在強(qiáng)烈相關(guān)性時(shí)，患者的分級(jí)可以使用單元型分析。
將目的治療性治療施用于試驗(yàn)群體中的每個(gè)個(gè)體并使用一種或多種預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量個(gè)體對(duì)治療的應(yīng)答。預(yù)期在許多情況中，試驗(yàn)群體將顯示出一系列應(yīng)答并且研究人員將選擇由多種應(yīng)答組成的應(yīng)答者組的數(shù)目，例如，低、中和高。此外，對(duì)試驗(yàn)群體中的每個(gè)個(gè)體的SLC6A3基因進(jìn)行基因型分型和/或單元型分析，其可以在施用所述治療之前或者之后進(jìn)行。
已經(jīng)得到了臨床和多態(tài)性數(shù)據(jù)之后，產(chǎn)生個(gè)體應(yīng)答和SLC6A3基因型或者單元型含量之間的相關(guān)性。可以以幾種方法產(chǎn)生相關(guān)性。在一個(gè)方法中，將個(gè)體通過(guò)他們的SLC6A3基因型或者單元型(或者單元型對(duì))分組(也稱(chēng)作多態(tài)性組)，并計(jì)算每個(gè)多態(tài)性組的成員顯示的臨床應(yīng)答的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
然后分析這些結(jié)果以確定在多態(tài)性組之間臨床應(yīng)答中任何觀察到的變化都是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的?？梢允褂玫慕y(tǒng)計(jì)分析方法描述于Fisher & vanBelle，BiostatisticsA Methodology for the Health Sciences(Wiley-lnterscience，NY，1993)。該分析還可以包括對(duì)SLC6A3基因中的哪些多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)表型差異有最重要的貢獻(xiàn)進(jìn)行回歸計(jì)算。
用于發(fā)現(xiàn)SLC6A3基因型含量和臨床應(yīng)答之間的相關(guān)性的第二種方法使用預(yù)測(cè)模型，其基于誤差最小化優(yōu)化算法。許多可能的優(yōu)化算法之一是遺傳算法。見(jiàn)Judson，″Genetic Algorithms and Their Uses in Chemistry″，Reviews in Computational Chemistry，Lipkowitz & Boyd，Eds.，Vol.10，pp.1-73(VCH Publishers，NY，1997)。也可以使用模擬退火(見(jiàn)Press等人，Numerical Recipes in CThe Art of Scientific Computing，Ch.10(Cambridge University Press，Cambridge，1992)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)Rich和Knight，Artificial Intelligence，Second Edition.，Ch.18(McGraw-Hill，NewYork，1991))、標(biāo)準(zhǔn)梯度下降法(見(jiàn)Press等人(1992)，上文)或者其他全局或者局部?jī)?yōu)化方法(見(jiàn)Judson(1997)，上文中的討論)。優(yōu)選地，使用如2000年6月26日申請(qǐng)的標(biāo)題為″Methods for Obtaining and UsingHaplotype Data″的PCT申請(qǐng)中描述的遺傳算法方法發(fā)現(xiàn)了相關(guān)性。
還可以使用ANOVA技術(shù)分析相關(guān)性以確定通過(guò)SLC6A3基因中多態(tài)性位點(diǎn)的不同子集解釋了臨床數(shù)據(jù)中的多少變化。如2000年6月26日申請(qǐng)的標(biāo)題為″Methods for Obtaining and Using Haplotype Data″的PCT申請(qǐng)中描述的，用ANOVA檢驗(yàn)如下假設(shè)應(yīng)答變量是否由可以測(cè)量的一個(gè)或多個(gè)性狀或者變量導(dǎo)致或者與所述一個(gè)或多個(gè)性狀或者變量相關(guān)。見(jiàn)Fisher & vanBelle(1993)，上文。
技術(shù)人員從上述分析可以容易地建立數(shù)學(xué)模型，其預(yù)測(cè)作為SLC6A3基因型或者單元型含量的函數(shù)的臨床應(yīng)答。優(yōu)選地，在設(shè)計(jì)用于檢驗(yàn)該模型的一個(gè)或多個(gè)接下來(lái)的臨床試驗(yàn)中驗(yàn)證該模型。
臨床應(yīng)答和SLC6A3基因的基因型或者單元型(或者單元型對(duì))之間關(guān)聯(lián)的鑒定可以是設(shè)計(jì)診斷方法的基礎(chǔ)，該診斷方法用于確定將應(yīng)答或者不應(yīng)答治療，或者備選地，將以較低水平應(yīng)答從而可能需要更多治療，即，更大劑量的藥物的個(gè)體。診斷方法可以采取幾種形式之一，例如直接DNA測(cè)試，即對(duì)SLC6A3基因中一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因型分型或者單元型分析；血清學(xué)試驗(yàn)；或者體檢測(cè)量。唯一需要是診斷試驗(yàn)結(jié)果和根本的SLC6A3基因型或者單元型之間的良好相關(guān)性，SLC6A3基因型或者單元型又與臨床應(yīng)答相關(guān)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該診斷方法使用上述預(yù)測(cè)性單元型分析方法。
計(jì)算機(jī)可以實(shí)現(xiàn)設(shè)計(jì)實(shí)踐本發(fā)明方法的任意或者所有分析操作和數(shù)學(xué)操作。此外，計(jì)算機(jī)可以執(zhí)行一種程序，該程序產(chǎn)生顯示在顯示裝置上的視圖(或者屏幕)，并且使用該顯示裝置，用戶可以觀察并分析有關(guān)SLC6A3基因和其基因組變異的大量信息，包括染色體定位、基因結(jié)構(gòu)和基因家族、基因表達(dá)數(shù)據(jù)、多態(tài)性數(shù)據(jù)、遺傳序列數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)、群體數(shù)據(jù)，例如，關(guān)于人種地理起源的數(shù)據(jù)、臨床應(yīng)答、一個(gè)或多個(gè)群體的基因型和單元型。本文描述的SLC6A3多態(tài)性數(shù)據(jù)可以作為關(guān)系數(shù)據(jù)庫(kù)的部分存儲(chǔ)，例如，作為Oracle數(shù)據(jù)庫(kù)的實(shí)例或者一組ASCII平面文件存儲(chǔ)。這些多態(tài)性數(shù)據(jù)可以存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)的硬驅(qū)上或者可以例如，存儲(chǔ)在CD-ROM或者計(jì)算機(jī)可以存取的一個(gè)或多個(gè)其他存儲(chǔ)裝置上。例如，數(shù)據(jù)可以存儲(chǔ)在一個(gè)或多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中，其通過(guò)網(wǎng)絡(luò)與計(jì)算機(jī)通訊。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于對(duì)個(gè)體中SLC6A3基因進(jìn)行單元型分析和/或基因型分型的方法、組合物和試劑盒。組合物含有寡核苷酸探針和引物，它們?cè)O(shè)計(jì)成與含有多態(tài)性位點(diǎn)或者與多態(tài)性位點(diǎn)相鄰的一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)區(qū)特異雜交。用于建立個(gè)體在本文描述的新的多態(tài)性位點(diǎn)上的基因型或者單元型的方法和組合物可用于研究多態(tài)性在SLC6A3蛋白質(zhì)的表達(dá)或者功能或者其缺乏所影響的疾病的病因中的影響，研究靶定SLC6A3的藥物的功效，預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)SLC6A3蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能所影響的疾病的易感性和預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)靶定SLC6A3的藥物的應(yīng)答性。
在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑒定基因型或者單元型和性狀之間的關(guān)聯(lián)的方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，性狀為對(duì)疾病的易感性、疾病的嚴(yán)重性、疾病的分期或者對(duì)藥物的應(yīng)答。此類(lèi)方法可應(yīng)用于為所有藥物遺傳學(xué)應(yīng)用開(kāi)發(fā)診斷試驗(yàn)和治療性治療，在所述藥物遺傳學(xué)應(yīng)用中，在基因型和治療結(jié)果，包括功效測(cè)量、藥物代謝動(dòng)力學(xué)測(cè)量和副作用測(cè)量之間可能存在關(guān)聯(lián)。
本發(fā)明還提供了用于存儲(chǔ)和顯示為SLC6A3基因測(cè)定的多態(tài)性數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)包含計(jì)算機(jī)處理器；顯示器；和含有多態(tài)性數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)。多態(tài)性數(shù)據(jù)包括在參照群體中為SLC6A3基因鑒定的基因型和單元型。在優(yōu)選實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)能夠產(chǎn)生一種顯示，其顯示根據(jù)它們的進(jìn)化關(guān)系組織的SLC6A3單元型。
在描述本文鑒定的多態(tài)性位點(diǎn)中，為了方便，參考基因的有義鏈。然而，如本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到的，含有SLC6A3基因的核酸分子可以是互補(bǔ)的雙鏈分子，從而，對(duì)有義鏈上特定位點(diǎn)的參考也指互補(bǔ)反義鏈上的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)。從而，可以參考任一條鏈上的相同多態(tài)性位點(diǎn)并且可以設(shè)計(jì)寡核苷酸以與任一鏈上含有多態(tài)性位點(diǎn)的靶標(biāo)區(qū)特異雜交。從而，本發(fā)明還包括與本文描述的SLC6A3基因組變體的有義鏈互補(bǔ)的單鏈多核苷酸。
通過(guò)制備含有SLC6A3基因的多態(tài)性變體的重組細(xì)胞和/或生物，優(yōu)選重組動(dòng)物，可以研究本文鑒定的多態(tài)性對(duì)SLC6A3的表達(dá)的影響。本文所用的“表達(dá)”包括，但不限于，一種或多種下面的該基因轉(zhuǎn)錄成前體mRNA；前體mRNA剪接和其他加工以產(chǎn)生成熟的mRNA；mRNA穩(wěn)定性；成熟mRNA翻譯成SLC6A3蛋白質(zhì)，包括密碼子選擇和tRNA可用性；和如果正確表達(dá)和功能所需，翻譯產(chǎn)物的糖基化和/或其他修飾。
為了制備本發(fā)明的重組細(xì)胞，可以將所希望的SLC6A3同源基因?qū)爰?xì)胞中的載體中，從而同源基因保持在染色體外。在這種情況中，基因?qū)⒂杉?xì)胞從染色體外位置表達(dá)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將SLC6A3同源基因以這樣的方式導(dǎo)入細(xì)胞中，使得它與細(xì)胞中存在的內(nèi)源SLC6A3基因重組。此類(lèi)重組需要發(fā)生雙重組事件，從而導(dǎo)致所希望的SLC6A3基因多態(tài)性。為了重組和染色體外保持，用于導(dǎo)入基因的載體是本領(lǐng)域已知的，并且本發(fā)明中可以使用任意合適的載體或者載體構(gòu)建體。用于將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法，如電穿孔、微粒轟擊、磷酸鈣共沉淀和病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)是本領(lǐng)域已知的；因此，方法的選擇可以在于技術(shù)人員的能力和偏愛(ài)。
SLC6A3同源基因可以導(dǎo)入的細(xì)胞的實(shí)例包括，但不限于，連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，如COS、NIH/3T3，和相關(guān)組織類(lèi)型的原代或者培養(yǎng)細(xì)胞，即，它們表達(dá)SLC6A3同源基因。此類(lèi)重組細(xì)胞可以用于比較不同蛋白質(zhì)變體的生物活性。
使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法制備表達(dá)變體基因的重組生物，例如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。優(yōu)選地，將包含變體基因的構(gòu)建體導(dǎo)入胚胎階段，例如，單細(xì)胞階段，或者通常不晚于約8細(xì)胞階段的非人動(dòng)物或者該動(dòng)物的祖先。可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的幾種方法產(chǎn)生攜帶本發(fā)明的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。一種方法包括向胚胎中轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒，該逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建成含有一個(gè)或多個(gè)絕緣子元件、一個(gè)或多個(gè)目的基因，和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他組分，以提供含有絕緣基因作為轉(zhuǎn)基因的完整穿梭載體。見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,610,053。另一種方法包括向胚胎直接注射轉(zhuǎn)基因。第三種方法包括使用胚胎干細(xì)胞。
SLC6A3同源基因可以導(dǎo)入的動(dòng)物的實(shí)例包括，但不限于，小鼠、大鼠、其他嚙齒動(dòng)物和非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。見(jiàn)″The Introduction of ForeignGenes into Mice″和其中引用的參考文獻(xiàn)，InRecombinant DNA，Watson，Gilman，Witkowski & Zoller，eds.(W.H.Freeman & Company，NY)pp.254-272。穩(wěn)定表達(dá)人SLC6A3同源基因和產(chǎn)生人SLC6A3蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以用作生物模型，其用于研究涉及異常SLC6A3表達(dá)和/或活性的疾病，和篩選和測(cè)定多種候選藥物、化合物和治療方案以減輕這些疾病的癥狀或者效果。
基于TAQMANTM mRNA水平分析.RT-PCR(實(shí)時(shí)定量PCR)測(cè)定法利用RNA逆轉(zhuǎn)錄酶催化從RNA鏈，包括mRNA鏈合成DNA鏈。所得DNA可以特異檢測(cè)和定量并且該方法可以用于測(cè)定特定種類(lèi)的mRNA的水平。用于進(jìn)行該測(cè)定的一種方法以商標(biāo)TAQMAN(PE Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)已知并且利用AMPLI TAQ GOLDTM DNA聚合酶的5’核酸酶活性在PCR反應(yīng)中切割特定形式的探針。這稱(chēng)作TAQMANTM探針。見(jiàn)Luthra等人，″Novel 5′Exonuclease-Based Real-Time PCR Assay Forthe Detection of t(14；18)(q32；q21)in Patients With Follicular Lymphoma″，Am.J.Pathol.，15363-68(1998)。探針由具有5’報(bào)道子染料(reporter dye)和3’淬滅子染料(quencher dye)的寡核苷酸(通?！?0 mer)組成。熒光報(bào)道子染料，如FAM(6-羧基熒光素)共價(jià)連接寡核苷酸的5’末端。通過(guò)位于3’末端的連接臂連接的TAMRA(6-羧基-N，N，N′，N′-四甲基羅丹明)淬滅報(bào)道子染料。見(jiàn)Kuimelis等人，″Structural Analogues of TaqMan Probes forReal-Time Quantitative PCR″，Nucl. Acids Symp.Ser.，37255-256(1997)；and Mullah 等人，″Efficient Synthesis of Double Dye-LabelledOligodeoxyribonucleotide Probes and Their Application in a Real TimePCR Assay″，Nucl. Acids Res.，26(4)1026-1031(1998)。在反應(yīng)期間，探針的切割分離報(bào)道子染料和淬滅子染料，導(dǎo)致報(bào)道子染料的熒光增強(qiáng)。
通過(guò)監(jiān)視報(bào)道子染料的熒光的增強(qiáng)直接檢測(cè)PCR產(chǎn)物的積累。見(jiàn)Heid等人，″Real Time Quantitative PCR″，Genome Res.，6(6)986-994(1996)。在固定數(shù)目的循環(huán)后，當(dāng)首先檢測(cè)到PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增而不是積累的PCR產(chǎn)物的量時(shí)，通過(guò)循環(huán)期間的時(shí)間點(diǎn)表征反應(yīng)。核酸靶標(biāo)的開(kāi)始拷貝數(shù)越高，就越早觀察到熒光的顯著增強(qiáng)。見(jiàn)Gibson，Heid & Williams等人，″ANovel Method For Real Time Quantitative RT-PCR″，Genome Res.，6995-1001(1996)。
當(dāng)探針是完整的時(shí)候，報(bào)道子染料與淬滅子染料的接近主要通過(guò)Frster型能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致報(bào)道子熒光的抑制。見(jiàn)Lakowicz等人，″OxygenQuenching and Fluorescence Depolarization of Tyrosine Residues inProteins″，J.Biol. Chem.，2584794-4801(1983)。在PCR期間，如果存在目的靶標(biāo)，那么探針在正向和反向引物位點(diǎn)之間特異退火。AMPLITAQGOLDTM DNA聚合酶的5′-3′溶核活性僅當(dāng)報(bào)道子和淬滅子之間的探針與靶標(biāo)雜交時(shí)切割所述探針。然后探針片段從靶標(biāo)移開(kāi)，并且鏈的聚合作用繼續(xù)。該過(guò)程在每個(gè)循環(huán)中發(fā)生并且不干擾產(chǎn)物的指數(shù)積累。封閉探針的3’末端以防止PCR期間探針的延伸。
被動(dòng)參照是包括在TAQMANTM緩沖液中的染料并且不參與5’核酸酶測(cè)定。被動(dòng)參照提供了內(nèi)部參照，在數(shù)據(jù)分析期間報(bào)道子染料信號(hào)可以對(duì)該內(nèi)部參照歸一化。為了校正由于濃度或者體積的改變引起的熒光波動(dòng)，歸一化是必要的。
對(duì)于給定反應(yīng)管，通過(guò)將報(bào)道子染料的發(fā)射強(qiáng)度除以被動(dòng)參照的發(fā)射強(qiáng)度得到稱(chēng)作Rn的比率(歸一化的報(bào)道子)來(lái)完成歸一化。
閾值周期或Ct值是首先檢測(cè)到ΔRn的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著增加時(shí)的周期。在Rn相對(duì)周期數(shù)的圖上，當(dāng)序列檢測(cè)應(yīng)用開(kāi)始檢測(cè)到與PCR產(chǎn)物的指數(shù)增長(zhǎng)有關(guān)的信號(hào)增強(qiáng)時(shí)，發(fā)生閾值周期。
為了進(jìn)行定量測(cè)量，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中包括cRNA(標(biāo)準(zhǔn)品)的連續(xù)稀釋液以構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，其是準(zhǔn)確和快速mRNA量化必需的。為了估計(jì)該技術(shù)的再現(xiàn)性，可以將相同cRNA樣品的擴(kuò)增進(jìn)行多次。
用于測(cè)量細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的其他技術(shù)產(chǎn)生有限復(fù)雜性的限制性片段庫(kù)用于電泳分析，如組合雙限制酶消化與定相引物的方法(見(jiàn)，例如，Zabeau的等人1992年9月24日申請(qǐng)的EP 0 534 858 A1，或者選擇具有與所定義的mRNA末端最接近的位點(diǎn)的限制性片段。見(jiàn)，例如，Prashar & Weissman，″Analysis of Differential Gene Expression by Display of 3′End RestrictionFragments of cDNAs″，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，93(2)659-663(1996)。
其他方法對(duì)cDNA庫(kù)統(tǒng)計(jì)地采樣，如通過(guò)對(duì)多種cDNA的每一種測(cè)序足夠的堿基，例如，20-50個(gè)堿基，以鑒定每種cDNA，或者通過(guò)測(cè)序短的標(biāo)簽，如9-10個(gè)堿基，它們?cè)谙鄬?duì)于所定義的mRNA末端途徑模式已知的位置處產(chǎn)生。見(jiàn)，例如，Velculescu，Science，270484-487(1995)。
其他方面的測(cè)量.在本發(fā)明的多種實(shí)施方案中，可以測(cè)量除了轉(zhuǎn)錄狀態(tài)之外的生物學(xué)狀態(tài)的方面，如翻譯狀態(tài)、活性狀態(tài)或者混合方面，以便得到藥物和途徑應(yīng)答。這些實(shí)施方案的細(xì)節(jié)在本章節(jié)中描述。
翻譯狀態(tài)測(cè)量.一種或多種基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)可以通過(guò)探針檢測(cè)，探針被可檢測(cè)地標(biāo)記或者可以隨后標(biāo)記。通常，探針是識(shí)別所表達(dá)的蛋白質(zhì)的抗體。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”包括但不限于，多克隆抗體、單克隆抗體、人源化的或者嵌合抗體和生物學(xué)功能的抗體片段，該抗體片段足夠結(jié)合所述蛋白質(zhì)。
為了產(chǎn)生針對(duì)所公開(kāi)的基因之一編碼的蛋白質(zhì)的抗體，通過(guò)用所述多肽或者其部分注射，可以免疫多種宿主動(dòng)物。此類(lèi)宿主動(dòng)物可以包括，但不限于，兔、小鼠和大鼠，等等。多種佐劑可以用于增強(qiáng)免疫學(xué)應(yīng)答，取決于宿主種類(lèi)，包括但不限于，弗氏佐劑(完全和不完全的)、礦物凝膠，如氫氧化鋁；表面活性物質(zhì)，如溶血卵磷脂、多聚醇(pluronic polyols)、聚陰離子、肽、油乳膠、匙孔血藍(lán)蛋白和二硝基苯酚；和潛在有用的人類(lèi)佐劑，如卡介苗(BCG)和小棒桿菌(Corynebacterium parvum)。
多克隆抗體是從用抗原，如靶基因產(chǎn)物，或者其抗原性功能衍生物免疫的動(dòng)物的血清得到的抗體分子的異質(zhì)群體。為了產(chǎn)生多克隆抗體，通過(guò)用補(bǔ)充如上述佐劑的編碼蛋白，或者其部分注射，可以免疫宿主動(dòng)物，如上述的宿主動(dòng)物。
單克隆抗體(mAbs)是針對(duì)特定抗原的抗體的同質(zhì)群體，可以通過(guò)提供通過(guò)傳代細(xì)胞系培養(yǎng)產(chǎn)生抗體分子的任意技術(shù)得到。這些技術(shù)包括，但不限于，Kohler & Milstein，Nature，256495-497(1975)；和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,376,110的雜交瘤技術(shù)；Kosbor等人，Immunol. Today，472(1983)；Cole等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，802026-2030(1983)的人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)；和EBV-雜交瘤技術(shù)，Cole等人，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy(Alan R.Liss，Inc.，1985)pp.77-96。此類(lèi)抗體可以是任意免疫球蛋白類(lèi)別，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其任何亞類(lèi)。產(chǎn)生本發(fā)明的mAb的雜交瘤可以在體外或者體內(nèi)培養(yǎng)。體內(nèi)高滴定度mAb的產(chǎn)生使得其是當(dāng)前優(yōu)選的生產(chǎn)方法。
此外，可以使用為了產(chǎn)生“嵌合抗體”而開(kāi)發(fā)的技術(shù)(見(jiàn)Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，816851-6855(1984)；Neuberger等人，Nature，312604-608(1984)；和Takeda等人，Nature，314452-454(1985))，該技術(shù)將具有合適的抗原特異性的小鼠抗體分子的基因與具有合適生物學(xué)活性的人抗體分子的基因剪接在一起。嵌合抗體是這樣的分子，其中不同的部分來(lái)自不同的動(dòng)物物種，如具有來(lái)自小鼠mAb的可變或者高變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的嵌合抗體。
備選地，關(guān)于產(chǎn)生單鏈抗體所描述的技術(shù)(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,946,778；Bird，Science，242423-426(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，855879-5883(1988)；和Ward 等人，Nature，334544-546(1989))可以適用于產(chǎn)生差別表達(dá)的基因單鏈抗體。通過(guò)用氨基酸橋連接Fv區(qū)的重鏈片段和輕鏈片段，得到單鏈多肽而形成單鏈抗體。
更優(yōu)選地，用于產(chǎn)生“人源化抗體”的技術(shù)可以適用于產(chǎn)生針對(duì)蛋白質(zhì)、其片段或者衍生物的抗體。此類(lèi)技術(shù)公開(kāi)在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,932,448；5,693,762；5,693,761；5,585,089；5,530,101；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,661,016；和5,770,429中。
識(shí)別特異表位的抗體片段可以通過(guò)已知技術(shù)產(chǎn)生。例如，此類(lèi)片段包括，但不限于，可以通過(guò)抗體分子的胃蛋白酶消化產(chǎn)生的F(ab′)2片段和通過(guò)還原F(ab′)2片段的二硫橋產(chǎn)生的Fab片段。備選地，可以構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)(見(jiàn)Huse等人，Science，2461275-1281(1989))，以允許快速和容易地鑒定具有所希望的特異性的單克隆Fab片段。
然后通過(guò)免疫測(cè)定方法利用上述抗體測(cè)定樣品中表達(dá)已知蛋白質(zhì)的程度。此類(lèi)免疫測(cè)定方法包括，但不限于，斑點(diǎn)印跡、蛋白質(zhì)印跡、競(jìng)爭(zhēng)和非競(jìng)爭(zhēng)蛋白質(zhì)結(jié)合測(cè)定法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、免疫組織化學(xué)、熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)，和通常使用和在科學(xué)和專(zhuān)利文獻(xiàn)中大量描述的其他方法，并且許多在商業(yè)上使用。
為了容易檢測(cè)，尤其優(yōu)選的是夾心ELISA，其存在許多變通方法，所有這些變通方法都被本發(fā)明包括。例如，在典型的正向測(cè)定法(forwardassay)中，將未標(biāo)記的抗體固定在固態(tài)基質(zhì)上并將待測(cè)試的樣品與被結(jié)合的分子接觸，溫育合適的時(shí)間，以足夠允許形成抗體-抗原二級(jí)復(fù)合體。此時(shí)，將用能夠誘導(dǎo)可檢測(cè)的信號(hào)的報(bào)道分子標(biāo)記的二級(jí)抗體加入并溫育，允許時(shí)間足夠形成抗體-抗原-標(biāo)記抗體的三級(jí)復(fù)合體。洗除任何未反應(yīng)的物質(zhì)，并且抗原的存在通過(guò)觀察信號(hào)來(lái)確定，或者可以通過(guò)與含有已知量的抗原的對(duì)照樣品比較來(lái)定量。正向測(cè)定法的變通方法包括同時(shí)測(cè)定法，其中樣品和抗體同時(shí)加入到結(jié)合的抗體，或者反向測(cè)定法，其中標(biāo)記的抗體和待測(cè)試的樣品首先混合，溫育并加入未標(biāo)記的表面結(jié)合的抗體。這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且次要改變的可能性將是顯然的。本文所用的“夾心測(cè)定法”意在包括對(duì)基本的兩位點(diǎn)技術(shù)的所有變通方案。對(duì)于本發(fā)明的免疫測(cè)定法，唯一的限制性因素是經(jīng)標(biāo)記的抗體必須是對(duì)目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)特異的抗體。
該類(lèi)型測(cè)定法中最常用的報(bào)道分子是酶、含有熒光團(tuán)-或者放射性核素的分子。對(duì)于酶免疫測(cè)定法(EIA)，將酶綴合到二級(jí)抗體，通過(guò)戊二醛或者高碘酸綴合。然而，如將容易認(rèn)識(shí)到的，存在多種不同的連接技術(shù)，它們是技術(shù)人員公知的。常使用的酶包括辣根過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶，等等。通常選擇與特定酶一起使用的底物用來(lái)當(dāng)被對(duì)應(yīng)的酶水解時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)的顏色改變。例如，對(duì)硝基苯磷酸適于與堿性磷酸酶綴合物一起使用；對(duì)于過(guò)氧化物酶綴合物，通常使用1，2-苯二胺或者甲苯胺。還可以使用熒光底物，其產(chǎn)生熒光產(chǎn)物而不是上面提到的顯色底物。然后將含有合適底物的溶液加入三級(jí)復(fù)合體。底物與連接二級(jí)抗體的酶反應(yīng)，得到定性的可見(jiàn)信號(hào)，其可以進(jìn)一步定量，通常通過(guò)分光光度法定量，得到對(duì)血清樣品中存在的蛋白質(zhì)的量的評(píng)估。
備選地，熒光化合物，如熒光素和羅丹明，可以化學(xué)偶聯(lián)到抗體而不改變它們的結(jié)合能力。當(dāng)通過(guò)用特定波長(zhǎng)的光照射激活時(shí)，熒光染料標(biāo)記的抗體吸收光能，在分子中誘導(dǎo)激發(fā)態(tài)，然后發(fā)出具有特征性更長(zhǎng)波長(zhǎng)的光。該發(fā)射呈現(xiàn)為用光學(xué)顯微鏡可目視檢測(cè)的特征性顏色。免疫熒光和EIA技術(shù)在本領(lǐng)域中非常成熟并且尤其優(yōu)選用于本發(fā)明方法。然而，其他報(bào)道分子，如放射性同位素、化學(xué)發(fā)光或者生物發(fā)光分子也可以使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白怎樣改變操作以適合所需的用途。
翻譯狀態(tài)的測(cè)量也可以根據(jù)一些額外方法進(jìn)行。例如，通過(guò)構(gòu)建微陣列可以進(jìn)行蛋白質(zhì)的整個(gè)基因組，即“蛋白質(zhì)組”的監(jiān)視，Goffeau 等人，上文，所述微陣列中結(jié)合位點(diǎn)包含固定化的、優(yōu)選單克隆的抗體，這些抗體對(duì)細(xì)胞基因組編碼的許多蛋白質(zhì)種類(lèi)特異。優(yōu)選地，存在針對(duì)大部分編碼蛋白質(zhì)，或者至少與測(cè)試或者證實(shí)目的生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)模型相關(guān)的那些蛋白質(zhì)的抗體。制備單克隆抗體的方法是公知的。見(jiàn)，例如，Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor，NY，1988)，將其為了所有目的完整引入本文)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，產(chǎn)生針對(duì)基于細(xì)胞的基因組序列設(shè)計(jì)的合成的肽片段的單克隆抗體。使用這種抗體陣列，將來(lái)自細(xì)胞的蛋白質(zhì)與陣列接觸，并且用本領(lǐng)域已知的測(cè)定法測(cè)定它們的結(jié)合。
備選地，通過(guò)二維凝膠電泳系統(tǒng)可以分離蛋白質(zhì)。二維凝膠電泳是本領(lǐng)域公知的并且通常包括沿著第一維等電聚焦，然后沿著第二維進(jìn)行SDS-PAGE電泳。見(jiàn)，例如，Hames等人，″Gel Electrophoresis of ProteinsAPractical Approach″(IRL Press，NY，1990)；Shevchenko等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，9314440-14445(1996)；Sagliocco等人，Yeast，121519-1533(1996)；和Lander，Science，274536-539(1996)。所得電泳圖可以通過(guò)多種技術(shù)分析，所述技術(shù)包括質(zhì)譜技術(shù)、使用多克隆和單克隆抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡和免疫印跡分析，和內(nèi)部和N-末端微測(cè)序。使用這些技術(shù)，可以鑒定在給定生理?xiàng)l件下產(chǎn)生的所有蛋白質(zhì)的大部分，所述給定生理?xiàng)l件包括在暴露于藥物的細(xì)胞中，例如，在酵母中，或者在通過(guò)例如缺失或者過(guò)表達(dá)特定基因而修飾的細(xì)胞中。
基于生物學(xué)狀態(tài)的其他方面的實(shí)施方案.盡管監(jiān)視mRNA豐度之外的細(xì)胞成分當(dāng)前帶來(lái)了在監(jiān)視mRNA中沒(méi)有遇到的一些技術(shù)困難，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，使用本發(fā)明的方法可以測(cè)量與細(xì)胞功能的表征有關(guān)的蛋白質(zhì)的活性，本發(fā)明的實(shí)施方案可以基于此類(lèi)測(cè)量。可以通過(guò)適合被表征的特定活性的任何功能的、生物化學(xué)的或者物理方法進(jìn)行活性測(cè)量。當(dāng)活性涉及化學(xué)轉(zhuǎn)化時(shí)，細(xì)胞蛋白質(zhì)可以與天然底物接觸，并測(cè)量轉(zhuǎn)化率。當(dāng)活性涉及多聚體單位的結(jié)合，例如，活化的DNA結(jié)合復(fù)合體與DNA的結(jié)合時(shí)，可以測(cè)量結(jié)合的蛋白質(zhì)的量或者該結(jié)合的二級(jí)結(jié)果，如所轉(zhuǎn)錄的mRNA的量。而且，當(dāng)唯一的功能活性已知時(shí)，例如在細(xì)胞周期控制中，可以觀察功能的執(zhí)行。不管怎樣已知和測(cè)量，蛋白質(zhì)活性的改變都形成了可以通過(guò)本發(fā)明的前述方法可以分析的應(yīng)答數(shù)據(jù)。
在備選的和非限制性實(shí)施方案中，應(yīng)答數(shù)據(jù)可以由細(xì)胞的生物學(xué)狀態(tài)的混合方面形成?？梢詮睦纾承﹎RNA豐度的改變、某些蛋白質(zhì)豐度的改變和某些蛋白質(zhì)活性的改變構(gòu)建應(yīng)答數(shù)據(jù)。
核酸和蛋白質(zhì)作為標(biāo)記的檢測(cè).在具體實(shí)施方案中，可以使用本領(lǐng)域已知的方法，通過(guò)原位或者體外形式測(cè)定生物樣品中對(duì)應(yīng)于標(biāo)記物的mRNA的水平。術(shù)語(yǔ)“生物樣品”意在包括組織、細(xì)胞、生物液體和其分離物、來(lái)自受試者的分離物，以及受試者中存在的組織、細(xì)胞和液體。許多表達(dá)檢測(cè)方法使用分離的RNA。對(duì)于體外方法，對(duì)于mRNA的分離不選擇的任意RNA分離技術(shù)都可以用于從細(xì)胞純化RNA。見(jiàn)例如，Ausubel 等人，Ed.，Curr.Prot.Mol. Biol.，John Wiley & Sons，NY(1987-1999)。此外，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)可以容易地處理大量組織樣品，如Chomczynski，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,843,155(1989)的一步RNA分離方法。
分離的mRNA可以用于雜交或者擴(kuò)增測(cè)定法，其包括但不限于，DNA印跡分析或者RNA印跡分析、PCR分析和探針陣列。用于檢測(cè)mRNA水平的一種優(yōu)選的診斷方法包括將分離的mRNA與可以與所選基因編碼的mRNA雜交的核酸分子(探針)接觸。核酸探針可以是例如，全長(zhǎng)cDNA，或者其部分，如全長(zhǎng)cDNA或者其部分，如長(zhǎng)為至少7、15、30、50、100、250或者500個(gè)核苷酸并且在嚴(yán)格條件下足以與編碼本發(fā)明的標(biāo)記的mRNA或者基因組DNA特異雜交的寡核苷酸。適于在本發(fā)明的診斷測(cè)定法中使用的其他合適的探針在本文中描述。mRNA與探針的雜交表明所述的標(biāo)記正被表達(dá)。
在一種形式中，將mRNA固定在固體表面上并與探針接觸，例如，通過(guò)在瓊脂糖凝膠上電泳分離的mRNA并將mRNA從凝膠轉(zhuǎn)移到膜，如硝酸纖維素。在備選形式中，將探針固定在固體表面上并將mRNA與探針接觸，例如，在Affymetrix基因芯片陣列中。技術(shù)人員可以容易地修改已知的mRNA檢測(cè)方法用于檢測(cè)本發(fā)明的標(biāo)記編碼的mRNA的水平。
用于測(cè)定對(duì)應(yīng)于樣品中本發(fā)明的標(biāo)記的mRNA水平的備選方法包括核酸擴(kuò)增方法，例如，通過(guò)RT-PCR(在Mullis，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,683,202(1987)中提出的實(shí)驗(yàn)實(shí)施方案；連接酶反應(yīng)，Barany(1991)，上文；自動(dòng)維持序列復(fù)制，Guatelli等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，871874-1878(1990)；轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)，Kwoh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，861173-1177(1989)；Q-Beta復(fù)制酶，Lizardi等人，Biol. Technology，61197(1988)；滾環(huán)復(fù)制，Lizardi等人，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,854,033(1988)；或者任意其他核酸擴(kuò)增方法，然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)檢測(cè)擴(kuò)增的分子。如果此類(lèi)分子以非常低的數(shù)目存在，那么這些檢測(cè)方案可以特別用于檢測(cè)核酸分子。如本文所用的，擴(kuò)增引物定義為一對(duì)核酸分子，其可以與基因的5’或3’區(qū)(分別為正鏈和負(fù)鏈，或者反之亦然)退火并且含有它們之間的短區(qū)域。通常，擴(kuò)增引物長(zhǎng)為約10-30個(gè)核苷酸并且側(cè)翼區(qū)長(zhǎng)為約50-200個(gè)核苷酸。在合適的條件下并且使用合適的試劑，此類(lèi)引物允許擴(kuò)增包含引物側(cè)翼的核苷酸序列的核酸分子。
在原位方法中，mRNA不需要在檢測(cè)前從細(xì)胞分離。在此類(lèi)方法中，使用已知的組織學(xué)方法制備/處理細(xì)胞或者組織樣品。將樣品固定在支持體，通常在載玻片上，然后與探針接觸，該探針與編碼所述標(biāo)記的mRNA雜交。
作為基于標(biāo)記的絕對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定的備選方法，測(cè)定可以基于標(biāo)記的歸一化的表達(dá)水平。通過(guò)校正標(biāo)記的絕對(duì)表達(dá)水平對(duì)表達(dá)水平歸一化，通過(guò)將標(biāo)記的的表達(dá)與組成性表達(dá)的非標(biāo)記的基因例如管家基因的表達(dá)進(jìn)行比較來(lái)進(jìn)行校正。用于歸一化的合適的基因包括管家基因，如肌動(dòng)蛋白基因或者上皮細(xì)胞特異基因。該歸一化允許將一種樣品，例如，患者樣品中的表達(dá)水平與另一種樣品比較，或者在不同來(lái)源的樣品之間比較。
備選地，表達(dá)水平可以作為相對(duì)表達(dá)水平提供。為了確定標(biāo)記的相對(duì)表達(dá)水平，在測(cè)定所討論的樣品的表達(dá)水平之前，為正常的對(duì)比患病生物樣品的10種或者更多樣品，優(yōu)選50種或更多樣品確定標(biāo)記的表達(dá)水平。測(cè)定大數(shù)目樣品中測(cè)定的每種基因的平均表達(dá)水平并且其用作標(biāo)記的基線表達(dá)水平。然后為試樣測(cè)定的標(biāo)記的表達(dá)水平(絕對(duì)表達(dá)水平)除以為該標(biāo)記得到的平均表達(dá)值。這提供了相對(duì)表達(dá)水平。
優(yōu)選地，用于基線測(cè)定的樣品將來(lái)自沒(méi)有多態(tài)性的患者。細(xì)胞來(lái)源的選擇依賴(lài)于相對(duì)表達(dá)水平的使用。使用正常組織中發(fā)現(xiàn)的表達(dá)作為平均表達(dá)得分幫助證實(shí)所測(cè)定的標(biāo)記是否特異的(對(duì)比正常細(xì)胞)。此外，隨著更多數(shù)據(jù)的積累，可以修正平均表達(dá)值，提供基于所積累的數(shù)據(jù)的改進(jìn)的相對(duì)表達(dá)值。
多肽的檢測(cè).在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，檢測(cè)對(duì)應(yīng)于標(biāo)記的多肽。用于檢測(cè)本發(fā)明的多肽的優(yōu)選試劑是能夠結(jié)合對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的標(biāo)記的多肽的抗體，優(yōu)選具有可檢測(cè)標(biāo)記的抗體?？贵w可以是多克隆的，或者更優(yōu)選地，是單克隆的?？梢允褂猛暾贵w，或者其片段，例如，F(xiàn)ab或者F(ab′)2。術(shù)語(yǔ)“經(jīng)標(biāo)記的”關(guān)于探針或者抗體，意在包括通過(guò)將可檢測(cè)的物質(zhì)偶聯(lián)，即物理連接到探針或者抗體來(lái)直接標(biāo)記所述探針或者抗體，以及通過(guò)與直接標(biāo)記的另一試劑的反應(yīng)性來(lái)間接標(biāo)記所述探針或者抗體。間接標(biāo)記的實(shí)例包括使用熒光標(biāo)記的二級(jí)抗體和具有生物素的DNA探針的末端標(biāo)記檢測(cè)一級(jí)抗體，用生物素標(biāo)記使得該DNA探針可以用熒光標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白檢測(cè)。
使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)可以從個(gè)體分離蛋白質(zhì)。所用的蛋白質(zhì)分離方法可以例如，為Harlow and Lane(1988)，上文中描述的方法。
多種形式可以用于確定樣品是否含有結(jié)合給定抗體的蛋白質(zhì)。此類(lèi)形式的實(shí)例包括，但不限于，EIA；放射免疫測(cè)定(RIA)、蛋白質(zhì)印跡分析和ELISA。技術(shù)人員將容易修改已知的蛋白質(zhì)/抗體檢測(cè)方法用于確定細(xì)胞是否表達(dá)本發(fā)明的標(biāo)記和血液或者其他身體組織中特定多肽表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)濃度。
在一種形式中，抗體或者抗體片段可以用于方法中，如用于蛋白質(zhì)印跡或者免疫熒光技術(shù)以檢測(cè)表達(dá)的蛋白質(zhì)。在此類(lèi)用途中，通常優(yōu)選在固相支持體上固定抗體或者蛋白質(zhì)。合適的固相支持體或者載體包括能夠結(jié)合抗原或者抗體的任何支持體。公知的支持體或者載體包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然或者修飾的纖維素、聚丙烯酰胺、輝長(zhǎng)巖和磁鐵礦。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將已知用于結(jié)合抗體或者抗原的許多其他合適的載體，并且將能夠使此類(lèi)支持體適合用于本發(fā)明。例如，從患者細(xì)胞分離的蛋白質(zhì)可以在聚丙烯酰胺凝膠電泳上電泳并固定到固相支持體，如硝酸纖維素上。支持體可以用合適的緩沖液洗滌并用可檢測(cè)性標(biāo)記的抗體處理。固相支持體可以用所述緩沖液再次洗滌以除去未結(jié)合的抗體。固相支持體上結(jié)合的標(biāo)記的量可以通過(guò)常規(guī)方法檢測(cè)并將該測(cè)量轉(zhuǎn)變?yōu)檠夯蛘吡硪簧眢w組織的中蛋白質(zhì)的水平或者濃度。
本發(fā)明還包括試劑盒，其用于檢測(cè)生物樣品中對(duì)應(yīng)于本發(fā)明標(biāo)記的多肽或者核酸的存在，所述生物樣品為例如任何體液，包括但不限于，血清、血漿、淋巴、膽囊液、尿、糞便、腦脊液、腹水(acitic fluid)或者血液并且包括身體組織的活組織檢查樣品。例如，試劑盒可以包含經(jīng)標(biāo)記的化合物或者試劑，其能夠檢測(cè)生物樣品中對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的標(biāo)記的多肽或者編碼該多肽的mRNA，和用于測(cè)定樣品中所述多肽或者mRNA的量的手段，例如，結(jié)合所述多肽的抗體或者結(jié)合編碼該多肽的DNA或者mRNA的寡核苷酸探針。試劑盒還可以包括使用該試劑盒解釋所得結(jié)果的使用說(shuō)明。
對(duì)于基于抗體的試劑盒，該試劑盒可以包含例如 1)第一種抗體，例如，附著到固相支持體的第一種抗體，其結(jié)合對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的標(biāo)記的多肽，和任選地 2)第二種不同的抗體，其結(jié)合所述多肽或者第一種抗體并且綴合可檢測(cè)的標(biāo)記。
對(duì)于基于寡核苷酸的試劑盒，該試劑盒可以包含例如 1)寡核苷酸，例如，可檢測(cè)地標(biāo)記的寡核苷酸，其與編碼對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的標(biāo)記的多肽的核酸序列雜交；或者 2)用于擴(kuò)增對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的標(biāo)記的核酸分子的引物對(duì)。
試劑盒還可以包含例如，緩沖劑、防腐劑或者蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。試劑盒可以還包含檢測(cè)可檢測(cè)的標(biāo)記必需的組分，例如，酶或者底物。試劑盒可以還含有對(duì)照樣品或者一系列對(duì)照樣品，其可以經(jīng)測(cè)定并與試樣比較。試劑盒的每種組分可以封閉在單個(gè)容器中并且所有不同的容器可以與關(guān)于使用該試劑盒解釋所進(jìn)行的測(cè)定的結(jié)果的說(shuō)明書(shū)一起位于一個(gè)包裝中。
抗體向細(xì)胞的導(dǎo)入.可以以多種方法進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和它們的濃度的表征。例如，可以將抗體以多種方法導(dǎo)入細(xì)胞中，包括例如，抗體向細(xì)胞的微注射(見(jiàn)Morgan等人，Immunol.Today，984-86(1988))或者將編碼所希望的抗體的雜交瘤mRNA轉(zhuǎn)化到細(xì)胞中。見(jiàn)Burke 等人，Cell，36847-858(1984)。在另一技術(shù)中，可以將重組抗體工程化并在多種非淋巴樣細(xì)胞類(lèi)型中異位表達(dá)以結(jié)合靶蛋白，以及阻斷靶蛋白活性。見(jiàn)Biocca等人，Trends Cell Biol.，5248-252(1995)。蛋白質(zhì)的表達(dá)優(yōu)選處于可控制的啟動(dòng)子，如Tet啟動(dòng)子控制下，或者組成性活性啟動(dòng)子的控制下，以產(chǎn)生飽和微擾。第一步是選擇對(duì)靶蛋白具有合適的特異性的特定單克隆抗體(見(jiàn)下文)。編碼所選抗體的可變區(qū)的序列可以克隆到多種工程化的抗體形式中，包括例如完整抗體、Fab片段、Fv片段、單鏈Fv片段(通過(guò)肽接頭結(jié)合的VH和VL區(qū))(″ScFv″片段)、雙抗體(兩個(gè)結(jié)合的具有不同特異性的ScFv片段)，等等。見(jiàn)Hayden，Gilliland & Ledbetter，Curr.Opin.Immunol.，9(2)201-212(1997)。多種形式的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的抗體可以靶向細(xì)胞隔室，例如細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體等等，這可以通過(guò)將所述抗體以與多種已知的細(xì)胞內(nèi)引導(dǎo)序列融合表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。見(jiàn)Bradbury 等人，Antibody Engineerinq，Borrebaeck，Ed.Vol.2，pp.295-361(IRL Press，1995)。具體地，ScFv形式似乎尤其適于細(xì)胞質(zhì)靶向。
有用的抗體類(lèi)型的種類(lèi).抗體類(lèi)型包括，但不限于，多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達(dá)文庫(kù)。本領(lǐng)域已知的多種方法可以用以產(chǎn)生針對(duì)靶蛋白的多克隆抗體。為了產(chǎn)生抗體，通過(guò)用靶蛋白注射可以免疫多種宿主動(dòng)物，此類(lèi)宿主動(dòng)物包括，但不限于，兔、小鼠、大鼠，等等。取決于宿主種類(lèi)，多種佐劑可以用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答，并且包括，但不限于，弗氏佐劑(完全和不完全的)、礦物凝膠，如氫氧化鋁；表面活性物質(zhì)，如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子、肽、油乳膠、和二硝基苯酚；和潛在有用的人類(lèi)佐劑，如BCG和小棒桿菌(Corynebacteriumparvum)。
單克隆抗體.為了制備針對(duì)靶蛋白的單克隆抗體，可以使用提供由培養(yǎng)的傳代細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的任意技術(shù)。此類(lèi)技術(shù)包括，但不限于，Kohler & Milstein，上文最初開(kāi)發(fā)的雜交瘤技術(shù)；三源雜交瘤(trioma)技術(shù)；人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(見(jiàn)Kozbor等人，Immunol.Today，472(1983))；和用于產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(shù)。見(jiàn)Cole等人(1985)，上文。在額外實(shí)施方案中，可以利用最近的技術(shù)(PCT專(zhuān)利申請(qǐng)PCT/US90/02545)在無(wú)微生物的動(dòng)物中產(chǎn)生單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明，可以使用人抗體并且通過(guò)使用人雜交瘤(見(jiàn)Cole等人(1983)，上文，或者通過(guò)用EBV病毒在體外轉(zhuǎn)化人B細(xì)胞可以得到人抗體。見(jiàn)Cole等人(1985)，上文。實(shí)際上，根據(jù)本發(fā)明，可以使用開(kāi)發(fā)用來(lái)產(chǎn)生“嵌合抗體”(見(jiàn)Morrison等人(1984)，上文；Neuberger等人(1984)，上文；Takeda等人(1985)，上文)的技術(shù)，該技術(shù)包括將對(duì)靶蛋白特異的小鼠抗體分子的基因與具有合適生物學(xué)活性的人抗體分子的基因剪接在一起；此類(lèi)抗體也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
此外，當(dāng)單克隆抗體是有利的時(shí)候，使用噬菌體展示技術(shù)，可以備選地從大抗體文庫(kù)選擇單克隆抗體。見(jiàn)Marks等人，J.Biol. Chem.，267(3)16007-16010(1992)。使用該技術(shù)，高達(dá)10-12種不同的抗體文庫(kù)已經(jīng)在fd絲狀噬菌體的表面表達(dá)，產(chǎn)生抗體的″single pot″體外免疫系統(tǒng)，其可用于單克隆抗體選擇。見(jiàn)Griffiths等人，EMBO J.，13(14)3245-3260(1994)。從此類(lèi)文庫(kù)選擇抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行，包括將噬菌體與固定化的靶蛋白接觸，并選擇和克隆結(jié)合靶標(biāo)的噬菌體，并將編碼抗體可變區(qū)的序列亞克隆到表達(dá)所希望的抗體形式的合適載體中。
根據(jù)本發(fā)明，為了產(chǎn)生單鏈抗體(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,946,778)所描述的技術(shù)適于產(chǎn)生對(duì)靶蛋白特異的單鏈抗體。本發(fā)明的額外實(shí)施方案利用為構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)所描述的技術(shù)(見(jiàn)Huse等人(1989)，上文)以允許快速和容易地鑒定對(duì)靶蛋白具有所希望的特異性的單克隆Fab片段。
通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)可以產(chǎn)生含有靶蛋白的獨(dú)特型的抗體片段。例如，此類(lèi)片段包括，但不限于，F(xiàn)(ab′)2片段，其可以通過(guò)抗體分子的胃蛋白酶消化產(chǎn)生；Fab′，其可以通過(guò)還原F(ab′)2片段的二硫橋產(chǎn)生；Fab片段，其可以通過(guò)用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產(chǎn)生，和Fv片段。
在抗體的制備中，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)，如ELISA篩選所希望的抗體。為了選擇對(duì)靶蛋白特異的抗體，可以對(duì)所產(chǎn)生的雜交瘤或者噬菌體展示抗體文庫(kù)測(cè)定結(jié)合靶蛋白的抗體。
治療的施用.在最后分析中，用以治療本發(fā)明公開(kāi)的疾病的藥物的劑量必須由負(fù)責(zé)該病例的醫(yī)生使用關(guān)于所述藥物、在臨床試驗(yàn)中確定的聯(lián)合藥物的性質(zhì)和患者的特征，包括該醫(yī)生治療該患者的疾病之外的疾病的知識(shí)來(lái)決定。劑量和一些優(yōu)選的劑量的一般概要可以并且將在本文提供，例如，伊潘立酮(Iloperidone)為1-50mg，每天一次，最優(yōu)選地，12-16mg，每天一次；奧氮平為約0.25-50mg，每天一次；優(yōu)選地，1-30mg，每天一次；最優(yōu)選地，1-25mg，每天一次；氯氮平為每天約12.5-900mg，優(yōu)選每天約150-450mg；利哌利酮為每天約0.25-16mg；優(yōu)選每天約2-8mg；舍吲哚每天約0.0001-1.0mg/kg；喹迪平約1.0-40mg/kg每天一次，或者以分份劑量施用；齊拉西酮每天約5-500mg；優(yōu)選每天約50-100mg；氟哌啶醇為0.5-40mg，每天一次或兩次。
所有有關(guān)化合物都可以口服利用并且通常經(jīng)口施用，并且因此優(yōu)選輔助組合的經(jīng)口施用。它們可以以單次劑型一起施用，或者可以單獨(dú)施用。然而，經(jīng)口施用不是唯一途徑或者甚至唯一優(yōu)選的途徑。例如，經(jīng)皮施用可以是健忘或者對(duì)于服用口服藥物易生氣的患者非常希望的?？梢酝ㄟ^(guò)一種途徑，如口服施用一種藥物，并且在具體情況下可以通過(guò)經(jīng)皮膚(transdermal)、經(jīng)皮(percutaneous)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鼻內(nèi)或者直腸內(nèi)途徑施用其他藥物。施用途徑可以以多種方式改變，受到藥物的物理性質(zhì)和患者和護(hù)理人員的方便性的限制。
實(shí)施例1 DAT1基因的3’UTR區(qū)中VNTR多態(tài)性和氯氮平應(yīng)答之間的關(guān)聯(lián)該實(shí)施例的目標(biāo)是評(píng)估多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1基因(SLC6A3；DAT1)的3’UTR區(qū)中VNTR多態(tài)性和用氯氮平治療的精神分裂癥或者分裂情感性障礙患者中藥物應(yīng)答之間的潛在關(guān)聯(lián)。
進(jìn)行追溯性藥物遺傳學(xué)分析以試圖評(píng)估DAT1基因的3’UTR區(qū)中串聯(lián)重復(fù)(VNTR)多態(tài)性的不同數(shù)目與用氯氮平治療的精神分裂癥或者分裂情感性障礙患者中藥物應(yīng)答之間的潛在關(guān)聯(lián)。
在精神分裂癥或者分裂情感性障礙的患者中已經(jīng)進(jìn)行了比較用氯氮平對(duì)比奧氮平治療的患者中自殺行為的危險(xiǎn)性的多中心、隨機(jī)化的兩年研究(見(jiàn)上文)。在氯氮平組中觀察到多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(SLC6A3)的外顯子9上的同義多態(tài)性和到發(fā)生1型事件的時(shí)間之間的顯著關(guān)聯(lián)。發(fā)現(xiàn)具有GG基因型的受試者是弱應(yīng)答者，因?yàn)樗麄冊(cè)谘芯拷K點(diǎn)顯示出最差的自殺行為。研究結(jié)果還表明在預(yù)防自殺企圖中，氯氮平比奧氮平更有效。見(jiàn)公布的PCT專(zhuān)利申請(qǐng)WO 2004/074513。
基因型分型.收集加入InterSePT研究(見(jiàn)上文)的402名患者的樣品并對(duì)VNTR多態(tài)性確定基因型。加入InterSePT研究的共402名受試者同意按照當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行的藥物遺傳學(xué)研究。在試驗(yàn)地點(diǎn)從患者收集15ml血液。由Covance(Indianapolis，USA)用PUREGENETM DNAIsolation Kit(D50K)根據(jù)生產(chǎn)商的推薦提取DNA。用如Kidd (KiddLaboratory，http://info.med.yale.edu/genetics/kkidd/SLC6A3 3VNTR.html)描述的PCR方法進(jìn)行VNTR基因型分型。有義和反義PCR引物分別為5′-GGT GTA GGG AAC GGC CTG AGA G-3′(SEQ ID NO3)和5′-CTTCCT GGA GGT CAC GGC TCA AGG-3′(SEQ ID NO4)。每個(gè)測(cè)定法需要約100-200ng基因組DNA。使用94℃(30″)，62℃(30″)和72℃(30″)的條件進(jìn)行30個(gè)PCR循環(huán)。用2％瓊脂糖凝膠分析PCR產(chǎn)物。
臨床評(píng)估.對(duì)于主要功效變量時(shí)間(天數(shù)，隨機(jī)化后)滿足下面兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的任一個(gè)(a)顯著的自殺企圖；和(b)由于迫切的自殺危險(xiǎn)而住院。1型事件定義為上面兩項(xiàng)的組合。對(duì)于第二位的功效變量，確定下面的(a)具有顯著自殺企圖的受試者的百分?jǐn)?shù)；(b)由于迫切自殺危險(xiǎn)而住院的受試者的百分?jǐn)?shù)；(c)從陽(yáng)性與陰性癥狀量表(Positive and Negative SyndromeScale，PANSS)的總得分中基線的改變；(e)從PANSS的陽(yáng)性部分和中基線的改變；和(e)從PANSS的陰性部分和中基線的改變。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.Windows下的SAS 8.2版軟件包用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分別使用非參數(shù)ANOVA和Fisher精確檢驗(yàn)比較基因組之間人口統(tǒng)計(jì)學(xué)差異中的連續(xù)和不連續(xù)(dischotomous)變量。使用時(shí)序檢驗(yàn)評(píng)估基因型對(duì)到發(fā)生1型事件的時(shí)間的差別影響。在進(jìn)一步分析中，使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型調(diào)整年齡、性別、藥物濫用，和終生自殺企圖。
時(shí)序檢驗(yàn)鑒定了VNTR多態(tài)性和研究期間通過(guò)1型事件的危險(xiǎn)測(cè)量的自殺行為之間的顯著關(guān)聯(lián)。此外，該關(guān)聯(lián)僅存在于氯氮平治療組。具有9個(gè)或者更少的重復(fù)等位基因的受試者顯示出顯著更高的1型事件率(P＝0.004)。相同受試者還顯示出顯著更多的終生自殺企圖(P＝0.01)。為了調(diào)節(jié)VNTR多態(tài)性和1型事件危險(xiǎn)之間的關(guān)系中可能的混淆，建立Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型。該多變量模型由VNTR多態(tài)性以及如下共變量(covariates)組成年齡、性別、藥物濫用和終生自殺企圖。VNTR多態(tài)性和1型事件的危險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)保持顯著(P＝0.0085)。這些結(jié)果表明在VNTR多態(tài)性中具有9個(gè)或者更少重復(fù)等位基因的受試者對(duì)于自殺行為是對(duì)氯氮平治療的弱應(yīng)答者。此外，通過(guò)精神病評(píng)估，包括陽(yáng)性與陰性癥狀量表(PANSS)測(cè)量發(fā)現(xiàn)，基因型組之間對(duì)于氯氮平治療沒(méi)有顯著差異。
DAT1基因中VNTR多態(tài)性與氯氮平應(yīng)答的關(guān)聯(lián).在當(dāng)前實(shí)施例的藥物遺傳學(xué)分析中，比較了對(duì)這兩個(gè)治療組中藥物應(yīng)答的遺傳影響。如表4中所示，主要的受試者是白種人。基因組之間在年齡和診斷中沒(méi)有顯著差異。具有10個(gè)或者更多等位基因的受試者傾向于具有相對(duì)年輕的年齡，盡管該差異不是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。
表4 加入InterSePT研究的受試者根據(jù)hDAT1基因中VNTR多態(tài)性分類(lèi)的人口統(tǒng)計(jì)特征 值為平均值(SD)。
+使用Fisher精確檢驗(yàn)。
*使用ANOVA。
9≥小于或者等于9個(gè)重復(fù)；10≤大于或者等于10個(gè)重復(fù)。
在時(shí)序檢驗(yàn)中，VNTR多態(tài)性和到1型事件發(fā)生的時(shí)間之間的顯著關(guān)聯(lián)在氯氮平治療組(白種人亞群P＝0.0165，總?cè)后wP＝0.0252)中觀察到，但是在奧氮平治療組中沒(méi)有觀察到(白種人亞群P＝0.4058，總?cè)后wP＝0.7495)(圖1和圖2)。具有9個(gè)或者更少重復(fù)等位基因的受試者與具有10個(gè)或更多重復(fù)等位基因的至少一種拷貝的受試者相比顯示出顯著更高的1型事件發(fā)生率，提示所述9個(gè)或者更少的重復(fù)等位基因可能以隱性方式與弱氯氮平應(yīng)答相關(guān)。然而，如圖3和圖4中顯示的，在奧氮平治療組中不能檢測(cè)到這種關(guān)聯(lián)(白種人亞群P＝0.4058，總?cè)后wP＝0.7495)。
具有10個(gè)或更多重復(fù)等位基因的至少一種拷貝的受試者在1型事件的危險(xiǎn)方面行為相似。從而，進(jìn)行具有9個(gè)或者更少重復(fù)等位基因的受試者與具有10個(gè)或更多重復(fù)等位基因的至少一種拷貝的受試者的比較。觀察到關(guān)聯(lián)的提高的顯著性(白種人亞群P＝0.0042，總?cè)后wP＝0.0082)(圖5和圖6)。對(duì)于奧氮平治療組進(jìn)行類(lèi)似分析。再次，如圖7和圖8中所示，在奧氮平治療組中沒(méi)有檢測(cè)到關(guān)聯(lián)(白種人亞群P＝0.2486，總?cè)后wP＝0.7959)。
為了調(diào)節(jié)VNTR多態(tài)性和1型事件的危險(xiǎn)之間關(guān)系中的可能的混淆，建立了Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型。該多變量模型由VNTR多態(tài)性以及如下共變量(covariates)組成年齡、性別、藥物濫用和終生自殺企圖。如表5所示，VNTR多態(tài)性和1型事件的危險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)在氯氮平治療組中保持顯著(白種人亞群P＝0.0085，總?cè)后wP＝0.0396)。類(lèi)似地，在奧氮平治療組中沒(méi)有檢測(cè)到關(guān)聯(lián)(白種人亞群P＝0.2647，總?cè)后wP＝0.6902)。
表5 VNTR多態(tài)性和1型事件之間關(guān)聯(lián)性的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型的結(jié)果 值為平均值(SD)。
*調(diào)節(jié)年齡、性別、藥物濫用，和終生自殺企圖。
還計(jì)算了研究結(jié)束時(shí)每個(gè)基因組中具有1型事件的受試者的百分?jǐn)?shù)。如表6中所示，具有9個(gè)或者更少重復(fù)等位基因的44％的白種人顯示出1型事件。相比，具有10個(gè)或者更多重復(fù)等位基因的至少一種拷貝的白種人的僅約16％顯示出1型事件。在總?cè)后w中，具有9個(gè)或者更少重復(fù)等位基因的受試者的39％顯示出1型事件，具有10個(gè)或更多重復(fù)等位基因的至少一種拷貝的受試者的約16％顯示出1型事件。這些結(jié)果與通過(guò)時(shí)序檢驗(yàn)和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型檢測(cè)的關(guān)聯(lián)性一致。
表6 研究結(jié)束時(shí)根據(jù)hDAT1基因中VNTR多態(tài)性分類(lèi)的1型事件 值為受試者數(shù)目(％)。
此外，通過(guò)精神病評(píng)估，包括陽(yáng)性與陰性癥狀量表(PANSS)測(cè)量的應(yīng)答氯氮平治療的基因組之間沒(méi)有顯著差異。
DAT1基因中VNTR多態(tài)性和終生自殺企圖的關(guān)聯(lián).檢查了DAT1基因中VNTR多態(tài)性對(duì)基線疾病嚴(yán)重性的潛在影響。如表7中所示，終身自殺企圖或者過(guò)去36個(gè)月內(nèi)自殺企圖中的基因型之間有顯著差異。在VNTR多態(tài)性中具有9個(gè)或者更少重復(fù)等位基因的受試者與具有10個(gè)或更多重復(fù)等位基因的至少一種拷貝的受試者相比顯示出顯著更高的自殺企圖。與終生自殺企圖的關(guān)聯(lián)提示該多態(tài)性在改變疾病嚴(yán)重性中可能的作用。
表7 根據(jù)hDAT1基因中VNTR多態(tài)性分類(lèi)的基線特征 值為平均值(SD)。
*使用ANCOVA比較基因型組之間的差異。調(diào)節(jié)年齡和性別。
+使用Fisher精確檢驗(yàn)。
討論.在已經(jīng)描述的DAT1基因座中的一些多態(tài)性中，已經(jīng)在與人類(lèi)疾病的關(guān)聯(lián)研究中充分研究了40-bp VNTR多態(tài)性。似乎該VNTR多態(tài)性可能與創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(Segman RH等人，Mol.Psychiatry 7(8)903-7(2002))、注意缺陷多動(dòng)癥(ADHD)(Smith KM等人，Am.J Med.Genet.119B(1)77-85(2003)；Chen CK等人 Mol. Psychiatry 8(4)393-6(2003))、延長(zhǎng)的甲基苯丙胺精神病(Ujike H等人，Pharmacogenomics J.3(4)242-7(2003))、兒童中的外化(externalizing)行為問(wèn)題(Young SE等人，Am.J.Med.Genet.114(2)144-9(2002))，和具有暴飲暴食行為的進(jìn)食障礙疾患(Shinohara M等人，J.Psychiatry Neurosci.29(2)134-7(2004))有關(guān)。有趣的是，觀察到該VNTR多態(tài)性和ADHD患者中哌甲酯應(yīng)答之間的關(guān)聯(lián)。Kirley A等人，Am.J.Med. Genet.121B(1)50-4(2003)。
多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過(guò)將釋放的多巴胺返回到突觸前末梢而在調(diào)節(jié)突觸中多巴胺的活性中起關(guān)鍵作用。5-羥色胺和多巴胺的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輔助的攝入解釋了人行為或者精神狀態(tài)中的活性，因?yàn)樗鼈兪菑V泛使用的抗抑郁藥和精神活性藥物的作用位點(diǎn)。DAT1基因的3’UTR中的VNTR多態(tài)性影響腦中的基因表達(dá)，可能導(dǎo)致改變的神經(jīng)元傳遞。Mill J等人，Am.J.Med.Genet.114(8)975-9(2002)；Fuke S等人，Pharmacogenomics J.1(2)152-6(2001)。因此，該多態(tài)性代表藥物遺傳學(xué)分析的良好標(biāo)記。
在該實(shí)施例中，我們觀察到用氯氮平治療的精神分裂癥或者分裂情感性障礙患者中VNTR多態(tài)性和1型事件危險(xiǎn)之間的顯著關(guān)聯(lián)。該關(guān)聯(lián)僅存在于氯氮平治療組，但是不存在于奧氮平治療組中，提示VNTR多態(tài)性和氯氮平應(yīng)答之間的直接關(guān)系。
與終生自殺企圖的關(guān)聯(lián)表明該多態(tài)性在修飾疾病嚴(yán)重性中的功能。具有9個(gè)或者更少重復(fù)等位基因的受試者傾向于具有更高危險(xiǎn)的1型事件并且對(duì)氯氮平治療應(yīng)答稍差。
總結(jié).氯氮平是當(dāng)前可用于治療精神分裂癥癥狀的最具臨床強(qiáng)效的藥物之一。當(dāng)在治療前鑒定了最可能從氯氮平受益的那些患者時(shí)，它顯著改善了這些患者的臨床治療。
在用Clozaril治療的多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(SLC6A3)中兩種多態(tài)性(3’-UTR中的VNTR和外顯子9上的多態(tài)性)和到達(dá)發(fā)生1型事件(自殺企圖)的時(shí)間之間的關(guān)聯(lián)。這些結(jié)果表明SLC6A3基因型可以用于預(yù)測(cè)對(duì)自殺性的治療中的氯氮平應(yīng)答。當(dāng)兩種危險(xiǎn)因素組合時(shí)，關(guān)聯(lián)的顯著性稍微提高。具有兩種危險(xiǎn)因素的亞群中約40％的患者在研究結(jié)束時(shí)經(jīng)歷了1型事件；沒(méi)有兩種危險(xiǎn)因素的亞群中僅15％的患者具有1型事件。根據(jù)基因型，經(jīng)計(jì)算約10％患者是弱應(yīng)答者。從而，如果可以基于SLC6A3基因型從治療排除潛在的弱應(yīng)答者，那么可以顯著改善氯氮平應(yīng)答。
實(shí)施例2 在確定精神分裂癥和分裂情感性障礙關(guān)于氯氮平應(yīng)答的遺傳影響是否存在差異的工作中，進(jìn)行了基于疾病的亞群體分析。如表8中所示，通過(guò)1型事件測(cè)量的DAT1基因的VNTR多態(tài)性和氯氮平應(yīng)答之間的關(guān)聯(lián)僅存在于患有精神分裂癥的受試者中，但是不存在于患有分裂情感性障礙的受試者中。此外，在精神分裂癥或者分裂情感性障礙受試者中應(yīng)答奧氮平治療的基因型組之間沒(méi)有差異。這些結(jié)果表明精神分裂癥和分裂情感性障礙之間關(guān)于自殺行為的遺傳影響存在顯著差異。DAT1基因的3’UTR VNTR多態(tài)性是預(yù)測(cè)精神分裂癥患者中氯氮平應(yīng)答的遺傳標(biāo)記。
表8 在研究結(jié)束時(shí)根據(jù)hDAT1基因中VNTR多態(tài)性的1型事件 值是受試者數(shù)目(％)。
+終點(diǎn)1型事件。
S/S＝9≥/9≥；S/L＝10≤/9≥；L/L＝10≤/10≤。
++時(shí)序檢驗(yàn)用于比較基因型組之間到達(dá)1型事件的總體差異。
+++時(shí)序檢驗(yàn)用于比較S/S和S/L加上L/L之間到達(dá)1型事件的差異。
引用的參考文獻(xiàn) 本文引用的所有參考文獻(xiàn)都完整引入本文作為參考并且同樣為了所有目的，就好像每種每篇單獨(dú)的出版物或者專(zhuān)利或者專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)貏e并單獨(dú)地指出為了所有目的完整引入作為參考。本文討論的參考文獻(xiàn)的討論意在僅僅總結(jié)它們的作者作出的斷言并且不承認(rèn)任何參考文獻(xiàn)構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。申請(qǐng)人保留對(duì)所引用的參考文獻(xiàn)的準(zhǔn)確性和貼切性提出質(zhì)疑的權(quán)利。
此外，本文引用的所有GenBank檢索號(hào)、Unigene Cluster號(hào)和蛋白質(zhì)檢索號(hào)都完整并且同樣為了所有目的引入本文作為參考，就好像每個(gè)這種號(hào)碼都特別并單獨(dú)地指出為了所有目的將其完整引入本文作為參考。
本發(fā)明不限于按照本申請(qǐng)中描述的特定實(shí)施方案，其意在作為對(duì)本發(fā)明的個(gè)別方面的單個(gè)描述。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白的，可以做出本發(fā)明的許多修飾和變通方案而不背離其精神和范圍。根據(jù)前面的描述和附圖，除了本文列舉的方法和裝置之外，本發(fā)明范圍內(nèi)的功能上等同的方法和裝置將對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。此類(lèi)修飾和變通方案意在落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本發(fā)明僅僅受到所附權(quán)利要求，以及此類(lèi)權(quán)利要求的等同物的完整范圍的限制。
序列表
<110>諾瓦提斯公司
<120>用于預(yù)測(cè)對(duì)氯氮平治療的應(yīng)答性的生物標(biāo)記
<130>DV/4-33840A/USN
<150>60/577,131
<151>2004-06-04
<160>4
<170>FastSEQ for Windows版本4.0
<210>1
<211>60
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>等位基因
<222>(1)...(60)
<223>人多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SLC6A3)基因，
41341到41401位
<400>1
gaagccatcg ccacgctccc tctgtcctca gcctgggccg tggtcttctt catcatgctg 60
<210>2
<211>60
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>變異
<222>(1)...(60)
<223>人多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SLC6A3)基因，
41341到41401位，多態(tài)性59 A->G在41370位
<400>2
gaagccatcg ccacgctccc tctgtcctcg gcctgggccg tggtcttctt catcatgctg 60
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)...(22)
<223>PCR引物有義
<400>3
ggtgtaggga acggcctgag ag 22
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>protein_bind
<222>(1)...(24)
<223>PCR引物反義
<400>4
cttcctggag gtcacggctc aagg 2權(quán)利要求
1.氯氮平用于生產(chǎn)用于治療所選的患者群體中精神分裂癥的藥物的用途，其中基于表明對(duì)氯氮平應(yīng)答性的患者樣品中存在的生物標(biāo)記選擇所選的患者群體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述生物標(biāo)記是位于多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(SLC6A3；DAT1)基因的3’-非翻譯區(qū)(UTR)中的可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)多態(tài)性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述生物標(biāo)記還包含GenBank序列檢索參考號(hào)AF119117.1中41370位上SLC6A3外顯子9A59G中的多態(tài)性位點(diǎn)。
4.預(yù)測(cè)患者對(duì)氯氮平治療的應(yīng)答性的方法，其包括步驟
(a)從患者得到體液或者其他組織的樣品，和
(b)為患者的體液或者組織中存在的SLC6A3基因的兩種拷貝確定SLC6A3基因(hDAT1基因)的3’UTR區(qū)中存在的可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)多態(tài)性的身份，其中
(i)如果SLC6A3基因的兩種拷貝都具有VNTR多態(tài)性中的9個(gè)或者更少的重復(fù)等位基因，那么預(yù)測(cè)患者是關(guān)于自殺行為對(duì)氯氮平治療的弱應(yīng)答者；
(ii)如果SLC6A3基因的一種拷貝具有VNTR多態(tài)性中的9個(gè)或者更少的重復(fù)等位基因，并且另一種拷貝具有VNTR多態(tài)性中的10個(gè)或者更多重復(fù)等位基因，那么預(yù)測(cè)患者是關(guān)于自殺行為對(duì)氯氮平治療的良好應(yīng)答者；和
(iii)如果SLC6A3基因的兩種拷貝都具有VNTR多態(tài)性中的10個(gè)或者更多重復(fù)等位基因，那么預(yù)測(cè)患者是關(guān)于自殺行為對(duì)氯氮平治療的良好應(yīng)答者。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其還包括步驟
(c)為患者的體液或者組織中存在的SLC6A3基因的兩種拷貝確定GenBank序列檢索參考號(hào)AF119117.1中41370位上SLC6A3外顯子9A59G中的多態(tài)性位點(diǎn)上核苷酸對(duì)的身份，其中
(i)如果兩個(gè)核苷酸對(duì)都是AT，那么將該患者分類(lèi)為AA并且認(rèn)為所述患者處于危險(xiǎn)類(lèi)別I中；
(ii)如果一個(gè)核苷酸對(duì)是AT，并且一個(gè)是GC，那么將該患者分類(lèi)為GA，并且認(rèn)為所述患者處于危險(xiǎn)類(lèi)別II中；和
(iii)如果兩個(gè)核苷酸對(duì)都是GC，那么將該患者分類(lèi)為GG并且認(rèn)為所述患者處于危險(xiǎn)類(lèi)別III中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其還包括步驟
(d)如果將該患者置于危險(xiǎn)類(lèi)別II或者III中，那么在治療期間采取額外的自殺/自毀行為預(yù)防措施。
7.根據(jù)權(quán)利要求4到6任一項(xiàng)的方法，其中所述體液是血液。
8.預(yù)測(cè)對(duì)氯氮平治療的應(yīng)答性的方法，其包括
確定是否存在患者的SLC6A3基因的3’UTR區(qū)中可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)多態(tài)性的身份的替代標(biāo)記，其中
(i)如果替代標(biāo)記表明SLC6A3基因的兩種拷貝都具有VNTR多態(tài)性中的9個(gè)或者更少的重復(fù)等位基因，那么預(yù)測(cè)患者是關(guān)于自殺行為對(duì)氯氮平治療的弱應(yīng)答者；
(ii)如果替代標(biāo)記表明SLC6A3基因的兩種拷貝具有VNTR多態(tài)性中的9個(gè)或者更少的重復(fù)等位基因，并且另一種拷貝具有VNTR多態(tài)性中的10個(gè)或者更多重復(fù)等位基因，那么預(yù)測(cè)患者是關(guān)于自殺行為對(duì)氯氮平治療的良好應(yīng)答者；和
(iii)如果替代標(biāo)記表明SLC6A3基因的兩種拷貝都具有VNTR多態(tài)性中的10個(gè)或者更多重復(fù)等位基因，那么預(yù)測(cè)患者是關(guān)于自殺行為對(duì)氯氮平治療的良好應(yīng)答者。
9.用于預(yù)測(cè)對(duì)氯氮平治療的應(yīng)答性的試劑盒，所述試劑盒包含
(a)用于確定SLC6A3基因的3’UTR區(qū)域中存在的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)多態(tài)性的可變數(shù)目的手段；和
(b)用于確定外顯子9A59G多態(tài)性位點(diǎn)上SLC6A3多態(tài)性位點(diǎn)上遺傳多態(tài)性模式的手段。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的試劑盒，其還包含DNA樣品收集手段。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或者10的試劑盒，其中用于確定SLC6A3多態(tài)性位點(diǎn)上的遺傳多態(tài)性模式的手段包含SLC6A3基因型分型寡核苷酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的試劑盒，其中SLC6A3基因型分型引物組合物包含至少兩套等位基因特異的引物對(duì)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或者12的試劑盒，其中將SLC6A3基因型分型寡核苷酸包裝在分開(kāi)的容器中。
14.根據(jù)權(quán)利要求9到13任一項(xiàng)的試劑盒，其還包含用于收集體液樣品的手段。
全文摘要
本發(fā)明提供了預(yù)測(cè)治療期間患者中自殺或者自毀行為的可能性的方法。該方法利用多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(SLC6A3)的3’－UTR中VNTR多態(tài)性的檢測(cè)。認(rèn)為具有9個(gè)或者更少重復(fù)的患者是對(duì)氯氮平的弱應(yīng)答者。SLC6A3基因中9個(gè)或者更少的重復(fù)已經(jīng)與SLC6A3基因的弱表達(dá)相關(guān)。還提供了基于該多態(tài)性或者其替代標(biāo)記的存在或者缺失的治療方法。還提供了用于本發(fā)明方法中的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1973051SQ20058001785
公開(kāi)日2007年5月30日 申請(qǐng)日期2005年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月4日
發(fā)明者Y·何, E·M·勒羅伊 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司