專利名稱：血細(xì)胞抗原基因分型的方法和用于血細(xì)胞抗原基因分型的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血細(xì)胞抗原基因分型領(lǐng)域，更具體地涉及對紅細(xì)胞(血型抗原)、血小板(血小板抗原)和白細(xì)胞(白細(xì)胞抗原)上的抗原進(jìn)行基因分型。
本發(fā)明提供了一種血細(xì)胞抗原基因分型的方法和用于血細(xì)胞抗原基因分型的試劑盒，并提供了用于血細(xì)胞抗原基因分型的引物組和探針組。
背景技術(shù)：
在將來自供者的血液或者血液成分，例如紅細(xì)胞、血小板和白細(xì)胞施用于另一人(或者更寬泛而言，施用于另一個(gè)哺乳動(dòng)物個(gè)體)時(shí)，如果供者血液或者血液成分與受者血液不完全匹配，就有可能出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)。熟知的有輸血反應(yīng)(血液凝集)，其發(fā)生于例如將來自A型血供者的血液給予B型血的人的時(shí)候(血型抗原A和B屬于ABO系統(tǒng))。如果將獼猴血型D(RhD)陽性供者的血液給予RhD陰性患者，則很可能形成同種抗體。RhD抗體將導(dǎo)致RhD陽性紅細(xì)胞迅速破壞并引起輸血反應(yīng)。此外，如果具有紅細(xì)胞或血小板抗體的婦女懷孕，這些抗體可穿過胎盤并可破壞未出生的孩子的紅細(xì)胞或血小板。這可引起嚴(yán)重的溶血，導(dǎo)致貧血、黃疸(出生后)，且如果治療不當(dāng)可能是致命的或者引起腦損傷。因此，為了避免輸血反應(yīng)，當(dāng)前采用的輸血原則是僅輸注ABO和RhD相匹配的紅細(xì)胞。為了避免育齡婦女產(chǎn)生同種抗體以及在妊娠期間出現(xiàn)可能的并發(fā)癥，因此僅給她們輸注ABO、RhD和K1相匹配的紅細(xì)胞。將來也可能給育齡婦女輸注Rhc和RhE相匹配的紅細(xì)胞。
不過，也存在各種其他血型抗原(紅細(xì)胞抗原)，且如果將不匹配的供者血液輸給具有同種抗體的受者，這些抗原也會(huì)引起嚴(yán)重的問題。血小板特異性抗原分型對患者的診斷和治療十分重要，因?yàn)榭沙霈F(xiàn)不同的同種免疫性血小板減少綜合征。如果婦女產(chǎn)生了抗血小板抗原的抗體(絕大多數(shù)情況下是1型人血小板抗原(HPA)抗體)且大多數(shù)在妊娠期間產(chǎn)生，這些抗體可在未出生的孩子引起致命的血小板破壞，出血傾向增加。在一些病例，這可導(dǎo)致顱內(nèi)出血。為預(yù)防出血，需要輸注HPA-1a陰性血小板。
輸注血小板通常不預(yù)先進(jìn)行供者和受者的血小板抗原[人類人血小板抗原(HPA)]配型。輸注不相配的血液或者血液成分可導(dǎo)致產(chǎn)生同種抗體，對于那些需要頻繁或者反復(fù)輸注紅細(xì)胞或血小板(或白細(xì)胞)的患者來說尤其如此。如果形成了多種同種抗體，或者如果同種抗體針對的是高頻率抗原，那么尋找相適合的紅細(xì)胞或血小板就成了一個(gè)問題。根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的研究(Seltsam et al.，2003)，在具有針對高頻率抗原的抗體的住院患者中，大約有1/3的患者的輸血支持治療是不令人滿意的。
測試血型抗原和抗體的經(jīng)典方法通過血細(xì)胞凝集試驗(yàn)進(jìn)行表型分型。這一血清學(xué)測試技術(shù)簡單便宜，不過其費(fèi)用和難度在需要進(jìn)行多重分析以進(jìn)行完全配型時(shí)將會(huì)增加，并且其需要有大量的特異性抗血清。僅在荷蘭，血液供者的總數(shù)便有500,000人之眾，且估計(jì)每年增加大約60,000名供者。對于紅細(xì)胞，存在至少29種血型抗原系統(tǒng)(各具有許多不同的等位基因)。此外，其還涉及對高頻率抗原和低頻率抗原進(jìn)行分型。與臨床相關(guān)的血細(xì)胞抗原系統(tǒng)大約有60種。因此，對所有的血液供者進(jìn)行完全的表型分型是一種昂貴、繁重、耗時(shí)的工作，并且由于缺乏足夠的分型試劑，這也是不可行的。
絕大多數(shù)血細(xì)胞抗原系統(tǒng)的分子基礎(chǔ)是已知的。絕大多數(shù)血型抗原、血小板抗原和中性粒細(xì)胞抗原是雙等位基因，并且是單核苷酸多態(tài)性(SNP)的結(jié)果。這些SNP可用于進(jìn)行基因分型?？萍嘉墨I(xiàn)中公開了數(shù)不清的用于對血型和血小板抗原進(jìn)行基因分型的基于DNA的測試方法，其中包括PCR-RFLP、等位基因特異性PCR、作為單一或者多重分析的序列特異性PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、單核苷酸染料終止子延伸方法以及高通量珠技術(shù)(綜述見Reid，2003)。采用質(zhì)譜分光光度計(jì)或者熱測序儀(pyrosequencer)的半定量方法也可用于基因分型。
例如，Randen et al.(2003)最近公開了采用LightCycler技術(shù)進(jìn)行解鏈曲線分析對人血小板抗原1、2、3、4、5和Gov(最近被稱為HPA-15，Metcalfe et al.，2003)進(jìn)行基因分型的方法。疾病最經(jīng)常涉及雙等位基因系統(tǒng)HPA-1至5和Gov(Berry et al.，2000)，這使得它們成為基因分型的重要靶位。LightCycler技術(shù)涉及使用對每一種上述血小板抗原具有特異性的引物對，通過PCR擴(kuò)增供者DNA的有關(guān)片段。使用熒光雜交探針和解鏈曲線分析能夠?qū)崿F(xiàn)在同一毛細(xì)管同時(shí)檢測血小板抗原的兩個(gè)等位基因，其不需要進(jìn)行以往基因分型方法所使用的繁重而費(fèi)時(shí)的凝膠電泳。
不過，與所有其他的已知的血細(xì)胞抗原基因分型方法一樣，LightCycler技術(shù)不能進(jìn)行對血液供者進(jìn)行完全基因分型這一任務(wù)量巨大的工作，這一工作需要的是適合進(jìn)行高通量篩選的方法。對60,000名供者的兩次不同的獻(xiàn)血進(jìn)行60種血型和血小板抗原的分型需要進(jìn)行每年7百萬次以上的分型測試，或者每周大約140,000次的分型測試。因此，為完成這一任務(wù)，十分需要一種快速可靠的高通量方法。
多重聚合酶鏈反應(yīng)自二十世紀(jì)八十年代出現(xiàn)以來，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)已經(jīng)有了很大的進(jìn)展。Chamberlain et al.(1988)披露了以多重PCR作為通用技術(shù)來擴(kuò)增(基因組)DNA中的多基因座。其中，在一個(gè)反應(yīng)混合物中加入的不是用于擴(kuò)增一個(gè)基因座的一對引物，而是多個(gè)引物對。不過，擴(kuò)增反應(yīng)的復(fù)雜性限制了此類多重PCR的進(jìn)展。反應(yīng)成分和循環(huán)條件必須根據(jù)每一額外的引物對而加以調(diào)整。為克服這一問題，Shuber et al.(1995)引入了“嵌合”序列特異性引物。這些引物與模板DNA互補(bǔ)并在5′端含有一無關(guān)的20個(gè)核苷酸的標(biāo)簽(通用序列)。盡管這些引物被設(shè)計(jì)為使得它們的預(yù)期解鏈溫度與其他引物類似并具有低于-10 kcal/mole的形成引物雙鏈的AG計(jì)算值，但仍需調(diào)整這些引物的濃度以獲得相似產(chǎn)率的PCR產(chǎn)物。為克服這一問題，同時(shí)也為了進(jìn)一步降低引物二聚體的形成，Belgrade et al.(1996)僅使用了有限量的嵌合引物(2pmol)并在15個(gè)PCR循環(huán)后加入過量的通用引物。然后在較低的退火溫度下再進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的熱循環(huán)。Brownie et al.(1997)加入了最初即已經(jīng)存在于PCR反應(yīng)混合物中的通用引物。4個(gè)PCR循環(huán)后，將退火溫度自60℃升高至74℃，并再進(jìn)行35個(gè)PCR循環(huán)。此外，Heath et al.(2000)披露了巢式PCR，他們再第二個(gè)PCR中加入兩種(互補(bǔ)的)通用引物，其中之一在5′端攜帶熒光標(biāo)簽。
迄今為止，多重PCR僅使用相對較少幾組引物對進(jìn)行等位基因特異性擴(kuò)增。現(xiàn)有技術(shù)中既沒有公開在對大量血細(xì)胞抗原進(jìn)行基因分型的方法中使用多重PCR的可行性，也沒有公開適合此類血細(xì)胞抗原基因分型的PCR條件和引物混合物的特點(diǎn)，也沒有公開用于分析擴(kuò)增產(chǎn)物以進(jìn)行與臨床有關(guān)的血細(xì)胞抗原基因型分型的實(shí)用、快速和可靠的方法。
DNA微陣列基因分型的通用領(lǐng)域已經(jīng)有了一些采用微陣列技術(shù)的方法，其中之一是所謂的微測序方法(mini-sequencing method)，其包括微陣列上的或者是溶液中的等位基因特異性延伸物(Pastinen et al.，1997；Fan et al.，2000)。這種方法的一個(gè)困難之處在于出現(xiàn)非特異性引物延伸，因此需要進(jìn)一步優(yōu)化引物或者延伸方法本身(Pastinen et al.，2000；Lindroos et al.，2002)。此外，這種方法需要步驟繁多的酶性處理和純化。
另一種方法稱為微陣列上的等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASO)。這種方法依賴于用于基因型測定的靶與短寡核苷酸探針的熱穩(wěn)定性(Hacia et al.，1996；Wang et al.，1998)。最初的發(fā)光寡核苷酸陣列出現(xiàn)于1991(Fodor et al.)。該方法已經(jīng)用于確定新的SNP或者用于重復(fù)測序(resequencing)。其也用于基因分型(Evans et al.，2002)，這通過將衍生自患者樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣至陣列上并使陣列與等位基因特異性寡聚物接觸，以分辨患者的等位基因。已經(jīng)公開了很多變化形式，它們采用不同的工具，例如酶、納米顆粒探針、人工核苷酸、熱梯度、流通陣列(flow-through arrays)、阻斷寡核苷酸，以提高敏感性或者特異性(Lu et al.，2002；Park et al.，2002；Prix et al.，2002；Kajiyama et al.，2003；Jobs et al.，2003；Van Beuningen et al.，2001；Iwasaki et al.，2002)。Wen et al.，2000對以寡核苷酸陣列分析TP53突變的敏感性和特異性與常規(guī)的DNA序列分析進(jìn)行了比較。所使用的寡核苷酸陣列對每一SNP含有多個(gè)探針。為了將寡聚物固定于基質(zhì)支持物，通常是玻片，探針可具有間隔物和胺基(Guoet al.，2001；Wen et al.，2003)。已經(jīng)公開了多種微陣列格式，例如具有96-微陣列格局的玻片，每個(gè)陣列含有250個(gè)點(diǎn)，以提高通量(Huang et al.，2001)。已經(jīng)公開了流通系統(tǒng)(Flow-through systems)以降低雜交時(shí)間并由此提高通量(Cheek et al.，2001；Van Beuningen et al.，2001)。
迄今為止，DNA微陣列方法尚未用于血細(xì)胞抗原基因分型，且現(xiàn)有技術(shù)中既沒有公開在對大量血細(xì)胞抗原進(jìn)行基因分型的方法中使用DNA微陣列的可行性，也沒有公開適合此類血細(xì)胞抗原基因分型的寡核苷酸探針和微陣列格式的特點(diǎn)，也沒有公開用于分析雜交結(jié)果以進(jìn)行與臨床有關(guān)的血細(xì)胞抗原基因型分型的實(shí)用、快速和可靠的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供可對大量血細(xì)胞抗原進(jìn)行基因分型的實(shí)用、快速和可靠的方法和手段。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是開發(fā)一種高通量技術(shù)，以使得能夠就整個(gè)現(xiàn)有的供者群體和/或增加的供者群體，在20種且最終在大約60種血細(xì)胞抗原系統(tǒng)的數(shù)量級上對大量血細(xì)胞抗原進(jìn)行基因分型，由此有助于選擇正確的供者血液并提高輸血的安全性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是實(shí)現(xiàn)基本上完全和可靠的基因分型，其至少覆蓋大多數(shù)與臨床有關(guān)的血細(xì)胞抗原系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)這一目的可僅使用簡單的裝置，將單一DNA樣品在單一的反應(yīng)管中進(jìn)行一輪PCR反應(yīng)，以同時(shí)擴(kuò)增相關(guān)的DNA片段并以可檢測的方式對其進(jìn)行標(biāo)記，并在短時(shí)間內(nèi)完成，例如少于30小時(shí)，或者少于24小時(shí)，優(yōu)選地少于6小時(shí)，且更優(yōu)選地少于2小時(shí)，或者更加優(yōu)選地少于1小時(shí)。
為達(dá)到上述目的，在一個(gè)方面，本發(fā)明通過提供了一種血細(xì)胞抗原基因分型的方法，其包括對來自一哺乳動(dòng)物物種的個(gè)體的DNA進(jìn)行多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)以便擴(kuò)增并以可檢測方式標(biāo)記至少兩種不同的血細(xì)胞抗原的基因座的含有所述血細(xì)胞抗原的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域，并使用如此擴(kuò)增并標(biāo)記的DNA片段來確定每一所述血細(xì)胞抗原的基因型，所述多重PCR包括使用針對每一種待進(jìn)行基因分型的血細(xì)胞抗原的至少一對血細(xì)胞抗原特異性嵌合引物以及至少一種以可檢測方式標(biāo)記的通用引物，其中所述至少一種通用引物具有不存在于所述哺乳動(dòng)物物種的DNA中的獨(dú)特序列，且其中每一嵌合引物對包括左側(cè)嵌合引物和右側(cè)嵌合引物，它們各自包括位于3′端的血細(xì)胞抗原特異性部分和位于5′端的通用部分，其中所述嵌合引物的通用部分的堿基序列對應(yīng)于所述至少一種通用引物的堿基序列，且其中所述嵌合引物對的所述血細(xì)胞抗原特異性部分包含所述血細(xì)胞抗原的基因座的含有所述血細(xì)胞抗原的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域。
在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地使用一對以可檢測方式標(biāo)記的通用引物，所述通用引物具有不存在于所述哺乳動(dòng)物物種的DNA中的獨(dú)特序列，且優(yōu)選地對于每一嵌合引物對，所述嵌合引物對的一個(gè)成員的通用部分的堿基序列對應(yīng)于通用引物對的一個(gè)成員的堿基序列，且所述嵌合引物對的另一成員的通用部分的堿基序列對應(yīng)于所述通用引物對的另一成員的堿基序列。
此外，在本發(fā)明中，特別優(yōu)選地通過將多重PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)變性后與存在于DNA陣列中或以任何其他形式存在例如載于珠上的血細(xì)胞抗原等位基因特異性寡核苷酸探針進(jìn)行雜交，并分析雜交模式，以確定每一所述血細(xì)胞抗原的基因型。
在另一方面，本發(fā)明提供了用于通過在此所述的方法進(jìn)行血細(xì)胞抗原基因分型的試劑盒，其包括針對每一種待進(jìn)行基因分型的血細(xì)胞抗原的至少一對血細(xì)胞抗原特異性嵌合引物以及一對以可檢測方式標(biāo)記的通用引物，均如在此所定義者。
本發(fā)明還提供了一組用于多重PCR的血細(xì)胞抗原特異性嵌合引物對，以及一組用于血細(xì)胞抗原基因分型的血細(xì)胞抗原等位基因特異性寡核苷酸探針。


圖1顯示了在存在或不存在通用MAPH引物時(shí)的19種血型抗原的多重PCR結(jié)果。在最初的擴(kuò)增循環(huán)過程中僅擴(kuò)增到極少量的PCR產(chǎn)物(泳道2)，但足以在隨后的循環(huán)中用作通用MAPH引物的模板。MAPH引物進(jìn)行有效的擴(kuò)增(泳道3)，因此幾乎不需要調(diào)整引物濃度，且獲得了相似產(chǎn)率的PCR產(chǎn)物。
圖2顯示了來自如本發(fā)明所述的19種血型抗原的多重PCR的、通過ABI毛細(xì)管測序儀獲得的圖式。
圖3顯示了6個(gè)供者樣品的雜交掃描結(jié)果，其各自包括人血小板抗原1至5和Gov的6種PCR產(chǎn)物。一個(gè)樣品的PCR產(chǎn)物與兩個(gè)陣列雜交，也就是4個(gè)區(qū)(blocks)。原始的掃描圖具有紅色的點(diǎn)和黑色的背景。為了更好的觀察，將其轉(zhuǎn)變?yōu)榉崔D(zhuǎn)灰階圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種血細(xì)胞抗原基因分型的方法，其包括對來自一哺乳動(dòng)物物種的個(gè)體的DNA進(jìn)行多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)以便擴(kuò)增并以可檢測方式標(biāo)記至少兩種不同的血細(xì)胞抗原的基因座的含有所述血細(xì)胞抗原的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域，并使用如此擴(kuò)增和標(biāo)記的DNA片段來確定每一種所述血細(xì)胞抗原的基因型，所述多重PCR包括使用針對每一種待進(jìn)行基因分型的血細(xì)胞抗原的至少一對血細(xì)胞抗原特異性嵌合引物以及至少一種以可檢測方式標(biāo)記的通用引物，其中所述至少一種通用引物具有不存在于所述哺乳動(dòng)物物種的DNA中的獨(dú)特序列，且其中每一嵌合引物對包括左側(cè)嵌合引物和右側(cè)嵌合引物，它們各自包括位于3′端的血細(xì)胞抗原特異性部分和位于5′端的通用部分，其中所述嵌合引物的通用部分的堿基序列對應(yīng)于所述至少一種通用引物的堿基序列，且其中所述嵌合引物對的所述血細(xì)胞抗原特異性部分包含所述血細(xì)胞抗原的基因座的區(qū)域，該區(qū)域含有所述血細(xì)胞抗原的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。
更具體地，本發(fā)明提供了一種血細(xì)胞抗原基因分型的方法，其包括對來自一哺乳動(dòng)物物種的個(gè)體的DNA進(jìn)行多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)以便擴(kuò)增并以可檢測方式標(biāo)記至少兩種不同的血細(xì)胞抗原的基因座的區(qū)域，該區(qū)域含有所述血細(xì)胞抗原的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，并使用如此擴(kuò)增和標(biāo)記的DNA片段來確定每一種所述血細(xì)胞抗原的基因型，所述多重PCR包括使用針對每一種待進(jìn)行基因分型的血細(xì)胞抗原的至少一對血細(xì)胞抗原特異性嵌合引物和一對以可檢測方式標(biāo)記的通用引物，其中所述通用引物對包括正向通用引物和反向通用引物，所述通用引物各自具有不存在于所述哺乳動(dòng)物物種的DNA中的獨(dú)特序列，且其中每一嵌合引物對包括左側(cè)嵌合引物和右側(cè)嵌合引物，它們各自包括位于3′端的血細(xì)胞抗原特異性部分和位于5′端的通用部分，其中這些嵌合引物之一的通用部分的堿基序列對應(yīng)于所述通用引物之一的堿基序列，且另一嵌合引物的通用部分的堿基序列對應(yīng)于另一通用引物的堿基序列，且其中所述嵌合引物對的所述血細(xì)胞抗原特異性部分包含所述血細(xì)胞抗原的基因座的含有所述血細(xì)胞抗原的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域。
本發(fā)明包括一系列特定的步驟，這些步驟組合起來能夠?qū)崿F(xiàn)上述的目的。該系列步驟包括自用于進(jìn)行本發(fā)明的基因分型分析的樣品中分離DNA，隨后進(jìn)行本發(fā)明的關(guān)鍵方面之一，即對攜帶造成血細(xì)胞抗原差別的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的基因片段進(jìn)行多重PCR。該多重PCR使用不同引物的混合物，這些引物包括兩對或兩對以上嵌合引物，此外還包括一種標(biāo)記的通用引物或一對標(biāo)記的通用引物。然后將如此擴(kuò)增并標(biāo)記的DNA片段變性(例如通過加熱)，并在能夠使得相匹配的序列發(fā)生雜交的條件下與一組探針相接觸，優(yōu)選地是存在于微陣列中的探針，所述微陣列包括眾多等位基因特異性探針。下一步，測定微陣列中每一個(gè)點(diǎn)上的標(biāo)記片段的存在情況，最后對測定的信號進(jìn)行解析以對樣品進(jìn)行分型。探針也可以其他形式存在，例如可以是固定于珠(玻璃珠、聚乙烯珠等)上的探針，或者是附著于適當(dāng)容器的壁上的探針等。不過陣列格式是最為優(yōu)選的實(shí)施方式。
物種本發(fā)明不僅可以進(jìn)行人類血細(xì)胞抗原基因分型，也可以對所有具有血細(xì)胞抗原系統(tǒng)的動(dòng)物進(jìn)行血細(xì)胞抗原基因分型。就實(shí)用性目的而言，基因分型涉及哺乳動(dòng)物的血細(xì)胞抗原，包括例如牲畜和寵物、野生動(dòng)物以及大體上所有具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值、情感價(jià)值或者野生動(dòng)物保護(hù)價(jià)值的動(dòng)物。不過，最優(yōu)選地，本發(fā)明涉及對人類進(jìn)行血細(xì)胞抗原基因分型。
血細(xì)胞抗原可通過本發(fā)明的方法進(jìn)行基因分型的血細(xì)胞抗原包括典型的血型抗原，例如Kidd、Duffy、Kell和獼猴血型。ABO血型抗原系統(tǒng)也可采用本發(fā)明進(jìn)行基因分型，不過由于其具有極其的重要性，可能必須進(jìn)行已有的且已經(jīng)公認(rèn)的血清學(xué)測試?？墒褂帽景l(fā)明進(jìn)行基因分型的其他血型抗原包括導(dǎo)致以下血型系統(tǒng)發(fā)生基因沉默的抗原變體和/或基因變體MNS、獼猴血型(Rh)、Kell、Kidd、Duffy、Colton、Diego、Dombrock、Lutheran、Lewis、Cartwright、Landsteiner Wiener(LW)、Cromer、Knops、Kx、Indian、Gerbich、Hh、Chido/Rodgers、GIL、I、JMH、OK、P-related、RAPH-MER2、Scianna、Xg、YT等。
除了血型抗原，本發(fā)明的方法也可用于血小板和白細(xì)胞(特別是中性粒細(xì)胞)抗原進(jìn)行基因分型。與臨床關(guān)聯(lián)最為密切的血小板抗原(至少是在西方世界)包括HPA-1、HPA-2、HPA-3、HPA-4、HPA-5和Gov(或HPA-15)?？墒褂帽景l(fā)明進(jìn)行基因分型的其他血小板抗原包括例如人血小板抗原6至14和16，雖然認(rèn)為這些抗原不是很重要。可使用本發(fā)明的方法進(jìn)行基因分型的典型的人中性粒細(xì)胞(Human Neutrophil Antigens)的實(shí)例包括HNA-1、4和5，其他抗原，例如HNA-2和3，一旦其分子基礎(chǔ)得以闡明即可進(jìn)行基因分型。
可以設(shè)想，即便僅僅對很小量的血細(xì)胞抗原進(jìn)行基因分型，依然可以采用本發(fā)明。出于某些目的，可能僅對紅細(xì)胞抗原、或僅對血小板抗原、或僅對與某一特別情況有關(guān)的一組選定的抗原進(jìn)行基因分型即可。采用本發(fā)明進(jìn)行基因分型的血細(xì)胞抗原的最小數(shù)量是兩種血細(xì)胞抗原，例如血細(xì)胞抗原RhD和RHD基因變體RhDψ，或者血細(xì)胞抗原JK1/2(Jka/Jkb)和血細(xì)胞抗原FY1/2(Fya/Fyb)。對更大量的血細(xì)胞抗原進(jìn)行基因分型顯然是優(yōu)選的，例如3、4、5種，且特別是6種或者更多。不過，在大多數(shù)情況下，優(yōu)選地進(jìn)行至少覆蓋絕大多數(shù)與臨床相關(guān)的血細(xì)胞抗原的差不多完全的基因分型。最為優(yōu)選地，本發(fā)明包括特異于HPA-1至5和HPA-15的至少6種不同的嵌合引物對，以及特異于紅細(xì)胞抗原的至少10或11或12種嵌合引物對，例如特異于各種Kidd、Duffy、Kell和獼猴血型抗原。
DNA
進(jìn)行多重PCR的DNA通常是待進(jìn)行血細(xì)胞抗原基因分型的個(gè)體的基因組DNA。
供者DNA可來自任何合適的來源，例如來自EDTA、肝素或檸檬酸鹽處理的血液樣品或白細(xì)胞層(buffy coats)，這可采用本領(lǐng)域人員已知的分離方法和手段，例如商品化的Qiagen Blood DNA提取試劑盒，采用鹽析方法，例如使用Miller et al.(1988)的標(biāo)準(zhǔn)方案，或者采用RocheMagnapure。
通用引物本發(fā)明的方法使用攜帶可檢測標(biāo)記物的至少一種通用引物，優(yōu)選地是攜帶可檢測標(biāo)記物的一對通用引物。通用引物的序列對應(yīng)于嵌合引物5’端的通用部分的序列。可以僅使用一種通用引物。在這種情況下，所有嵌合引物在其5’端均具有相同的堿基序列，即嵌合引物5’端的通用部分對應(yīng)于該單一通用引物的序列。不過，在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)使用兩種不同的通用引物(即一對通用引物)是優(yōu)選的。在這種情況下，每對嵌合引物含有一具有對應(yīng)于所述通用引物之一的通用部分的引物，以及一具有對應(yīng)于另一通用引物的通用部分的引物。
重要的是，通用引物不與待基因分型的DNA發(fā)生雜交。假定待基因分型的DNA是人基因組DNA，通用引物(以及嵌合引物的相應(yīng)部分)不應(yīng)該雜交于人基因組DNA，且因此應(yīng)該具有不存在于所述DNA中的獨(dú)特序列。優(yōu)選地，通用引物的序列明顯不同于存在于人基因組中的任何序列。此外，特別優(yōu)選的是，通用引物被設(shè)計(jì)為使得其Tm值與嵌合引物中特異于血細(xì)胞抗原的部分的Tm值相似。優(yōu)選地，通用引物的Tm值在50至70℃之間，更優(yōu)選地在56至68℃之間。此外，通用引物的長度優(yōu)選地為12至30個(gè)堿基，更優(yōu)選地為15至25個(gè)，或者更加優(yōu)選地為16至20個(gè)堿基。
使用White et al.，2002公開的通用引物獲得了非常好結(jié)果，其中序列g(shù)gccgcgggaattcgatt(SEQ ID NO1，正向MAPH)的Tm為67.55℃，而gccgcgaattcactagtg(SEQ ID NO2，反向MAPH)的Tm為57.94℃。
可檢測標(biāo)記物通用引物攜帶可檢測標(biāo)記物。標(biāo)記物可以是任何適合于具體目的的標(biāo)記物，例如放射性原子或基團(tuán)、酶例如催化其底物發(fā)生可測定的轉(zhuǎn)化的酶、染料、熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、生物素等。最為優(yōu)選地，標(biāo)記物是熒光團(tuán)，本領(lǐng)域人員已知多種這樣的熒光團(tuán)。其中的實(shí)例是Cy3、Cy5、熒光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)、羅丹明、Hex、Tet、Fam等。
最優(yōu)選地，本發(fā)明使用熒光團(tuán)Cy5，這是一種Sulfoindocyanine染料(Mujumdar et al.，1993)。
通常，特別是如果標(biāo)記物是連接于寡核苷酸的一種基團(tuán)，其應(yīng)該連接于通用引物的寡核苷酸序列的5’端。
由于通用引物是標(biāo)記的，因此盡管嵌合引物沒有標(biāo)記，本發(fā)明仍然在擴(kuò)增的同時(shí)實(shí)現(xiàn)了非常高效的標(biāo)記，同時(shí)可以使用未經(jīng)事先標(biāo)記的各種嵌合引物。
嵌合引物本發(fā)明所用的嵌合引物在其5’端具有通用部分且在其3’端具有血細(xì)胞抗原特異性部分。通用部分的寡核苷酸序列對應(yīng)于通用引物的序列，在此對其不需要進(jìn)一步闡述。
至于嵌合引物的血細(xì)胞抗原特異性部分，最優(yōu)選的是這些部分具有相似的Tm值，無論是與混合物中的其他嵌合引物的血細(xì)胞抗原特異性部分相比，還是與所用的通用引物相比，均是如此。因此，優(yōu)選的是嵌合引物的血細(xì)胞抗原特異性部分的Tm值在50至70℃之間，更優(yōu)選地在55至65℃之間，且最優(yōu)選地在56至62℃之間。此外，嵌合引物的血細(xì)胞抗原特異性部分的長度優(yōu)選地為12至35個(gè)堿基，更優(yōu)選地為15至30個(gè)，或者更加優(yōu)選地為16至25個(gè)堿基。
此外，所選定的嵌合引物的血細(xì)胞抗原特異性部分優(yōu)選地使得PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的寡核苷酸產(chǎn)物的長度為50至800、優(yōu)選地80至500、最優(yōu)選地100至400或300個(gè)核苷酸。產(chǎn)物的長度為100至200個(gè)核苷酸應(yīng)該是理想的。
用于設(shè)計(jì)合適的嵌合引物的血細(xì)胞抗原特異性部分的各種軟件產(chǎn)品是已知的?；诠娔軌颢@得的編碼血細(xì)胞抗原的基因的DNA序列，可使用軟件Primer3(http://www.broad.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3www.cgi)來設(shè)計(jì)引物?？墒褂肅ELERA數(shù)據(jù)庫來核實(shí)任何非特異性的基因組DNA結(jié)合，并可使用Oligo6軟件(Medprobe)來核實(shí)任何引物二聚體的形成。優(yōu)選地選擇AG計(jì)算值低于-10kcal/mole的引物。
優(yōu)選的嵌合引物列表包括以下引物HPA1-left gccgcgaattcactagtgcttcaggtcacagcgaggt SEQ ID NO3HPA1-right ggccgcgggaattcgattgctccaatgtacggggtaaa SEQ ID NO4HPA2-left gccgcgaattcactagtgtgaaaggcaatgagctgaag SEQ ID NO5HPA2-right ggccgcgggaattcgattagccagactgagcttctcca SEQ ID NO6HPA3-left gccgcgaattcactagtggcctgaccactcctttgc SEQ ID NO7HPA3-right ggccgcgggaattcgattggaagatctgtctgcgatcc SEQ ID NO8HPA4-left gccgcgaattcactagtgatccgcaggttactggtgag SEQ ID NO9HPA4-right ggccgcgggaattcgattccatgaaggatgatctgtgg SEQ ID NO10HPA5-left gccgcgaattcactagtgtccaaatgcaagttaaattaccag SEQ ID NO11HPA5-right ggccgcgggaattcgattacagacgtgctcttggtaggtSEQ ID NO12HPA15-left gccgcgaattcactagtgtgtatcagttcttggttttgtgatgSEQ ID NO13HPA15-rightggccgcgggaattcgattaaaaccagtagccacccaag SEQ ID NO14JI1/2-left gccgcgaattcactagtggtctttcagccccatttgag SEQ ID NO15JK1/2-rightggccgcgggaattcgattgttgaaaccccagagtccaa SEQ ID NO16
FY1/2-left gccgcgaattcactagtggaattcttcctatggtgtgaatgaSEQ ID NO17FY1/2-right ggccgcgggaattcgattaagaagggcagtgcagagtcSEQ ID NO18GATAbox-leftgccgcgaattcactagtgggccctcattagtccttgg SEQ ID NO19GATAbox-right ggccgcgggaattcgattgaaatgaggggcatagggata SEQ ID NO20Fyx-leftgccgcgaattcactagtgtcatgcttttcagacctctcttc SEQ ID NO175Fyx-right ggccgcgggaattcgattcaagacgggcaccacaat SEQ ID NO176KEL1/2-left gccgcgaattcactagtgaagggaaatggccatactgaSEQ ID NO21KEL1/2-rightggccgcgggaattcgattagctgtgtaagagccgatccSEQ ID NO22KEL3/4-left gccgcgaattcactagtggcctcagaaactggaacagcSEQ ID NO23KEL3/4-rightggccgcgggaattcgattagcaaggtgcaagaacactct SEQ ID NO24KEL6/7-left gccgcgaattcactagtggcagcaccaaccctatgttcSEQ ID NO177KEL6/7-rightggccgcgggaattcgatttcaggcacaggtgagcttc SEQ ID NO178RHCEex2for gccgcgaattcactagtgcgtctgcttccccctcc SEQ ID NO25RHex2revggccgcgggaattcgattctgaacagtgtgatgaccacc SEQ ID NO26RHDex3-left gccgcgaattcactagtgtcctggctctccctctct SEQ ID NO179RHCEex3-right ggccgcgggaattcgatttttttcaaaaccccggaag SEQ ID NO180RHCEex5-leftgccgcgaattcactagtgggatgttctggccaagtg SEQ ID NO27RHex5revggccgcgggaattcgattggctgtcaccacactgactgSEQ ID NO28RHDψ-left ggccgcgggaattcgattgtagtgagctggcccatca SEQ ID NO29RHDψ-right gccgcgaattcactagtgtgtctagtttcttaccggcaagt SEQ ID NO30RHD-leftB gccgcgaattcactagtgttataataacacttgtccacagggSEQ ID NO31RHD-rightC ggccgcgggaattcgattcggctccgacggtatcSEQ ID NO32BigC-left gccgcgaattcactagtgggccaccaccatttgaa SEQ ID NO33BigC-right intron2 ggccgcgggaattcgattccatgaacatgccacttcacSEQ ID NO34RhDVI-left(fw) ggccgcgggaattcgattctttgaattaagcacttcacaga SEQ ID NO181RhDVI-right(rev)gccgcgaattcactagtggccagaatcacactcctgctSEQ ID NO182MN-left gccgcgaattcactagtgtgagggaatttgtcttttgca SEQ ID NO35
MN-right ggccgcgggaattcgattcagaggcaagaattcctcca.SEQ ID NO36Ss-leftgccgcgaattcactagtgtttttctttgcacatgtctttSEQ ID NO183Ss-right ggccgcgggaattcgatttctttgtctttacaatttcgtgtg SEQ ID NO184U-left gccgcgaattcactagtgcgctgatgttatctgtcttatttttc SEQ ID NO37U-rightggccgcgggaattcgattgatcgttccaataataccagcc SEQ ID NO38DO-leftggccgcgggaattcgatttgatccctccctatgagctg SEQ ID NO185DO-right gccgcgaattcactagtgttatatgtgctcaggttcccagt SEQ ID NO186JO-leftgccgcgaattcactagtgcctggcttaaccaaggaaaa SEQ ID NO39JO-right ggccgcgggaattcgatttcatactgctgtggagtcctgSEQ ID NO40Colton-leftgccgcgaattcactagtggccacgaccctctttgtct SEQ ID NO187Colton-right ggccgcgggaattcgatttacatgagggcacggaagat SEQ ID NO188Diego-left gccgcgaattcactagtgacttattcacgggcatccag SEQ ID NO189Diego-rightggccgcgggaattcgattaagctccacgttcctgaaga SEQ ID NO190Wr-leftgccgcgaattcactagtgggcttcaaggtgtccaactc SEQ ID NO636Wr-right ggccgcgggaattcgattaggatgaagaccagcagagc SEQ ID NO637Yt-leftggccgcgggaattcgattccttcgtgcctgtggtagat SEQ ID NO638Yt-right gccgcgaattcactagtgttctgggacttctgggaatg SEQ ID NO639Lu-leftgccgcgaattcactagtgggacccagagagagagagactg SEQ ID NO640Lu-right ggccgcgggaattcgattgggagtccagctggtatgg SEQ ID NO641。
最優(yōu)選的是具有SEQ ID NO3至40的嵌合引物。
上述軟件產(chǎn)品能夠使得本領(lǐng)域人員設(shè)計(jì)用于其他血細(xì)胞抗原的其他引物。本發(fā)明包括使用一組具有相同的血細(xì)胞抗原特異性部分但具有不同的通用部分的相似的嵌合引物。
引物的比例為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，且特別是盡可能避免出現(xiàn)引物二聚體，重要的是僅使用最小比例的嵌合引物，而擴(kuò)增主要是歸因于通用引物的延伸。在實(shí)踐中，所使用的通用引物的摩爾量優(yōu)選地是每一嵌合引物的摩爾量的至少10倍、更優(yōu)選地是至少40倍。每一擴(kuò)增反應(yīng)優(yōu)選地使用5nM的每一嵌合引物，且每一嵌合引物對0.2μM的各種通用引物。對于每微升反應(yīng)體積，每一嵌合引物的量優(yōu)選地為5 femtomol(5*10-15mol)，而對于每一嵌合引物對使用大約0.2pmol(0.2*10-12mol)的各種通用引物。
多重PCR條件本發(fā)明的方法采用的多重PCR使用通用引物和嵌合引物的混合物，這些引物在反應(yīng)開始時(shí)就存在。本發(fā)明所用的PCR并不區(qū)分其中僅有嵌合引物被延伸的單獨(dú)的第一部分和其中僅有通用引物被延伸的第二部分。本發(fā)明在后面的PCR循環(huán)中使用的退火溫度或引物延伸溫度與最初的幾個(gè)PCR循環(huán)中使用的退火溫度或引物延伸溫度相同。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，改變反應(yīng)條件以便將嵌合引物延伸轉(zhuǎn)變?yōu)橥ㄓ靡镅由斓淖鞣ㄊ遣槐匾摹?br> 多重PCR優(yōu)選地使用耐熱DNA聚合酶，例如Taq DNA聚合酶。也可使用其他的耐熱DNA聚合酶，甚至可使用不耐熱DNA聚合酶，不過這可能需要反復(fù)添加新鮮的DNA聚合酶。合適的DNA聚合酶可通過商業(yè)途徑獲得，例如作為多重PCR試劑盒的一個(gè)成分，如Qiagen多重試劑。此類試劑盒也含有其他必要的成分，例如所需的各種dNTP以及合適的緩沖系統(tǒng)。
進(jìn)行PCR熱循環(huán)的裝置也是商品化的，例如MWG AG BiotechPrimusHT熱循環(huán)儀。
本發(fā)明的擴(kuò)增通常以熱處理激活DNA聚合酶開始，例如95℃，15分鐘。隨后開始熱循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括熱變性步驟、退火步驟(以便通過雜交將引物結(jié)合于模板)和引物延伸或者延長步驟。在本發(fā)明中，熱變性步驟的加熱溫度優(yōu)選地為90至98℃，更優(yōu)選地為大約94或95℃，且持續(xù)時(shí)間為15至60秒(允許短些或者特別是更長些)，更優(yōu)選地為大約30秒。此外，在本發(fā)明中，退火步驟的加熱溫度優(yōu)選地為54至60℃，更優(yōu)選地為大約57℃，且持續(xù)時(shí)間為60至120秒(允許短些或者特別是更長些)，更優(yōu)選地為大約90秒。此外，在本發(fā)明中，引物延伸步驟的加熱溫度優(yōu)選地為68至76℃，更優(yōu)選地為大約72℃，且持續(xù)時(shí)間為60至120秒(允許短些或者特別是更長些)，更優(yōu)選地為大約90秒。最終在引物延伸步驟的溫度處理更長的時(shí)間，例如10分鐘，可結(jié)束熱循環(huán)。
根據(jù)可利用的時(shí)間和對精度的要求，可任意選擇循環(huán)總數(shù)?？偣?0個(gè)循環(huán)應(yīng)該就足夠了，不過優(yōu)選40或45或50個(gè)循環(huán)或者更多。
基因分型多重PCR產(chǎn)生的是標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物的混合物，其中理想地的情況是各產(chǎn)物基本上包括不同血細(xì)胞抗原的基因座的區(qū)域，該區(qū)域含有所述血細(xì)胞抗原的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。在絕大多數(shù)現(xiàn)在已知的血細(xì)胞抗原的多態(tài)性中，核苷酸多態(tài)性是單核苷酸多態(tài)性(SNP)，但本發(fā)明也包括多態(tài)性位點(diǎn)覆蓋一個(gè)以上核苷酸的情況。
已有多種用于分析標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物混合物中存在的SNP的策略，包括產(chǎn)物測序，但大多數(shù)不適合進(jìn)行快速、可靠的高通量基因分型。因此本發(fā)明優(yōu)選地使用將多重PCR產(chǎn)物與含有血細(xì)胞抗原等位基因特異性寡核苷酸探針的DNA陣列相接觸這一特殊的步驟。所述接觸是在將擴(kuò)增的寡核苷酸產(chǎn)物變性后進(jìn)行的，例如通過加熱，且進(jìn)行接觸的條件適合于這些產(chǎn)物與陣列中相應(yīng)的探針發(fā)生雜交。在與探針接觸前對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并不是必要的，因此通常可以將其省略。
探針探針是包括核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的寡核苷酸。由此，它們具有等位基因特異性。雖然它們的長度可以是自8或10個(gè)核苷酸直至數(shù)百個(gè)核苷酸不等，但本發(fā)明使用的探針的長度優(yōu)選地為15至40個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地為l6或17至29或30個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，所有探針具有相似的Tm值，特別是在55至75℃的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地在60至70℃的范圍內(nèi)，或特別優(yōu)選地在60至65℃的范圍內(nèi)。
盡管原則上針對每一血細(xì)胞抗原的每一等位基因可以僅使用一種探針，但本發(fā)明針對每一血細(xì)胞抗原的每一等位基因使用數(shù)種探針，由此增加該方法的可靠性。根據(jù)本發(fā)明，針對每一血細(xì)胞抗原的每一等位基因，所述陣列含有至少兩種、優(yōu)選地至少5種不同的有義探針和至少兩種、優(yōu)選地至少5種反義探針，它們各自覆蓋核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，但覆蓋的是不同的位置。優(yōu)選地，這些位置位于或者靠近所述寡聚物的中心。
正如前面談及引物的血細(xì)胞抗原特異性部分時(shí)所述，可用于設(shè)計(jì)合適的血細(xì)胞抗原等位基因特異性探針的各種軟件產(chǎn)品是已知的(特別是Primer3軟件產(chǎn)品)。
優(yōu)選的探針列表包括如下探針(SNP被突出顯示)HPA1-allele aHPA-1aa tacaggccctgcctctgggSEQ ID NO4lHPA-1ab aggccctgcctctgggct SEQ ID NO42HPA-1ac ccctgcctctgggctcaccSEQ ID NO43HPA-1ad tgcctctgggctcacctcgSEQ ID NO44HPA-1ae ctctgggctcacctcgctgSEQ ID NO45HPA-1aa CRcagcgaggtgagcccagagSEQ ID NO46HPA-1ab CRcgaggtgagcccagaggcaSEQ ID NO47HPA-1ac CRggtgagcccagaggcagggSEQ ID NO48HPA-1ad CRagcccagaggcagggcct SEQ ID NO49HPA-1ae CRcccagaggcagggcctgtaSEQ ID NO50HPA1-allele bHPA-1ba tacaggccctgcctccgggSEQ ID NO51HPA-1bb aggccctgcctccgggct SEQ ID NO52HPA-1bc ccctgcctccgggctcac SEQ ID NO53HPA-1bd ctgcctccgggctcacct SEQ ID NO54
HPA-1bcctccgggctcacctcgct SEQ ID NO55HPA-1ba CR agcgaggtgagcccggag SEQ ID NO56HPA-1bb CR aggtgagcccggaggcag SEQ ID NO57HPA-1bc CR gtgagcccggaggcaggg SEQ ID NO58HPA-1bd CR agcccggaggcagggcct SEQ ID NO59HPA-1be CR cccggaggcagggcctgtaSEQ ID NO60HPA2-allele aHPA-2aactgacgcccacacccaag SEQ ID NO61HPA-2abctcctgacgcccacaccc SEQ ID NO62HPA-2acggctcctgacgcccacac SEQ ID NO63HPA-2adagggctcctgacgcccac SEQ ID NO64HPA-2aeccagggctcctgacgccc SEQ ID NO65HPA-2aa CR cttgggtgtgggcgtcag SEQ ID NO66HPA-2ab CR gggtgtgggcgtcaggag SEQ ID NO67HPA-2ac CR gtgtgggcgtcaggagcc SEQ ID NO68HPA-2ad CR gtgggcgtcaggagccct SEQ ID NO69HPA-2ac CR gggcgtcaggagccctgg SEQ ID NO70HPA2-allele bHPA-2bacctgatgcccacacccaagSEQ ID NO71HPA-2bbctcctgatgcccacacccaSEQ ID NO72HPA-2bcggctcctgatgcccacaccSEQ ID NO73HPA-2bdagggctcctgatgcccacaSEQ ID NO74HPA-2beccagggctcctgatgccc SEQ ID NO75HPA-2ba CR cttgggtgtgggcatcaggSEQ ID NO76HPA-2bb CR tgggtgtgggcatcaggagSEQ ID NO77HPA-2bc CR ggtgtgggcatcaggagcc SEQ ID NO78HPA-2bd CR tgtgggcatcaggagccctSEQ ID NO79HPA-2be CR gggcatcaggagccctgg SEQ ID NO80HPA3-allele aHPA-3aaccatccccagcccctccc SEQ ID NO81HPA-3abgcccatccccagcccctc SEQ ID NO82HPA-3acctgcccatccccagcccc SEQ ID NO83HPA-3ad1 gctgcccatccccagccc SEQ ID NO84HPA-3adggctgcccatccccagcc SEQ ID NO85HPA-3ad2 gggctgcccatccccagc SEQ ID NO86HPA-3aeggggctgcccatcccca SEQ ID NO87HPA-3aa CR gggaggggctggggatgg SEQ ID NO88HPA-3ab CR gaggggctggggatgggc SEQ ID NO；89HPA-3ac CR ggggctggggatgggcag SEQ ID NO90HPA-3ad1 CRgggctggggatgggcagc SEQ ID NO91
HPA-3ad CR ggctggggatgggcagcc SEQ ID NO92HPA-3ad2 CRgctggggatgggcagccc SEQ ID NO93HPA-3ae CR tggggatgggcagccccSEQ ID NO94HPA3-allele bHPA-3baccagccccagcccctccSEQ ID NO95HPA-3bbgcccagccccagcccctSEQ ID NO96HPA-3bcctgcccagccccagcccSEQ ID NO97HPA-3bd1 gctgcccagccccagccSEQ ID NO98HPA-3bdggctgcccagccccagcSEQ ID NO99HPA-3bd2 gggctgcccagccccagSEQ ID NO100HPA-3beggggctgcccagccccaSEQ ID NO101HPA-3ba CR gaggggctggggctgg SEQ ID NO102HPA-3bb CR aggggctggggctgggcSEQ ID NO103HPA-3bc CR gggctggggctgggcagSEQ ID NO104HPA-3bd1 CRggctggggctgggcagcSEQ ID NO105HPA-33bd CRgctggggctgggcagccSEQ ID NO106HPA-3bd2 CRctggggctgggcagcccSEQ ID NO107HPA-3be CR tggggctgggcagccccSEQ ID NO108HPA4-allele aHPA-4aagccacccagatgcgaaag SEQ ID NO109HPA-4abcacccagatgcgaaagct SEQ ID NO110HPA-4accccagatgcgaaagctca SEQ ID NO111HPA-4adcagatgcgaaagctcacc SEQ ID NO112HPA-4aegatgcgaaagctcaccag SEQ ID NO113HPA-4aa CR ctggtgagctttcgcatc SEQ ID NO114HPA-4ab CR ggtgagctttcgcatctg SEQ ID NO115HPA-4ac CR tgagctttcgcatctggg SEQ ID NO116HPA-4ad CR agctttcgcatctgggtg SEQ ID NO117HPA-4ac CR ctttcgcatctgggtggc SEQ ID NO118HPA4-allele bHPA-4bagccacccagatgcaaaag SEQ ID NO119HPA-4bbccacccagatgcaaaagct SEQ ID NO120HPA-4bcacccagatgcaaaagctcac SEQ ID NO121HPA-4bdcagatgcaaaagctcacca SEQ ID NO122HPA-4begatgcaaaagctcaccagtaaSEQ ID NO123HPA-4ba CR ttactggtgagcttttgcatcSEQ ID NO124HPA-4bb CR tggtgagcttttgcatctg SEQ ID NO125HPA-4bc CR gtgagcttttgcatctgggt SEQ ID NO126HPA-4bd CR agcttttgcatctgggtgg SEQ ID NO127HPA-4be CR cttttgcatctgggtggc SEQ ID NO128
HPA5-allele aHPA-5aagagtctacctgtttactatcaaagagg SEQ ID NO129HPA-5abagtctacctgtttactatcaaagaggta SEQ ID NO130HPA-5acgtctacctgtttactatcaaagaggtaa SEQ ID NO131HPA-5adctacctgtttactatcaaagaggtaaaa SEQ ID NO132HPA-5aeacctgtttactatcaaagaggtaaaaa SEQ ID NO133HPA-5aa CR tttttacctctttgatagtaaacaggt SEQ ID NO134HPA-5ab CR ttttacctctttgatagtaaacaggtag SEQ ID NO135HPA-5ac CR ttacctctttgatagtaaacaggtagac SEQ ID NO136HPA-5ad CR tacctctttgatagtaaacaggtagact SEQ ID NO137HPA-5ae CR cctctttgatagtaaacaggtagactc SEQ ID NO138HPA5-allele bHPA-5bagagtctacctgtttactatcaaaaagg SEQ ID NO139HPA-5bbagtctacctgtttactatcaaaaaggta SEQ ID NO140HPA-5bcgtctacctgtttactatcaaaaaggtaa SEQ ID NO141HPA-5adctacctgtttactatcaaaaaggtaaaa SEQ ID NO142HPA-5beacctgtttactatcaaaaaggtaaaaa SEQ ID NO143HPA-5ba CR tttttacctttttgatagtaaacaggt SEQ ID NO144HPA-5bb CR ttttacctttttgatagtaaaacaggtag SEQ ID NO145HPA-5bc CR ttacctttttgatagtaaacaggtagac SEQ ID NO146HPA-5bd CR tacctttttgatagtaaacaggtagact SEQ ID NO147HPA-5be CR cctttttgatagtaaacaggtagactc SEQ ID NO148HPA15-allele aGov-aa ttattatcttgacttcagttacaggattt SEQ ID NO149Gov-ab tcttgacttcagttacaggatttaccSEQ ID NO150Gov-ac tgacttcagttacaggatttaccaa SEQ ID NO151Gov-ad cttcagttacaggatttaccaagaatSEQ ID NO152Gov-ac cagttacaggatttaccaagaatttgSEQ ID NO153Gov-aa CR caaattcttggtaaatcctgtaactgSEQ ID NO154Gov-ab CR attcttggtaaatcctgtaactgaagSEQ ID NO155Gov-ac CR tggtaaatcctgtaactgaagtcaa SEQ ID NO156Gov-ad CR ggtaaatcctgtaactgaagtcaagaSEQ ID NO157Gov-ae CR aaatcctgtaactgaagtcaagataataa SEQ ID NO158HPA15-allele bGov-ba tatcttgacttcagttccaggatt SEQ ID NO159Gow-bb cttgacttcagttccaggatttac SEQ ID NO160Gov-bc gacttcagttccaggatttacca SEQ ID NO161Gov-bd ttcagttccaggatttaccaagSEQ ID NO162Gov-be cagttccaggatttaccaagaatt SEQ ID NO163Gov-ba CR aattcttggtaaatcctggaactg SEQ ID NO164
Gov-bb CRcttggtaaatcctggaactgaa SEQ ID NO165Gov-bc CRggtaaatcctggaactgaagtca SEQ ID NO166Gov-bd CRgtaaatcctggaactgaagtcaag SEQ ID NO167Gov-bc CRaatcctggaactgaagtcaagata.SEQ ID NO168Colton-a-alleleCo.a.1 aacaaccagacggcggtSEQ ID NO191Co.a.2 accagacggcggtccagSEQ ID NO192Co.a.3 cagacggcggtccaggaSEQ ID NO193Co.a.4 gacggcggtccaggacaa SEQ ID NO194Co.a.5 cggcggtccaggacaacSEQ ID NO195Co.a.1.crgttgtcctggaccgccgt SEQ ID NO196Co.a.2.crtcctggaccgccgtctgSEQ ID NO197Co.a.3.crctggaccgccgtctggtSEQ ID NO198Co.a.4.crggaccgccgtctggttgSEQ ID NO199Co.a.5.craccgccgtctggttgttSEQ ID NO200Colton-b-alleleCo.b.1 ggaacaaccagacggtggt SEQ ID NO201Co.b.2 acaaccagacggtggtccag SEQ ID NO202Co.b.3 accagacggtggtccagga SEQ ID NO203Co.b.4 gacggtggtccaggacaacg SEQ ID NO204Co.b.5 cggtggtccaggacaacg SEQ ID NO205Co.b.1.crcgttgtcctggaccaccgt SEQ ID NO206Co.b.2.crttgtcctggaccaccgtctg SEQ ID NO207Co.b.3.crctggaccaccgtctggttgt SEQ ID NO208Co.b.4.crggaccaccgtctggttgttc SEQ ID NO209Co.b.5.craccaccgtctggttgttcc SEQ ID NO210Diego-a-alleleDi.a.1 gtgaagtccacgccggcSEQ ID NO211Di.a.2 gaagtccacgccggcctSEQ ID NO212Di.a.3 agtccacgccggcctccSEQ ID NO213Di.a.4 tccacgccggcctccctSEQ ID NO214Di.a.5 acgccggcctccctggcc SEQ ID NO215Di.a.1.crgccagggaggccggcgtSEQ ID NO216Di.a.2.cragggaggccggcgtggaSEQ ID NO217Di.a.3.crggaggccggcgtggactSEQ ID NO218Di.a.4.craggccggcgtggacttcSEQ ID NO219Di.a.5.crggccggcgtggacttcaSEQ ID NO220Diego-b-alleleDi.b.1 ggtgaagtccacgctggc SEQ ID NO221Di.b.2 gtgaagtccacgctggcct SEQ ID NO222
Di.b.3 tgaagtccacgctggcctcc SEQ ID NO223Di.b.4 gaagtccacgctggcctccct SEQ ID NO224Di.b.5 acgctggcctccctggcccSEQ ID NO225Di.b.1.crggccagggaggccagcgt SEQ ID NO226Di.b.2.crcagggaggccagcgtgga SEQ ID NO227Di.b.3.cragggaggccagcgtggactSEQ ID NO228Di.b.4.crggaggccagcgtggacttcSEQ ID NO229Di.b.5.crggccagcgtggacttcaccSEQ ID NO230Diego Wr-a-alleleWr.a.1 tgggcttgcgttccaagt SEQ ID NO231Wr.a.2 ggcttgcgttccaagtttcSEQ ID NO232Wr.a.3 ttgcgttccaagtttcccaSEQ ID NO233Wr.a.4 cgttccaagtttcccatctSEQ ID NO234Wr.a.5 tccaagtttcccatctggaSEQ ID NO235Wr.a.1 CRtccagatgggaaacttggaSEQ ID NO236Wr.a.2 CRagatgggaaacttggaacgSEQ ID NO237Wr.a.3 CRtgggaaacttggaacgcaaSEQ ID NO238Wr.a.4 CRgaaacttggaacgcaagccSEQ ID NO239Wr.a.5 CRacttggaacgcaagccca SEQ ID NO240Diego Wr-b-allele2Wr.b.1 gggcttgcgttccgagtt SEQ ID NO241Wr.b.2 gcttgcgttccgagtttc SEQ ID NO242Wr.b.3 ttgcgttccgagtttccc SEQ ID NO243Wr.b.4 cgttccgagtttcccatc SEQ ID NO244Wr.b.5 tccgagtttcccatctgg SEQ ID NO245Wr.b.1 CRccagatgggaaactcgga SEQ ID NO246Wr.b.2 CRgatgggaaactcggaacg SEQ ID NO247Wr.b.3 CRgggaaactcggaacgcaa SEQ ID NO248Wr.b.4 CRgaaactcggaacgcaagc SEQ ID NO249Wr.b.5 CRaactcggaacgcaagccc SEQ ID NO250Dombrock-a-alleleDo.a.1 taccacccaagaggaaactSEQ ID NO251Do.a.2 ccacccaagaggaaactggSEQ ID NO252Do.a.3 acccaagaggaaactggttg SEQ ID NO253Do.a.4 caagaggaaactggttgcaSEQ ID NO254Do.a.5 aggaaactggttgcagttga SEQ ID NO255Do a 6 crctcaactgcaaccagtttcc SEQ ID NO256Do a 7 crcaactgcaaccagtttcctc SEQ ID NO257Do a 8 crtgcaaccagtttcctcttgg SEQ ID NO258Do a 9 craccagtttcctcttgggtgg SEQ ID NO259
Do a 10 crcagtttcctcttgggtggta SEQ ID NO260Dombrock-b-alleleDo.b.1taccacccaagaggagact SEQ ID NO261Do.b.2ccacccaagaggagactgg SEQ ID NO262Do.b.3acccaagaggagactggttg SEQ ID NO263Do.b.4caagaggagactggttgca SEQ ID NO264Do.b.5aggagactggttgcagttga SEQ ID NO265Do b 6 cr ctcaactgcaaccagtctcc SEQ ID NO266Do b 7 cr caactgcaaccagtctcctc SEQ ID NO267Do b 8 cr tgcaaccagtctcctcttgg SEQ ID NO268Do b 9 cr accagtctcctcttgggtgg SEQ ID NO269Do b 10 crcagtctcctcttgggtggt SEQ ID NO270Dombrock-Joseph(a) positive alleleJo.a.pos. 1 ccccagaacatgactaccac SEQ ID NO271Jo.a.pos.2ccagaacatgactaccacacaSEQ ID NO272Jo.a.pos.3agaacatgactaccacacacgc SEQ ID NO273Jo.a.pos.4catgactaccacacacgctgtSEQ ID NO274Jo.a.pos.5actaccacacacgctgtgg SEQ ID NO275Jo.a.pos.1.cr gccacagcgtgtgtggtagt SEQ ID NO276Jo.a.pos.2.cr acagcgtgtgtggtagtcatgSEQ ID NO277Jo.a.pos.3.cr agcgtgtgtggtagtcatgttSEQ ID NO278Jo.a.pos.4.cr cgtgtgtggtagtcatgttctg SEQ ID NO279Jo.a.pos.5.cr gtggtagtcatgttctgggg SEQ ID NO280Dombrock-Joscph(a)negative alleleJo.a.neg.1ctaccccagaacatgactatcac SEQ ID NO281Jo.a.neg.2cccagaacatgactatcacaca SEQ ID NO282Jo.a.neg.3cagaacatgactatcacacacgc SEQ ID NO283Jo.a.neg.4catgactatcacacacgctgtg SEQ ID NO284Jo.a.neg.5actatcacacacgctgtggc SEQ ID NO285Jo.a.neg.1.cr aatagccacagcgtgtgtgatagt SEQ ID NO286Jo.a.ncg.2.cr cacagcgtgtgtgatagtcatg SEQ ID NO287Jo.a.neg.3.cr cagcgtgtgtgatagtcatgtt SEQ ID NO288Jo.a.neg.4.cr cgtgtgtgatagtcatgttctgg SEQ ID NO289Jo.a.neg.5.cr gtgatagtcatgttctggggtag SEQ ID NO290Duffy-a-alleleFy.A.1ccagatggagactatggtgccSEQ ID NO291Fy.A.2atggagactatggtgccaac SEQ ID NO292Fy.A.3ggagactatggtgccaacctgSEQ ID NO293Fy.A.4gactatggtgccaacctgga SEQ ID NO294Fy.A.5tatggtgccaacctggaag SEQ ID NO295
Fy.A.1.cr cttccaggttggcaccataSEQ ID NO296Fy.A.2.cr tccaggttggcaccatagtc SEQ ID NO297Fy.A.3.cr aggttggcaccatagtctcc SEQ ID NO298Fy.A.4.cr gttggcaccatagtctccat SEQ ID NO299Fy.A.5.cr gcaccatagtctccatctgg SEQ ID NO300Duffy-b-alleleFy.B.1cccagatggagactatgatgcc SEQ ID NO301Fy.B.2gatggagactatgatgccaac SEQ ID NO302Fy.B.3tggagactatgatgccaacctg SEQ ID NO303Fy.B.4gactatgatgccaacctggaa SEQ ID NO304Fy.B.5tatgatgccaacctggaagc SEQ ID NO305Fy.B.1.cr gcttccaggttggcatcata SEQ ID NO306Fy.B.2.cr ttccaggttggcatcatagtc SEQ ID NO307Fy.B.3.cr caggttggcatcatagtctcc SEQ ID NO308Fy.B.4.cr gttggcatcatagtctccatc SEQ ID NO309Fy.B.5.cr gcatcatagtctccatctggg SEQ ID NO310Duffy GATAbox-normal-alleleFy.GATA.normal.1 agtccttggctcttatcttg SEQ ID NO311Fy.GATA.normal.2 agtccttggctcttatcttgga SEQ ID NO312Fy.GATA.normal.3 cttggctcttatcttggaagc SEQ ID NO313Fy.GATA.normal.4 gctcttatcttggaagcacagg SEQ ID NO314Fy.GATA.normal.5 cttatcttggaagcacaggcgc SEQ ID NO315Fy.GATA.normal.1.cr gcctgtgcttccaagataag SEQ ID NO316Fy.GATA.normal.2.crtgtgcttccaagataagagc SEQ ID NO317Fy.GATA.normal.3.cr tgcttccaagataagagcca SEQ ID NO318Fy.GATA.normal.4.cr ttccaagataagagccaagga SEQ ID NO319Fy.GATA.normal.5.cr caagataagagccaaggact SEQ ID NO320Duffy GATAbox-mutation-alleleFy.GATA.mut.1 tccttggctcttaccttg SEQ ID NO321Fy.GATA.mut.2 tccttggctcttaccttgga SEQ ID NO322Fy.GATA.mut.3 tggctcttaccttggaagcSEQ ID NO323Fy.GATA.mut.4 gctcttaccttggaagcacag SEQ ID NO324Fy.GATA.mut.5 cttaccttggaagcacaggcg SEQ ID NO325Fy.GATA.mut.1.cr cctgtgcttccaaggtaagSEQ ID NO326Fy.GATA.mut.2.cr gtgcttccaaggtaagagcSEQ ID NO327Fy.GATA.mut.3.cr gcttccaaggtaagagccaSEQ ID NO328Fy.GATA.mut.4.cr ttccaaggtaagagccaagg SEQ ID NO329Fy.GATA.mut.5.cr caaggtaagagccaagga SEQ ID NO330Duffy Fyx-normal-alleleFy.X.(b).1ttttcagacctctcttccgct SEQ ID NO331
Fy.X.(b).2agacctctcttccgctggcSEQ ID NO332Fy.X.(b).3ctctcttccgctggcagc SEQ ID NO333Fy.X.(b).4ctcttccgctggcagctc SEQ ID NO334Fy.X.(b).5cttccgctggcagctctg SEQ ID NO335Fy.X.(b).1.cr cagagctgccagcggaa SEQ ID NO336Fy.X.(b).2.cr agctgccagcggaagag SEQ ID NO337Fy.X.(b).3.cr ctgccagcggaagagagg SEQ ID NO338Fy.X.(b).4.cr gccagcggaagagaggtc SEQ ID NO339Fy.X.(b).5.cr cagcggaagagaggtctg SEQ ID NO340Duffy Fyx-mutation-alleleFy.X.1gcttttcagacctctcttctgctSEQ ID NO341Fy.X.2tcagacctctcttctgctggc SEQ ID NO342Fy.X.3acctctcttctgctggcagc SEQ ID NO343Fy.X.4ctcttctgctggcagctctg SEQ ID NO344Fy.X.5cttctgctggcagctctgcSEQ ID NO345Fy.X.1.cr gcagagctgccagcagaa SEQ ID NO346Fy.X.2.cr gagctgccagcagaagagag SEQ ID NO347Fy.X.3.cr agctgccagcagaagagagg SEQ ID NO348Fy.X.4.cr gccagcagaagagaggtctg SEQ ID NO349Fy.X.5.cr cagcagaagagaggtctgaaa SEQ ID NO350Kidd-allele-aJk.a.1cagccccatttgaggaca SEQ ID NO351Jk.a.2gccccatttgaggacatcta SEQ ID NO352Jk.a.3ccatttgaggacatctactttg SEQ ID NO353Jk.a.4atttgaggacmctactttgga SEQ ID NO354Jk.a.5gaggacatctactttggactct SEQ ID NO355Jk.a.1.cr cagagtccaaagtagatgtcctcSEQ ID NO356JK.a.2.cr agtccaaaagatgtcctcaaa SEQ ID NO357Jk.a.3.cr aaagtagatgtcctcaaatggg SEQ ID NO358Jk.a.4 cr tagatgtcctcaaatggggc SEQ ID NO359Jk.a.5.cr atgtcctcaaatggggctgSEQ ID NO360Kidd-allele-bJk.b.1tcagccccatttgagaacaSEQ ID NO361Jk.b.2gccccaatgagaacatctaSEQ ID NO362Jk.b.3cccatttgagacatctactttg SEQ ID NO363Jk.b.4atttgagaacatctactttggacSEQ ID NO364Jk.b.5gagaacatctactttggactctgSEQ ID NO365Jk.b.1.cr ccagagtccaaagtagatgttctc SEQ ID NO366Jk.b.2.cr agagtccaaagtagatgttctcaaa SEQ ID NO367Jk.b.3.cr ccaaagtagatgttctcaaatggSEQ ID NO368
Jk.b.4.cr agtagatgttctcaaatggggcSEQ ID NO369Jk.b.5.cr atgttctcaaatggggctga SEQ ID NO370Kell-K1-alleleKEL.1.1 tccttaaactttaaccgaatgct SEQ ID NO371KEL.1.2 ttaaactttaaccgaatgctgaga SEQ ID NO372KEL.1.3 aactttaaccgaatgctgagactt SEQ ID NO373KEL.1.4 aaccgaatgctgagacttctg SEQ ID NO374KEL.1.5 cgaatgctgagacttctgatgag SEQ ID NO375KEL 1.6 CR actcatcagaagtctcagcattc SEQ ID NO376KEL 1.7 CR tcagaagtctcagcattcggt SEQ ID NO377KEL 1.8 CR aagtctcagcattcggttaaagSEQ ID NO378KEL 1.9 CR tctcagcattcggttaaagtttaa SEQ ID NO379KEL 1.10 CR agcattcggttaaagtttaagga SEQ ID NO380Kell-K2-alleleKEL.2.1 ccttaaactttaaccgaacgctSEQ ID NO381KEL.2.2 aactttaaccgaacgctgaga SEQ ID NO382KEL.2.3 ctttaaccgaacgctgagacttSEQ ID NO383KEL.2.4 aaccgaacgctgagacttct SEQ ID NO384KEL.2.5 cgaacgctgagacttctgatg SEQ ID NO385KEL 2.6 CR tcatcagaagtctcagcgttc SEQ ID NO386KEL 2.7 CR cagaagtctcagcgttcggt SEQ ID NO387KEL 2.8 CR agtctcagcgttcggttaaag SEQ ID NO388KEL 2.9 CR tctcagcgttcggttaaagtt SEQ ID NO389KEL 2.10 CR agcgttcggttaaagtttaaggSEQ ID NO390Kell-K3-alleleKEL.3.1 aatctccatcacttcatggct SEQ ID NO391KEL.3.2 tccatcacttcatggctgtt SEQ ID NO392KEL.3.3 atcacttcatggctgtcca SEQ ID NO393KEL.3.4 acttcatggctgttccagtt SEQ ID NO394KEL.3.5 tcatggctgttccagtttc SEQ ID NO395KEL.3.1.cr agaaactggaacagccatgaa SEQ ID NO396KEL.3.2.cr aactggaacagccatgaagtg SEQ ID NO397KEL.3.3.cr tggaacagccatgaagtgatg SEQ ID NO398KEL.3.4.cr acagccatgaagtgatggag SEQ ID NO399KEL.3.5.cr gccatgaagtgatggagatt SEQ ID NO400Kell-K4-alleleKEL.4.1 tctccatcacttcacggct SEQ ID NO401KEL.4.2 ccatcacttcacggctgtt SEQ ID NO402KEL.4.3 cacttcacggctgttccaSEQ ID NO403KEL.4.4 acttcacggctgttccagSEQ ID NO404
KEL.4.5 tcacggctgttccagtttSEQ ID NO405KEL.4.1.cr aaactggaacagccgtgaa SEQ ID NO406KEL.4.2.cr ctggaacagccgtgaagtg SEQ ID NO407KEL.4.3.cr ggaacagccgtgaagtgatg SEQ ID NO408KEL.4.4.cr acagccgtgaagtgatggSEQ ID NO409KEL.4.5.cr gccgtgaagtgatggagaSEQ ID NO410Kell-K6-alleleKEL.6.1 tactgcctgggggctgccccgcc SEQ ID NO411KEL.6.2 tgggggctgccccgcctgt SEQ ID NO412KEL.6.3 gctgccccgcctgtgac SEQ ID NO413KEL.6.4 ctgccccgcctgtgacaaSEQ ID NO414KEL.6.5 gccccgcctgtgacaac SEQ ID NO415KEL.6.1.cr gttgtcacaggcggggc SEQ ID NO416KEL.6.2.cr ttgtcacaggcggggcagSEQ ID NO417KEL.6.3.cr tcacaggcggggcagcccSEQ ID NO418KEL.6.4.cr acaggcggggcagccccca SEQ ID NO419KEL.6.5.cr aggcggggcagccccca SEQ ID NO420Kell-K7-alleleKEL.7.1 actgcctgggggctgcctcgccSEQ ID NO421KEL.7.2 cctgggggctgcctcgcctgt SEQ ID NO422KEL.7.3 ggctgcctcgcctgtgacSEQ ID NO423KEL.7.4 ctgcctcgcctgtgacaacc SEQ ID NO424KEL.7.5 gcctcgcctgtgacaaccSEQ ID NO425KEL.7.1.cr ggttgtcacaggcgaggcSEQ ID NO426KEL.7.2.cr ggttgtcacaggcgaggcag SEQ ID NO427KEL.7.3.cr ttgtcacaggcgaggcagccc SEQ ID NO428KEL.7.4.cr acaggcgaggcagcccccagg SEQ ID NO429KEL.7.5.cr aggcgaggcagcccccagg SEQ ID NO430Lutheran a-alleleLu.a.1 ggagctcgcccccgcct SEQ ID NO431Lu.a.2 gctcgcccccgcctagc SEQ ID NO432L.u.a.3 cgcccccgcctagcctc SEQ ID NO433Lu.a.4 cccccgcctagcctcgg SEQ ID NO434Lu.a.5 cccgcctagcctcggct SEQ ID NO435Lu.a.1 CRagccgaggctaggcggg SEQ ID NO436Lu.a.2 CRccgaaggctaggcgggggSEQ ID NO437Lu.a.3 CRgaggctaggcgggggcg SEQ ID NO438Lu.a.4 CRgctaggcgggggcgagc SEQ ID NO439Lu.a.5 CRaggcggggggcgagctccSEQ ID NO440Lutheran b-allele
Lu.b.1gggagctcgcccccacct SEQ ID NO441Lu.b.2gagctcgcccccacctagcSEQ ID NO442Lu.b.3ctcgcccccacctagcctcSEQ ID NO443Lu.b.4cccccacctagcctcggctSEQ ID NO444Lu.b.5cccacctagcctcggctgaSEQ ID NO445Lu.b.1 CR tcagccgaggctaggtgggSEQ ID NO446Lu.b.2 CR agccgaggctaggtgggggSEQ ID NO447Lu.b.3 CR gaggctaggtgggggcgagSEQ ID NO448Lu.b.4 CR gctaggtgggggcgagctcSEQ ID NO449Lu.b.5 CR aggtgggggcgagctccc SEQ ID NO450MNS M-alleleM.1 gtgagcatatcagcatcaag SEQ ID NO451M.2 atcagcatcaagtaccactgg SEQ ID NO452M.3 catcaagtaccactggtgtg SEQ ID NO453M.4 taccactggtgtggcaatgc SEQ ID NO454M.5 ctggtgtggcaatgcaca SEQ ID NO455M.1.crtgtgcattgccacaccagtSEQ ID NO456M.2.crgcattgccacaccagtggta SEQ ID NO457M.3.crccacaccagtggtacttgatg SEQ ID NO458M.4.craccagtggtacttgatgctSEQ ID NO459M.5.crcttgatgctgatatgctcac SEQ ID NO460MNS N-alleleN.1 tgtgagcatatcagcattaag SEQ ID NO461N.2 atcagcattaagtaccactgaggSEQ ID NO462N.3 cattaagtaccactgaggtgg SEQ ID NO463N.4 accactgaggtggcaatgcSEQ ID NO464N.5 ctgaggtggcaatgcacact SEQ ID NO465N.1.crgtgtgcattgccacctcagt SEQ ID NO466N.2.crgcattgccacctcagtggta SEQ ID NO467N.3.crccacctcagtggtacttaatgc SEQ ID NO468N.4.crcctcagtggtacttaatgct SEQ ID NO469N.5.crcttaatgctgatatgctcaca SEQ ID NO470MNS S-allelebig.S.1 tttgctttataggagaaatgggaSEQ ID NO471big.S.2 ctttataggagaaatgggaca SEQ ID NO472big.S.3 ttataggagaaatgggacaacttg SEQ ID NO473big.S.4 gagaaatgggacaacttgtcc SEQ ID NO474big.S.5 aaatgggacaacttgtccatc SEQ ID NO475big.S.1.crgatggacaagttgtcccattt SEQ ID NO476big.S.2.crgacaagttgtcccatttctcc SEQ ID NO477
big. S.3.cr aagttgtcccatttctcctataSEQ ID NO478big S.4.crtgtcccatttctcctataaagca SEQ ID NO479big.S.5.crcccatttctcctataaagcaaaa SEQ ID NO480MNS s-allelelittle.s.1tgctttataggagaaacggga SEQ ID NO481little.s.2tttataggagaaacgggaca SEQ ID NO482little.s.3ggagaaacgggacaacttg SEQ ID NO483little.s.4gagaaacgggacaacttgtc SEQ ID NO484little.s.5aaacgggacaacttgtccat SEQ ID NO485little.s.1.cr tggacaagttgtcccgttt SEQ ID NO486little.s.2.cr acaagttgtcccgtttctcc SEQ ID NO487little.s.3.cr agttgtcccgtttctcctata SEQ ID NO488little.s.4.cr tgtcccgtttctcctataaagcSEQ ID NO489little.s.5.cr cccgtttctcctataaagca SEQ ID NO490MNS U-positive-alleleU.pos.1 ttgctgctctctttagctcc SEQ ID NO491U.pos.2 ctctctttagctcctgtagtgat SEQ ID NO492U.pos.3 agctcctgtagtgataatactca SEQ ID NO493U.pos.4 gtagtgataatactcattatttttg SEQ ID NO494U.pos.5 taatactcattatttttggggtg SEQ ID NO495U.pos.1.crcaccccaaaaataatgagtatta SEQ ID NO496U.pos.2.crcaaaaataatgagtattatcactacaSEQ ID NO497U.pos.3.cragtattatcactacaggagctaaa SEQ ID NO498U.pos.4.cratcactacaggagctaaagag SEQ ID NO499U.pos.5.crgagctaaagagagcagcaaa SEQ ID NO500MNS U-negative-alleleU.neg.1 ttttgctgctctctttatctccSEQ ID NO501U.neg.2 gctctctttatctcctgtagagat SEQ ID NO502U.neg.3 tatctcctgtagagataacactca SEQ ID NO503U.neg.4 gtagagataacactcattattttt SEQ ID NO504U.neg.5 taacactcattatttttggggtSEQ ID NO505U.neg.1.craccccaaaaataatgagtgttaSEQ ID NO506U.neg.2.craaaaataatgagtgttatctctaca SEQ ID NO507U.neg.3.cragtgttatctctacaggagataaa SEQ ID NO508U.neg.4.cratctctacaggagataaagagag SEQ ID NO509U.neg.5.crgagataaagagagcagcaaaatta SEQ ID NO510Rhesus C-allele(307T)Rh.big.C.1tgagccagttcccttctgg SEQ ID NO511Rh.big.C.2gagccagttcccttctggSEQ ID NO512Rh.big.C.3ctgagccagttcccttctg SEQ ID NO513
Rh.big.C.4 ccttctgggaaggtggtcSEQ ID NO514Rh.big.C.5 ccttctgggaaggtggtca SEQ ID NO515Rh.big.C.1.cr tgaccaccttcccagaagg SEQ ID NO516Rh.big.C.2.cr gaccaccttcccagaaggSEQ ID NO517Rh.big.C.3.cr ccagaagggaactggctcSEQ ID NO518Rh.big.C.4.cr ccagaagggaactggctca SEQ ID NO519Rh.big.C.5.cr cagaagggaactggctcag SEQ ID NO520Rhesus c-allele(307C)Rh.little.c.1 gagccagttccctcctggSEQ ID NO521Rh.little.c.2 agccagttccctcctgg SEQ ID NO522Rh.little.c.3 tgagccagttccctcctgSEQ ID NO523Rh.little.c.4 cctcctgggaaggtggt SEQ ID NO524Rh.little.c.5 cctcctgggaaggtggtcSEQ ID NO525Rh.little.c.1.cr gaccaccttcccaggaggSEQ ID NO526Rh.little.c.2.cr accaccttcccaggagg SEQ ID NO527Rh.little.c.3.cr ccaggagggaactggct SEQ ID NO528Rh.little.c.4.cr ccaggagggaactggctcSEQ ID NO529Rh.little.c.5.cr caggagggaactggctcaSEQ ID NO530Rhesus BigC-intron2-specific-insert-alleleRhC.intron.2.1 agggtgccctttgtcacttc SEQ ID NO531RhC.intron.2.2 gccctttgtcacttcccagt SEQ ID NO532RhC.intron.2.3 cctttgtcacttcccagtgg SEQ ID NO533RhC.intron.2.4 ttgtcacttcccagtggtacaaSEQ ID NO534RhC.intron.2.5 tcacttcccagtggtacaatcaSEQ ID NO535RhC.intron.2.1.cr gaagtgacaaagggcaccct SEQ ID NO536RhC.intron.2.2.cr actgggaagtgacaaagggc SEQ ID NO537RhC.intron.2.3.cr ccactgggaagtgacaaagg SEQ ID NO538RhC.intron.2.4.cr tgtaccactgggaagtgacaaaSEQ ID NO539RhC.intron.2.5.cr tgattgtaccactgggaagtgaSEQ ID NO540Rhesus BigC-intron2-specitic-insert-negative-allelePCR的設(shè)置被選擇為使得僅當(dāng)存在bigC-intron2-specific-insert時(shí)才形成PCR產(chǎn)物。Antitag(用于去除背景)用于計(jì)算基因分型的比率。
Rhesus E-alleleRh.big.E.1 gccaagtgtcaactctcctct SEQ ID NO541Rh.big.E.2 caagtgtcaactctcctctgct SEQ ID NO542Rh.big.E.3 gtgtcaactctcctctgctgag SEQ ID NO543Rh.big.E.4 caactctcctctgctgagaagtcSEQ ID NO544Rh.big.E.5 tctcctctgctgagaagtcc SEQ ID NO545Rh.big.E.1.crggacttctcagcagaggagag SEQ ID NO546
Rh.big.E.2.crcttctcagcagaggagagttga SEQ ID NO547Rh.big.E.3.crctcagcagaggagagttgacac SEQ ID NO548Rh.big.E.4.crgcagaggagagttgacacttg SEQ ID NO549Rh.big.E.5.crgaggagagttgacacttggcSEQ ID NO550Rhesus c-alleleRh.little.e.1gccaagtgtcaactetgctct SEQ ID NO551Rh.little.e.2caagtgtcaactctgctctgct SEQ ID NO552Rh.little.e.3tgtcaactctgctctgctgag SEQ ID NO553Rh.little.e.4caactctgctctgctgagaag SEQ ID NO554Rh.little.e.5tctgctctgctgagaagtccSEQ ID NO555Rh.little.e.1.cr ggacttctcagcagagcagag SEQ ID NO556Rh.little.e.2.cr ttctcagcagagcagagttga SEQ ID NO557Rh.little.e.3.cr tcagcagagcagagttgacac SEQ ID NO558Rh.little.e.4.cr gcagagcagagttgacacctg SEQ ID NO559Rh.little.e.5.cr gagcagagttgacacttggcSEQ ID NO560Rhesus RHD-alleleRhD1 ttccccacagctccatcat SEQ ID NO561RhD2 acagctccatcatgggctacSEQ ID NO562RhD3 tccatcatgggctcaacttcSEQ ID NO563RhD4 tcatgggctacaacccagctSEQ ID NO564RhD5 gggctacaacttcagcttgct SEQ ID NO565RhDcr1 agcaagctgaagttgtagccc SEQ ID NO566RhDcr2 agctgcagttgtagcccatga SEQ ID NO567RhDcr3 gaagttgtagcccatgatggSEQ ID NO568RhDcr1 gcccatgatggagctgt SEQ ID NO569RhDcr5 tgatggagctgtggggaa SEQ ID NO570Rhesus RHD-negative-allelePCR的設(shè)置被選擇為使得僅當(dāng)存在RHD基因時(shí)才形成PCR產(chǎn)物。Antitag(用于去除背景)用于計(jì)算基因分型的比率。
Rhesusr′s-alleler′s.T.1 ggaaggtcaacttggtgca SEQ ID NO571r′s.T.2 ggaaggtcaacttggtgcagt SEQ ID NO572r′s.T.3 caacttggtgcagttggtg SEQ ID NO573r′s.T.4 acttggtgcagttggtggt SEQ ID NO574r′s.T.5 ttggtgcagttggtggtgatSEQ ID NO575r′s.T.1.cr catcaccaccaactgcaccaSEQ ID NO576r′s.T.2.cr caccaccaactgcaccaagtSEQ ID NO577r′s.T.3.cr accaactgcaccaagttgacSEQ ID NO578
r′s.T.4.cractgcaccaagttgaccttcc SEQ ID NO579r′s.T.5.crtgcaccaagttgaccttcc SEQ ID NO580Rhesus r′s-negative-allelePCR的設(shè)置被選擇為使得僅當(dāng)存在r′s基因時(shí)才形成PCR產(chǎn)物。Antitag(用于去除背景)用于計(jì)算基因分型的比率。
Rhesus DVI-allelePCR的設(shè)置被選擇為使得僅當(dāng)存在正常RHD基因時(shí)才形成PCR產(chǎn)物。Antitag(用于去除背景)用于計(jì)算基因分型的比率。
DVI-probes for presence normal RHD alleleRh.DVI.1 atttcaaccctcttggcctt SEQ ID NO581Rh.DVI.2 aaccctcttggcctttgttt SEQ ID NO582Rh.DVI.3 tcttggcctttgtttccttg SEQ ID NO583Rh.DVI.4 ggtatcagcttgagagctcg SEQ ID NO584Rh.DVI.5 atcagcttgagagctcggag SEQ ID NO585Rh.DVI.1.cr aaggccaagagggttgaaat SEQ ID NO586Rh.DVI.2.cr aaacaaaggccaagagggtt SEQ ID NO587Rh.DVI.3.cr caaggaaacaaaggccaaga SEQ ID NO588Rh.DVI.4.cr cgagctctcaagctgatacc SEQ ID NO589Rh.DVI.5.cr ctccgagctctcaagctgat SEQ ID NO590Rhesus RHD-Pseudogene-mutation-alleleRhD Y 1 tttctttgcagacttaggtgc SEQ ID NO591RhD Y 2 ctttgcagacttaggtgcaca SEQ ID NO592RhD Y 3 tttgcagacttaggtgcacagtSEQ ID NO593RhD Y 4 acttaggtgcacagtgcgg SEQ ID NO594RhD Y 5 cttaggtgcacagtgcggt SEQ ID NO595RhD Y cr 1 caccgcactgtgcacctaa SEQ ID NO596RhD Y cr 2 ccgcactgtgcacctaagtc SEQ ID NO597RhD Y cr 3 gcactgtgcacctaagtctgc SEQ ID NO598RhD Y cr 4 tgcacctaagtctgcaaaga SEQ ID NO599RhD Y cr 5 cacctaagtctgcaaagaaatagcg SEQ ID NO600Rhesus RHD-Pseudogcnc-normal-alleleRhD non Y 1 ctatttctttgcagacttatgtgc SEQ ID NO601RhD non Y 2 tctttgcagacttatgtgcacaSEQ ID NO602RhD non Y 3 ttgcagacttatgtgcacagtgSEQ ID NO603RhD non Y 4 acttatgtgcacagtgcggt SEQ ID NO604RhD non Y 5 cttatgtgcacagtgcggtg SEQ ID NO605RhD non Y cr 1 acaccgcactgtgcacataa SEQ ID NO606RhD non Y cr 2 accgcactgtgcacataagtc SEQ ID NO607RhD non Y cr 3 gcactgtgcacataagtctgc SEQ ID NO608
RhD non Y cr 4tgtgcacataagtctgcaaagSEQ ID NO609RhD non Y cr 5cacataagtctgcaaagaaatagcgSEQ ID NO610Yt-a-alleleYt.a.1gcgggagacttccacggSEQ ID NO611Yt.a.2gggagacttccacggcct SEQ ID NO612Yt.a.3gagacttccacggcctgc SEQ ID NO613Yt.a.4gacttccacggcctgcaSEQ ID NO614Yt.a.5ttccacggcctgcaggta SEQ ID NO615Yt.a.1 CR tacctgcaggccgtggaa SEQ ID NO616Yt.a.2 CR tgcaggccgtggaagtcSEQ ID NO617Yt.a.3 CR gcaggccgtggaagtctc SEQ ID NO618Yt.a.4 CR aggccgtggaagtctccc SEQ ID NO619Yt.a.5 CR ccgtggaagtctcccgcSEQ ID NO620Yt-b-alleleYt.b.1gcgggagacttcaacggc SEQ ID NO621Yt.b.2gggagacttcaacggcctg SEQ ID NO622Yt.b.3gagacttcaacggcctgca SEQ ID NO623Yt.b.4gacttcaacggcctgcag SEQ ID NO624Yt.b.5ttcaacggcctgcaggtaa SEQ ID NO625Yt.b.1 CR ttacctgcaggccgttgaa SEQ ID NO626Yt.b.2 CR ctgcaggccgttgaagtc SEQ ID NO627Yt.b.3 CR tgcaggccgttgaagtctc SEQ ID NO628Yt.b.4 CR caggccgttgaagtctccc SEQ ID NO629Yt.b.5 CR gccgttgaagtctcccgc SEQ ID NO630使用已有的軟件程序，本領(lǐng)域人員將能夠設(shè)計(jì)出針對其他血細(xì)胞抗原等位基因的探針。
DNA陣列可以是包括例如72種不同探針的有限陣列，不過優(yōu)選地所述陣列包括基本上所有以上所列的探針。
為了有助于促進(jìn)探針與陣列支持物的結(jié)合并能夠充分接近擴(kuò)增產(chǎn)物，探針寡聚物通常會(huì)具有接頭分子和反應(yīng)基團(tuán)，優(yōu)選地位于寡聚物的5′端，用于與支持物結(jié)合。所有這些對于本領(lǐng)域人員來說都是熟知的，僅僅作為例證而言，合適的接頭例如是C6(1，6-亞己基(hexamethylene)，即-(CH2)6-)，而合適的反應(yīng)基團(tuán)例如是氨基。
陣列支持物探針位于合適的支持物上，它們通常通過化學(xué)方式與之連接。支持物可以是玻片或任何其他合適的支持物，例如塑料、硅或者多孔金屬氧化物。通常要對支持物進(jìn)行預(yù)處理以增強(qiáng)寡聚物的結(jié)合，例如通過以聚-L-賴氨酸、氨基硅烷、醛或環(huán)氧樹脂(epoxy)進(jìn)行包被而預(yù)處理?？梢圆捎酶鞣N技術(shù)以實(shí)現(xiàn)探針的結(jié)合，例如UV照射、非特異性靜電吸附、采用碳二亞胺(carbodiimide)(EDC)化學(xué)方法通過5′氨基或磷酸基團(tuán)進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，等等。
為了避免非特異性雜交，通常優(yōu)選地將攜帶探針的陣列支持物與預(yù)雜交溶液進(jìn)行孵育，這是本領(lǐng)域人員所熟知的，而為了準(zhǔn)備用于雜交的探針，優(yōu)選地將其變性，例如通過在大約80℃或者更高的溫度進(jìn)行加熱。
對照為了對背景進(jìn)行校正，優(yōu)選地加入一些具有不存在于供者DNA中的序列的探針，可預(yù)期這些探針不與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交?？赏ㄟ^減去在這些背景對照點(diǎn)上測得的信號來校正在等位基因特異性探針點(diǎn)上測得的信號。此類背景校正探針或者Antitag的合適的實(shí)例是以下探針a3、a9、a17、a23、a27、a33、a35、a38、a42和a43a3 cagaccataagcacaggcgtSEQ ID NO631，a9 gctcgtccacagtgcgttatSEQ ID NO632，a17 cggcgttcaagcaaaccgaaSEQ ID NO633，a23 gacatatagctccactcagaSEQ ID NO634，a27 tagggtactgatgagcactcSEQ ID NO635，a33 tcagccctatcgcaggatgtSEQ ID NO169，a35 gagacacttgacagtagccaSEQ ID NO170，a38 ggcagggcacctcagtttatSEQ ID NO171，a42 tcaccagccagactgtgtagSEQ ID NO172，a43 cttcacgcaagttgtccagaSEQ ID NO173。
此外，可以加入至少一種陽性探針。這種探針應(yīng)該互補(bǔ)于加入到擴(kuò)增產(chǎn)物中的一種標(biāo)記的陽性對照寡聚物。例如陽性探針可以是以下寡聚物CS05CS05gtcctgacttctagctcatgSEQ ID NO174，其能夠與其標(biāo)記的互補(bǔ)物catgagctagaagtcaggac雜交，后者被加入到擴(kuò)增產(chǎn)物混合物中，然后將混合物施加到DNA陣列上。
雜交條件擴(kuò)增產(chǎn)物與DNA陣列中的探針通常在50至65℃之間，優(yōu)選地在大約56℃，雜交一段充分的時(shí)間，例如15分鐘至10小時(shí)，更優(yōu)選地為30分鐘至4小時(shí)。
陣列布局陣列的布局完全是隨心所欲的。通常，一個(gè)陣列支持物可攜帶大量的點(diǎn)，這些點(diǎn)位于可以是彼此相同(這是優(yōu)選的)或者不同的多個(gè)區(qū)(blocks)內(nèi)。每個(gè)點(diǎn)含有一種探針，且優(yōu)選地將相似的探針置于彼此相距盡可能遠(yuǎn)的點(diǎn)上。優(yōu)選地，各個(gè)等位基因特異性探針在每個(gè)區(qū)均有一個(gè)點(diǎn)，此外每個(gè)區(qū)還額外含有一些對照點(diǎn)。這樣，一個(gè)區(qū)可包括128個(gè)等位基因特異性點(diǎn)、5個(gè)背景對照和一個(gè)陽性對照，總共134個(gè)點(diǎn)。
測定熒光信號標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與特定點(diǎn)的結(jié)合是基于這些點(diǎn)所發(fā)出的熒光信號而確定的。信號測定可以使用光電倍增管、掃描激光系統(tǒng)或者任何本領(lǐng)域人員已知的其他裝置和技術(shù)。
評估所得數(shù)據(jù)為了就供者DNA的血細(xì)胞抗原基因型對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行評估，可使用Genepix Pro 5.0(Axon Instruments Inc.)將熒光信號強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為可進(jìn)一步分析(例如采用Excel分析)的信號值。
實(shí)施例以下實(shí)施例僅用于闡述本發(fā)明，其無意于以任何方式限制本發(fā)明。在這些實(shí)施例中，實(shí)施例1在雙等位基因人血小板抗原系統(tǒng)HPA-1至5和Gov上測試了本發(fā)明通過特定的多重PCR并結(jié)合等位基因特異性探針的DNA微陣列進(jìn)行血細(xì)胞抗原基因分型的構(gòu)思。對一組盲化的58份供者樣品進(jìn)行了這6種HPA系統(tǒng)的基因分型，其中僅在一個(gè)HPA系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了一處偏差?？赏ㄟ^調(diào)整評分標(biāo)準(zhǔn)并對新的格式進(jìn)行驗(yàn)證而克服這一偏差。然后在實(shí)施例2中證實(shí)了本發(fā)明的多重PCR以表2中的所有引物均得到良好結(jié)果。
實(shí)施例1表1顯示了點(diǎn)樣于聚賴氨酸包被的玻片上的探針的序列和Tm值。HPA-3和5的SNP分別位于富GC區(qū)域和少GC區(qū)域。因此，這些探針較其他寡核苷酸更短些或更長些，且Tm值在60-65℃以外。使用具有16SMP 3微點(diǎn)樣針(Telechem)的Omnigrid100微陣列儀(Genemachines)，將溶解于0.4M NaHCO3(pH9.4)中的濃度為50μM的探針點(diǎn)樣于聚-L-賴氨酸包被的玻片上。每一玻片含有48個(gè)區(qū)，每個(gè)區(qū)134個(gè)點(diǎn)，其對應(yīng)于128種等位基因特異性探針、5種背景對照以及陽性對照CS05。相似的探針被點(diǎn)樣于彼此相距盡可能遠(yuǎn)的點(diǎn)上。通過以250mJ/cm2(Stratalinkermodel 1800 UV Illuminator，Stratagene)進(jìn)行UV照射使DNA交聯(lián)。為防止非特異性雜交，將載片以100μl的預(yù)雜交溶液[400ng/μl酵母tRNA(Roche)，400ng/μl鯡精DNA(Gibco BRL)，5xDenhardt溶液，3.2xSSC和O.4％SDS]在65℃孵育30分鐘。雜交前，將含有預(yù)雜交混合物的載片在80℃孵育2分鐘以使得點(diǎn)樣的DNA變性。預(yù)雜交后，將載片在2xSSC中室溫條件下洗滌5分鐘，共兩次，并分別以70％(兩次)、90％和100％的乙醇脫水各5分鐘。
僅針對6種血小板抗原進(jìn)行多重PCR，使用了5nM的各種HPA和gov引物(7.5nM的各種HPA-3引物)和1.2μM的各種標(biāo)記了Cy5的通用引物。此外，如實(shí)施例2所述的多重PCR進(jìn)行多重PCR。按照Pastinenet al.(2000)所述制備雜交反應(yīng)室。使用硅橡膠格柵將玻片分成24隔不同的格。在對載片進(jìn)行預(yù)加熱(65℃，75分鐘)的過程中，將40μl的多重PCR產(chǎn)物在95℃變性5分鐘，置于冰上，并加入120μl冰冷的雜交溶液[2ng Cy5-標(biāo)記的CS05(5′-catgagctagaagtcaggac-3′)的互補(bǔ)鏈和4xSSC]。為進(jìn)行雜交，每個(gè)陣列加入80μl的該混合物并在56℃孵育3.5小時(shí)。然后將載片自600ml3xSSC中的雜交容器中取出，在50℃以2xSSC/0.1％SDS洗滌2次，在室溫下以0.2xSSC洗滌2次，均各5分鐘。以800rpm離心5分鐘使玻片干燥，在Agilent G2565BA微陣列掃描儀中以10μm的分辨率進(jìn)行掃描。光電倍增管電壓持續(xù)設(shè)定在100％。每一載片分析6個(gè)不同供者的PCR產(chǎn)物，顯示于圖3。Genepix分析后，將所得數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成Excel。使用一組具有已知HPA分型的12個(gè)供者的樣品來確定HPA評分標(biāo)準(zhǔn)。表3列出了評分標(biāo)準(zhǔn)。計(jì)算陰性對照(C)的中位信號強(qiáng)度Fmed平均值，將該背景值加上3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差自各個(gè)寡聚物的中位強(qiáng)度Fmed中減去，得到域值Fth，顯示于表3第3欄。如果相配探針(allele a)和不相配探針(allele b)的Fth均為負(fù)值，則將該引物對自基因分型結(jié)果中排除。為進(jìn)行基因分型，計(jì)算一組中的兩個(gè)寡核苷酸(一個(gè)來自allele a，另一個(gè)來自allele b)的強(qiáng)度比率。在第6欄中計(jì)算出a-等位基因的Fmed-Fbg強(qiáng)度與兩個(gè)等位基因的Fmed-Fbg強(qiáng)度之和的比率。這一公式a/(a+b)已經(jīng)由Hinds etal.(2004)披露。原則上，對于基因型aa、ab或bb，這些比率的值應(yīng)該分別為大約1.0、0.5或0.0。僅使用了正的Fmed-Fbg值，而負(fù)值在第5欄被設(shè)為1。隨后，在第7欄中將這些比率轉(zhuǎn)化為基因型。對于HPA-1、-2、-4和-5，比值超過0.75被分型為aa，低于0.25為bb，而在0.35至0.65之間為ab。由于PCR片段與代表a等位基因的探針具有高結(jié)合性，因此將HPA-3和Gov的標(biāo)準(zhǔn)分別調(diào)整為對于aa分別為0.95和0.8，對于bb分別為0.45和0.35，對于ab分別為在0.55至0.85之間和在0.45至0.7之間。在第7欄，頻率最高的基因型以橙色示出。對于每一血型、每一區(qū)和每一樣品，均如此進(jìn)行。使用12個(gè)供者的樣品來驗(yàn)收那些正確預(yù)測基因型的探針組。作為用于最終評分的標(biāo)準(zhǔn)如果預(yù)測出的是純合子基因型，50％所使用的探針組應(yīng)該預(yù)測出基因型，而如果預(yù)測出的是雜合子基因型，40％所使用的探針組應(yīng)該預(yù)測出基因型(對于HPA-3為30％)。采用這些標(biāo)準(zhǔn)對一組盲化的58份樣品進(jìn)行基因分型。其中9份樣品的結(jié)果顯示于表4。所有58份樣品的基因型均列于表5。56份樣品的基因型可以按照本標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。僅在1份樣品中獲得了與其已知的基因型有偏差的結(jié)果。在該例中，33.3％的探針組指示是HPA-3bb基因型，而37.5％指示是HPA-3ab基因型，如表6所示。調(diào)整評分標(biāo)準(zhǔn)后使得分型結(jié)果完全一致。
實(shí)施例2以表2所列的引物構(gòu)建引物混合物。PCR混合物中的引物濃度也列于表2。使用Qiagen多重試劑盒進(jìn)行多重PCR。在多重PCR中，退火溫度在PCR過程中沒有改變，使用了兩種熒光標(biāo)記的通用引物。更具體地，在開始時(shí)，PCR混合物含有極少量的嵌合引物(5nM)和過量的熒光標(biāo)記的通用引物(每種嵌合引物0.2μM的各種通用引物)。在溫度方面，PCR開始為95℃，15分鐘，隨后是45個(gè)循環(huán)的94℃持續(xù)30秒，57℃持續(xù)90秒，72℃持續(xù)90秒，方案以72℃持續(xù)10分鐘的最后聚合步驟結(jié)束。在最初幾個(gè)循環(huán)中，擴(kuò)增出極少量的PCR產(chǎn)物，不過如圖1中的8％丙烯酰胺凝膠電泳所見，其足以在隨后的循環(huán)中用作通用MAPH引物的模板。通過在5’端給MAPH引物標(biāo)記上熒光標(biāo)記物Cy5，僅需要兩種熒光標(biāo)記的引物便可對PCR產(chǎn)物進(jìn)行高效標(biāo)記。如White et al.(2002)所述，在ABI 3700毛細(xì)管測序儀(Applied Biossystems)上進(jìn)行觀察可對多重PCR產(chǎn)物進(jìn)行更好的辨別，在本例中，僅有MAPH-rev標(biāo)記了熒光團(tuán)(FAM)。如圖2的層析圖所示，以所有設(shè)計(jì)的PCR引物進(jìn)行多重PCR均產(chǎn)生了預(yù)期的峰型。這表明所有的基因片段均以相似的產(chǎn)率被擴(kuò)增。
表1、探針的序列和解鏈溫度。



每一寡核苷酸探針在其均具有氨基和C6間隔物等位基因特異性探針中多態(tài)性位點(diǎn)被突出顯示。
表2、用于多重PCR產(chǎn)物的引物


*嵌合引物的Tm值不含MAPH-標(biāo)簽。
#Cy5標(biāo)記的是5′端。
RHDψ-right和RHD-right C引物的基因特異性部分已被公開(Maaskant-van wijk et al.Transfusion 39，546，1999)。公開的引物序列Rex6AD35′-HPA-TGTCTAGTTTCTTACCGGCAAGT-3′；R10685′ATTGCCGGCTCCGACGGTATC-3′)BigC-left的基因特異性部分已作為公開引物部分被公開且BigC-rightintron2、RHex2rev、RHCEex5for引物部分已經(jīng)被公開(Tax et al.Transfusion 42，634-44，2002)。
公開的引物序列R3485′-CTGAACAGTGTGATGACC-3′；c/rev5′-TGATGACCACCTTCCCAGG-3′；R6375′GCCCTCTTCTTGTGGATG-3′；C/for5′-CAGGGCCACCATTTGAA-3′；C/rev5′-GAACATGCCACTTCACTCCAG-3′)MN-引物部分已經(jīng)被公開(Akane et al.Vox Sang，79，183-7，2000)公開的引物序列MN-left5′-GAGGGAATTTGTCTTTTGCA-3′和MN-right5′-AGAGGCAAGAATTCCTCC-3′。
表3、用于HPA-1基因分型的評分標(biāo)準(zhǔn)

樣品的頻率最高的基因型結(jié)果以粗體表示。被排除的基因型結(jié)果以粗體表示并加框。
表4、9份樣品盲組的基因分型結(jié)果


樣品的頻率最高的基因型結(jié)果以粗體表示。被排除的基因型結(jié)果以粗體表示并加框。
表5、58份樣品盲組的基因型


當(dāng)對純合子基因型的預(yù)測基因型高于50％或者對雜合子基因型的預(yù)測基因型高于40％(對HPA-3ab＞30％)時(shí)，基因型以粗體表示。
表6、與6種其他樣品的結(jié)果相比，樣品9的HPA-3基因分型結(jié)果

樣品的頻率最高的基因型結(jié)果以粗體表示。被排除的基因型結(jié)果以粗體表示并加框。樣品9的基因型應(yīng)該是HPA-3bb，因此以大寫字母表示該樣品的bb基因型。
表7、為多重PCR所額外測試的引物在一多重PCR中已經(jīng)將這些引物與SEQ ID NO15至40的引物一起進(jìn)行了測試。獲得了具有正確大小的PCR產(chǎn)物。

*Tm值不包括MAPH標(biāo)簽。
參考文獻(xiàn)-Alkane A，Mizukami H and Shiono H.2000.Classification of standardalleles of the MN blood group system.Vox Sang 79，183-187.
-Belgrade P，MarinoMM，Lubin M and Barany F.1996.A MultiplexPCR-Ligase Detection Reaction Assay for Human Identity Testing.GenomeSci.Technol.1，77-87.
-Berry JE，Murphy CM，Smith GA，Ranasinghe E，F(xiàn)inberg R，Walton J，Brown J，Navarrete C，Metcalfe P and Ouwehand WH.2000.Detection ofGov system antibodies by MAIPA reveals an immunogenicity similar to theHPA-5 alloantigens.Br J Haematol.110，735-742.
-Beuningen R van，van Damme H，Boender P，Bastiaensen N，Chan Aand Kievits T.2001.Fast and specific hybridisation using flow-throughmicroarrays on porous metal oxide.Clin.Chem.47，1931-1933.
-Brownie J，Shawcross S，Theaker J，Whitcombe D，F(xiàn)errie R，NewtonC and Little S.1997.The elimination of primer-dimer accumulation in PCR.Nucl.Acids Res.25，3235-3241.
-Chamberlain JS，Gibbs RA，Ranier JE，Nguyen PN，and Caskey CT.1988.Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus viamultiplex DNA amplification.Nucl.Acids Res.16，11141-11156.
-Cheek BJ，Steel AB，Torres MP，Yu YY and Yang H.2001.Chemiluminescence detection for hybridization assays on the flow-thru chip，a three-dimensional microchannel biochip.Anal Chem.73，5777-5783.
-Evans JG and Lee-Tataseo C.2002.Determination of the factor VLeiden single-nucleotide polymorphism in a commercial clinical laboratoryby use of NanoChip microelectronic array technology.Clin Chem.48，1406-1411.
-Fan JB，Chen X，Halushka MK，Berno A，Huang X，Ryder T，LipshutzRJ，Lockhart DJ and Chakravarti A.2000.Parallel genotyping of humanSNPs using generic high-density oligonucleotide tag arrays.Genome Res.10，853-860.
-Fodor SP，Read JL，Pirrung MC，Stryer L，Lu AT and Solas D.1991.Light-directed，spatially addressable parallel chemical synthesis.Science 251，767-773.
-Guo Z，Gatterman MS，Hood L，Hansen JA and Petersdorf EW.2001.Oligonucleotide arrays for high-throughput SNPs detection in the MHC classI genesHLA-B as a model system.Genome Res.12，447-457.
-Hacia JG，Brody LC，Chee MS，F(xiàn)odor SP and Collins FS.1996.Detection of heterozygous mutations in BRCA1 using high densityoligonucleotide arrays and two-colour fluorescence analysis.Nat Genet.14，441-447.
-Heath KE，Day INM and Humphries SE.2000.Universal primerquantitative fluorescent multiplex(UPQFM)PCRa method to detect majorand minor rearrangements of the low density lipoprotein receptor gene.J.Med.Genet.37，272-280.
-Hinds DA，Stokowski RP，Patil N，Konvicka K，Kershenobich D，CoxDR and Ballinger DG.2004.Matching strategies for genetic associationstudies in structured populations.Am J Hum Genet.74，317-325.
-Huang JX，Mehrens D，Wiese R，Lee S，Tam SW，Daniel S，Gilmore J，Shi M and Lashkari D.2001.High-throughput genomic and proteomicanalysis using microarray technology.Clin Chem.47，1912-1916.
-Iwasaki H，Ezura Y，Ishida R，Kajita M，Kodaira M，Knight J，DanielS，Shi M and Emi M.2002.Accuracy of genotyping for single nucleotidepolymorphisms by a microarray-based single nucleotide polymorphism typingmethod involving hybridization of short allele-specific oligonucleotides.DNARes.9，59-62.
-Jobs M，Howell WM，Stromqvist L，Mayr T and Brookes AJ.2003.DASH-2flexible，low-cost，and high-throughput SNP genotyping bydynamic allele-specific hybridization on membrane arrays.Genome Res.13，916-924.
-Kajiyama T，Miyahara Y，Kricka LJ，Wilding P，Graves DJ，Surrey Sand Fortina P.2003.Genotyping on a thermal gradient DNA chip.GenomeRes.13，467-475.
-Lindroos K，Sigurdsson S，Johansson K，Ronnblom L and SyvanenAC.2002.Multiplex SNP genotyping in pooled DNA samples by afour-colour microarray system.Nucleic Acids Res.30，e70.
-Lu M，ShortreedMR，Hall JG，Wang L，Berggren T，Stevens PW，KelsoDM，Lyamichev V，Neri B and Smith LM.2002.A surface invasive cleavageassay for highly parallel SNP analysis.Hum.Mutat.19，416-422.
-Maaskant-van Wijk PA，F(xiàn)aas BH，de Ruijter JA，Overbeeke MA，vondem Borne AE，van Rhenen DJ and van der Schoot CE.1999.Genotyping ofRHD by multiplex polymerase chain reaction analysis of six RHD-specificexons.Transfusion 39，546.
-Metcalfe P，Watkins NA，Ouwehand WH，Kaplan C，Newman P，Kekomaki R，De Haas M，Aster R，Shibata Y，Smith J，Kiefel V and Santoso S.2003.Nomenclature of human platelet antigens.Vox Sang.85，240-245.
-Miller SA，Dykes DD and Polesky HF.1988.A simple salting outprocedure for extracting DNA from human nucleated cells.Nucl.Acids Res.16，1215.
-Mujumdar RB，Ernst LA，Mujumdar SR，Lewis CJ and Waggoner AS.1993.Cyanine dye labeling reagentssulfoindocyanine succinimidyl esters.Bioconjug.Chem.4，105-111.
-Park SJ，Taton TA andMirkin CA.2002.Array-based electricaldetection of DNA with nanoparticle probes.Science 295，1503-1506.
-Pastinen T，Kurg A，Metspalu A，Peltonen L and Syvanen AC.1997.Minisequencinga specific tool for DNA analysis and diagnostics onoligonucleotide arrays.Genome Res.7，606-614.
-Pastinen T，Raitio M，Lindroos K，Tainola P，Peltonen L and SyvanenAC.2000.A system for specific，high-throughput genotyping byallele-specific primer extension on microarrays.Genome Res.10，1031-1042.
-Prix L，Uciechowski P，Bockmann B，Giesing M and Schuetz AJ.2002.Diagnostic biochip array for fast and sensitive detection of K-ras mutations instool.Clin.Chem.48，428-435.
-Randen I，Sorensen K，Killie MK and Kjeldsen-Kragh J.2003.Rapidand reliable genotyping of human plaelet antigen(HPA)-1，-2，-3，-4，and-5 a/band Gov a/b by melting curve analysis.
-Transfusion 43，445-450.redid ME.2003.Applications of DNA-basedassays in blood group antigen and antibody identification.Transfusion43，1748-1757.
-Seltsam A，Wagner FF，Salama A and Flegel WA.2003.Antibodies tohigh-frequency antigens may decrease the quality of transfusion supportanobservational study.Transfusion 43，1563-1566.
-Shuber AP，Grondin VJ and Klinger KW.1995.A simplified procedurefor developing multiplex PCRs.Genome Research 5，488-493.
-Tax MG，van der Schoot CE，van Doom R，Douglas-Berger L，vanRhenen DJ and Maaskant-vanWijk PA.2002.RHC and RHc genotyping indifferent ethnic groups.Transfusion 42，634-444.
-Wang DG，F(xiàn)an JB，Siao CJ，Berno A，Young P，Sapolsky R，GhandourG，Perkins N，Winchester E，Spencer J，Kruglyak L，Stein L，Hsie L，Topaloglou T，Hubbell E，Robinson E，Mittmann M，Morris MS，Shen N，Kilburn D，Rioux J，Nusbaum C，Rozen S，Hudson TJ and Lander ES.1998.Large-Scale Identification，Mapping，and Genotyping of Single-NucleotidePolymorphisms in the Human Genome.Science 280，1077-1082.
-Wen WH，Bernstein L，Lescallett J，Beazer-Barclay Y，Sullivan-HalleyJ，White M and Press MF.2000.Comparison of TP53 mutations identified byoligonucleotide microarray and conventional DNA sequence analysis.CancerRes.60，2716-2722.
-Wen SY，Wang H，Sun OJ，Wang SQ.2003.Rapid detection of theknown SNPs ofCYP2C9 using oligonucleotide microarray.World JGastroenterol.9，1342-1346.
-White S，Kalf M，Liu Q，Villerius M，Engelsma D，Kriek M，VollebregtE，Bakker B，van Ommen GJ，Breuning MH and den Dunnen JT.2002.Comprehensive detection of genomic duplications and deletions in the DMDgene，by use of multiplexamplifiable probe hybridisation.Am.J.Hum.Genet.71，365-374.
權(quán)利要求
1.一種血細(xì)胞抗原基因分型的方法，其包括對來自一哺乳動(dòng)物物種的個(gè)體的DNA進(jìn)行多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)以便擴(kuò)增并以可檢測方式標(biāo)記至少兩種不同的血細(xì)胞抗原的基因座的含有所述血細(xì)胞抗原的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域，并使用如此擴(kuò)增和標(biāo)記的DNA片段來確定每一種所述血細(xì)胞抗原的基因型，所述多重PCR包括使用針對每一種待進(jìn)行基因分型的血細(xì)胞抗原的至少一對血細(xì)胞抗原特異性嵌合引物以及至少一種以可檢測方式標(biāo)記的通用引物，其中所述至少一種通用引物具有不存在于所述哺乳動(dòng)物物種的DNA中的獨(dú)特序列，且其中每一嵌合引物對包括左側(cè)嵌合引物和右側(cè)嵌合引物，它們各自包括位于3′端的血細(xì)胞抗原特異性部分和位于5′端的通用部分，其中所述嵌合引物的通用部分的堿基序列對應(yīng)于所述至少一種通用引物的堿基序列，且其中所述嵌合引物對的所述血細(xì)胞抗原特異性部分包含所述血細(xì)胞抗原的基因座的含有所述血細(xì)胞抗原的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種以可檢測方式標(biāo)記的通用引物所使用的摩爾量是每一嵌合引物的摩爾量的至少100倍，更優(yōu)選地為至少200倍。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中使用具有不存在于所述哺乳動(dòng)物物種的DNA中的獨(dú)特序列的、以可檢測方式標(biāo)記的通用引物對，且其中對于每一嵌合引物對，所述嵌合引物對的一個(gè)成員的通用部分的堿基序列對應(yīng)于所述通用引物對的一個(gè)成員的堿基序列，且所述嵌合引物對的另一成員的通用部分的堿基序列對應(yīng)于所述通用引物對的另一成員的堿基序列。
4.權(quán)利要求3的方法，其中一種所述通用引物具有堿基序列g(shù)ccgcgaattcactagtg(SEQ ID NO2)，而另一所述通用引物具有堿基序列g(shù)gccgcgggaattcgatt(SEQ ID NO1)。
5.權(quán)利要求14中任一項(xiàng)的方法，其中每一通用引物在其5′端攜帶熒光標(biāo)記物，優(yōu)選地為Cy5。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述哺乳動(dòng)物物種是人，所述DNA是基因組DNA，且所述血細(xì)胞抗原包括選自如下一組中的至少兩種成員、優(yōu)選地所有成員HPA1、HPA2、HPA3、HPA4、HPA5、Gov、JK1/2、FY1/2、GATAbox、KEL1/2、KEL3/4、RHCEex2/RHex2、RHCEex5/RHex5、RHDψ、RHD、BigC、MN、U和JO。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述嵌合引物包括選自如下一組中的至少兩對、優(yōu)選地基本上所有對HPA1-leftgccgcgaattcactagtgcttcaggtcacagcgaggt SEQ ID NO3HPA1-right ggccgcgggaattcgattgctccaatgtacggggtaaa SEQ ID NO4HPA2-leftgccgcgaattcactagtgtgaaaggcaatgagctgaag SEQ ID NO5HPA2-right ggccgcgggaattcgattagccagactgagcttctcca SEQ ID NO6HPA3-leftgccgcgaattcactagtggcctgaccactcctttgcSEQ ID NO7HPA3-right ggccgcgggaattcgattggaagatctgtctgcgatcc SEQ ID NO8HPA4-leftgccgcgaattcactagtgatccgcaggttactggtgag SEQ ID NO9HPA4-right ggccgcgggaattcgattccatgaaggatgatctgtgg SEQ ID NO10HPA5-leftgccgcgaattcactagtgtccaaatgcaagttaaattaccag SEQ ID NO11HPA5-right ggccgcgggaattcgattacagacgtgctcttggtaggt SEQ ID NO12HPA15-left gccgcgaattcactagtgtgtatcagttcttggttttgtgatg SEQ ID NO13HPA15-right ggccgcgggaattcgattaaaaccagtagccacccaag SEQ ID NO14JK1/2-left gccgcgaattcactagtggtctttcagccccatttgag SEQ ID NO15JK1/2-right ggccgcgggaattcgattgttgaaaccccagagtccaa SEQ ID NO16FY1/2-left gccgcgaattcactagtggaattcttcctatggtgtgaatga SEQ ID NO17FY1/2-right ggccgcgggaattcgattaagaagggcagtgcagagtc SEQ ID NO18GATAbox-left gccgcgaattcactagtgggccctcattagtccttgg SEQ ID NO19GATAbox-right ggccgcgggaattcgattgaaatgaggggcatagggataSEQ ID NO20Fyx-left gccgcgaattcactagtgtcatgcttttcagacctctcttc SEQ ID NO175Fyx-right ggccgcgggaattcgattcaagacgggcaccacaat SEQ ID NO176KEL1/2-leftgccgcgaattcactagtgaagggaaatggccatactga SEQ ID NO21KEL1/2-right ggccgcgggaattcgattagctgtgtaagagccgatcc SEQ ID NO22KEL3/4-leftgccgcgaattcactagtggcctcagaaactggaacagc SEQ ID NO23KEL3/4-right ggccgcgggaattcgattagcaaggtgcaagaacaactct SEQ ID NO24KEL6/7-leftgccgcgaattcactagtggcagcaccaaccctatgttc SEQ ID NO177KEL6/7-right ggccgcgggaattcgatttcaggcacaggtgagcttc SEQ ID NO178RHCEex2for gccgcgaattcactagtgcgtctgcttccccctccSEQ ID NO25RHex2rev ggccgcgggaattcgattctgaacagtgtgatgaccaccSEQ ID NO26RHDex3-leftgccgcgaattcactagtgtcctggctctccctctct SEQ ID NO179RHCEex3-right ggccgcgggaattcgatttttttcaaaaccccggaag SEQ ID NO180RHCEex5-left gccgcgaattcactagtgggatgttctggccaagtg SEQ ID NO27RHex5rev ggccgcgggaattcgattggctgtcaccacactgactg SEQ ID NO28RHDψ-left ggccgcggga attcgattgtagtgagctggcccatca SEQ ID NO29RHDψ-rightgccgcgaattcactagtgtgtctagtttcttaccggcaagt SEQ ID NO30RHD-leftB gccgcgaattcactagtgttataataacacttgtccacaggg SEQ ID NO31RHD-rightC ggccgcgggaattcgattcggctccgacggtatc SEQ ID NO32BigC-left gccgcgaattcagtagtgggccaccaccatttgaaSEQ ID NO33BigC-rightintron2 ggccgcgggaattcgattccatgaacatgccacttcac SEQ ID NO34RhDVI-left(fw) ggccgcgggaattcgattctttgaaattaagcacttcacaga SEQ ID NO181RhDVI-right(rev) gccgcgaattcactagtggccagaatcacactcctgct SEQ ID NO182MN-leftgccgcgaattcactagtgtgagggaatttgtcttttgca SEQ ID NO35MN-right ggccgcgggaattcgattcagaggcaagaattcctcca. SEQ ID NO36Ss-leftgccgcgaattcactagtgtttttctttgcacatgtcttt SEQ ID NO183Ss-right ggccgcgggaattcgatttctttgtctttacaatttcgtgtgSEQ ID NO184U-left gccgcgaattcactagtgcgctgatgttatctgtcttatttttc SEQ ID NO37U-rightggccgcgggaattcgattgatcgttccaataataccagcc SEQ ID NO38DO-leftggccgcgggaattcgatttgatccctccctatgagctgSEQ ID NO185DO-right gccgcgaattcactagtgttatatgtgctcaggttcccagt SEQ ID NO186JO-leftgccgcgaatttcactagtgcctggcttaaccaaggaaaa SEQ ID NO39JO-right ggccgcgggaattcgatttcatactgctgtggagtcctg SEQ ID NO40Colton-leftgccgcgaattcactagtggccacgaccctctttgtct SEQ ID NO187Colton-right ggccgcgggaattcgatttacatgagggcacggaagatSEQ ID NO188Diego-left gccgcgaattcactagtgacttattcacgggcatccagSEQ ID NO189Diego-rightggccgcgggaattcgattaagctccacgttcctgaagaSEQ ID NO190Wr-leftgccgcgaattcactagtgggcttcaaggtgtccaactcSEQ ID NO636Wr-right ggccgcgggaattcgattaggatgaagaccagcagagcSEQ ID NO637Yt-leftggccgcgggaattcgattccttcgtgcctgtggtagatSEQ ID NO638Yt-right gccgcgaattcactagtgttctgggacttctgggaatgSEQ ID NO639Lu-leftgccgcgaattcactagtgggacccagagagagagagactg SEQ ID NO640Lu-right ggccgcgggaattcgattgggagtccagctggtatgg SEQ ID NO641。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中多重PCR所用的DNA聚合酶是Taq聚合酶或類似的耐熱聚合酶，且多重PCR的每一循環(huán)包括在90至98℃進(jìn)行15至60秒(優(yōu)選地在大約94℃進(jìn)行大約30秒)的熱變性步驟，在54至60℃進(jìn)行60至120秒(優(yōu)選地在大約57℃進(jìn)行大約90秒)的退火步驟，以及在68至76℃進(jìn)行60至120秒(優(yōu)選地在大約72℃進(jìn)行大約90秒)的引物延伸步驟。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其中基于50μl的反應(yīng)體積，所述多重PCR使用來自所述個(gè)體的大約100ng的基因組DNA，大約5nM的每一嵌合引物，每一嵌合引物對大約0.2μM的每一種以可檢測方式標(biāo)記的通用引物和大約25μl的2x含MasterMix的緩沖液、各種dNTP和DNA聚合酶。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中通過將多重PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)變性后與存在于DNA陣列中或以任何其他形式存在例如載于珠上的血細(xì)胞抗原等位基因特異性寡核苷酸探針進(jìn)行雜交，并分析雜交模式，以確定每一所述血細(xì)胞抗原的基因型。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述等位基因特異性探針的長度為15至40個(gè)核苷酸，優(yōu)選地為17至30個(gè)核苷酸。
12.權(quán)利要求10或11的方法，其中所述陣列含有針對血細(xì)胞抗原的每一等位基因至少兩種、優(yōu)選地至少5種不同的有義探針和至少兩種、優(yōu)選地至少5種不同的反義探針，其中的每一探針均覆蓋所述核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，但覆蓋的是不同的位置。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述陣列含有選自如下一組中的至少72種不同的探針、優(yōu)選地基本上所有探針HPA1-allele aHPA-1aa tacaggccctgcctctgggSEQ ID NO41HPA-1ab aggccctgcctctgggct SEQ ID NO42HPA-1ac ccctgcctctgggctcaccSEQ ID NO43HPA-1ad tgcctctgggctcacctcgSEQ ID NO44HPA-1ae ctctgggctcacctcgctgSEQ ID NO45HPA-1aa CR cagcgaggtgagcccagagSEQ ID NO46HPA-1ab CR cgaggtgagcccagaggcaSEQ ID NO47HPA-1ac CR ggtgagcccagaggcagggSEQ ID NO48HPA-1ad CR agcccagaggcagggcct SEQ ID NO49HPA-1ae CRcccagaggcagggcctgta SEQ ID NO50HPA1-allele bHPA-1ba tacaggccctgcctccggg SEQ ID NO51HPA-1bb aggccctgcctccgggctSEQ ID NO52HPA-1bc ccctgcctccgggctcacSEQ ID NO53HPA-1bd ctgcctccgggctcacctSEQ ID NO54HPA-1be ctccgggctcacctcgctSEQ ID NO55HPA-1ba CRagcgaggtgagcccggagSEQ ID NO56HPA-1bb CRaggtgagcccggaggcagSEQ ID NO57HPA-1bc CRgtgagcccggaggcagggSEQ ID NO58HPA-1bd CRagcccggaggcagggcctSEQ ID NO59HPA-1be CRcccggaggcagggcctgta SEQ ID NO60HPA2-allcle aHPA-2aa ctgacgcccacacccaagSEQ ID NO61HPA-2ab ctcctgacgcccacacccSEQ ID NO62HPA-2ac ggctcctgacgcccacacSEQ ID NO63HPA-2ad agggctcctgacgcccacSEQ ID NO64HPA-2ae ccagggctcctgacgcccSEQ ID NO65HPA-2aa CRcttggfgtgtgggcgtcag SEQ ID NO66HPA-2ab CRgggtgtgggcgtcaggagSEQ ID NO67HPA-2ac CRgtgtgggcgtcaggagccSEQ ID NO68HPA-2ad CRgtgggcgtcaggagccctSEQ ID NO69HPA-2ae CRgggcgtcaggagccctggSEQ ID NO70HPA2-allele bHPA-2ba cctgatgcccacacccaag SEQ ID NO71HPA-2bb ctcctgatgcccacaccca SEQ ID NO72HPA-2bc ggctcctgatgcccacacc SEQ ID NO73HPA-2bd agggctcctgatgcccaca SEQ ID NO74HPA-2be ccagggctcctgatgcccSEQ ID NO75HPA-2ba CRcttgggtgtgggcatcagg SEQ ID NO76HPA-2bb CRtgggtgtgggcatcaggag SEQ ID NO77HPA-2bc CRggtgtgggcatcaggagcc SEQ ID NO78HPA-2bd CRtgtgggcatcaggagccct SEQ ID NO79HPA-2be CRgggcatcaggagccctggSEQ ID NO80HPA3-allele aHPA-3aa ccatccccagcccctcccSEQ ID NO81HPA-3abgcccatccccagcccctcSEQ ID NO82HPA-3acctgcccatccccagccccSEQ ID NO83HPA-3ad1 gctgcccatccccagcccSEQ ID NO84HPA-3adggctgcccatccccagccSEQ ID NO85HPA-3ad2 gggctgcccatccccagcSEQ ID NO86HPA-3aeggggctgcccatcccca SEQ ID NO87HPA-3aa CRgggaggggctggggatggSEQ ID NO88HPA-3ab CRgaggggctggggatgggcSEQ ID NO89HPA-3ac CRggggctggggatgggcagSEQ ID NO90HPA-3ad1 CRgggctggggatgggcagcSEQ ID NO91HPA-3ad CRggctggggatgggcagccSEQ ID NO92HPA-3ad2 CRgctggggatgggcagcccSEQ ID NO93HPA-3ae CRtggggatgggcagcccc SEQ ID NO94HPA3-allcle bHPA-3baccagccccagcccctcc SEQ ID NO95HPA-3bbgcccagccccagcccct SEQ ID NO96HPA-3bcctgcccagccccagccc SEQ ID NO97HPA-3bd1 gctgcccagccccagcc SEQ ID NO98HPA-3bdggctgcccagccccagc SEQ ID NO99HPA-3bd2 gggctgcccagccccag SEQ ID NO100HPA-3beggggctgcccagcccca SEQ ID NO101HPA-3ba CRggaggggctggggctgg SEQ ID NO102HPA-3bb CRaggggctggggctgggc SEQ ID NO103HPA-3bc CRgggctggggctgggcag SEQ ID NO104HPA-3bd1 CRggctggggctgggcagc SEQ ID NO105HPA-3bd CRgctggggctgggcagcc SEQ ID NO106HPA-3bd2 CRctggggctgggcagccc SEQ ID NO107HPA-3be CRtggggctgggcagcccc SEQ ID NO108HPA4-allele aHPA-4aagccacccagatgcgaaagSEQ ID NO109HPA-4abcacccagatgcgaaagctSEQ ID NO110HPA-4accccagatgcgaaagctcaSEQ ID NO111HPA-4adcagatgcgaaagctcaccSEQ ID NO112HPA-4aegatgcgaaagctcaccagSEQ ID NO113HPA-4aa CRctggtgagctttcgcatcSEQ ID NO114HPA-4ab CRggtgagctttcgcatctgSEQ ID NO115HPA-4ac CRtgagctttcgcatctggg SEQ ID NO116HPA-4ad CRagctttcgcatctgggtg SEQ ID NO117HPA-4ac CRctttcgcatctgggtggc SEQ ID NO118HPA4-allele bHPA-4bagccacccagatgcaaaag SEQ ID NO119HPA-4bbccacccagatgcaaaagctSEQ ID NO120HPA-4bcacccagatgcaaaagctcac SEQ ID NO121HPA-4bdcagatgcaaaagctcaccaSEQ ID NO122HPA-4begatgcaaaagctcaccagtaa SEQ ID NO123HPA-4ba CRttactggtgagcttttgcatc SEQ ID NO124HPA-4bb CRtggtgagcttttgcatctgSEQ ID NO125HPA-4bc CRgtgagcttttgcatctgggt SEQ ID NO126HPA-4bd CRagcttttgcatctgggtggSEQ ID NO127HPA-4bc CRcttttgcatctgggtggc SEQ ID NO128HPA5-allele aHPA-5aagagtctacctgtttactatcaaagaggSEQ ID NO129HPA-5abagtctacctgtttactatcaaagaggta SEQ ID NO130HPA-5acgtctacctgtttactatcaaagaggtaa SEQ ID NO131HPA-5adctacctgtttactatcaaagaggtaaaa SEQ ID NO132HPA-5aeacctgtttactatcaaagaggtaaaaaSEQ ID NO133HPA-5aa CRtttttacctctttgatagtaaacaggtSEQ ID NO134HPA-5ab CRttttacctctttgatagtaaacaggtag SEQ ID NO135HPA-5ac CRttacctctttgatagtaaacaggtagac SEQ ID NO136HPA-5ad CRtacctctttgatagtaaacaggtagact SEQ ID NO137HPA-5ae CRcctctttgatagtaaacaggtagactcSEQ ID NO138HPA5-allele bHPA-5bagagtctacctgtttactatcaaaaaggSEQ ID NO139HPA-5bbagtctacctgtttactatcaaaaaggta SEQ ID NO140HPA-5bcgtctacctgtttactatcaaaaaggtaat SEQ ID NO141HPA-5adctacctgtttactatcaaaaaggtaaaa SEQ ID NO142HPA-5beacctgtttactatcaaaaaggtaaaaaSEQ ID NO143HPA-5ba CRtttttacctttttgatagtaaacaggtSEQ ID NO144HPA-5bb CRttttacctttttgatagtaaacaggtag SEQ ID NO145HPA-5bc CRttacctttttgatagtaaacaggtagac SEQ ID NO146HPA-5bd CRtacctttttgatagtaaacaggtagact SEQ ID NO147HPA-5be CRcctttttgatagtaaacaggtagactcSEQ ID NO148HPA15-allele aGov-aa ttattatcttgacttcagttacaggattt SEQ ID NO149Gov-ab tcttgacttcagttacaggatttacc SEQ ID NO150Gov-ac tgacttcagttacaggatttaccaa SEQ ID NO151Gov-ad cttcagttacaggatttaccaagaat SEQ ID NO152Gov-ae cagttacaggatttaccaagaatttg SEQ ID NO153Gov-aa CRcaaattcttggtaaatcctgtaactg SEQ ID NO154Gov-ab CRattcttggtaaatcctgtaactgaag SEQ ID NO155Gov-ac CRtggtaaatcctgtaactgaagtcaa SEQ ID NO156Gov-ad CRggtaaatcctgtaactgaagtcaaga SEQ ID NO157Gov-ae CRaaatcctgtaactgaagtcaagataataa SEQ ID NO158HPA15-allcle bGov-ba tatcttgacttcagttccaggatt SEQ ID NO159Gov-bb cttgacttcagttccaggatttac SEQ ID NO160Gov-bc gacttcagttccaggatttaccaSEQ ID NO161Gov-bd ttcagttccaggatttaccaag SEQ ID NO162Gov-be cagttccaggatttaccaagaatt SEQ ID NO163Gov-ba CRaattcttggtaaatcctggaactg SEQ ID NO164Gov-bb CRcttggtaaatcctggaactgaa SEQ ID NO165Gov-bc CRggtaaatcctggaactgaagtcaSEQ ID NO166Gov-bd CRgtaaatcctggaactgaagtcaag SEQ ID NO167Gov-be CRaatcctggaactgaagtcaagata. SEQ ID NO168Colton-a-alleleCo.a.1 aacaaccagacggcggt SEQ ID NO191Co.a.2 accagacggcggtccag SEQ ID NO192Co.a.3 cagacggcggtccagga SEQ ID NO193Co.a.4 gacggcggtccaggacaa SEQ ID NO194Co.a.5 cggcggtccaggacaac SEQ ID NO195Co.a.1.crgttgtcctggaccgccgt SEQ ID NO196Co.a.2.crtcctggaccgccgtctg SEQ ID NO197Co.a.3.crctggaccgccgtctggt SEQ ID NO198Co.a.4.crggaccgccgtctggttg SEQ ID NO199Co.a.5.craccgccgtctggttgtt SEQ ID NO200Colton-b-alleleCo.b.1 ggaacaaccagacggtggtSEQ ID NO201Co.b.2 acaaccagacggtggtccag SEQ ID NO202Co.b.3accagacggtggtccagga SEQ ID NO203Co.b.4gacggtggtccaggacaacgSEQ ID NO204Co.b.5cggtggtccaggacaacg SEQ ID NO205Co.b.1.cr cgttgtcctggaccaccgt SEQ ID NO206Co.b.2.cr ttgtcctggaccaccgtctgSEQ ID NO207Co.b.3.cr ctggaccaccgtctggttgtSEQ ID NO208Co.b.4.cr ggaccaccgtctggttgttcSEQ ID NO209Co.b.5.cr accaccgtctggttgttcc SEQ ID NO210Diego-a-alleleDi.a.1gtgaagtccacgccggc SEQ ID NO211Di.a.2gaagtccacgccggcct SEQ ID NO212Di.a.3agtccacgccggcctcc SEQ ID NO213Di.a.4tccacgccggcctccct SEQ ID NO214Di.a.5acgccggcctccctggcc SEQ ID NO215Di.a.1.cr gccagggaggccggcgt SEQ ID NO216Di.a.2.cr agggaggccggcgtgga SEQ ID NO217Di.a.3.cr ggaggccggcgtggact SEQ ID NO218Di.a.4.cr aggccggcgtggacttc SEQ ID NO219Di.a.5.cr ggccggcgtggacttca SEQ ID NO220Diego-b-alleleDi.b.1ggtgaagtccacgctggc SEQ ID NO221Di.b.2gtgaagtccacgctggcct SEQ ID NO222Di.b.3tgaagtccacgctggcctccSEQ ID NO223Di.b.4gaagtccacgctggcctccct SEQ ID NO224Di.b.5acgctggcctccctggccc SEQ ID NO225Di.b.1.cr ggccagggaggccagcgt SEQ ID NO226Di.b.2.cr cagggaggccagcgtgga SEQ ID NO227Di.b.3.cr agggaggccagcgtggact SEQ ID NO228Di.b.4.cr ggaggccagcgtggacttc SEQ ID NO229Di.b.5.cr ggccagcgtggacttcacc SEQ ID NO230Diego Wr-a-alleleWr.a.1tgggcttgcgttccaagt SEQ ID NO231Wr.a.2ggcttgcgttccaagtttc SEQ ID NO232Wr.a.3ttgcgttccaagtttccca SEQ ID NO233Wr.a.4cgttccaagtttcccatct SEQ ID NO234Wr.a.5tccaagtttcccatctgga SEQ ID NO235Wr.a.1 CR tccagatgggaaacttggaSEQ ID NO236Wr.a.2 CR agatgggaaacttggaacgSEQ ID NO237Wr.a.3 CR tgggaaacttggaacgcaaSEQ ID NO238Wr.a.4 CR gaaacttggaacgcaagccSEQ ID NO239Wr.a.5 CR acttggaacgcaagccca SEQ ID NO240Diego Wr-b-alleleWr.b.1 gggcttgctgttccgagttSEQ ID NO241Wr.b.2 gcttgcgttccgagtttc SEQ ID NO242Wr.b.3 ttgcgttccgagtttccc SEQ ID NO243Wr.b.4 cgttccgagtttcccatc SEQ ID NO244Wr.b.5 tccgagtttcccatctgg SEQ ID NO245Wr.b.1 CR ccagatgggaaactcgga SEQ ID NO246Wr.b.2 CR gatgggaaactcggaacg SEQ ID NO247Wr.b.3 CR gggaaactcggaacgcaa SEQ ID NO248Wr.b.4 CR gaaactcggaacgcaagc SEQ ID NO249Wr.b.5 CR aactcggaacgcaagccc SEQ ID NO250Dombrock-a-allelcDo.a.1 taccacccaagaggaaactSEQ ID NO251Do.a.2 ccacccaagaggaaactggSEQ ID NO252Do.a.3 acccaagaggaaactggttg SEQ ID NO253Do.a.4 caagaggaaactggttgcaSEQ ID NO254Do.a.5 aggaaactggttgcagttga SEQ ID NO255Do a 6 cr ctcaactgcaaccagtttcc SEQ ID NO256Do a 7 cr caactgcaaccagtttcctc SEQ ID NO257Do a 8 cr tgcaaccagtttcctcttgg SEQ ID NO258Do a 9 cr accagtttcctcttgggtgg SEQ ID NO259Do a 10 cr cagtttcctcttgggtggta SEQ ID NO260Dombrock-b-allelcDo.b.1 taccacccaagaggagactSEQ ID NO261Do.b.2 ccacccaagaggagactggSEQ ID NO262Do.b.3 acccaagaggagactggttg SEQ ID NO263Do.b.4 caagaggagactggttgcaSEQ ID NO264Do.b.5 aggagactggttgcagttga SEQ ID NO265Do b 6 cr ctcaactgcaaccagtctcc SEQ ID NO266Do b 7 cr caactgcaaccagtctcctc SEQ ID NO267Do b 8 cr tgcaaccagtctcctcttgg SEQ ID NO268Do b 9 craccagtctcctcttgggtggSEQ ID NO269Do b 10 crcagtctcctcttgggtggt SEQ ID NO270Dombrock-Joseph(a)positive alleleJo.a.pos.1ccccagaacatgactaccacSEQ ID NO271Jo.a.pos.2ccagaacatgactaccacaca SEQ ID NO272Jo.a.pos.3agaacatgactaccacacacgc SEQ ID NO273Jo.a.Pos.4catgactaccacacacgctgt SEQ ID NO274Jo.a.pos.5actaccacacacgctgtgg SEQ ID NO275Jo.a.pos.1.cr gccacagcgtgtgtggtagtSEQ ID NO276Jo.a.pos.2.cr acagcgtgtgtggtagtcatg SEQ ID NO277Jo.a.pos.3.cr agcgtgtgtggtagtcatgtt SEQ ID NO278Jo.a.pos.4.cr cgtgtgtggtagtcatgttctg SEQ ID NO279Jo.a.pos.5.cr gtggtagtcatgttctggggSEQ ID NO280Dombrock-Joseph(a)negative alleleJo.a.neg.1ctaccccagaacatgactatcac SEQ ID NO281Jo.a.neg.2cccagaacatgactatcacaca SEQ ID NO282Jo.a.neg.3cagaacatgactatcacacacgc SEQ ID NO283Jo.a.neg.4catgactatcacacacgctgtg SEQ ID NO284Jo.a.neg.5actatcacacacgctgtggcSEQ ID NO285Jo.a.neg.1.cr aatagccacagcgtgtgtgatagtSEQ ID NO286Jo.a.neg.2.cr cacagcgtgtgtgatagtcatg SEQ ID NO287Jo.a.neg.3.cr cagcgtgtgtgatagtcatgtt SEQ ID NO288Jo.a.neg.4.cr cgtgtgtgatagtcatgttctgg SEQ ID NO289Jo.a.neg.5.cr gtgatagtcatgttctggggtag SEQ ID NO290Duffy-a-alleleFy.A.1ccagatggagactatggtgcc SEQ ID NO291Fy.A.2atggagactatggtgccaacSEQ ID NO292Fy.A.3ggagactatggtgccaacctg SEQ ID NO293Fy.A.4gactatggtgccaacctggaSEQ ID NO294Fy.A.5tatggtgccaacctggaag SEQ ID NO295Fy.A.1.cr cttccaggttggcaccata SEQ ID NO296Fy.A.2.cr tccaggttggcaccatagtcSEQ ID NO297Fy.A.3.cr aggttggcaccatagtctccSEQ ID NO298Fy.A.4.cr gttggcaccatagtctccatSEQ ID NO299Fy.A.5.cr gcaccatagtctccatctggSEQ ID NO300Duffy-b-alleleFy.B.1cccagatggagactatgatgcc SEQ ID NO301Fy.B.2gatggagactatgatgccaacSEQ ID NO302Fy.B.3tggagactatgatgccaacctg SEQ ID NO303Fy.B.4gactatgatgccaacctggaaSEQ ID NO304Fy.B.5tatgatgccaacctggaagc SEQ ID NO305Fy.B.1.cr gcttccaggttggcatcata SEQ ID NO306Fy.B.2.cr ttccaggttggcatcatagtcSEQ ID NO307Fy.B.3.cr caggttggcatcatagtctccSEQ ID NO308Fy.B.4.cr gttggcatcatagtctccatcSEQ ID NO309Fy.B.5.cr gcatcatagtctccatctgggSEQ ID NO310Duffy GATAbox-normal-alleleFy.GATA.normal.1 agtccttggctcttatcttg SEQ ID NO311Fy.GATA.normal.2 agtccttggctcttatcttggaSEQ ID NO312Fy.GATA.normal.3 cttggctcttatcttggaagc SEQ ID NO313Fy.GATA.normal.4 gctcttatcttggaagcacaggSEQ ID NO314Fy.GATA.normal.5 cttatcttggaagcacaggcgcSEQ ID NO315Fy.GATA.normal.1.cr gcctgtgcttccaagataag SEQ ID NO316Fy.GATA.normal.2.cr tgtgcttccaagataagagc SEQ ID NO317Fy.GATA.normal.3.cr tgcttccaagataagagcca SEQ ID NO318Fy.GATA.normal.4.cr ttccaagataagagccaaaggaSEQ ID NO319Fy.GATA.nonnal.5.cr caagataagagccaaggact SEQ ID NO320Duffy GAJAbox-mutation-allelcFy.GATA.mut.1 tccttggctcttaccttgSEQ ID NO321Fy.GATA.mut.2 tccttggctcttaccttgga SEQ ID NO322Fy.GATA.mut.3 tggctcttaccttggaagc SEQ ID NO323Fy.GATA.mut.4 gctcttaccttggaagcacag SEQ ID NO324Fy.GATA.mut.5 cttaccttggaagcacaggcg SEQ ID NO325Fy.GATA.mut.1.cr cctgtgcttccaaggtaag SEQ ID NO326Fy.GATA.mut.2.cr gtgcttccaaggtaagagc SEQ ID NO327Fy.GATA.mut.3.cr gcttccaaggtaagagcca SEQ ID NO328Fy.GATA.mut.4.cr ttccaaggtaagagccaagg SEQ ID NO329Fy.GATA.mut.5.cr caaggtaagagccaaggaSEQ ID NO330Duffy Fyx-normal-alleleFy.X.(b).1ttttcagacctctcttccgct SEQ ID NO331Fy.X.(b).2agacctctcttccgctggc SEQ ID NO332Fy.X.(b).3ctctcttccgctggcagcSEQ ID NO333Fy.X.(b).4 ctcttccgctggcagctc SEQ ID NO334Fy.X.(b).5 cttccgctggcagctctg SEQ ID NO335Fy.X.(b).1.crcagagctgccagcggaa SEQ ID NO336Fy.X.(b).2.cragctgccagcggaagag SEQ ID NO337Fy.X.(b).3.crctgccagcggaagagagg SEQ ID NO338Fy.X.(b).4.crgccagcggaagagaggtc SEQ ID NO339Fy.X.(b).5.crcagcggaagagaggtctg SEQ ID NO340Duffy Fyx-mutation-alleleFy.X.1 gcttttcagacctctcttctgct SEQ ID NO341Fy.X.2 tcagacctctcttctgctggc SEQ ID NO342Fy.X.3 acctctcttctgctggcagcSEQ ID NO343Fy.X.4 ctcttctgctggcagctctgSEQ ID NO344Fy.X.5 cttctgctggcagctctgc SEQ ID NO345Fy.X.1.crgcagagctgccagcagaa SEQ ID NO346Fy.X.2.crgagctgccagcagaagagagSEQ ID NO347Fy.X.3.cragctgccagcagaagagaggSEQ ID NO348Fy.X.4.crgccagcagaagagaggtctgSEQ ID NO349Fy.X.5.crcagcagaagagaggtctgaaa SEQ ID NO350Kidd-allele-aJk.a.1 cagccccatttgaggaca SEQ ID NO351Jk.a.2 gccccatttgaggacatctaSEQ ID NO352Jk.a.3 ccatttgaggacatctactttg SEQ ID NO353Jk.a.4 atttgaggacatctactttgga SEQ ID NO354Jk.a.5 gaggacatctactttggactct SEQ ID NO355Jk.a.1.crcagagtccaaagtagatgtcctc SEQ ID NO356Jk.a.2.cragtccaaagtagatgtcctcaaa SEQ ID NO357Jk.a.3.craaagtagatgtcctcaaatggg SEQ ID NO358Jk.a.4.crtagatgtcctcaaatggggcSEQ ID NO359Jk.a.5.cratgtcctcaaatggggctg SEQ ID NO360Kidd-allele-bJk.b.1 tcagccccatttgagaaca SEQ ID NO361Jk.b.2 gccccatttgagaacatctaSEQ ID NO362Jk.b.3 cccatttgagaacatctactttg SEQ ID NO363Jk.b.4 atttgagaacatctactttggac SEQ ID NO364Jk.b.5 gagaacatctactttggactctg SEQ ID NO365Jk.b.1.crccagagtccaaagtagatgttctcSEQ ID NO366Jk.b.2.cragagtccaaagtagatgttctcaaa SEQ ID NO367Jk.b.3.crccaaagtagatgttctcaaatgg SEQ ID NO368Jk.b.4.cragtagatgttctcaaatggggcSEQ ID NO369Jk.b.5.cratgttctcaaatggggctga SEQ ID NO370Kell-K1-alleleKEL.1.1 tccttaaactttaaccgaatgct SEQ ID NO371KEL.1.2 ttaaactttaaccgaatgctgaga SEQ ID NO372KEL.1.3 aactttaaccgaatgctgagactt SEQ ID NO373KEL.1.4 aaccgaatgctgagacttctg SEQ ID NO374KEL.1.5 cgaatgctgagacttctgatgag SEQ ID NO375KEL 1.6 CR actcatcagaagtctcagcattc SEQ ID NO376KEL 1.7 CR tcagaagtctcagcattcggt SEQ ID NO377KEL 1.8 CR aagtctcagcattcggttaaagSEQ ID NO378KEL 1.9 CR tctcagcattcggttaaagtttaa SEQ ID NO379KEL 1.10 CR agcattcggttaaagtttaagga SEQ ID NO380Kell-K2-alleleKEL.2.1 ccttaaactttaaccgaacgctSEQ ID NO381KEL.2.2 aactttaaccgaacgctgaga SEQ ID NO382KEL.2.3 ctttaaccgaacgctgagacttSEQ ID NO383KEL.2.4 aaccgaacgctgagacttct SEQ ID NO384KEL.2.5 cgaacgctgagacttctgatg SEQ ID NO385KEL 2.6 CR tcatcagaagtctcagcgttc SEQ ID NO386KEL 2.7 CR cagaagtctcagcgttcggt SEQ ID NO387KEL 2.8 CR agtctcagcgttcggttaaag SEQ ID NO388KEL 2.9 CR tctcagcgttcggttaaagtt SEQ ID NO389KEL 2.10 CR agcgttcggttaaagtttaaggSEQ ID NO390Kell-K3-alleleKEL.3.1 aatctccatcacttcatggct SEQ ID NO391KEL.3.2 tccatcacttcatggctgtt SEQ ID NO392KEL.3.3 atcacttcatggctgttcca SEQ ID NO393KEL.3.4 actrcatggctgttccagtt SEQ ID NO394KEL.3.5 tcatggctgttccagtttc SEQ ID NO395KEL.3.1.cr agaaactggaacagccatgaa SEQ ID NO396KEL.3.2.cr aactggaacagccatgaagtg SEQ ID NO397KEL.3.3.cr tggaacagccatgaagtgatg SEQ ID NO398KEL.3.4.cr acagccatgaagtgatggag SEQ ID NO399KEL.3.5.crgccatgaagtgatggagattSEQ ID NO400Kell-K4-alleleKEL.4.1 tctccatcacttcacggct SEQ ID NO401KEL.4.2 ccatcacttcacggctgtt SEQ ID NO402KEL.4.3 cacttcacggctgttcca SEQ ID NO403KEL.4.4 acttcacggctgttccag SEQ ID NO404KEL.4.5 tcacggctgttccagttt SEQ ID NO405KEL.4.1.craaactggaacagccgtgaa SEQ ID NO406KEL.4.2.crctggaacagccgtgaagtg SEQ ID NO407KEL.4.3.crggaacagccgtgaagtgatgSEQ ID NO408KEL.4.4.cracagccgtgaagtgatgg SEQ ID NO409KEL.4.5.crgccgtgaagtgatggaga SEQ ID NO410Kell-K6-alleleKEL.6.1 tactgcctgggggctgccccgcc SEQ ID NO411KEL.6.2 tgggggctgccccgcctgt SEQ ID NO412KEL.6.3 gctgccccgcctgtgac SEQ ID NO413KEL.6.4 ctgccccgcctgtgacaa SEQ ID NO414KEL.6.5 gccccgcctgtgacaac SEQ ID NO415KEL.6.1.crgttgtcacaggcggggc SEQ ID NO416KEL.6.2.crttgtcacaggcggggcag SEQ ID NO417KEL.6.3.crtcacaggcggggcagccc SEQ ID NO418KEL.6.4.cracaggcggggcagccccca SEQ ID NO419KEL.6.5.craggcggggcagccccca SEQ ID NO420Kell-K7-alleleKEL.7.1 actgcctgggggctgcctcgcc SEQ ID NO421KEL.7.2 cctgggggctgcctcgcctgt SEQ ID NO422KEL.7.3 ggctgcctcgcctgtgac SEQ ID NO423KEL.7.4 ctgcctcgcctgtgacaaccSEQ ID NO424KEL.7.5 gcctcgcctgtgacaacc SEQ ID NO425KEL.7.1.crggttgtcacaggcgaggc SEQ ID NO426KEL.7.2.crggttgtcacaggcgaggcagSEQ ID NO427KEL.7.3.crttgtcacaggcgaggcagccc SEQ ID NO428KEL.7.4.cracaggcgaggcagcccccagg SEQ ID NO429KEL.7.5.craggcgaggcagcccccagg SEQ ID NO430Lutheran a-alleleLu.a.1ggagctcgcccccgcct SEQ ID NO431Lu.a.2 gctcgcccccgcctagc SEQ ID NO432Lu.a.3 cgcccccgcctagcctc SEQ ID NO433Lu.a.4 cccccgcctagcctcgg SEQ ID NO434Lu.a.5 cccgcctagcctcggct SEQ ID NO435Lu.a.1 CR agccgaggctaggcggg SEQ ID NO436Lu.a.2 CR ccgaggctaggcggggg SEQ ID NO437Lu.a.3 CR gaggctaggcgggggcg SEQ ID NO438Lu.a.4 CR gctaggcgggggcgagc SEQ ID NO439Lu.a.5 CR aggcgggggcgagctcc SEQ ID NO440Lutheran b-allelcLu.b.1 gggagctcgcccccacct SEQ ID NO441Lu.b.2 gagctcgcccccacctagcSEQ ID NO442Lu.b.3 ctcgcccccacctagcctcSEQ ID NO443Lu.b.4 cccccacctagcctcggctSEQ ID NO444Lu.b.5 cccacctagcctcggctgaSEQ ID NO445Lu.b.1 CR tcagccgaggctaggtgggSEQ ID NO446Lu.b.2 CR agccgaggctaggtgggggSEQ ID NO447Lu.b.3 CR gaggctaggtgggggcgagSEQ ID NO448Lu.b.4 CR gctaggtgggggcgagctcSEQ ID NO449Lu.b.5 CR aggtgggggcgagctccc SEQ ID NO450MNS M-alleleM.1gtgagcatatcagcatcaag SEQ ID NO451M.2atcagcatcaagtaccactgg SEQ ID NO452M.3catcaagtaccactggtgtg SEQ ID NO453M.4taccactggtgtggcaatgc SEQ ID NO454M.5ctggtgtggcaatgcaca SEQ ID NO455M.1.cr tgtgcattgccacaccagtSEQ ID NO456M.2.cr gcattgccacaccagtggta SEQ ID NO457M.3.cr ccacaccagtggtacttgatg SEQ ID NO458M.4.cr accagtggtacttgatgctSEQ ID NO459M.5.cr cttgatgctgatatgctcac SEQ ID NO460MNS N-alleleN.1tgtgagcatatcagcaaaag SEQ ID NO461N.2atcagcattaagtaccactgaggSEQ ID NO462N.3cattaagtaccactgaggtgg SEQ ID NO463N.4accactgaggtggcaatgcSEQ ID NO464N.5 ctgaggtggcaatgcacactSEQ ID NO465N.1.cr gtgtgcattgccacctcagtSEQ ID NO466N.2.cr gcattgccacctcagtggtaSEQ ID NO467N.3.cr ccacctcagtggtacttaatgc SEQ ID NO468N.4.cr cctcagtggtacttaatgctSEQ ID NO469N.5.cr cttaatgctgatatgctcaca SEQ ID NO470MNS S-allelebig.S.1 tttgctttataggagaaatggga SEQ ID NO471big.S.2 ctttataggagaaatgggaca SEQ ID NO472big.S.3 ttataggagaaatgggacaacttgSEQ ID NO473big.S.4 gagaaatgggacaacttgtcc SEQ ID NO474big.S.5 aaatgggacaacttgtccatc SEQ ID NO475big.S.1.cr gatggacaagttgtcccattt SEQ ID NO476big.S.2.cr gacaagttgtcccatttctcc SEQ ID NO477big.S.3.cr aagttgtcccatttctcctata SEQ ID NO478big.S.4.cr tgtcccatttctcctataaagca SEQ ID NO479big.S.5.cr cccatttctcctataaagcaaaa SEQ ID NO480MNS s-allelelittle.s.1 tgctttataggagaaacggga SEQ ID NO481little.s.2 tttataggagaaacgggacaSEQ ID NO482little.s.3 ggagaaacgggacaacttg SEQ ID NO483little.s.4 gagaaacgggacaacttgtcSEQ ID NO484little.s.5 aaacgggacaacttgtccatSEQ ID NO485little.s.1.crtggacaagttgtcccgttt SEQ ID NO486little.s.2.cracaagttgtcccgtttctccSEQ ID NO487little.s.3.cragttgtcccgtttctcctata SEQ ID NO488Iittle.s.4.crtgtcccgtttctcctataaagc SEQ ID NO489little.s.5.crcccgtttctcctataaagcaSEQ ID NO490MNS U-positive-alleleU.pos.1 ttgctgctctctttagctccSEQ ID NO491U.pos.2 ctctctttagctcctgtagtgat SEQ ID NO492U.pos.3 agctcctgtagtgataatactca SEQ ID NO493U.pos.4 gtagtgataatactcattatttttg SEQ ID NO494U.pos.5 taatactcattatttttggggtg SEQ ID NO495U.pos.1.cr caccccaaaaataatgagtatta SEQ ID NO496U.pos.2.cr caaaaataatgagtattatcactaca SEQ ID NO497U.pos.3.cr agtattatcactacaggagctaaaSEQ ID NO498U.pos.4.cr atcactacaggagctaaagag SEQ ID NO499U.pos.5.cr gagctaaagagagcagcaaaSEQ ID NO500MNS U-negative-alleleU.neg.1ttttgctgctctctttatctcc SEQ ID NO501U.neg.2gctctctttatctcctgtagagatSEQ ID NO502U.neg.3tatctcctgtagagataacactcaSEQ ID NO503U.neg.4gtagagataacactcattatttttSEQ ID NO504U.neg.5taacactcattatttttggggt SEQ ID NO505U.neg.1.cr accccaaaaataatgagtgtta SEQ ID NO506U.neg.2.cr aaaaataatgagtgttatctctaca SEQ ID NO507U.neg.3.cr agtgttatctctacaggagataaaSEQ ID NO508U.neg.4.cr atctctacaggagataaagagag SEQ ID NO509U.neg.5.cr gagataaagagagcagcaaaattaSEQ ID NO510Rhesus C-allele(307T)Rh.big.C.1 tgagccagttcccttctgg SEQ ID NO511Rh.big.C.2 gagccagttcccttctgg SEQ ID NO512Rh.big.C.3 ctgagccagttcccttctg SEQ ID NO513Rh.big.C.4 ccttctgggaaggtggtc SEQ ID NO514Rh.big.C.5 ccttctgggaaggtggtca SEQ ID NO515Rh.big.C.1.cr tgaccaccttcccagaagg SEQ ID NO516Rh.big.C.2.cr gaccaccttcccagaagg SEQ ID NO517Rh.big.C.3.cr ccagaagggaactggctc SEQ ID NO518Rh.big.C.4.cr ccagaagggaactggctca SEQ ID NO519Rh.big.C.5.cr cagaagggaactggctcag SEQ ID NO520Rhesus c-allele(307C)Rh.little.c.1 gagccagttccctcctgg SEQ ID NO521Rh.little.c.2 agccagttccctcctgg SEQ ID NO522Rh.littlc.c.3 tgagccagttccctcctg SEQ ID NO523Rh.little.c.4 cctcctgggaaggtggt SEQ ID NO524Rh.little.c.5 cctcctgggaaggtggtc SEQ ID NO525Rh.little.c.1.cr gaccaccttcccaggagg SEQ ID NO526Rh.little.c.2.cr accaccttcccaggagg SEQ ID NO527Rh.little.c.3.cr ccaggagggaactggct SEQ ID NO528Rh.little.c.4.cr ccaggagggaactggctc SEQ ID NO529Rh.little.c.5.cr caggagggaactggctca SEQ ID NO530Rhesus BigC-intron2-specific-insert-alleleRhC.intron.2.1 agggtgccctttgtcacttc SEQ ID NO531RhC.intron.2.2 gccctttgtcacttcccagt SEQ ID NO532RhC.intron.2.3 cctttgtcacttcccagtgg SEQ ID NO533RhC.intron.2.4 ttgtcacttcccagtggtacaaSEQ ID NO534RhC.intron.2.5 tcacttcccagtggtacaatcaSEQ ID NO535RhC.intron.2.1.crgaagtgacaaagggcaccct SEQ ID NO536RhC.intron.2.2.cractgggaagtgacaaagggc SEQ ID NO537RhC.intron.2.3.crccactgggaagtgacaaagg SEQ ID NO538RhC.intron.2.4.crtgtaccactgggaagtgacaaaSEQ ID NO539RhC.intron.2.5.crtgattgtaccactgggaagtgaSEQ ID NO540Rhesus E-alleleRh.big.E.1 gccaagtgtcaactctcctct SEQ ID NO541Rh.big.E.2 caagtgtcaactctcctctgctSEQ ID NO542Rh.big.E.3 gtgtcaactctcctctgctgagSEQ ID NO543Rh.big.E.4 caactctcctctgctgagaagtc SEQ ID NO544Rh.big.E.5 tctcctctgctgagaagtcc SEQ ID NO545Rh.big.E.1.crggacttctcagcagaggagag SEQ ID NO546Rh.big.E.2.crcttctcagcagaggagagttgaSEQ ID NO547Rh.big.E.3.crctcagcagaggagagttgacacSEQ ID NO548Rh.big.E.4.crgcagaggagagttgacacttg SEQ ID NO549Rh.big.E.5.crgaggagagttgacacttggc SEQ ID NO550Rhesus e-alleleRh.little.e.1gccaagtgtcaactctgctct SEQ ID NO551Rh.little.e.2caagtgtcaactctgctctgctSEQ ID NO552Rh.little.e.3tgtcaactctgctctgctgag SEQ ID NO553Rh.little.e.4caactctgctctgctgagaag SEQ ID NO554Rh.little.e.5tctgctctgctgagaagtcc SEQ ID NO555Rh.little.e.1.cr ggacttctcagcagagcagag SEQ ID NO556Rh.little.e.2.cr ttctcagcagagcagagttga SEQ ID NO557Rh.little.e.3.cr tcagcagagcagagttgacac SEQ ID NO558Rh.little.e.4.cr gcagagcagagttgacacttg SEQ ID NO559Rh.little.e.5.cr gagcagagttgacacttggc SEQ ID NO560Rhesus RHD-alleleRhD1 ttccccacagctccatcat SEQ ID NO561RhD2 acagctccatcatgggctac SEQ ID NO562RbD 3 tccatcatgggctacaacttcSEQ ID NO563RhD 4 tcatgggctacaacttcagctSEQ ID NO564RhD 5 gggctacaacttcagcttgctSEQ ID NO565RhD cr 1agcaagctgaagttgtagcccSEQ ID NO566RhD cr 2agctgaagttgtagcccatgaSEQ ID NO567RhD cr 3gaagttgtagcccatgatgg SEQ ID NO568RhD cr 4gcccatgatggagctgtSEQ ID NO569RhD cr 5tgatggagctgtggggaa SEQ ID NO570Rhesus r’s-alleler′s.T.1ggaaggtcaacttggtgca SEQ ID NO571r′s.T.2ggaaggtcaacttggtgcagtSEQ ID NO572r′s.T.3caacttggtgcagttggtg SEQ ID NO573r′s.T.4acttggtgcagttggtggt SEQ ID NO574r′s.T.5ttggtgcagttggtggtgat SEQ ID NO575r′s.T.1.cr catcaccaccaactgcacca SEQ ID NO576r′s.T.2.cr caccaccaactgcaccaagt SEQ ID NO577r′s.T.3.cr accaactgcaccaagttgac SEQ ID NO578r′s.T.4.cr actgcaccaagttgaccttccSEQ ID NO579r′s.T.5.cr tgcaccaagttgaccttcc SEQ ID NO580Rhesus DVI-alleleRh.DVI.1atttcaaccctcttggcctt SEQ ID NO581Rh.DVI.2aaccctcttggcctttgttt SEQ ID NO582Rh.DVI.3tcttggcctttgtttccttg SEQ ID NO583Rh.DVI.4ggtatcagcttgagagctcg SEQ ID NO584Rh.DVI.5atcagcttgagagctcggag SEQ ID NO585Rh.DVI.1.cr aaggccaagagggttgaaat SEQ ID NO586Rh.DVI.2.cr aaacaaaggccaagagggtt SEQ ID NO587Rh.DVI.3.cr caaggaaacaaaggccaaga SEQ ID NO588Rh.DVI.4.cr cgagctctcaagctgatacc SEQ ID NO589Rh.DVL.5.cr ctccgagctctcaagctgat SEQ ID NO590Rhesus RHD-Pseudogene-mutation-alleleRhD Y 1 tttctttgcagacttaggtgcSEQ ID NO591RhD Y 2 ctttgcagacttaggtgcacaSEQ ID NO592RhD Y 3 tttgcagacttaggtgcacagt SEQ ID NO593RhD Y 4 acttaggtgcacagtgcgg SEQ ID NO594RhD Y 5 cttaggtgcacagtgcggt SEQ ID NO595RhD Y cr 1caccgcactgtgcacctaa SEQ ID NO596RhD Y cr 2ccgcactgtgcacctaagtc SEQ ID NO597RhD Y cr 3gcactgtgcacctaagtctgcSEQ ID NO598RhD Y cr 4tgcacctaagtctgcaaaga SEQ ID NO599RhD Y cr 5cacctaagtctgcaaagaaatagcgSEQ ID NO600Rhesus RHD-Pseudogene-normal-alleleRhD non Y 1 ctatttctttgcagacttatgtgc SEQ ID NO601RhD non Y 2 tctttgcagacttatgtgcaca SEQ ID NO602RhD non Y 3 ttgcagacttatgtgcacagtg SEQ ID NO603RhD non Y 4 acttatgtgcacagtgcggt SEQ ID NO604RhD non Y 5 cttatgtgcacagtgcggtg SEQ ID NO605RhD non Y cr 1acaccgcactgtgcacataa SEQ ID NO606RhD non Y cr 2accgcactgtgcacataagtcSEQ ID NO607RhD non Ycr 3 gcactgtgcacataagtctgcSEQ ID NO608RhD non Y cr 4tgtgcacataagtctgcaaagSEQ ID NO609RhD non Y cr 5cacataagtctgcaaagaaatagcgSEQ ID NO610Yt-a-alleleYt.a.1gcgggagacttccacggSEQ ID NO611Yt.a.2gggagacttccacggcct SEQ ID NO612Yt.a.3gagacttccacggcctgc SEQ ID NO613Yt.a.4gacttccacggcctgcaSEQ ID NO614Yt.a.5ttccacggcctgcaggta SEQ ID NO615Yt.a.1 CR tacctgcaggccgtggaa SEQ ID NO616Yt.a.2 CR tgcaggccgtggaagtcSEQ ID NO617Yt.a.3 CR gcaggccgtggaagtctc SEQ ID NO618Yt.a.4 CR aggccgtggaagtctccc SEQ ID NO619Yt.a.5 CR ccgtggaagtctcccgcSEQ ID NO620Yt-b-alleleYt.b.1gcgggagacttcaacggc SEQ ID NO621Yt.b.2gggagacttcaacggcctg SEQ ID NO622Yt.b.3gagacttcaacggcctgca SEQ ID NO623Yt.b.4gacttcaacggcctgcag SEQ ID NO624Yt.b.5ttcaacggcctgcaggtaa SEQ ID NO625Yt.b.1 CR ttacctgcaggccgttgaa SEQ ID NO626Yt.b.2 CR ctgcaggccgttgaagtc SEQ ID NO627Yt.b.3 CR tgcaggccgttgaagtctc SEQ ID NO628Yt.b.4 CRcaggccgttgaagtctcccSEQ ID NO629Yt.b.5 CRgccgttgaagtctcccgc SEQ ID NO630。
14.權(quán)利要求10-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述寡核苷酸探針在5′端包括接頭、優(yōu)選地為-(CH2)6-部分，以及反應(yīng)基團(tuán)、優(yōu)選地為氨基，用于附著于陣列支持物、優(yōu)選地為聚L-賴氨酸包被的玻片。
15.權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)的方法，其中所述陣列包括一或多種具有不存在于所述哺乳動(dòng)物物種的DNA中的序列的寡核苷酸以降低背景，所述寡核苷酸優(yōu)選地選自如下一組a3cagaccataagcacaggcgtSEQ ID NO631，a9gctcgtccacagtgcgttatSEQ ID NO632，a17 cggcgttcaagcaaaccgaaSEQ ID NO633，a23 gacatatagctccactcagaSEQ ID NO634，a27 tagggtactgatgagcactcSEQ ID NO635，a33 tcagccctatcgcaggatgtSEQ ID NO169，a35 gagacacttgacagtagccaSEQ ID NO170，a38 ggcagggcacctcagtttatSEQ ID NO171，a42 tcaccagccagactgtgtagSEQ ID NO172，a43 cttcacgcaagttgtccagaSEQ ID NO173。
16.權(quán)利要求10-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述陣列包括一或多種陽性雜交對照，優(yōu)選地為CS05gtcctgacttctagctcatgSEQ ID NO174，并且其以可檢測方式標(biāo)記的互補(bǔ)物被加入到多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中。
17.權(quán)利要求10-16中任一項(xiàng)的方法，其中在加入多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之前，對所述探針進(jìn)行預(yù)雜交和DNA變性處理。
18.權(quán)利要求10-17中任一項(xiàng)的方法，其中將未經(jīng)過預(yù)純化的變性的多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物施加于DNA陣列。
19.權(quán)利要求10-18中任一項(xiàng)的方法，其中對于每一血細(xì)胞抗原，使用各個(gè)等位基因的信號強(qiáng)度的比率來指定基因型。
20.用于通過權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的方法進(jìn)行血細(xì)胞抗原基因分型的試劑盒，其包括針對每一種待進(jìn)行基因分型的血細(xì)胞抗原的一對血細(xì)胞抗原特異性嵌合引物，以及至少一種如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所定義的以可檢測方式標(biāo)記的通用引物，優(yōu)選地為一對以可檢測方式標(biāo)記的通用引物。
21.權(quán)利要求20的試劑盒，進(jìn)一步包括如權(quán)利要求10-15中任一項(xiàng)所定義的DNA陣列。
22.一組用于多重PCR的血細(xì)胞抗原特異性嵌合引物對，其包括選自如權(quán)利要求7中所定義的組中的至少兩個(gè)引物對、優(yōu)選地為基本上所有的引物對。
23.一組用于血細(xì)胞抗原基因分型的血細(xì)胞抗原等位基因特異性寡核苷酸探針，其包括選自如權(quán)利要求13中所定義的組中的至少72種不同的探針、優(yōu)選地為基本上所有的探針。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種血細(xì)胞抗原基因分型的方法，其包括對來自一哺乳動(dòng)物物種的個(gè)體的DNA進(jìn)行多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)以便擴(kuò)增并以可檢測方式標(biāo)記至少兩種不同的血細(xì)胞抗原的基因座的含有血細(xì)胞抗原的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域，并用如此擴(kuò)增并標(biāo)記的DNA片段來確定每一種所述血細(xì)胞抗原的基因型。多重PCR包括使用針對每一種待進(jìn)行基因分型的血細(xì)胞抗原的至少一對血細(xì)胞抗原特異性嵌合引物和至少一種以可檢測方式標(biāo)記的通用引物，優(yōu)選地為一對以可檢測方式標(biāo)記的通用引物。通用引物具有不存在于所述哺乳動(dòng)物物種的DNA中的獨(dú)特序列。每一嵌合引物對包括左側(cè)嵌合引物和右側(cè)嵌合引物，各引物包括3′端的血細(xì)胞抗原特異性部分和5′端的通用部分。嵌合引物的通用部分的堿基序列對應(yīng)于所述至少一種通用引物的堿基序列。嵌合引物對的血細(xì)胞抗原特異性部分包含所述血細(xì)胞抗原的基因座的含有血細(xì)胞抗原的核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域。本發(fā)明還提供了用于通過此方法進(jìn)行血細(xì)胞抗原基因分型的試劑盒，一組血細(xì)胞抗原特異性嵌合引物對和一組血細(xì)胞抗原等位基因特異性寡核苷酸探針。
文檔編號C12Q1/56GK101027408SQ200580017847
公開日2007年8月29日 申請日期2005年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月1日
發(fā)明者西格里德·赫爾馬·維爾馬·貝布爾, 亨德里卡·維林加-杰爾斯馬, 約翰內(nèi)斯·特奧多魯斯·登鄧內(nèi)恩, 馬申卡·德哈斯 申請人:桑昆血液供給基金會(huì)