專利名稱：：檢測抗癲癇藥物過敏反應相關抗原基因型的試劑及臨床應用方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種用于檢測抗癲癇藥物過敏反應相關抗原基因型的試劑及其臨床應用方法，是一種利用PCR-SSP(序列特異性引物)檢測抗癲癇藥物過敏反應相關抗原基因型的方法。屬于生物醫(yī)藥
技術領域：
。
背景技術：
：抗癲癇藥物是弓l起皮膚型不良反應(cutaneousadversedrugreactions，cADRs)的常見因素之一。cADRs包括輕度的斑丘疹以及嚴重危及生命的皮膚反應，如Stevens-Johnson綜合癥(SJS)、中毒性表皮壞死松解癥(TEN)及藥物超敏綜合癥(HSS)。皮膚型不良反應影響健康，嚴重危及生命的皮膚反應的發(fā)生概率大約為I:IO,OOO，致死率達到30%以上，其中SCR/TEN的致死率高達40。/。。超過90%的嚴重皮膚反應發(fā)生在用藥后的兩個月?？拱d癇藥物如卡馬西平(carbamazepine，CBZ),苯巴比妥(phenobarbital)，苯妥英(phenytoin)及拉莫三嗪(lamotrigine)均與嚴重皮膚反應相關，其中卡馬西平是一線抗驚撅藥物，也是一種情緒穩(wěn)定劑，主要用于癲癇及躁狂癥的治療，也用于精神分裂癥及三叉神經(jīng)的治療。其中卡馬西平是引起不良皮膚反應的最常見因素。在新使用卡馬西平的個體中發(fā)生不良反應的概率為l:1，0001:10，000。美國FDA近期通知醫(yī)務人員，使用卡馬西平可導致危險的甚至致命的皮膚反應(StevensJohnson綜合征和中毒性表皮壞死松解癥)，在有特定人類白細胞抗原(HLA)等位基因HLA-BW502的患者中更常見。該等位基因幾乎只見于有亞洲地區(qū)(包括南亞的印度)血統(tǒng)的患者，如中國漢族人種中HLA-BW502的比率高達14.5%，歐洲人種的概率很低，只有1-2%M(Lonjouetal.,2006)。中國裔、東南亞裔及印度裔已占了全球人口的約1/2，且其后嗣也遍布歐美各地，因此卡馬西平引發(fā)Stevens-Johnson綜合癥候群確實可說是一全球性問題。如果患者有HLA-BW502流行地區(qū)的血統(tǒng)，如中國裔、東南亞裔及印度裔，在開始卡馬西平治療前應篩査HLA-BW502等位基因，以減低抗癲癇藥物的高風險性。近來的研究表明，在中國或亞洲人種中HLA-B*1502和卡馬西平導致的SJS相關性強。HLA-B位點分型中，順序特異性引物聚合酶鏈反應(PCR-SSP)方法是最常用的技術，該技術操作簡單，特異性高。盡管國外已經(jīng)有利用PCR-SSP技術進行HLA-B分型的試劑盒，但該試劑盒主要用于腎移植及骨髓移植。而且由于價格高，使用該試劑盒時檢測位點多，程序復雜，因此，不適用于檢測抗癲癇藥物引起過敏反應相關抗原。綜上所述，在服用卡馬西平等抗癲癇藥物之甜，對患者進行HLA-BW502的分型檢測，從而降低高危藥物的危險性，是非常有必要的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個目的，是為了提供一種用于檢測抗癲癇藥物過敏反應相關抗原基因型的試劑。本發(fā)明的第二個目的，是為了提供一種用于檢測抗癲癇藥物過敏反應相關抗原基因型的試劑的臨床應用方法。本發(fā)明的第一個目的可以通過采取如下措施達到檢測抗癲癇藥物過敏反應相關抗原基因型的試劑，其特征是1)包括Taq酶、七聯(lián)管和PCR引物；2)PCR引物如序列表SEQIDN2:l所示。本發(fā)明的第一個目的還可以通過采取如下措施達到本發(fā)明的一種實施方式是序列表SEQIDN2:1所示的PCR引物包括四對該序列特異性引物及二對內(nèi)參引物，適用于以人外周血或其它組織抽提的gDNA為模板進行PCR擴增。本發(fā)明的一種實施方式是序列表SEQIDN2:1所示的PCR引物系利用序列特異性引物PCR-SSP，根據(jù)HLA-B序列設計而成。本發(fā)明的一種實施方式是所述七聯(lián)管可以為12或24個7聯(lián)管兩種包裝，每個七聯(lián)管做一人份量，七聯(lián)管的最左邊為第一反應管，從左至右依此為二至七反應管，于一20。C保存。本發(fā)明的一種實施方式是所述Taq酶包括12ul和24ul兩種規(guī)格，濃度為5UAH，于一20。C保存。本發(fā)明的第二個目的可以通過采取如下措施達到檢測抗癲癇藥物過敏反應相關抗原基因型的試劑的臨床應用方法，其特征在于1)設計如序列表SEQIDNa:1所示的PCR引物，利用該PCR引物4對該序列特異性引物HS1、HS2、HS3和HS4及2對內(nèi)參引物HC1、HC2，設定用特異性引物HS1、HS2、HS3和HS4擴增HLA-B基因的第二、三、四號外顯子，反應編號分別為Sl、S2、S3、S4;用內(nèi)參引物HC1擴增HLA-DRB1的3號內(nèi)含子、HC2擴增APC基因的15外顯子，APC指腺瘤性息肉adenamoutouspolyposiscoil，反應編號為C1、C2;2)以人外周血或其它組織抽提的gDNA為模板進行PCR擴增，即特異性引物HS1、HS2、HS3和HS4擴增樣本的HLA-B基因的第二、三、四號外顯子，用內(nèi)參引物HC1擴增HLA-DRB1的3號內(nèi)含子、HC2擴增APC基因的15外顯子；3)采用2.0%或其他大于或小于2.0%百分含量的凝膠電泳檢測，當被檢測的所有樣本均出現(xiàn)反應編號為C1、C2的特異目的片段時(內(nèi)對照產(chǎn)物)，表明擴增反應成功有效；當反應編號為S1、S2、S3、S4的特異目的片段都出現(xiàn)時，表明樣本的基因型為HLA-B*1502。本發(fā)明的第二個目的還可以通過采取如下措施達到臨床應用方法包括如下具體步驟1)將前述的Taq酶、七聯(lián)管和PCR引物制作成試劑盒，可以包括12或24個7聯(lián)管兩種包裝，每個7聯(lián)管做1人份，于一2(TC保存，包括DNA樣品在內(nèi)用前達到室溫；2)將Taq酶保持在裝有冰的器皿上；3)取8ulDNA及1ulTaq酶混勻，先用震動器震動310秒鐘，再用微型離心機離心15秒鐘，在震動和離心過程中避免液體附于管壁上端；4)在每個聯(lián)管孔加上述混合液l.125ul，在加液過程中，使液體順管壁流下，避免交叉污染，可輕輕震動7聯(lián)管，確保每孔樣品流到孔底；5)應用ABI9600/9700擴增儀或類似功能的PCR儀進行PCR擴增；通過設計4條特異性引物擴增患者HLA-B基因的第二、三、四號外顯子，從而對患者進行HLA-BW502的分型檢測；6)先將擴增后的樣本儲存在-2(TC冰箱中待用，再將擴增產(chǎn)物上樣于2.0%的凝膠孔中，最后進行電泳，電泳時間為30-40分鐘，電泳載體為微膠系統(tǒng)，電泳電壓為150-200伏。本發(fā)明具有如下突出的有益效果本發(fā)明是利用PCR-SSP技術檢測抗癲癇藥物引起過敏反應相關抗原的方法，是一種PCR-SSP技術專一檢測HLA-B*1502基因型，通過設計4條特異性引物擴增HLA-B基因的第二、三、四號外顯子，從而對患者進行HLA-BW502的分型檢測，從而降低高危藥物的危險性。具有操作簡單、準確率高和成本低的有益效果。特別適用于中國或亞洲人種中患者在服用卡馬西平等抗癲癇藥物之前，通過HLA-B*1502基因型檢測，以確定能否服用卡馬西平等抗癲癇藥物。圖1是用引物HS1擴增HLA-B基因夕卜2-4號顯子的電泳凝膠成像圖。圖2是用引物HS2擴增HLA-B基因夕卜2號顯子的電泳凝膠成像圖。圖3是用引物HS3擴增HLA-B基因夕卜2-3號顯子的電泳凝膠成像圖。圖4是用引物HS4擴增HLA-B基因外2-3號顯子的電泳凝膠成像圖。圖5是用內(nèi)參引物HC1擴增HLA-B基因內(nèi)參1的電泳凝膠成像圖。圖6是用內(nèi)參引物HC2擴增HLA-B基因內(nèi)參2的電泳凝膠成像圖。具體實施方式實驗材料1、使用抗癲癇藥物患者的全血gDNA或其他組織的gDNA2、主要試劑Taq酶(鼎國)，dNTPS，PCRbuffer3、引物及擴增目的片段參照圖1圖6，2%凝膠檢測樣本抗癲癇藥物相關抗原基因型，M:DNA標記；l:卡馬西平耐受患者2:正常；3:卡馬西平-SJS患者；1,2，3的內(nèi)參反應C1、C2均有特異性目的條帶，及S4反應條帶，3還具S1、S2，S3反應條帶，表明僅卡馬西平-SJS患者為HLA-BW502基因型。本實施例中，針對HLA-B*1502(序列號為No.D50293)的2，3，4號外顯子設計4對序列特異性引物；內(nèi)參1為HLA-DRB1的3號內(nèi)含子擴增產(chǎn)物，內(nèi)參2為APC(腺瘤性息肉，adenamoutouspolyposiscoil)基因的15外顯子擴增產(chǎn)物，擴增條帶大小，反應編號等見表l。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>4、反應體系及PCR程序配置12.5WPCR反應體系如下gDNA:10-50ng，dNTPs:200MM，Taq酶0.625U，各引物終濃度1MM(賽百盛)，反應緩沖液終濃度lXPCRbuffer。PCR反應程序94°C60s，l個循環(huán)；94°C30s，56°C30s72°C45s，30個循環(huán)；4'C保存。5、檢測2.0%凝膠電泳檢測，電壓150200V，時間30分鐘，凝膠成像系統(tǒng)成像。經(jīng)過對60個居住在臺灣的漢族卡馬西平導致的SJS患者(CBZ-JSJ)，144位卡馬西平耐受患者(CBZ-tolerant)和93位未使用卡馬西平的正常對照進行基因分型。卡馬西平導致的SJS患者全部為HLA-BW502等位基因型，而耐受的患者只有3%，正常對照只有9%。進一步研究表明HLA-BW502與卡馬西平導致的SJS/TEN存在強相關性，與MPE或HSS無相關性。最近有報道6位卡馬西平導致的SJS/TEN患者基因型為HLA-BM502，達到100%，而正常對照為14.5%，卡馬西平導致的SJS/TEN與HLA-BW502存在強相關，與臺灣報道的基本一致。在歐洲進行的一項研究中，12位卡馬西平導致的SJS/TEN患者有4位為HLA-BW502，而且父母之一為亞裔。序列表引物序列(5'-3'):針對HLA-B*1502的2，3，4號外顯子設計4對序列特異性引物HS1:F:CGAGAGAGCCTGCGGAACR:GCCCACTTCTGGAAGGTTCTHS2:F:CGCGAGTCCGAGGATGGCR:GCAGGTTCCGCAGGCTCTHS3:F:CGCGAGTCCGAGGATGGCR:GAGCCACTCCACGCACAGHS4:F:GGAGTATTGGGACCGGAACR:GCCATACATCCTCTGGATGA針對HLA-B*1502的內(nèi)參1、內(nèi)參2設計4對序列特異性引物HC1:F:TGCCAAGTGGAGCACCCAAR:GCATCTTGCTCTGTGCAGATHC2:F:ATGATGTTGACCTTTCCAGGGR:TTCTGTAACTTTTCATCAGTTGC權利要求1、檢測抗癲癇藥物過敏反應相關抗原基因型的試劑，其特征是1)包括Taq酶、七聯(lián)管和PCR引物；2)PCR引物如序列表SEQID№1所示。2、如權利要求l檢測抗癲癇藥物過敏反應相關抗原基因型的試劑，其特征是:所述的序列表SEQIDNa:1所示的PCR引物包括四對該序列特異性引物及二對內(nèi)參引物，適用于以人外周血或其它組織抽提的gDNA為模板進行PC財廣增。3、如權利要求2檢測抗癲癇藥物過敏反應相關抗原基因型的試劑，其特征是-序列表SEQIDN2:1所示的PCR引物系利用序列特異性引物PCR-SSP，根據(jù)HLA-BH4502序列設計而成。4、如權利要求l檢測抗癲癇藥物過敏反應相關抗原基因型的試劑，其特征是:所述七聯(lián)管可以為12或24個7聯(lián)管兩種包裝，每個七聯(lián)管做一人份量，七聯(lián)管的最左邊為第一反應管，從左至右依此為二至七反應管，于一2(TC保存。5、如權利要求l檢測抗癲癇藥物過敏反應相關抗原基因型的試劑，其特征是:所述Taq酶包括12yl和24ixl兩種規(guī)格，濃度為5U/W，于一2(TC保存。6、檢測抗癲癇藥物過敏反應相關抗原基因型的試劑的臨床應用方法，其特征是1)設計如序列表SEQIDN2:1所示的PCR引物，利用該PCR引物4對該序列特異性引物HS1、HS2、HS3和HS4及2對內(nèi)參引物HC1、HC2，設定用特異性引物HS1、HS2、HS3和HS4擴增HLA-B基因的第二、三、四號外顯子，反應編號分別為S1、S2、S3、S4;用內(nèi)參引物HC1擴增HLA-DRB1的3號內(nèi)含子、HC2擴增APC基因的15外顯子，APC指腺瘤性息肉adenamoutouspolyposiscoil，反應編號為C1、C2;2)以人外周血或其它組織抽提的gDNA為模板進行PCR擴增，即特異性引物HS1、HS2、HS3和HS4擴增樣本的HLA-B基因的第二、三、四號外顯子，用內(nèi)參引物HC1擴增HLA-DRB1的3號內(nèi)含子、HC2擴增APC基因的15外顯子；3)采用凝膠電泳檢測，當被檢測的所有樣本均出現(xiàn)反應編號為C1、C2的特異目的片段時，表明擴增反應成功有效；當反應編號為S1、S2、S3、S4的特異目的片段都出現(xiàn)時，表明樣本的基因型為HLA-B*1502。7、如權利要求6所述的檢測抗癲癇藥物過敏反應相關抗原基因型的試劑的臨床應用方法，其特征是包括如下具體步驟1)將前述的Taq酶、七聯(lián)管和PCR引物制作成試劑盒，可以包括12或24個7聯(lián)管兩種包裝，每個7聯(lián)管做1人份，于一2(TC保存，包括DNA樣品在內(nèi)用前達到室溫；2)將Taq酶保持在裝有冰的器皿上；3)取8ulDNA及1ulTaq酶混勻，先用震動器震動310秒鐘，再用微型離心機離心15秒鐘，在震動和離心過程中避免液體附于管壁上端；4)在每個7聯(lián)管孔加上述混合液1.125ul，在加液過程中，使液體順管壁流下，避免交叉污染，可輕輕震動7聯(lián)管，確保每孔樣品流到孔底；5)應用ABI9600/9700擴增儀或類似功能的PCR儀進行PCR擴增；通過設計4條特異性引物擴增患者HLA-B基因的第二、三、四號外顯子，從而對患者進行HLA-BW502的分型檢測；6)擴增后的樣本可以立即上樣檢測，也可以將擴增后的樣本儲存在-2(TC冰箱中待用，再將擴增產(chǎn)物上樣于2.(m的凝膠孔中，最后進行電泳，電泳時間為30-40分鐘，電泳載體為微膠系統(tǒng)，電泳電壓為150-200伏。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于檢測抗癲癇藥物過敏反應相關抗原基因型的試劑及其臨床應用方法，其特征是1)包括Taq酶、七聯(lián)管和PCR引物；2)PCR引物如序列表SEQID№1所示。其臨床應用方法的特征在于1)利用序列特異性引物PCR-SSP，根據(jù)HLA-B序列設計4對該序列特異性引物及2對內(nèi)參引物，以人外周血或其它組織抽提的gDNA為模板進行PCR擴增；2)采用凝膠電泳檢測，從而確定樣本的基因型為HLA-B*1502。本發(fā)明具有操作簡單、準確率高和成本低的有益效果。特別適用于中國或亞洲人種中患者在服用卡馬西平等抗癲癇藥物之前，通過HLA-B*1502基因型檢測，以確定能否服用卡馬西平等抗癲癇藥物。文檔編號C12Q1/68GK101353698SQ200810026919公開日2009年1月28日申請日期2008年3月21日優(yōu)先權日2008年3月21日發(fā)明者廖衛(wèi)平,石奕武,高玫梅申請人:廣州醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院