專利名稱：：具有非隨機失活狀態(tài)x染色體及特定短串聯(lián)重復序列的人胚胎干細胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及受精卵來源人胚胎干細胞，具體是涉及一種具有非隨機失活狀態(tài)x染色體及特定短串聯(lián)重復序列的人胚胎干細胞系。
背景技術(shù)：
：人類胚胎干細胞(humanembryonicstemcell,hES)是由囊胚的內(nèi)細胞團(innercellmass,ICM)分離培養(yǎng)而來的，具有全能分化特性的細胞，具有自我更新和多向分化潛能，在細胞治療、胚胎發(fā)育、藥物篩選、基因治療以及遺傳、表觀遺傳機制研究等領(lǐng)域具有很需要意義。人類胚胎干細胞研究始于1998年，它已成為繼人類基因組計劃后生命科學中最活躍的研究領(lǐng)域。近年來，胚胎干細胞的分離純化、性能研究、培養(yǎng)擴增、誘導分化等有了突破性進展。1998年，美國威斯康星大學Thomson實驗室利用36枚臨床治療不孕夫婦捐贈的新鮮或冷凍的囊胚，首次成功地分離、建立了5株hES細胞系(ThomsonJA,ltskovitzEldorJ,ShapiroSS,etal.Embryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocysts.Science，1998，282:1145-1147)。2000年，澳大利亞MonashUniversity和新加坡大學生殖中心的專家合作，成功地從人囊胚建立了2株未分化的hES細胞系(ReubinoffBEetal.Embryonicstemcelllinesfromhumanblastocysts:somaticdifferentiationinvitro.NatBiotechnol.2000Apr;18(4):399-404.)。國內(nèi)在2000年后，廣州、湖南、北京、上海等醫(yī)學科研單位相繼開始了胚胎干細胞的研究。2002年，中山醫(yī)科大學曾報道，他們使用5例人受精卵來源的囊胚初步建成了3個胚胎干細胞株(何志旭等。人胚胎干細胞系的初步建立.中華醫(yī)學雜志，2002，82:1314)。2004年，日本和英國的科學家也都得到了hES細胞系(SuemoriHetal.Establishmentofhumanembryonicstemcelllinesandtheirtherapeuticapplication.RinshoByori,2004,52:254;StojkovicMetal.Derivationofhumanembryonicstemcellsfromday-8blastocystsrecoveredafterthree-stepinvitroculture.StemCells.2004;22(5):790-7)。迄今國際上有美國、英國、新加坡、澳大利亞、瑞典、日本、中國、韓國等20余個實驗室建有400株左右hES細亂公開發(fā)表的有關(guān)hES細胞建系的論著有300多篇(GuhrA,KurtzA,etal.Currentstateofhumanembryonicstemcellresearch;anoverviewofcelllinesandtheiruseinexperimentalwork.StemCells.2006Oct;24(10):2187-91)。訖今為止NIH登記的人ES細胞株超過60多株。hES細胞在體外合適條件下，可以保持未分化狀態(tài)和無限增殖能力，也可以定向誘導分化為幾乎所有種類的細胞。由于干細胞具有以上特征，理論上可以成為人類細胞或者器官移植的來源，為人類疾病的治療帶來了新希望。近10年的發(fā)展，hES細胞培養(yǎng)技術(shù)日益成熟，為干細胞的臨床的應用提供可能。利用hES細胞修復或替代因各種因素所造成的人體組織器官缺損和功能障礙是人類疾病治療模式劃時代的革新。用于細胞替代治療的hES細胞必須具備安全性、有效性、免疫豁免性三大特點,因而國內(nèi)外很多研究集中于以下課題(1)純化hES細胞培養(yǎng)環(huán)境，避免動物源性物質(zhì)的污染；(2)hES細胞誘導分化為各種成體細胞及其前體細胞以及移植；(3)體細胞核移植與ntES細胞系的建立；(4)人孤雌胚胎干細胞系的建立；(5)hES細胞的表觀遺傳學變化，如印記基因及甲基化水平、X染色體失活的檢測等；(6)hES細胞與基因治療。我國人類胚胎干細胞(hES)建系的來源與培養(yǎng)方法主要有以下幾種(一)、hES系的主要來源為體外受精囊胚，細胞核移植胚胎及早期發(fā)育的桑椹胚和人孤雌胚胎分離培養(yǎng)的hES系。囊胚法囊胚內(nèi)細胞團(Innercellmass,ICM)是分離hES的最常用材料。將人工受精的胚胎或正常體內(nèi)受精的胚胎培養(yǎng)至囊胚，分離培養(yǎng)出ICM，進一步分離培養(yǎng)增殖的ICM,得到hES細胞集落，傳代增殖并檢測后即得到hES細胞系。目前所建立的hES系基本上都是由人工體外受精培養(yǎng)至囊胚期的ICM分離培養(yǎng)得至U(BaharvandH，AshtianiSK，ValojerdiMR,etal.Establishmentandinvitrodifferentiationofanewembryonicstemcelllinefromhumanblastocyst[J]Differentiation,2004,72(5):224-229.;VerlinskyY,StrelchenkoN,KukharenkoV，etal.Humanembryonicstemcelllineswithgeneticdisorders[J]ReprodBiomedOnline,2005，10(1):105-110.)。其具體技術(shù)路線為囊胚一脫透明帶(Tyrode酸或鏈蛋白酶或機械法)一去滋養(yǎng)層細胞(免疫外科法或酶消化法)一純化的ICM—適宜的飼養(yǎng)層上擴增ICM—離散增殖的ICM為小細胞團塊一重新接種在飼養(yǎng)層上培養(yǎng)一離散hES細胞集落為小細胞團塊一接種在飼養(yǎng)層上傳代培養(yǎng)一出現(xiàn)多個hES樣集落一在飼養(yǎng)層上或無飼養(yǎng)層擴大培養(yǎng)一鑒定一建立hES系。ICM的分離是一大難點。分離ICM的方法主要有免疫外科法和機械法兩種。目前大多數(shù)hES細胞系都是采用免疫外科方法，用特殊的抗體，例如BeWO細胞的單克隆抗體，抗人的全血清，或者紅細胞抗體從囊胚中分離出ICM細胞。這些抗體與滋養(yǎng)層細胞表面的主要組織相容性抗原(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)結(jié)合形成免疫復合物，在補體存在時可導致滋養(yǎng)層細胞發(fā)生免疫溶解，從而得到ICM細胞。但免疫外科法存在動物源性污染問題，在很大程度上存在傳播動物疫病和產(chǎn)生異種免疫排斥的風險。盡量減少動物源性污染，改善胚胎干細胞的體外培養(yǎng)條件，建立更有效更簡便的獲得胚胎干細胞的方法已成為現(xiàn)今各國研究的重點。(二)、建立和維持hES系的條件飼養(yǎng)層飼養(yǎng)層是建立和維持ES細胞系的必要條件。大部分已分離得到的人hES細胞系均是在飼養(yǎng)層條件下建立和維持的。有研究表明，小鼠胚胎成纖維細胞(Mouseembryonicfibroblast，MEF)作為建立hES系的飼養(yǎng)層是有效可行的(DaylonJ，ArielJL，DanielB，etal.TGFB6activin6nodalsignalingisnecessaryforthemaintenanceofpluripotencyinhumanembryonicstemcells[J]Development,2005，132:1273-1282.)。由于MEF為異源細胞，用其培養(yǎng)hES存在傳播病原體和造成異種蛋白污染的危險。因此，人們在嘗試用其他飼養(yǎng)層來替代MEF，如人胚胎成纖維細胞(RichardsM，F(xiàn)ongCY，ChanWK,etal.Humanfeederssupportprolongedundifferentiatedgrowthofhumaninnercellmassesandembryonicstemcells[J].NatBiotechnoI，2002,20(9):933-936.)、包皮成纖維細胞(ProwseB,McQuadeLR,BryantKJ,etal.Aproteomeanalysisofconditionedmedia什omhumanneonatalfibroblastsusedinthemaintenanceofhumanembryonicstemcells[J].Proteomics,2005,5(4):978-989.)以及商品化的成人和胎兒成纖維細胞(RichardsM,TanS,FongCY，etal.Comparativeevaluationofvarioushumanfeedersforpro-longedundifferentiatedgrowthofhumanembryonicstemcells[J].StemCells,2003,21:546-556.)。人源飼養(yǎng)層細胞在一定程度上能替代MEF，作為hES的飼養(yǎng)層細胞。人類飼養(yǎng)層細胞在體外可以連續(xù)傳代，不僅較MEF可以節(jié)約大量時間，而且用同一材料作飼養(yǎng)層相對較不同批次的MEF穩(wěn)定。另外，還可避免用STO或MEF培養(yǎng)hES時存在異種蛋白污染等危險。培養(yǎng)基組成hES系的培養(yǎng)基組成一般采用高糖DMEM培養(yǎng)液，添加15%20%的胎牛血清(FBS)或血清替代品(SR)和其他一些微量營養(yǎng)成分(如非必需氨基酸、谷氨酰胺等)、抗氧化劑(如2巰基乙醇(2-ME))和抗生素等。多數(shù)研究認為，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、FBS或SR在hES培養(yǎng)中具有重要作用(Jos6l,Karin,MarieGMA,etal.Derivationofhumanembryonicstemcelllinesinserumreplacementmediumusingpostnatalhumanfibroblastsasfeedercells[J]■StemCells,2005，23:544-549.)。多數(shù)研究認為，bFGF是hES自我更新和維持未分化狀態(tài)所必需的。目前，hES研究重點在于篩選使胚胎干細胞保持在未分化狀態(tài)的最佳培養(yǎng)體系；檢驗得到的胚胎干細胞生物學特性是否穩(wěn)定。hES系的生物學特性及鑒定方法hES體積小，核大而明顯，有一個或多個核仁，核質(zhì)比高。hES細胞在體外培養(yǎng)時呈集落狀生長，呈相對松散、扁平狀集落，集落內(nèi)細胞界限隱約可見。hES具有正常穩(wěn)定的二倍體核型和帶型。hES細胞的堿性磷酸酶活性呈陽性，已分化的細胞呈弱陽性或陰性。hES表達的人早期胚胎階段特異性抗原有SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1隱81。hESCs還表達Oct4、Fgf4、H2az、Foxd3、Nanog禾卩Sox2等與多能性有關(guān)的關(guān)鍵蛋白(LeeJB，KimJM，KimS丄et3l.Comparativechsracteristicsofthreehumanembryonicstemcelllines[J].MoICells,2005，19(1):31-38.)。另外，hES具有高端粒酶活性及向3個胚層細胞分化的潛能。hES的生物學特性為自我更新及全向分化。hES分子遺傳、表觀遺傳學研究基因組印跡是某些等位基因的表觀遺傳修飾，與胎兒發(fā)育異常及腫瘤生長有關(guān)。在個體發(fā)育不同時期，基因組印跡狀態(tài)不同。己有研究表明，鼠胚胎干細胞基因組印跡異?；虿缓碳倍?KirnJH,AuerbachJM,Rodriguez2GomezJAetal.DopamineneuronsderivedfromembryonicstemcellsfunctioninananimalofParkinson'sdisease[J].Nature,2002,418(6893):50256.);但另一組研究者則發(fā)現(xiàn)人和小鼠EG細胞的基因組印跡基本正常，這可能為胚胎干細胞臨床應用排除了一大障礙(HumpherysD,EgganK,Akutsuetal.EpigeneticinstabilityinEScellsandclonedmice[J].Science,2001，293(5527):95297)。對印記基因、甲基化等表觀遺傳學變化在hES細胞(BoWenSun,A.CongYangetal.Temporalandparental-specificexpressionofimprintedgenesinanewlyderivedChinesehumanembryonicstemcelllineandembryoidbodiesHumanMolecularGenetics,2006，Vol.15,No.165-75)的研究目前已成為現(xiàn)今各國在胚胎干細胞領(lǐng)域研究的熱點。分子遺傳學在核型變化、純合子變異、同源交換等方面對胚胎干細胞的研究也具有重要意義。X染色體失活是表觀遺傳機制的一個重要部分，這種現(xiàn)象在1961年就有了LYON假說，S卩(1)雌性哺乳動物細胞內(nèi)只有一條X染色體有活性，另一條失活并固縮；(2)失活發(fā)生在胚胎早期(囊胚期)；(3)失活是隨機的，即失活的X染色體既可來自父親也可來自母親，一個細胞某條X染色體一旦失活，由該細胞繁衍而來的子細胞都具有同一條失活的X染色體。X染色體失活的選擇和啟動發(fā)生在囊胚期，這個過程由X失活中心(XIC)控制，XIC是一個順式作用位點，包含辨別X染色體數(shù)目的信息和XIST基因，前者可保證僅有一條染色體有活性，但機制不明，XIST基因缺失將導致X染色體失活失敗。X染色體失活的過程為XIST基因編碼XISTRNA，它轉(zhuǎn)錄后被包裹在合成它的X染色體上隨后XISTRNA在X染色體上積累并不斷擴展接著一對基因沉默有重要功能的因子再被招募來，包括PCG蛋白EED和ENX1。這些蛋白在失活的X染色體上組成暫時的位點，立即誘導DNA甲基化和組蛋白修飾的發(fā)生，這對X染色體失活的建立和維持有重要的作用。失活的染色體依舊持續(xù)合成XISTRNA，維持本身的失活狀態(tài)。人類基因組DNA有3X109bp，其中10%是串聯(lián)重復序列，稱為衛(wèi)星DNA。按重復片段的長短，又可分為大衛(wèi)星、中衛(wèi)星、小衛(wèi)星和微衛(wèi)星序列。其中重復片段為2-7bp組成的稱為微衛(wèi)星，又稱為短串聯(lián)重復序列(ShortTandemRepeat,簡稱STR)，不同人體基因組衛(wèi)星DNA重復單位的數(shù)目是可變的，因此形成極其復雜的等位基因片段長度多態(tài)性。一般認為，人類基因平均每610kb就有1個STR基因座，為法醫(yī)個人識別和親子鑒定提供了高信息基因座的豐富來源。在實踐中，聯(lián)合使用多個STR可以產(chǎn)生數(shù)以億計的基因型組合，而每一種組合在群體中出現(xiàn)的頻率都非常低，可以在很高概率水平上認定嫌疑人以及進行親緣關(guān)系鑒定。因此，STR基因座的PCR分型因其高靈敏度，高效率的實用特點，目前已成為國內(nèi)外法醫(yī)個體識別和親子鑒定最主要的技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種具有非隨機失活狀態(tài)X染色體及特定短串聯(lián)重復序列的人胚胎干細胞系，該人胚胎干細胞系具有兩條X染色體，但其存在非隨機失活特性，并且具有獨特的短串聯(lián)重復序列(STR)序列，此類細胞及其衍生物在今后潛在的應用中具有唯一識別的特征。本發(fā)明所述的具有非隨機失活狀態(tài)X染色體及特定短串聯(lián)重復序列的人胚胎干細胞系，其特征在于(a)所述胚胎干細胞系的平均群體倍增時間為約32小時；(b)所述胚胎干細胞系的未分化克隆堿性磷酸酶即AKP檢測為強陽性，具有較高的堿性磷酸酶活性；(C)所述胚胎干細胞系能表達以下特異性表面抗原之一階段特異性抗原-3即SSEA-3，階段特異性抗原-4即SSEA-4，腫瘤反應抗原-1-60即TRA-1-60，以及腫瘤反應抗原-1-81即TRA-1-81，而不表達階段特異性抗原-1即SSEA-1;(d)所述胚胎干細胞系能表達八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4即Oct-4轉(zhuǎn)錄因子，保持未分化特性；(e)所述胚胎干細胞系每隔10代進行一次核型分析，具有正常核型，或者為易位型13三體；(f)所述胚胎干細胞系具有兩條X染色體，X染色體失活分析顯示其存在非隨機失活特性；(g)所述胚胎干細胞系具有獨特的短串聯(lián)重復序列。本發(fā)明中，選取了人類雄激素受體基因(Humanandrogenreceptorgene)來分析X染色體失活的狀態(tài)。人類雄激素受體基因第一外顯子包含高多態(tài)性三核苷酸重復序列。研究表明在離這些核苷酸重復序列大約100bp遠的地方甲基化的HpallandHhal位點和X染色體失活有關(guān)。本實驗中選用甲基化特異性PCR來分析X染色體失活的狀態(tài)。(TakeoKubotaetal(1999)AnewassayfortheanalysisofX-chromosomeinactivationbasedonmethylation-specificPCR.HumGenet104:49-55)。在正常女性及擁有女性核型的人胚胎干細胞中，X染色體的失活應該是隨機發(fā)生的，但在本發(fā)明中得到的是非隨機失活特性的人類胚胎干細胞。本領(lǐng)域所熟知，正常女性擁有兩條X染色體，而男性只有一條。為了平衡兩條x染色體基因表達，女性的一條x染色體會發(fā)生失活，其上的基因均不表達。這種失活現(xiàn)象發(fā)生在胚胎早期，是隨機的，即既可以是父親來源的x染色體失活，也可以是母親來源的x染色體失活。在每個細胞，這種選擇是獨立的，從總體來看，父系和母系X染色體失活的比例為50%對50%。在一些無癥狀的X連鎖疾病中，可以發(fā)生非隨機的X染色體失活，即在所有的細胞中，均為來自父系的X染色體失活或均為來自母系的X染色體失活，或者這些失活比例極端不平衡，至少達到90%比10%，業(yè)內(nèi)稱這種失活為非隨機的X染色體失活。理論上擁有XX核型的胚胎干細胞正常情況下也應該是隨機失活。但在本發(fā)明所述的胚胎干細胞上，均表現(xiàn)為極端的非隨機的X染色體失活狀泰(見圖6)。本發(fā)明中，進行STR分型所采用的是Promega公司的熒光標記16基因座復合擴增體系，鑒定能力已達10—17，無論用于個體或親緣關(guān)系鑒定都足以作出認定結(jié)論。這16個位點包括美國FBI推薦用于建設(shè)國家DNA數(shù)據(jù)庫(CombinedDNAindexSystem,CODIS)的13個基因座，艮卩D3S1385、TH01、D21S11、D18S511、VWA、D8S1179、TPOX、FGA、D5S818、D31S317、D7S820、D16S539、CSF1PO(這13個位點已成為國際公認的用于法醫(yī)學STR分型的基因座)，以及PentaE、PentaD和一個性別位點Amelogenin。短串聯(lián)重復序列(STR)分析是利用個體間存在不同短串聯(lián)重復序列擴增片斷的特性來鑒定，人類基因基因組DNA中每6—10KBb就有一個STR位點，其多態(tài)性成為法醫(yī)物證和親子鑒定的豐富來源。胚胎干細胞由于是從不同的受精卵來源建立的，其遺傳背景也不一樣，STR位點分析可以明確地將不同的胚胎干細胞株區(qū)別開來，我們發(fā)明的三株胚胎干細胞具有不同的STR位點特征，和其他已建立的胚胎干細胞也不同(見圖2)。本發(fā)明因其具有特殊的X染色體失活狀態(tài)及獨特的STR特性，得到的此類細胞及其衍生物在將來可能的表觀遺傳學機制研究，對女性X染色體相關(guān)疾病模型的建立，以及由此類細胞誘導產(chǎn)生的分化細胞在臨床應用上的可行性評估提供了理想的細胞模型。圖1顯示上圖顯示的是FY—hES1細胞系的一個克隆成長過程，依次是第1天、第2天、第3天及第4天的克隆大小，計算得該克隆的倍增時間為31.25小時(100X標尺二100um)。圖2是人胚胎干細胞FY—hES的干細胞生物特性結(jié)果圖，自左至右分別顯示AKP、SSEA-1、SSEA-4、TRA-1曙60、TRA-1-81的生物特性；圖3顯示FY-hES-5，-7，-8細胞系均能表達Oct-4轉(zhuǎn)錄因子(B-D)，保持未分化特性，F(xiàn)Y-hES-1作為對照也表達Oct-4轉(zhuǎn)錄因子(E)，F(xiàn)為管家基因e-actin的表達。Oct-4是ES細胞維持自我更新的重要基因，未分化的ES克隆能夠高表達。圖中，A:分子量標準Marker;B:FY-hES-5OCT-4表達；C:FY-hES-70CT-4表達；D:FY-hES-8OCT-4表達；E:FY-hES-1OCT-4表達；F:陽性參照e-actin。圖4(a)顯示人胚胎干細胞FY—hES-5的STR結(jié)果；圖中顯示，人胚胎干細胞FY—hES-5擁有獨特的STR位點，分別是在D3S1358位點上表達15，1017號峰，TH01位點上表達6，9號峰，其他依次為D21S11:29，30;D18S51:17，19;PENTAE:11，14;D5S818:7，12;D13S317:11，12;D7S820:8,11;D16S539:10，10;CSF1PO:11，12;PENTAD:10，14;VWA:14，16;D8S1179:"，14;TPOX:8，11;FGA:19，23。圖4(b)顯示人胚胎干細胞FY—hES-7的STR結(jié)果；圖中顯示，人胚胎干細胞FY—hES-7擁有獨特的STR位點，分別是在D3S1358位點上表達17，17號峰，TH01位點上表達6，7號峰，其他依次為D21S11:32，32.2;D18S51:14，16;PENTAE:11，11;D5S818:10，11;D13S317:7，10;D7S820:8，10;D16S539:9，9;CSF1PO:11，11;PENTAD:10，10;VWA:17，20;D8S1179:10，11;TPOX:8，11;FGA:19，20。圖4(c)顯示人胚胎干細胞FY—hES-8的STR結(jié)果；圖中顯示，人胚胎干細胞FY—hES-8擁有獨特的STR位點，分別是在D3S1358位點上表達15，17號峰，TH01位點上表達8，9號峰，其他依次為D21S11:29，30;D18S51:12，14;PENTAE:12，14;D5S818:7，13;D13S317:10，11;D7S820:9，10;D16S539:11，11;CSF1PO:9，11;PENTAD:12，12;VWA:14，14;D8S1179:"，16;TPOX:8，9;FGA:12，23。圖5(a)是人胚胎干細胞FY—hES-5的核型圖；圖中顯示，人胚胎干細胞FY—hES-5的核型存在13號染色體非平衡易位，其核型為46，XX，+13，der(13，13)(q10,q10)，箭頭所示為易位的13號染色體。圖5(b)是人胚胎干細胞FY—hES-7的核型圖；圖中顯示，人胚胎干細胞FY—hES-7的核型為正常46，XX。圖5(c)是人胚胎干細胞FY—hES-8的核型圖；圖中顯示，人胚胎干細胞FY—hES-8的核型為正常46，XX。圖6是人胚胎干細胞FY—hES的體內(nèi)分化結(jié)果圖，自上至下分別顯示分化為角化鱗狀上皮組織(外胚層)、神經(jīng)組織(外胚層)、軟骨組織(中胚層)、脂肪組織(中胚層)、腺體上皮組織(內(nèi)胚層)。圖7是人胚胎干細胞FY_hES-5、7、8的X染色體失活分析圖，左側(cè)為X染色體失活產(chǎn)物圖，右側(cè)為活性X染色體產(chǎn)物；圖中顯示胚胎干細胞FY_hES-5的X染色體失活分析顯示其失活狀態(tài)的X染色體存在非隨機現(xiàn)象。失活的X染色體只有191bp—個峰，而活性的X染色體也只有194bp—個峰，即在胚胎干細胞FY—hES-5所有細胞中，191bp的X染色體全部都是失活的，而194bp的X染色體全部都是非失活的。胚胎干細胞FY—hES-8的X染色體失活分析顯示其失活狀態(tài)的X染色體存在非隨機現(xiàn)象。失活的X染色體只有193bp—個峰，而活性的X染色體也只有203bp—個峰，即在胚胎干細胞FY—hES-5所有細胞中，193bp的X染色體全部都是失活的，而203bp的X染色體全部都是非失活的。鼎錢M一、無創(chuàng)性孕早期出生缺陷篩查中生化指標的確定一、人胚胎干細胞系的建立材料1.胚胎來源本院生殖中心提供，在體外授精(IVF)或單精注射(ICSI)后第三天，不適宜進行胚胎移植或冷凍的低質(zhì)量胚胎，經(jīng)捐贈夫婦知情同意后用于本實驗。2.主要儀器C02培養(yǎng)箱(Forma)、解剖顯微鏡(Olympus)、普通倒置顯微鏡(Nikon)、離心機(KUBOTA21000)、恒溫水浴鍋(H.H.S-11.2，上海醫(yī)療器械三廠)、電子分析天平(Startorius)、普通冰箱(海爾)、-80°C低溫冰箱(Forma725)、液氮罐(MVE，美國)Millipore純水儀(Purelabmaxima.美國)、移液槍(Eppendorf，德國)、眼科手術(shù)器械(浙江省華東醫(yī)藥公司)、超凈工作臺、組織培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿(Falcon)、分裝管、錐形離心管(NUNC)。3.主要試劑:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>bFGFlnvitrogenGibcoCAT#13256-029hLIFChemiconCAT#LIF10102-beta-mercaptoethanollnvitrogenGibcoCAT#21985-023Non-essentialaminoacidslnvitrogenGibcoCAT#"140050Pen/StreplnvitrogenGibcoCAT#15070-063GlutamaxlnvitrogenGibco25030-149MitomycinCSigmaCAT弁M-05030.05%Trypsin/EDTAlnvitrogenGibcoCAT#25300-054Dimethylsulphoxide(DMSO)SigmaCAT#D2650GelatinSigmaCAT#G1890collagenaseIVlnvitrogenGibcoCAT#17104-0194.溶液配制PBS緩沖液、DMEM液、0.1%明膠、絲裂霉素-C貯存液、膠原酶IV貯存液、bFGF貯存液、MEF培養(yǎng)液、囊胚優(yōu)化培養(yǎng)液、phES培養(yǎng)液、phES凍存液等，參照《干細胞手冊二Handbookofstemcells》(Lanza，R等編，裴雪濤教授等編譯。一北京科學出版社，2006)。方法1.小鼠胚胎成纖維細胞(PMEF)的分離培養(yǎng)1.1取妊娠13.5-14.5天的昆明白孕鼠，采用頸椎脫臼法處死，無菌條件下剖腹取出子宮，置于PBS液中反復沖洗，去除血污。1.2剪開子宮壁取出胚胎，去除頭、四肢、內(nèi)臟后，剪碎鼠胚組織，移入34個15ml的離心管中，加入2倍體積的0.25c/o胰蛋白酶/0.02XEDTA消化液，37。C水浴消化8min，用吸管反復吹打，棄去第一次消化的上清液。1.3再加入2倍體積的0.25c/o胰蛋白酶/0.02XEDTA消化液，37'C水浴消化58min，用吸管反復吹打，靜置2min吸取上清液，移入盛有培養(yǎng)液的離心管中終止消化，1000rpm離心5min，棄上清，加入新培養(yǎng)液。1.4重復1.3步驟56次，直至大部分組織細胞消化下來。1.5收集所有離心后的細胞沉淀于同一個離心管中，再次離心棄上清，加入新培養(yǎng)液，調(diào)整細胞密度為4X105/ml，接種于培養(yǎng)皿中，在37°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2~3天換液1次；待細胞達到90%匯合時，可傳代培養(yǎng)、凍存或制作飼養(yǎng)層。2.飼養(yǎng)層細胞的制備2.1當?shù)?3代MEF細胞生長連成一片時，在培養(yǎng)上清中加入絲裂霉素-C，使終濃度為10|jg/ml，放回培養(yǎng)箱作用2.5hr。2.2將0.1%明膠水溶液吸入培養(yǎng)皿內(nèi)，以能覆蓋培養(yǎng)皿表面即可，放回培養(yǎng)箱作用0.5hr以上；使用前，吸棄多余的明膠水溶液，超凈臺風干備用。2.3棄含有絲裂霉素一C的MEF細胞培養(yǎng)上清液，用PBS洗滌三次。2.40.25%胰蛋白酶/0.02XEDTA液消化1min后，加入培養(yǎng)液吹打洗脫細胞，用培養(yǎng)液制備成4x10e個/ml密度的細胞懸液，種植到預先用明膠處理過的培養(yǎng)皿內(nèi)。2.5在37'C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2.6將制備好的飼養(yǎng)層皿放置在培養(yǎng)箱內(nèi)備用(可在13d內(nèi)使用)，使用前提前424h更換為胚胎干細胞培養(yǎng)液。3.囊胚培養(yǎng)3.1囊胚的序貫培養(yǎng)3.1.1配制G2.3培養(yǎng)液在4.75ml的G2.3培養(yǎng)基內(nèi)加入0.25ml的HSA(濃度為5。/0)，用移液槍在35mm的培養(yǎng)皿中做35uI的微滴，覆蓋礦物油，37°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)平衡過夜。3.1.2將生殖中心D3廢棄的胚胎由G1.3微滴中轉(zhuǎn)入G2.3培養(yǎng)液中清洗3次后，再轉(zhuǎn)到新鮮G2.3微滴中培養(yǎng)；每天觀察胚胎發(fā)育情況直至D7，并且對形成的囊胚進行分級。3.2囊胚的優(yōu)化培養(yǎng)3.2.1配制囊胚優(yōu)化培養(yǎng)液取上述配制G2.3培養(yǎng)液1ml加入2000ul的hLIF以及10ng的bFGF，用移液槍在35mm的培養(yǎng)皿中做35pI的微滴，覆蓋礦物油，37°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)平衡過夜。3.2.2生殖中心D3廢棄的胚胎轉(zhuǎn)到G2.3微滴中培養(yǎng)至D5，再轉(zhuǎn)入囊胚優(yōu)化培養(yǎng)液滴中培養(yǎng)；每天觀察胚胎發(fā)育情況直至D7，并且對形成的囊胚進行分級(參照Gardner囊胚分級法)，囊胚根據(jù)內(nèi)細胞團數(shù)目的多少可分為A、14B、C三級A級、ICM細胞數(shù)目多且排列致密，大小明顯可見；B級、ICM細胞數(shù)目少且排列疏散，大小可見；C級、ICM細胞數(shù)目很少，幾乎不見。4.ICM的分離4.1機械分割法4.1.1制作切割針將外徑90um、內(nèi)徑70ixm的玻璃管的中部在酒精燈的外火焰上拉成兩段。再將拉出的玻璃針細部在酒精燈的內(nèi)火焰拔尖，使細部均勻縮小，拉出長約化m、中部直徑約30pm的纖細針鋒。4.1.2去除透明帶囊胚放入pronase(0.5mg/ml)中，洗滌2遍后，轉(zhuǎn)入另一滴pronase中，在解剖顯微鏡下觀察囊胚透明帶的變化，大約12min后，見透明帶開始溶解后立即轉(zhuǎn)到hES培養(yǎng)液滴中，洗滌2-3遍。如囊胚孵出則直接在hES培養(yǎng)液滴中洗滌。4.1.3機械分離ICM:去透明帶的囊胚轉(zhuǎn)入hES培養(yǎng)液滴，在解剖鏡下左手用1ml注射器針頭(29G)壓住囊胚內(nèi)細胞團的對側(cè)予以固定，右手用自制的玻璃細針(30um粗細)在ICM的兩側(cè)切割去除外滋養(yǎng)層。4.1.4分離后的ICM用口吸管轉(zhuǎn)入hES培養(yǎng)液滴內(nèi)清洗三遍后，接種到提前一晚制作的MEF飼養(yǎng)層上。4.2免疫外科法4.2.1去除透明帶同4.1.24.2.2抗體結(jié)合將去除透明帶后的囊胚移入抗人全血清(1:50)中，孵育30min，立即轉(zhuǎn)入hES培養(yǎng)液滴充分洗滌3遍。4.2.3補體結(jié)合抗體作用過后的囊胚轉(zhuǎn)移至新鮮豚鼠血清(補體)中，孵育30min，處理過程中隨時觀察，當滋胚層細胞膨大，呈透明空泡狀即終止處理，轉(zhuǎn)入hES培養(yǎng)液滴內(nèi)，用細吸管反復吹打去除外滋養(yǎng)層細胞。4.2.4分離后的ICM在hES培養(yǎng)液滴內(nèi)洗滌3遍后，接種到提前處理制作的MEF飼養(yǎng)層上。5.原代克隆的培養(yǎng)5.1hES培養(yǎng)液的配制K-DMEM+15。/oSR+5o/oFBS+其它。5.2.原代克隆的觀察ICM接種后前5天靜置不動，以免影響ICM的貼壁；第5天予以半量換液并在解剖鏡下觀察ICM的生長情況，培養(yǎng)至第10天時，根據(jù)巢式克隆的大小及外周滋養(yǎng)層細胞的多少分為A、B、C三類6.hES細胞的傳代方法比較原代培養(yǎng)10-12d后，用玻璃細針在原皿內(nèi)將克隆機械地分成3-4塊，然后將小細胞團用口吸管轉(zhuǎn)入新的MEF飼養(yǎng)層上進行首次傳代。首次傳代再培養(yǎng)45天，克隆增至12mm大小后，按照1:21:3的比例進行傳代。傳代可用機械法、膠原酶IV消化及胰酶消化傳代法，具體如下6.1機械傳代6.1.1在解剖顯微鏡下用自制玻璃細針，在ES克隆表面先后進行縱向與橫向的分割，將克隆分離為100X100pm大小的細胞團塊。6.1.2用拉制的巴斯口吸管將分離后的細胞團塊轉(zhuǎn)移至新制的飼養(yǎng)層上，并左右搖晃培養(yǎng)皿使克隆均勻分布；每天觀察、記錄ES細胞生長情況。6.2膠原酶IV消化傳代6.2.1棄原培養(yǎng)液，用DPBS洗滌1次，加入濃度為1mg/ml膠原酶IV,用量以能覆蓋細胞為度，在37°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1520min。6.2.2棄消化液，輕敲培養(yǎng)皿底部，加入適量培養(yǎng)液終止消化，用吸管輕輕吹打使大部分細胞從皿底脫離。6.2.3收集細胞懸液于一10ml的離心管中，加hES洗液至5ml，1000rpm，離心4分鐘。6.2.4棄上清夜，加入適量培養(yǎng)液，將細胞沉淀小心吹打均勻，轉(zhuǎn)移至新制的飼養(yǎng)層上擴大培養(yǎng)，每天觀察、記錄ES細胞生長情況。6.3胰酶消化傳代6.3.1棄原培養(yǎng)液，用DPBS洗滌1次，加入適量濃度為0.05%的胰酶，在37°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱中作用5min。6.3.2余步驟同6.2。7.hES細胞的凍存復蘇(慢速凍存一快速復溫法)7.1凍存hES細胞加入濃度為1mg/ml膠原酶IV，在37""C作用1520min后，輕輕吹打成小細胞團，離心1000rpmx5min，棄上清，加入凍存液混勻；調(diào)整細胞濃度為106個/巾1,分裝入凍存小管，每管0.5ml，4°C30min，-8(TC過夜，次日投入液氮中長期保存。7.2復蘇hES細胞從液氮罐中取出凍存管，立即投入37。C的溫水中快速晃動，直至只有一小塊凍存液未融解。將細胞凍存懸液轉(zhuǎn)入盛有5ml培養(yǎng)液的無菌離心管，1000rpm離心5min.棄上清,加入培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，將細胞接種于預先制備的飼養(yǎng)層上培養(yǎng)。結(jié)果1.由廢胚來源的囊胚，在序慣培養(yǎng)體系中培養(yǎng)至第7天(D7)，大多為低級囊胚，表現(xiàn)為囊腔小，內(nèi)細胞團小或無，不利于hES建系。在囊胚優(yōu)化培養(yǎng)體系中培養(yǎng)至D7天發(fā)現(xiàn)囊腔明顯擴張，ICM細胞數(shù)目增多且致密；但繼續(xù)培養(yǎng)至D8囊腔皺縮，腔內(nèi)出現(xiàn)大量碎片，ICM較前增大但色澤黯淡，接種到飼養(yǎng)層后不能貼壁生長，提示囊胚在體外培養(yǎng)時間不應超過7天。2.廢胚來源hES細胞系的建立本實驗采用K-DMEM+20%SR+5%FBS組培養(yǎng)液培養(yǎng)的32枚ICM中，有27枚ICM貼壁，獲得16枚A、B級原代克隆，進行傳代后其中12枚傳至2一6代便逐漸黯淡、溶解直至死亡；最終建立了3株hES細胞系。新建立的hES細胞系在飼養(yǎng)層上均形成扁平的圓形集落，結(jié)構(gòu)致密，邊緣清楚，高倍鏡下可見克隆的單個細胞間隙清楚，核質(zhì)比高、核仁清晰。3株hES細胞系均能反復冷凍復蘇，保持未分化狀態(tài)，復蘇率大約為25%40%。hES生物學特性檢測材料細胞來源本發(fā)明人所在實驗室建立的3株的hES細胞系FY-hES-5、FY-hES-7和FY-hES-8。2.實驗動物68w齡雄性SCID小鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。3.儀器熒光倒置顯微鏡(Nikon)、3100Geneticanalyzer(美國ABI公司)、PE9700PCR擴增儀(美國ABI公司)、UVP紫外成像系統(tǒng)、電泳儀(Biometra)4.試劑Trizonl試劑(上海閃晶分子生物科技有限公司)、QiagenOneSt印forRT-PCRKit(Qiagen);ESCellCharacterizationKit(SCR001,Chemicon);HumanEmbryonicGermLayerCharacterizationKit(SCRO30,Chemicon);GOATANTIMOUSEIgG-FITC、GOATANTIMOUSElgM國FITC(Santacruz);PromegaPowerPlex16Systemkit(Promega,USA)。方法1.hES細胞群體倍增時間(populationdoublingtime,PDtime)檢測hES細胞采用1mg/ml的膠原酵消化傳代并低密度接種，用標記筆在每個培養(yǎng)皿的底部標記約5個克隆，于接種后的第1開始，每隔24小時照相測量同一個ES克隆大小，直至第4天。按照公式PD(hour)=AtxLg2/(LgNt-LgN0)來計算其倍增時間，每株細胞至少計算三個PD值，然后求平均值。2.hES細胞特異性標志物鑒定2.1堿性磷酸酶檢測(AKP染色)人胚胎干細胞培養(yǎng)至第20代時，進行堿性磷酸酶檢測(AKP染色)去培養(yǎng)液用4%多聚甲醛固定15分鐘后，TBST液沖洗2次，加入堿性磷酸酶孵育液，室溫下孵育30分鐘至染色滿意時，TBST液沖洗，光鏡下觀察結(jié)果。2.2人類胚胎干細胞表面抗原鑒定2.2.1hES細胞傳代培養(yǎng)至第4天，生長旺盛時終止培養(yǎng)，4%多聚甲醛固定20min。2.2.2TBST沖洗2次，每次5-10min2.2.30.1%TritonX-100/PBS作用10min2.2.4TBST沖洗2次，每次5-10min。2.2.5加入4%山羊血清阻斷封閉非特異性抗原，室溫下孵育30分鐘。2.2.6加入一抗SSEA-1，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81(用4%山羊血清1:50稀釋)，室溫孵育1小時。2.2.7TBST沖洗3次，每次5-10min。2.2.8用4%山羊血清1:100稀釋FITC標記的二抗，室溫孵育30min。2.2.9TBST沖洗3次，每次5-10min。2.2.10PBS覆蓋，熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果。3.RT-PCR檢測hES細胞中Oct-4轉(zhuǎn)錄因子的表達3.1Trizol試劑盒分離提純總RNA3.1.1各取10個hES克隆細胞團，加入0.5ml的TriZOL，充分混勻，室溫靜置5min。3.1.2再加入100nl的氯仿，充分混勻，室溫靜置5min。3.1.34°C，10000rpm離心15min。3.1.4取上清液，加入250pl的異丙醇，充分混勻室溫靜置5min。3.1.54°C，10000rpm離心10min。3.1.6棄上清液，加入75%的酒精500nI，4"C，10000rpm離心10min。3.1.7棄上清液，室溫干燥，再加入25uI的DEPC水，混勻。3.1.8紫外分光光度計測定OD260/280，比值大于1.8即可。3.2—步法RT-PCR檢測Oct-4的表達3.2.1弓l物設(shè)計OCT誦4PrimerA:5'-GTGTTCAGCCAAAAGACCATC-3，PrimerB:5'-CCCTGAGAAAGGAGACCCA-3'3.2.2RT-PCR反應體系50iJl反應體系，具體組成如下RNase-freewater26,0|jlRT-PCRBuffer10.0pidNTPMix2.0piPrimerA3.0piPrimerB3.0|jlRT-PCREnzymeMix2.0piTemplateRNA4.0pi3.2.3RT-PCR反應擴增條件逆轉(zhuǎn)錄反應30min50°CPCR起始步驟15min95°C以下步驟循環(huán)36次變性1min94°C退火1min56°C延伸1min72°C最后延伸10min72°C3.2.4配制1.5%瓊脂糖凝膠，電泳30min,觀察擴增條帶，記錄結(jié)果。4.染色體核型分析4.1選擇培養(yǎng)至第10代以后，處于指數(shù)生長期的hES細胞進行核型分析；加入秋水仙素(終濃度為0.25yg/ml)以抑制分裂期細胞停止于分裂中期，置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4小時。4.2用吸管吹打，使大部分圓形的分裂中期細胞從皿底脫落，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)，再用PBS清洗一遍后，加入適量0.05%胰蛋白酶液作用5min，加入培養(yǎng)液反復吹打，收集細胞懸液；1000rpm離心5分鐘，棄上清液，留沉淀細胞。4.3往細胞沉淀加37r預溫的0.4。/。枸櫞酸鈉與0.4%KCI(1:1)的低滲液，用吸管吹打均勻，在水溫箱中靜置5分鐘。4.4向低滲處理后的細胞懸液中加新鮮配制的甲醇與冰醋酸(3:1)固定液0.5ml，用吸管輕輕吹打調(diào)勻進行預固定，1000rpm離心5分鐘。4.5棄上清液加固定液4ml，輕輕吹打，封口后室溫靜置40分鐘，1000rpm離心5分鐘。4.6棄上清液加固定液2ml，輕輕吹打，封口后室溫靜置20分鐘，1000rpm離心5分鐘。4.7吸棄掉大部分上清液，留0.5ml左右上清夜及細胞沉淀，混勻后取1-2滴滴片，置65。C烤片過夜。4.8制備好的染色體制片于0.25。/。胰酶消化G顯帶后，用新鮮配置的10%吉姆薩染液染10min，流水沖洗干凈，干燥。4.9高倍鏡下分析2040個分裂中期細胞的染色體核型，采用Leica染色體分析軟件觀察結(jié)果，發(fā)報告。5.個體識別(STR位點分析)采用Qiagen法提取基因組DNA，進行PCR擴增，產(chǎn)物在ABI3100遺傳分析儀上進行毛細管電泳，分析16個短串聯(lián)重復位點做個體識別。16個位點為D3S1358、麗1、D21S"、D18S51、PentaE、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1P0、PentaD、amelogenin、vWA、D8S1179、TPOX、FGA。6.體內(nèi)外分化能力檢測6.1體外分化能力檢測6.1.1擬胚體形成生長旺盛的胚胎干細胞用0.05%胰酶作用3分鐘，加入擬胚體培養(yǎng)液，輕輕吹打成小細胞團，轉(zhuǎn)入細菌培養(yǎng)皿內(nèi)懸浮培養(yǎng)，3天后更換至新的細菌培養(yǎng)皿；此后每2天換液l次，至擬胚體形成。6.1.2自發(fā)分化培養(yǎng)7天后將形成的擬胚體轉(zhuǎn)入0.1%明膠包被的培養(yǎng)皿內(nèi)貼壁培養(yǎng)2周，觀察其分化現(xiàn)象。6.1.3自發(fā)分化培養(yǎng)4天后，采用三胚層細胞特異性抗體來檢測分化細胞抗原表達情況，這些抗體是人平滑肌激動蛋白(用于檢測骨和肌肉細胞相關(guān)抗原，中胚層)，甲胎蛋白(用于檢測肝細胞等相關(guān)抗原，內(nèi)胚層)和波形蛋白(用于檢測神經(jīng)細胞相關(guān)抗原，外胚層)。6.2體內(nèi)分化能力檢測6.2.1畸胎瘤形成胚胎干細胞消化離心后，制成1x106/ml的細胞懸液，接種到6周齡雄性SCID小鼠的腹股溝皮下和腹腔內(nèi)。4周后，觀察是否有腫瘤生長；1012周后，處死小鼠，摘除腫塊進行如下分析。6.2.2組織學檢查腫塊經(jīng)10%中性福爾馬林固定2411后；梯度乙醇脫水；二甲苯透明；石蠟包埋；連續(xù)5pm切片，經(jīng)65'C恒溫烤箱6h烘干；逐級脫蠟、水化；蘇木素染色5min，水洗；鹽酸酒精分色30sec，水洗；伊紅染色5min，水洗；逐級脫水、透明，中性樹膠封片，鏡下觀察組織細胞形態(tài)。結(jié)果1.hES細胞系的平均PD時間每株hES細胞系各監(jiān)測3個克隆的生長速度，并計算其平均倍增時間，參見圖1，記錄如下表表1:3株hES細胞系的平均PD時間細胞系FY—hES5FY—hES7FY—hES8PD時間(小時)33.0032.5031.25由上表可以看出，3株hES細胞系的PD時間大體相同，都在32小時左右，提示hES細胞每隔32小時就能擴增一倍。2.干細胞特異性標志物鑒定3株hES細胞系的未分化克隆AKP檢測均為強陽性，胞質(zhì)內(nèi)有藍黑色顆粒沉積，部分分化的克隆著色弱，飼養(yǎng)層細胞不著色，說明hES細胞具有較高的堿性磷酸酶活性。ES表面抗原SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60以及TRA-1-81檢測結(jié)果顯示，3株hES細胞系的SSEA-4、TRA-1-60以及TRA-1-81免疫熒光反應呈現(xiàn)強綠色，SSEA-1抗原抗體免疫熒光反應為陰性(參見圖2)，說明3株hES細胞系均能表達特異性表面抗原SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81，不表達表面抗原SSEA-1。3.Oct-4轉(zhuǎn)錄因子的表達Oct-4是ES細胞維持自我更新的重要基因，未分化的ES克隆能夠高表達。本實驗采用RT-PCR的方法來檢測該因子，結(jié)果提示新建立的3株hES細胞系均能表達Oct-4轉(zhuǎn)錄因子，保持未分化特性。(參見圖3)4.個體識別:3株hES細胞系在16個STR位點上出現(xiàn)特異性峰可以將其區(qū)分開來。參見圖4(a)、圖4(b)和圖4(c)。5.染色體核型分析3株hES細胞系每隔10代進行一次核型分析，分析結(jié)果提示其中3株細胞系具有正常核型，但FY—hES5細胞系的核型為易位型13三體。參見圖5(a)、圖5(b)和圖5(c)。6.體內(nèi)外分化能力檢測6.1體外分化潛能FY-hES5、FY-hES7、FY-hES8的細胞分別在懸浮培養(yǎng)的D7、D6、D8、D7天形成囊性擬胚體(EB);形成囊性EB后轉(zhuǎn)到鋪有明膠的培養(yǎng)皿內(nèi)，貼壁培養(yǎng)至第四天，進行三胚層特異性標記物檢測，結(jié)果表明hES細胞可自發(fā)分化為神經(jīng)細胞、上皮細胞、平滑肌細胞等三個胚層的細胞。6.2體內(nèi)分化潛能FY-hES5、FY-hES7、FY-hES8的細胞在接種到SCID小鼠腹股溝皮下6周左右，開始出現(xiàn)腫塊；12周時腫塊增大約30mm3大小，處死小鼠，摘除腫塊，做病理切片可見三個胚層的組織，包括角化復層扁平上皮、神經(jīng)細胞、色素上皮(外胚層)；平滑肌，軟骨(中胚層)以及腸腺上皮和纖毛柱狀上皮(內(nèi)胚層)。參見圖6。甲基化特異性PCR檢測X染色體失活狀態(tài)胚胎干細胞DNA的提取提取的DNA使用甲基化試劑盒進行重亞硫酸鹽處理，使DNA中的未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則保持不變準備兩套PCR反應體系，一為甲基化的X等位基因，另一套為未甲基化的X染色體反應體系以。加入1yI處理過的細胞DNA標本到PCR反應管中，反應體系如下10xFXbuffer1.510mMdNTP0.75PrimerARM誦F0.2PrimerARM-R0.2AmpliTaqGold0.1H2011,25(uI)(甲基化體系)10xFXbuffer1.510mMdNTP0.75PrimerARU-F0.2PrimerARU-R0.2AmpliTaqGold0.1H2011.25(yl)(未甲基化體系)反應條件如下950Cfor12'94。Cfor30"<~58°Cfor30"<~72。Cfor30"—28個循環(huán)72°Cfor7'4°C放置產(chǎn)物的純化GeneticAnalyzer310進行產(chǎn)物分析，人類雄激素受體基因產(chǎn)物大小介于170—230bp之間。X染色體失活狀態(tài)的分析正常女性X染色體失活分析中，其失活的峰應該有兩個，活性的峰也應該是兩個，從兩個峰面積(或修正后面積)的比例中可以計算出兩條X染色體失活比例，正常比例為接近1:1，但也可波動至8:2。如果此比例高于9:1或只有一個峰，則此狀態(tài)為非隨機失活。(參考文獻TKubotaetal1999,Anew3ss3yforthe3n3lysisofX-chromosomein3ctiv3tionbasedonmethylation-specificPCR,HumGent104:49-55)。結(jié)果X染色體失活分析顯示3株人胚胎干細胞具有非隨機失活狀態(tài)X染色體。胚胎干細胞FY—hES-5的X染色體失活分析顯示其失活狀態(tài)的X染色體存在非隨機現(xiàn)象。失活的X染色體只有191bp—個峰，而活性的X染色體也只有194bp—個峰，即在胚胎干細胞FY—hES-5所有細胞中，191bp的X染色體全部都是失活的，而194bp的X染色體全部都是非失活的。胚胎干細胞FY—hES-7的X染色體失活分析顯示其失活狀態(tài)的X染色體存在非隨機現(xiàn)象。失活的X染色體只有194bp—個峰，而活性的X染色體也只有204bp—個峰，即在胚胎干細胞FY—hES-5所有細胞中194bp的X染色體全部都是失活的，而204bp的X染色體全部都是非失活的。胚胎干細胞FY_hES-8的X染色體失活分析顯示其失活狀態(tài)的X染色體存在非隨機現(xiàn)象。失活的X染色體只有193bp—個峰，而活性的X染色體也只有203bp—個峰，即在胚胎干細胞FY—hES-5所有細胞中，193bp的X染色體全部都是失活的，而203bp的X染色體全部都是非失活的。正常女性血DNA分析X染色體失活顯示其失活狀態(tài)的X染色體是隨機的。失活的X染色體有194bp和207兩個峰，而活性的X染色體也有194bp和207bp兩個峰，且兩個峰面積比接近1:1。參見圖7。權(quán)利要求1、具有非隨機失活狀態(tài)X染色體及特定短串聯(lián)重復序列的人胚胎干細胞系，其特征在于(a)所述胚胎干細胞系的平均群體倍增時間為約32小時；(b)所述胚胎干細胞系的未分化克隆堿性磷酸酶即AKP檢測為強陽性，具有較高的堿性磷酸酶活性；(c)所述胚胎干細胞系能表達以下特異性表面抗原之一階段特異性抗原-3即SSEA-3，階段特異性抗原-4即SSEA-4，腫瘤反應抗原-1-60即TRA-1-60，以及腫瘤反應抗原-1-81即TRA-1-81，而不表達階段特異性抗原-1即SSEA-1；(d)所述胚胎干細胞系能表達八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4即Oct-4轉(zhuǎn)錄因子，保持未分化特性；(e)所述胚胎干細胞系每隔10代進行一次核型分析，具有正常核型，或者為易位型13三體；(f)所述胚胎干細胞系具有兩條X染色體，X染色體失活分析顯示其存在非隨機失活特性；(g)所述胚胎干細胞系具有獨特的短串聯(lián)重復序列。全文摘要本發(fā)明涉及一種具有非隨機失活狀態(tài)X染色體及特定短串聯(lián)重復序列的人胚胎干細胞系，其特征在于所述胚胎干細胞系的平均群體倍增時間為約32小時；所述胚胎干細胞系的未分化克隆AKP檢測為強陽性，具有較高的堿性磷酸酶活性；所述胚胎干細胞系能表達特異性表面抗原SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81，不表達表面抗原SSEA-1；所述胚胎干細胞系能表達Oct-4轉(zhuǎn)錄因子，保持未分化特性；所述胚胎干細胞系每隔10代進行一次核型分析，具有正常核型，或者為易位型13三體；所述胚胎干細胞系具有兩條X染色體，X染色體失活分析顯示其存在非隨機失活特性；所述胚胎干細胞系具有獨特的短串聯(lián)重復序列。文檔編號C12N5/08GK101525593SQ200810026660公開日2009年9月9日申請日期2008年3月7日優(yōu)先權(quán)日2008年3月7日發(fā)明者孫筱放申請人:廣州醫(yī)學院