專利名稱：用于制備IL－15/Fc融合蛋白的表達(dá)系統(tǒng)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括至少一個(gè)編碼白細(xì)胞介素-15/Fc(IL-15/Fc)融合蛋白的核酸的表達(dá)系統(tǒng)以及在其幫助下制備IL-15/Fc融合蛋白。而且，本發(fā)明涉及使用該表達(dá)系統(tǒng)制備IL-15/Fc融合蛋白的方法，而且還涉及該表達(dá)系統(tǒng)，該核酸，該宿主細(xì)胞或用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)蛋白的CD5引導(dǎo)序列的用途。
在哺乳動物中的免疫事件基于作為類似于免疫網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜的細(xì)胞和非細(xì)胞相互作用的多樣性。在這個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)中的許多機(jī)制的功能僅僅在最近才被闡明。在1994年描述的包括白細(xì)胞介素-15因子的細(xì)胞因子(Grabstein等，1994，Science 264965-968)作為可溶解的信使在免疫網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。白細(xì)胞介素-15(IL-15)作為免疫調(diào)節(jié)劑、生長因子、趨化因子和生存因子在免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的增殖、分化、活化和生存中起作用，該免疫系統(tǒng)例如，T細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和其它的諸如角化細(xì)胞和其它的IL-15敏感細(xì)胞。除了作為免疫調(diào)節(jié)劑的功能，IL-15還在肌肉和脂肪組織的代謝的調(diào)控中發(fā)揮作用。
典型的，IL-15通過異源三聚體白細(xì)胞介素-15受體(IL-15R)結(jié)合到其效應(yīng)器細(xì)胞。IL-15R由特異結(jié)合IL-15的α亞單位，也被IL-2識別的β亞單位和被白細(xì)胞介素家族的另外成員如IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15識別的γ亞單位組成。
IL-15在復(fù)雜的自體免疫疾病和慢性炎癥疾病，例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、多發(fā)性硬化癥、Crohn′s疾病、潰瘍性結(jié)腸炎、小腸結(jié)腸炎、肺結(jié)節(jié)病或系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及在移植器官、組織和細(xì)胞的免疫排斥中發(fā)揮作用。IL-15還在淋巴性白血病中發(fā)揮作用。
白細(xì)胞介素-15根據(jù)激活原則被治療性地用于癌癥患者和免疫缺陷性疾患中擴(kuò)展淋巴細(xì)胞群，或者根據(jù)拮抗原則，通過使用阻斷IL-15功能的試劑而在具有免疫系統(tǒng)病理性激活的疾病中應(yīng)用。這些試劑可以是可溶的IL-15-受體多肽，抗IL-15或IL-15受體的抗體或它們可以是含有IL-15部分的融合蛋白，例如含有IL-15成份和免疫球蛋白成份的融合蛋白(在Fehninger和Caligiuri，2001，Blood 97(1)14-32中綜述)。本文證明該白介素-免疫球蛋白有用。
可以在原核表達(dá)系統(tǒng)中制備白介素和免疫球蛋白的重組融合蛋白。這些表達(dá)系統(tǒng)的主要的不利之處是缺乏原核生產(chǎn)的蛋白的糖基化，這可能損害了該表達(dá)產(chǎn)品的功能和穩(wěn)定性，并且因此限制了該表達(dá)產(chǎn)品的醫(yī)學(xué)可用性。相反，白介素和免疫球蛋白的重組融合蛋白在替代的通常確保正確糖基化的諸如哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)中具有相對低的表達(dá)效率的缺點(diǎn)(Zheng等，1999，J.Immunol.1634041-4048)。因此，還需要提供適合真核細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，其能夠制備大量具有足夠純度的重組IL-15/Fc融合蛋白。
因此，本發(fā)明的目的是提供這種類型的改良的表達(dá)系統(tǒng)。
通過提供用于制備IL-15/Fc融合蛋白的表達(dá)系統(tǒng)而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，該表達(dá)系統(tǒng)包括一個(gè)或多個(gè)核酸，該核酸包括a)至少一個(gè)編碼IL-15/Fc融合蛋白的核酸，b)至少一個(gè)啟動子c)至少一個(gè)編碼CD5引導(dǎo)序列的核酸，該啟動子和編碼CD5引導(dǎo)序列的核酸被功能性的連接到編碼IL-15/Fc融合蛋白的核酸上。
在根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)的協(xié)助下，通過重組DNA技術(shù)的方法，例如在真核細(xì)胞中可以較大規(guī)模的制備IL-15/Fc融合蛋白。因此，本發(fā)明使得可以為商業(yè)目的制備IL-15/Fc融合蛋白。
重組DNA技術(shù)通常指例如向載體傳送遺傳信息的技術(shù)。這些載體使得該遺傳信息能夠被例如通過導(dǎo)入宿主而進(jìn)一步處理，使得該遺傳信息能夠在新環(huán)境中擴(kuò)增和表達(dá)。該遺傳信息通常以核酸的形式存在，例如以基因組DNA或cDNA的形式存在，其包括一個(gè)或多個(gè)編碼形式的所需基因產(chǎn)物的信息。可以作為載體的實(shí)例是質(zhì)粒，在質(zhì)粒中，核酸，例如cDNA為了擴(kuò)增而可以被整合到在轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件例如啟動子、增強(qiáng)子、或沉默子的控制下的合適位置，從而在宿主細(xì)胞中表達(dá)。質(zhì)粒進(jìn)一步可以包括既影響所需表達(dá)產(chǎn)物的合成又影響后者在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定和定位的要素，或者元件使得使用的質(zhì)粒和表達(dá)產(chǎn)品可被選擇的要素。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語表達(dá)系統(tǒng)指一個(gè)或多個(gè)核酸———當(dāng)與對轉(zhuǎn)錄必須的諸如核糖體、氨基酸和/或tRNAs等其它要素適當(dāng)結(jié)合時(shí)，——該表達(dá)系統(tǒng)可能導(dǎo)致IL-15/Fc融合蛋白在適合的條件下，諸如在適合的宿主細(xì)胞中表達(dá)。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，該表達(dá)系統(tǒng)由所述的一個(gè)或多個(gè)核酸組成。
為了在宿主細(xì)胞中使表達(dá)成為可能，表達(dá)系統(tǒng)的核酸還可以是一個(gè)或多個(gè)載體的部分，該載體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組DNA技術(shù)的方法制備(Sambrook等.(eds.)，1989，Molecular CloningALaboratory Course Manual.Cold Spring Harbor Press，New York)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知本發(fā)明可以使用多種載體。用于在真核細(xì)胞中表達(dá)的合適的載體例如，酵母載體pYES(在啤酒酵母(S.cerevisiae)中表達(dá)；Invitrogen)和pICZ(在畢赤酵母(P.pastoris)中表達(dá)；Invitrogen).桿狀病毒載體，例如pBacPAK9(在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)；Clontech)，以及還有大量的可以用于在哺乳動物細(xì)胞中異源表達(dá)的載體，例如Rc/CMV，Rc/RSV，pcDNA和其它SV40衍生的載體，其中除被表達(dá)的核酸序列之外，還可以插入適合的轉(zhuǎn)錄調(diào)控要素。
除了在選擇的宿主中調(diào)節(jié)質(zhì)粒復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)之外，合適的載體優(yōu)選通常含有選擇標(biāo)記基因和識別限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，其使得核酸片段能被插入。通過合適的限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)可以將編碼IL-15/Fc融合蛋白的核酸插入載體。
適合用于根據(jù)本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)的病毒載體系統(tǒng)包括，例如反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒載體和皰疹病毒或乳頭狀瘤病毒載體。
編碼IL-15/Fc融合蛋白的核酸優(yōu)選DNA或RNA，特別優(yōu)選基因組DNA，cDNA或其組合。
IL-15/Fc融合蛋白的核酸編碼IL-15/Fc融合蛋白。根據(jù)本發(fā)明的IL-15/Fc融合蛋白是含有兩個(gè)融合部分，即IL-15組分和Fc組分的融合蛋白。除了功能蛋白之外還含有免疫球蛋白的融合部分的重組蛋白例如描述于Capon等(US 5,428,130)中。
給出了優(yōu)選的由N端突變或未突變的IL-15部分和C端Fc部分組成的融合蛋白。該蛋白例如公開于WO 97/41232和Kim等(1998，J.Immunol.1605742-5748)中。
融合蛋白的IL-15部分選擇性的調(diào)節(jié)與IL-15受體(IL-15R)的結(jié)合，該受體例如在活化的T細(xì)胞上表達(dá)。因此該IL-15部分可以是天然形成的IL-15及其突變。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，IL-15組分是野生型的IL-15。在這里，該IL-15可以是例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、牛、山羊、綿羊、馬、豬、狗、貓或猴的任何種中的IL-15，優(yōu)選人的IL-15。其還包括不同的剪切變體和天然發(fā)生的變體。更優(yōu)選這里給出哺乳動物的核酸，特別是人或鼠科的核酸形式。
IL-15突變包括IL-15組分，相比較于天然發(fā)生的IL-15，含有突變，例如一個(gè)或多個(gè)刪除、插入或取代或其組合。然而，使用的IL-15變體必須能夠使IL-15/Fc融合蛋白結(jié)合IL-15R。例如這可以在使用標(biāo)記的IL-15和具有IL-15受體的膜或細(xì)胞的放射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)中檢測(Carson WE等，1994，J Exp Med.，180(4)1395-1403)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該突變可以具有類似IL-15的作用(具有激動劑作用的組分)和其活性，相比較于IL-15，可以具有相同、降低或甚至增加的水平?？梢杂糜诤芯哂屑觿┳饔玫腎L-15組分的IL-15/Fc融合蛋白的檢測系統(tǒng)是通過所述的IL-15組分激活鼠科的CTLL-2細(xì)胞的增殖。
根據(jù)本發(fā)明，如果IL-15組分具有至少10％、優(yōu)選至少25％、更優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選100％，甚至更優(yōu)選150％以及最優(yōu)選至少200％的活性，則該組分具有激動劑作用。
具有激動劑作用的IL-15組分的活性指由IL-15組分引起的刺激反應(yīng)與通過野生型的IL-15(野生型IL-15相應(yīng)于100％活性)的刺激的百分比。在測試中既可以單獨(dú)使用IL-15組分，也可以使用融合蛋白。
對于具有激動劑作用的IL-15組分，優(yōu)選使用保守的氨基酸取代，其殘基被具有相似特性的另一個(gè)殘基取代。典型的取代是在脂肪族氨基酸的組中的取代、在具有脂肪族羥基側(cè)鏈的氨基酸的組中的取代、在具有酸性基團(tuán)的氨基酸的組中的取代、在具有酰胺衍生物的氨基酸組中的取代、在具有堿性基團(tuán)的氨基酸的組中的取代或在具有芳基基團(tuán)的氨基酸的組中的取代。典型的保守和半保守取代如下所述
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，使用具有拮抗劑作用的IL-15的組分。這種類型的組分抑制IL-15的作用或抑制IL-15與IL-15R結(jié)合，這種抑制可能是完全的或僅僅是部分的。用于具有有拮抗劑作用的IL-15組分的IL-15/Fc融合蛋白的檢測系統(tǒng)是描述于WO 97/41232(BAF-BO3細(xì)胞增殖方法)中的檢測系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明，如果IL-15組分抑制至少10％、優(yōu)選至少25％、更優(yōu)選至少50％，最優(yōu)選至少95％的IL-15介導(dǎo)的作用或IL-15與IL-15R的結(jié)合，則該IL-15組分具有拮抗劑作用。在測試中即可單獨(dú)使用IL-15組分又可使用融合蛋白。
對于具有拮抗劑作用的IL-15組分，優(yōu)選非保守的氨基酸取代，其殘基被具有不同特性的氨基酸取代。進(jìn)一步優(yōu)選在與IL-15R相互作用的或用于信號傳導(dǎo)的分子區(qū)域發(fā)生的取代。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用的具有拮抗劑作用的IL-15組分是在WO 97/41232中描述的突變或在第56位置的氨基酸具有突變的IL-15組分(天冬氨酸，AAA21551)。最優(yōu)選的突變是在白細(xì)胞介素-15的第149和/或156氨基酸位置的點(diǎn)突變，特別是用天冬氨酸替代谷氨酸(參見WO 97/41232)。在一個(gè)實(shí)施方案中，還可能結(jié)合描述的突變。
在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白的突變的IL-15部分與野生型的IL-15，優(yōu)選人野生型的IL-15(例如，國家生物技術(shù)信息中心的數(shù)據(jù)，接受號AAA21551)或其它天然發(fā)生的變體(例如，國家生物技術(shù)信息中心的數(shù)據(jù)接受號為CAA63914和CAA71044的變體)具有至少65％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少85％，仍然優(yōu)選至少95％和最優(yōu)選至少99％的同一性。
IL-15/Fc融合蛋白的第二個(gè)功能單位是Fc組分。該Fc部分指免疫球蛋白恒定的片段(c＝恒定)，其通過木瓜蛋白酶剪切而制得并且其氨基酸序列是高度保守的。該Fc片段是通常不結(jié)合抗原的抗體片段。根據(jù)本發(fā)明的Fc部分指優(yōu)選上述定義的除了鉸鏈區(qū)還包括恒定結(jié)構(gòu)域CH2和CH3的免疫球蛋白片段。
該Fc組分源自任何抗體的Fc部分，例如IgA，IgD，IgG，IgE或IgM，優(yōu)選IgM或IgG，更優(yōu)選IgG1，IgG2，IgG3和IgG4亞類的Fc部分。
在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，融合蛋白的Fc部分是免疫球蛋白G(IgG)的Fc片段，其缺乏IgG可變區(qū)的輕鏈和重鏈?？梢允褂玫腎gGs的實(shí)例是IgG1，IgG2，IgG2a，IgG2b，IgG3和IgG4。優(yōu)選人或鼠的IgG1。
本發(fā)明可以使用抗體的整個(gè)Fc部分，或僅僅是其一部分。然而，F(xiàn)c部分的所述部分優(yōu)選以這樣的方式設(shè)計(jì)即IL-15/Fc融合蛋白比沒有免疫球蛋白組分的IL-15組分在血液循環(huán)中具有更長的半衰期。這可以通過將融合蛋白和IL-15組分給藥，例如用注射的方法用于一個(gè)或多個(gè)實(shí)驗(yàn)動物的血流中，并比較血液循環(huán)中的半衰期而檢測。通過半衰期增加至少10％，更優(yōu)選至少20％，仍然優(yōu)選至少50％和最優(yōu)選至少100％來顯示更長的半衰期。
該Fc部分還可以是具有至少一個(gè)突變的Fc部分。該突變的Fc可以采用上述的對于IL-15部分的突變方法。
一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白的突變的Fc部分與鼠或人野生型免疫球蛋白，優(yōu)選人IgG1-Fc或自然發(fā)生的變體相比具有至少65％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少85％，仍然更優(yōu)選至少95％并最優(yōu)選至少99％的同一性。
在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，融合蛋白的Fc部分是天然的形式或具有保守氨基酸取代并含有完整FcR-和/或互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的形式。融合蛋白的Fc部分可以調(diào)節(jié)補(bǔ)體系統(tǒng)的活性并結(jié)合表達(dá)Fc受體的細(xì)胞，因此導(dǎo)致被融合蛋白的IL-15部分識別的細(xì)胞的消除。在調(diào)節(jié)補(bǔ)體激活和Fc受體結(jié)合的氨基酸位置的突變的引入，特別是非保守氨基酸的替代，使得關(guān)閉這些功能成為可能。這些突變的實(shí)例是那些Fc受體(FcR)結(jié)合位點(diǎn)或補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)的突變(在天然人IgG1的氨基酸214，356，358和/或435位點(diǎn)或在天然鼠IgG2A的Leu 235，Glu318，Lys 320和/或Lys 322位點(diǎn))。在這些位置的氨基酸取代通常導(dǎo)致Fc部分的漸退的(lytic)和補(bǔ)體-激活功能的缺失(WO 97/41232)。
進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，人Fc部分的鉸鏈區(qū)的位置4，更優(yōu)選人IgG1(人IgG1的167位置)的半光氨酸被例如丙氨酸取代，以防止分子內(nèi)的橋聯(lián)并因此產(chǎn)生的表達(dá)的IL-15/Fc融合蛋白的聚積。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分是人免疫球蛋白IgG1的Fc部分或鼠免疫球蛋白IgG2A的Fc部分，其除了鉸鏈區(qū)，還包括重鏈區(qū)CH2和CH3。
在該IL-15/Fc融合蛋白中，IL-15組分通過直接或通過連接體而融合到免疫球蛋白組分中。該連接體優(yōu)選由不超過25個(gè)氨基酸，更優(yōu)選不超過15個(gè)氨基酸，仍然更優(yōu)選不超過10個(gè)氨基酸和最優(yōu)選不超過1、2、3、4或5個(gè)氨基酸組成。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼白細(xì)胞介素的人核酸或者結(jié)合到同樣的編碼Fc的人核酸或者結(jié)合到其它諸如小鼠或大鼠的種的編碼Fc的核酸上。例如，編碼IL-15的人核酸可以結(jié)合到同樣的編碼IgG1的人核酸上、編碼IgG2A的鼠核酸上或編碼IgG2B的大鼠核酸上。進(jìn)一步的可能的核酸的結(jié)合對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來講是可以理解的。
對于IL-15/Fc融合蛋白的最優(yōu)選的核酸是SEQ ID No.1序列的第979到2014位置，SEQ ID No.2的第1985到3020位置的序列，或SEQ ID No.3或者編碼SEQ ID No.4或SEQ ID No.5的多肽序列的核酸。最優(yōu)選包括編碼IL-15/Fc融合蛋白的核酸的載體是SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的載體。
然而，術(shù)語“編碼IL-15/Fc融合蛋白的核酸”還包括與SEQ ID No.3所示的核苷酸序列或編碼SEQ ID No.4或5的多肽的核苷酸序列具有至少大約60％，優(yōu)選大約75％，特別優(yōu)選大約90％并更特別優(yōu)選大約95％同一性的核酸，相應(yīng)的IL-15/Fc融合蛋白結(jié)合IL-15R，并相比較于沒有免疫球蛋白組分的相應(yīng)的IL-15/Fc融合蛋白(用于檢測系統(tǒng)，參見上文)具有在血液中增加的半衰期。
術(shù)語“包含編碼IL-15/Fc融合蛋白的核酸的載體”還包括與SEQ IDNo.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列具有至少大約60％，優(yōu)選大約75％，特別優(yōu)選大約90％并更特別優(yōu)選大約95％同一性的核酸，相應(yīng)的IL-15/Fc融合蛋白結(jié)合IL-15R，并相比較于沒有免疫球蛋白組分的相應(yīng)的IL-15/Fc融合蛋白(用于檢測系統(tǒng)，參見上文)具有在血液中增加的半衰期。
該表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)一步包括啟動子。該啟動子及其功能是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。該啟動子例如可以衍生自病毒、細(xì)菌或真核生物。該啟動子可以控制要表達(dá)的基因組成型轉(zhuǎn)錄或可以被誘導(dǎo)的，并因此使得基因表達(dá)被特異性調(diào)控成為可能。該啟動子還可以是細(xì)胞或組織特異的，即限制在特定細(xì)胞類型中表達(dá)該基因產(chǎn)物。具有這些特性的啟動子對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的。特別適合在宿主細(xì)胞中控制表達(dá)的啟動子，例如，在酵母中表達(dá)的ADH2啟動子，或在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的多角體蛋白啟動子。在哺乳動物細(xì)胞中調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物強(qiáng)表達(dá)的啟動子是，例如，病毒基因的病毒啟動子，例如RSV(勞氏肉瘤病毒)啟動子、SV40(猿猴病毒40)啟動子和CMVi/e(巨細(xì)胞病毒立即早期多肽)啟動子。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選CMV啟動子。還包括CMV啟動子的突變，該突變序列與天然發(fā)生的CMV啟動子相比具有優(yōu)選95％、更優(yōu)選99％的同源性(Kouzarides等，1983，MoI Biol.Med.1(1)47-58)和/或該突變相比較于野生型啟動子，具有優(yōu)選從90-110％，更優(yōu)選從95-105％的活性。
另外，該轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可以，特別是當(dāng)使用CMV啟動子時(shí)，含有一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子，優(yōu)選內(nèi)含子A(Chapman等，1991，Nucleic Acids Res.19(14)3979-3986)。此實(shí)施方案具有可能達(dá)到特別高量的IL-15/Fc融合蛋白的優(yōu)點(diǎn)，例如通過向轉(zhuǎn)錄因子提呈合適的結(jié)合位點(diǎn)。還包括內(nèi)含子A中的突變，該突變序列與天然發(fā)生的內(nèi)含子，特別是內(nèi)含子A相比具有優(yōu)選80％，更優(yōu)選90％并更優(yōu)選95％的同源性(Chapman等，1991，Nucleic Acids Res.19(14)3979-3986)，和/或相比較于野生型的內(nèi)含子，特別是內(nèi)含子A具有優(yōu)選從90-110％，更優(yōu)選95-105％的活性。
根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)的另一個(gè)要素是編碼CD5引導(dǎo)子的核酸，即CD5淋巴細(xì)胞抗原的分泌信號序列(Jones等，1986，Nature 323(6086)346-349)。該分泌信號序列調(diào)節(jié)表達(dá)產(chǎn)物分泌到宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中。將編碼CD5引導(dǎo)子的核酸與編碼IL-15/Fc融合蛋白的核酸在表達(dá)系統(tǒng)中排列，以便該引導(dǎo)子能夠調(diào)節(jié)該融合蛋白的分泌。轉(zhuǎn)錄和翻譯之后，優(yōu)選CD5引導(dǎo)子位于融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)物的羧基端，但是也可以同等優(yōu)選位于融合蛋白的氨基端。
令人驚訝的是，CD5引導(dǎo)子顯示出在CHO細(xì)胞中調(diào)節(jié)表達(dá)產(chǎn)物分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中，比可比較的信號序列(參見實(shí)施例2，圖8)高200-300倍。而且還包括在CD5引導(dǎo)子中的突變，該突變序列與天然發(fā)生的CD5引導(dǎo)子相比具有優(yōu)選80％，更優(yōu)選90％并更優(yōu)選95％的同源性(Jones等，1986，Nature 323(6086)346-349)，和/或相比較于野生型的CD5引導(dǎo)子具有優(yōu)選從80-120％，更優(yōu)選90-110％的并更優(yōu)選從95-105％的活性。
在表達(dá)系統(tǒng)中，啟動子和編碼CD5引導(dǎo)子的核酸被功能性地連接到編碼IL-15/Fc融合蛋白的核酸上。功能性連接指就編碼IL-15/Fc融合蛋白的核酸而言，啟動子和編碼CD5引導(dǎo)子的核酸以這樣的方式排列，以便它們可以實(shí)施它們的功能。啟動子的功能是調(diào)節(jié)融合蛋白的表達(dá)。如果兩者都位于一個(gè)核酸上，該啟動子通常在融合蛋白的5’端，或在3’端。引導(dǎo)子的功能是調(diào)節(jié)融合蛋白的分泌。如果編碼引導(dǎo)子的核酸和編碼融合蛋白的核酸位于一個(gè)核酸，該引導(dǎo)子通常位于融合蛋白的側(cè)面。“功能性連接”優(yōu)選指啟動子和CD5引導(dǎo)子以與融合蛋白有關(guān)的方式排列，以便該啟動子調(diào)控融合蛋白的表達(dá)并且該CD5引導(dǎo)子引起該融合蛋白的分泌。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)系統(tǒng)另外含有至少用于選擇標(biāo)記基因的核酸，其例如能夠使轉(zhuǎn)染有表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞從非轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中選擇出來。標(biāo)記基因的實(shí)例是與抗生素聯(lián)合使用的抗性調(diào)節(jié)基因。所述基因例如插入到表達(dá)載體并與適用于適當(dāng)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的抗生素一起使用。用于選擇真核宿主細(xì)胞的已知抗生素的實(shí)例是氨芐青霉素、卡那霉素、zeocin和本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中的新霉素，所有這些使得宿主細(xì)胞能夠通過表達(dá)相應(yīng)的抗性調(diào)節(jié)基因而被篩選。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其它標(biāo)記基因，例如選擇基因tk或DHFR與相應(yīng)的諸如HAT或氨蝶呤和甲氨蝶呤的選擇試劑一同應(yīng)用。其它合適的選擇標(biāo)記基因，例如維多利亞水母(A.Victoria)及其變體來源的綠色熒光蛋白基因，允許轉(zhuǎn)染有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞通過光學(xué)選擇而不需要使用選擇試劑處理。
優(yōu)選使用編碼色氨酸合成酶的基因作為選擇地標(biāo)記基因，相應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒被導(dǎo)入色氨酸合成酶缺陷的宿主細(xì)胞以用于選擇和表達(dá)。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)系統(tǒng)還包括至少一個(gè)多腺苷酸化信號的核酸，通常，其除了終止轉(zhuǎn)錄，還影響RNA轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性。其實(shí)例是來自SV40、β珠蛋白基因的多腺苷酸化序列，或在優(yōu)選的實(shí)施方案中來自牛生長激素基因BGH(EP 173552)。多腺苷酸化信號的核酸以這樣的方式作為表達(dá)系統(tǒng)的一部分，其能夠改良融合蛋白的表達(dá)或其穩(wěn)定性。通常將其連接到編碼融合蛋白的核酸，以便該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物包括編碼IL-15/Fc融合蛋白的核酸和多腺苷酸化信號。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，例如在無細(xì)胞系統(tǒng)中，為了轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，該表達(dá)系統(tǒng)含有除了上述組分之外的表達(dá)所需要的組分。這種類型的可能組分的實(shí)例是轉(zhuǎn)錄因子、酶(例如肽基轉(zhuǎn)移酶、aminoacyl-tRNS合成酶和RNA聚合酶)以及其它細(xì)胞蛋白(例如eIF4E，eFE1 andeEF2)，還進(jìn)一步有輔助底物(ATP，GTP和鎂離子)，優(yōu)選tRNAs，氨基酸和/或核糖體。
在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)系統(tǒng)僅僅包括一個(gè)含有a)到c)的組分的核酸，如果合適還有d)，其中所有的均如上所定義。
在本發(fā)明一個(gè)高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)系統(tǒng)包括序列SEQ IDNo.1，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3中任何的核酸，或者編碼SEQ IDNo.4或SEQ ID No.5的多肽的核酸。然而，還包括其序列與SEQ IDNo.1，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3序列之一的核酸或者與編碼SEQID No.4或SEQ ID No.5的多肽的核酸之間具有至少大約60％，優(yōu)選大約75％，特別優(yōu)選大約90％并更特別優(yōu)選95％同一性的核酸，相應(yīng)的IL-15/Fc融合蛋白結(jié)合IL-15R，且相比較于相應(yīng)的沒有免疫球蛋白組分(用于檢測系統(tǒng)，參見上文)的IL-15/Fc融合蛋白，其在血液中具有增加的半衰期。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該表達(dá)系統(tǒng)包括核酸，在該核酸中從5’到3’排列下列組分CMV啟動子，如果合適其后為內(nèi)含子A，CD5引導(dǎo)子，IL-15/Fc融合蛋白，特別是具有在IL-15的149和/或156的氨基酸位置上存在天冬氨酸取代谷氨酰胺的點(diǎn)突變的IL-15，(參見WO97/41232)，和在鉸鏈區(qū)的位置4的半胱氨酸被丙氨酸取代的人IgG1的Fc部分組成，如果合適還有多聚腺苷酸信號和如果合適，至少有一個(gè)標(biāo)記基因。該標(biāo)記基因，特別的還可以被安排在第二個(gè)核酸上。因此，這樣的核酸(有或沒有標(biāo)記基因)也是根據(jù)本發(fā)明的核酸的優(yōu)選實(shí)施方案。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一個(gè)核酸，其包括IL-15/Fc融合蛋白、啟動子、CD5引導(dǎo)子、如果合適還包括選擇性標(biāo)記基因，以及如果合適還包括多聚腺苷酸信號，所有的組分如上所述。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該核酸含有SEQ ID No.1，SEQ ID No.2或SEQ ID No.3，或者編碼SEQ ID No.4或SEQ ID No.5的多肽的核酸。然而，還包括其序列與SEQ ID No.1，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3序列之一的核酸或者與編碼SEQ ID No.4或SEQ ID No.5的多肽的核酸之間具有至少大約60％，優(yōu)選大約75％，特別優(yōu)選大約90％并更特別優(yōu)選95％同一性的核酸，相應(yīng)的IL-15/Fc融合蛋白結(jié)合IL-15R，相比較于相應(yīng)的沒有免疫球蛋白組分(用于檢測系統(tǒng)，參見上文)的IL-15/Fc融合蛋白，其在血液中具有增加的半衰期。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)或根據(jù)本發(fā)明的核酸的宿主細(xì)胞。
可以使用的宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞(例如啤酒酵母(S.cerevisiae)和畢赤酵母(P.pastori))、昆蟲細(xì)胞(例如Sf9)或哺乳動物細(xì)胞。這種類型的哺乳動物細(xì)胞的實(shí)例是人胚胎腎細(xì)胞系HEK-293，從中國倉鼠卵巢細(xì)胞制備的CHO細(xì)胞系，及其衍生物例如，CHO-K1和CHO-DHFR，細(xì)胞系BHK，NIH 3T3，HeLa，COS-I，COS-7和NS.1。宿主細(xì)胞優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞，更優(yōu)選CHO細(xì)胞及其衍生物，更優(yōu)選CHO-K1細(xì)胞系。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是那些被表達(dá)系統(tǒng)的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的情況下，表達(dá)系統(tǒng)整合到靶細(xì)胞的基因組中并且以穩(wěn)定的方式維持在基因組中。不同于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，這里轉(zhuǎn)染的基因不僅不降解，而且隨著細(xì)胞的分裂而加倍并遺傳到子代細(xì)胞中。后者因而保留了在很長的時(shí)間里制備所需蛋白的能力。
制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞特別是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如可以通過電穿孔的方法轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，其中由于暫時(shí)施加電場而使細(xì)胞膜產(chǎn)生通透，從而允許核酸被吸收入細(xì)胞中，或者通過病毒載體轉(zhuǎn)染或感染的方法。除了重組蛋白的瞬時(shí)表達(dá)，使用的表達(dá)系統(tǒng)還可以允許轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的克隆選擇，以便選擇具有合適表達(dá)效率的克隆細(xì)胞系。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真核哺乳動物細(xì)胞，其含有至少一個(gè)根據(jù)SEQ ID No.1，SEQ ID No.2或SEQ ID No.3的核酸，或者編碼SEQ ID No.4或SEQ ID No.5的多肽的核酸。還包括其序列與上述序列具有至少大約60％，優(yōu)選大約75％，特別優(yōu)選大約90％，并更特別優(yōu)選95％同一性的核酸，相應(yīng)的IL-15/Fc融合蛋白結(jié)合IL-15R，其相比較于相應(yīng)的沒有免疫球蛋白組分(用于檢測系統(tǒng)，參見上文)的IL-15/Fc融合蛋白在血液中具有增加的半衰期。
在一個(gè)特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)宿主細(xì)胞是CHO-K1細(xì)胞系(中國倉鼠卵巢細(xì)胞的亞克隆)，其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了至少一個(gè)根據(jù)SEQ ID No.1，SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.3的核酸，或者編碼SEQ ID No.4或SEQ ID No.5的多肽的核酸。還包括其序列與上述序列具有至少大約60％，優(yōu)選大約75％，特別優(yōu)選大約90％并更特別優(yōu)選大約95％同一性的核酸，相應(yīng)的IL-15/Fc融合蛋白結(jié)合IL-15R，其相比較于相應(yīng)的沒有免疫球蛋白組分(用于檢測系統(tǒng)，參見上文)的IL-15/Fc融合蛋白在血液中具有增加的半衰期。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及制備如上定義的IL-15/Fc融合蛋白的方法，包括a.提供如上描述的宿主細(xì)胞，b.培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，c.選擇，如果合適并d.分離表達(dá)的IL-15/Fc融合蛋白。
可以使用的宿主細(xì)胞的實(shí)例如上所述。該細(xì)胞優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞，更優(yōu)選CHO細(xì)胞及其衍生物，最優(yōu)選CHO-K1細(xì)胞系?？梢圆捎脴?biāo)準(zhǔn)的方法用編碼IL-15/Fc融合蛋白的核酸轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞(Sambrook等人，1989，supra)。
轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞可以是粘附細(xì)胞或懸浮培養(yǎng)。使用的宿主細(xì)胞優(yōu)選存在于懸浮培養(yǎng)基中的細(xì)胞，避免在從粘附細(xì)胞向懸浮細(xì)胞的適應(yīng)過程中的表達(dá)效率的降低。
可以使用標(biāo)準(zhǔn)的方法在發(fā)酵條件下，在適合的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)原代細(xì)胞和細(xì)胞系(Freshney，1993，Animal Cell CultureA practicalapproach，John Wiley & Sons，Inc.)，該條件適合所使用的宿主細(xì)胞在每個(gè)情況下對于鹽濃度、PH、維生素、微量元素、選擇試劑、溫度、通氣等的要求，并且其使得所需要的表達(dá)產(chǎn)物以最佳條件表達(dá)。有利的是，所使用的是不含血清或外源蛋白的營養(yǎng)培養(yǎng)基，其能確保表達(dá)產(chǎn)物相對高的純度。
選擇，特定的克隆選擇，指一種方法，其中具有所需要特性的宿主細(xì)胞通過一步一步的篩選(thinning-out)而增殖。優(yōu)選的克隆選擇的方法選擇那些確保表達(dá)產(chǎn)物的足夠表達(dá)水平和/或高糖基化的方式和高唾液酸化的狀態(tài)的宿主細(xì)胞克隆。糖基化方式和唾液酸化狀態(tài)影響表達(dá)產(chǎn)物的半衰期、生物分布、免疫原性和純化及其他行為。合適的測定糖基化方式和唾液酸狀態(tài)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，其包括使用IEF(等電點(diǎn)聚焦)的結(jié)合酶剪切和HPAEC-PAD(具有脈沖安培計(jì)的高效陰離子交換層析)。
本發(fā)明的方法還包括從宿主細(xì)胞中分離異源表達(dá)的IL-15/Fc融合蛋白的方法，或在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，從宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離異源表達(dá)的IL-15/Fc融合蛋白的方法。可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法分離，如果合適，純化重組蛋白，其包括，例如細(xì)胞裂解、差速離心、沉淀、凝膠過濾、親和層析、離子交換層析和HPLC反相層析等。用于純化重組蛋白的合適方法的一個(gè)例子是親和層析，其中不溶的基質(zhì)由于化學(xué)處理而與配體結(jié)合。有用的配體可以是具有能夠結(jié)合該基質(zhì)的活性化學(xué)基團(tuán)的任何分子。通常選擇配體以便能夠以可逆的方式與需要純化的多肽結(jié)合。在適合該分子與配體結(jié)合的條件下，將在宿主細(xì)胞預(yù)純化的培養(yǎng)基中的需要被純化的分子施加到基質(zhì)上，通過隨后的洗滌步驟，將未結(jié)合的分子從培養(yǎng)基中去掉。通過加入離解多肽與配體結(jié)合的溶液而可以洗脫需要純化的多肽。另一個(gè)合適的方法是陰離子交換層析，其中通過過量的正電荷或負(fù)電荷而將需要純化的多肽結(jié)合到基質(zhì)上。在根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，首先通過從宿主細(xì)胞中除去細(xì)胞培養(yǎng)基而純化表達(dá)產(chǎn)物，然后可以通過離心和/或過濾步驟來除去細(xì)胞碎片。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過蛋白-A親和層析和陰離子交換層析的組合而從宿主細(xì)胞的預(yù)純化培養(yǎng)基中純化重組的IL-15/Fc融合蛋白，如果需要，然后進(jìn)行凝膠過濾。通過這種方法獲得的表達(dá)產(chǎn)物可以隨后通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法鑒定關(guān)于含量、同一性和純度的特性，所述方法例如，BCA，光密度檢測，SDS PAGE，Western Blot，ELISA，氨基酸分析，氨基末端測序，指紋法(MALDI)，分子量測定(HPLC-ESI)等。
從組合物中純化IL-15/Fc的特別優(yōu)選的方法包括a)將該組合物施加到親和層析柱上，并從柱上洗脫第一次的IL-15/Fc洗脫液；b)將步驟a)的洗脫液施加到陰離子交換層析柱上并從柱上洗脫第二次IL-15/Fc洗脫液；c)將步驟b)的洗脫液施加到凝膠過濾柱上并從柱上洗脫第三次IL-15/Fc洗脫液。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法使得制備的IL-15/Fc融合蛋白的量至少10pg/(細(xì)胞X天)，更優(yōu)選至少15pg/(細(xì)胞X天)。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，純化后的蛋白的純度至少90％，更優(yōu)選至少95％并且最優(yōu)選至少99％。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及上述的表達(dá)系統(tǒng)、核酸或宿主細(xì)胞在制備IL-15/Fc融合蛋白中的用途，該用途通過如上描述的方法實(shí)施。
本發(fā)明還進(jìn)一步涉及如上所描述的CD5引導(dǎo)子在CHO細(xì)胞及其衍生物，特別是CHO-K1細(xì)胞中表達(dá)蛋白的用途。令人驚訝的是，當(dāng)使用CD5引導(dǎo)子時(shí)，該蛋白的表達(dá)或其釋放到細(xì)胞培養(yǎng)上清中的蛋白相比較于沒有引導(dǎo)子的表達(dá)高200-300倍。另外，在這些細(xì)胞中，CD5引導(dǎo)子顯示出顯著優(yōu)越于其它引導(dǎo)子(參見實(shí)施例2，圖8)。該蛋白可以是任何蛋白。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該蛋白的表達(dá)被CMV啟動子特別是與內(nèi)含子A聯(lián)合調(diào)節(jié)。
通過下面的實(shí)施例和附圖解釋本發(fā)明，而非對其進(jìn)行限定。


圖1pcDNA3.1hCD5.6Ala7表達(dá)構(gòu)建體的圖譜的描述。
圖2-3pcDNA3.1hCD5.6Ala7表達(dá)構(gòu)建體的序列的描述(SEQ ID No.1)。
圖4pMG10Ala7表達(dá)構(gòu)建體的圖譜描述。
圖5-6pMG10Ala7表達(dá)構(gòu)建體的序列描述(SEQ ID No.2)。
圖7A突變的具有CD5引導(dǎo)子的人IL-15/Fc的核酸序列的描述(SEQ ID No.3)。
圖7B突變的具有CD5引導(dǎo)子的人IL-15/Fc的氨基酸序列的描述(SEQ ID No.4)。
圖7C突變的具有CD5引導(dǎo)子的人IL-15/Fc的氨基酸序列的描述(SEQ ID No.5)。
圖8用含有在每個(gè)事例中顯示的引導(dǎo)子序列的pcDNA3.1hCD5.6Ala7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞之后，細(xì)胞培養(yǎng)基上清中IL-15/Fc含量的描述。
圖9用不同表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞之后，細(xì)胞培養(yǎng)基上清中IL-15/Fc含量的描述。每個(gè)條代表在每種情況下兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的兩次檢測的平均值+SEM。
pcDNA3.1相應(yīng)于pcDNA3.1hCD5.6Ala7載體。
pVS8-Ala7相應(yīng)于具有IL-15/Fc構(gòu)建體的pSwitch質(zhì)粒(Valentis)。
pMG-Ala7相應(yīng)于具有IL-15/Fc構(gòu)建體的pMG質(zhì)粒(Invivogen)。
pCINeo-Ala7相應(yīng)于具有IL-15/Fc構(gòu)建體的pCI-Neo質(zhì)粒(Promega)。
實(shí)施例實(shí)施例1在CHO-K1細(xì)胞中生產(chǎn)IL-15/Fc為了生產(chǎn)用于生產(chǎn)IL-15/Fc的CHO-K1細(xì)胞系，應(yīng)該形成IL-15/Fc的表達(dá)構(gòu)建體，并根據(jù)其分泌特性、其含有的片段的同一性/整合性和適合的抗性基因?qū)ζ渥顑?yōu)化。
a)開始材料人IL-15/Fc表達(dá)構(gòu)建體(突變的IL-15/人Fc)由美國波士頓哈佛醫(yī)學(xué)院以色列之家Deaconness醫(yī)學(xué)中心的免疫系(the Department ofImmunology of the″Beth Israel Deaconness Medical Center″(HarvardMedical School，Boston，USA))提供。
從MWG-Biotech(Ebersberg，Germany)獲得寡核苷酸。從基因文庫獲得相關(guān)信號肽的序列。
限制性內(nèi)切酶(BgIII，XBaI，BamHI，Smal，BstXI，ApaI)，Lipfectamin2000，其它分子生物學(xué)試劑(T4-DNA連接酶，T4-多核苷酸激酶)和質(zhì)粒pSecTagA，pcDNA3.1從Invitrogen(Karlsruhe，Germany)或Amersham-Pharmacia(NheI，Protein A Sepharose Uppsala，Sweden)獲得。
感受態(tài)E.coli XL10-GoId細(xì)胞從Stratagene(La Jolla，USA)獲得.BCA試劑盒(Pierce)購自KMF Laborchemie(Sankt Augustin，Germany)。
質(zhì)粒-DNA純化試劑盒(Endofree-Maxi Kit，Endofree-Giga Kit)來自Qiagen(Hilden，Germany)。
抗體從BD-Pharmingen(鼠-抗-hIL-15；目錄號554712；Heidelberg，Germany)和Dianova(山羊-抗-小鼠-POD；目錄號15-036-003；山羊-抗-人-POD；目錄號109-036-088；Hamburg，Germany)獲得。
b)方法/結(jié)果起始質(zhì)粒在pSecTagA載體骨架上含有包括融合到人IgG1的Fc部分(鉸鏈區(qū)和CH2，CH3區(qū))的突變的人IL-15的融合蛋白的cDNA。除了在此申請中引用的Fc部分是鼠Igγ2a外，該質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)相應(yīng)于Kim等描述的(J.Immunol，1605742-5748；1998)。
已經(jīng)存在于pSecTagA載體中的Igk引導(dǎo)子用于通過IL-15/Fc部分的讀碼框(in-frame)克隆分泌該融合蛋白。為了此目的，從天然的IL-15序列中除去內(nèi)在的信號序列。然而由于克隆，10個(gè)額外的氨基酸被插入到Igk引導(dǎo)子序列的3’端和IL-15編碼序列的5’端之間，在蛋白加工之后，其仍留在分泌蛋白中。為了除去這些非特異的氨基酸并為了改善該蛋白的分泌特性，對其它分泌的或細(xì)胞表面的蛋白的多種引導(dǎo)子序列進(jìn)行檢測鼠Igk(Coloma et al，J.Immun.Methods 15289-104；1992；接受號X91670)，人CD5(Jones et al，Nature 323346-349；1986；接受號X04391)，CD4(Hodge et al，Hum.Immunol.3099-104；1991；接受號M35160)，MCP-1(Yoshimura et al Je.FEBS Lett.244487-493；1989；接受號M24545)和IL-2(Taniguchi et al，Nature 302305-310；1983；接受號K02056)(接受號基于國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information))。在除去Igk引導(dǎo)子和額外的氨基酸后，通過克隆雙鏈寡核苷酸而用提及的信號肽序列替代引導(dǎo)子。通過測序?qū)ζ渫恍赃M(jìn)行檢測。隨后，通過使用Lipfectamin2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞而對獲得的構(gòu)建體進(jìn)行檢測。在根據(jù)Moll和Vestweber的方法(Methods in Molecular Biology，9677-84，1999)進(jìn)行蛋白-A-Sepharose純化之后，通過BCA方法檢測用多種構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基上清的蛋白含量。通過SDS凝膠的銀染和對Fc或IL-15部分的蛋白印跡檢測的方法對蛋白的同一性進(jìn)行檢測，以便確保融合蛋白的兩個(gè)組分都存在。在描述的實(shí)驗(yàn)中，CD5引導(dǎo)子獲得了最好的結(jié)果，因此被選作該載體的進(jìn)一步優(yōu)化。
進(jìn)一步檢測是否用含有外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的基因組DNA取代Fc部分的cDNA也能夠有助于改良蛋白表達(dá)。不得不被核剪切器除去的內(nèi)含子的存在可以改良RNA從細(xì)胞核的輸出和RNA的穩(wěn)定性。因此，通過引入剪切供體和剪切受體的位點(diǎn)而將基因組Fc部分連接到IL-15cDNA序列。獲得的質(zhì)粒同樣也被多種引導(dǎo)序列修飾并用上述方法檢測。然而，通過蛋白印跡分析的蛋白質(zhì)揭示存在多種不需要的剪切變體，從而決定繼續(xù)使用Fc部分的cDNA。
結(jié)果，獲得的質(zhì)粒包括人CD5引導(dǎo)子和cDNA-Fc部分。
突變的IL-15/Fc表達(dá)構(gòu)建體的測序揭示Fc部分含有3個(gè)已經(jīng)存在于原始構(gòu)建體中的突變。這些突變中的兩個(gè)涉及在高度保守位置的氨基酸。第三個(gè)突變是在鉸鏈區(qū)的位置4的Cys-Ala突變，其是為了防止分子內(nèi)和分子間半光氨酸橋而故意插入的。
為了除去兩個(gè)不需要的突變并保留該Cys-Ala突變，通過RT-PCR對Fc的cDNA進(jìn)行亞克隆。使用的RNA來源是用編碼VCAM-1-Fc融合蛋白的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的CHO-K1細(xì)胞系。擴(kuò)增的Fc-cDNA片段被克隆入CD5-mutIL-15質(zhì)粒，然后通過BamHI/XbaI限制性內(nèi)切酶除去Fc部分。
在獨(dú)特的限制性內(nèi)切圖譜的基礎(chǔ)上以及通過隨后的測序?qū)Λ@得的質(zhì)粒再進(jìn)行分析，并將其稱為CD5-6Ala7。由于作為DNA-嵌入試劑的zeocin的使用能夠產(chǎn)生突變，將IL-15/Fc的表達(dá)盒從原始的pSecTagA骨架上除去并克隆到含有在SV40啟動子控制下的新霉素抗性基因的pcDNA3.1中。對獲得的質(zhì)粒的兩條鏈進(jìn)行測序，顯示與IL-15/Fc表達(dá)盒完全對應(yīng)。
通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞和對細(xì)胞培養(yǎng)基上清進(jìn)行蛋白印跡分析再次檢測構(gòu)建體的蛋白表達(dá)。作為陽性對照，在平行實(shí)驗(yàn)中使用CD5-6Ala7質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
最后，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞一式三份的接種于6孔組織培養(yǎng)盤中。使用分別稀釋在250μl Optimem1培養(yǎng)基中的2μg質(zhì)粒和4μl Lipofectamin2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在室溫孵育30分鐘后混合兩個(gè)溶液，將混合液滴加到組織培養(yǎng)盤的培養(yǎng)基中。
轉(zhuǎn)染2天后，除去培養(yǎng)基并通過針對人IL-15部分的蛋白印跡方法分析其IL-15/Fc含量20μl細(xì)胞培養(yǎng)上清與5μl的5×Laemmli緩沖液混合，并在85℃孵育5min。然后將樣品在12％聚丙烯酰胺凝膠上電泳。然后使用半干印跡盒對凝膠進(jìn)行印跡分析。使用在PBS中含有5％奶粉和0.1％Tween20的封閉液對印記進(jìn)行處理。然后使用在封閉液中以1∶1000稀釋度稀釋的單克隆小鼠-抗-人-IL-15抗體孵育4小時(shí)。三次洗滌步驟之后(10min PBS，0.1％Tween20)，將印記用二級抗體，山羊-抗-小鼠過氧化物酶(稀釋度1∶5000)，在室溫另外孵育2小時(shí)。然后再對印跡洗滌3次，然后使用Lumilight溶液滴加到印跡表面，然后用X射線膠片暴露于該印跡。
在用CD5-6Ala7轉(zhuǎn)染之后獲得的在信號范圍之內(nèi)的特異蛋白印跡信號顯示所有的三個(gè)平行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)物上清中含有IL-15/Fc蛋白。因此表明pcDNA3.1hCD5.6Ala7質(zhì)粒(圖1-3)可用于在CHO-K1細(xì)胞中表達(dá)蛋白。
c)結(jié)論制備了IL-15/Fc質(zhì)粒，pcDNA3.1hCD5.6Ala7，其含有包括在CMV啟動子控制下的CD5引導(dǎo)子和融合到人IgG1-Fc的cDNA的突變的人IL-15的表達(dá)盒。為了選擇穩(wěn)定的真核細(xì)胞克隆，引入新霉素抗性基因。對該質(zhì)粒進(jìn)行測序，顯示100％的對應(yīng)于相關(guān)的編碼區(qū)，僅在載體骨架上有與之無關(guān)的輕微的偏差(個(gè)堿基對的重復(fù)3)。通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞對該構(gòu)建體的功能進(jìn)行驗(yàn)證。
實(shí)施例2使用含有編碼所需要產(chǎn)物的DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞系(如CHO-K1細(xì)胞)是標(biāo)準(zhǔn)的生產(chǎn)治療蛋白的方法。然而，這種方法中產(chǎn)生的穩(wěn)定細(xì)胞克隆的低的生產(chǎn)水平是眾所周知的問題。因此有多種策略來提高已經(jīng)存在的細(xì)胞系的產(chǎn)量。除了增加細(xì)胞中質(zhì)?？截惖臄?shù)目的嘗試(例如，通過甲氨蝶呤/DHFR系統(tǒng))，還可以進(jìn)一步修飾表達(dá)構(gòu)建體自身。除了強(qiáng)啟動子(如CMV啟動子)，引入內(nèi)含子可能導(dǎo)致更好的RNA穩(wěn)定性和更好的從細(xì)胞核的RNA輸出，其輸出通過細(xì)胞的剪切裝置完成。然而，對于哪一個(gè)內(nèi)含子/轉(zhuǎn)基因的組合是合適的，必須進(jìn)行檢測。為了這個(gè)目的，多種內(nèi)含子與人IL-15/Fc組合以便發(fā)現(xiàn)通過CHO-K1細(xì)胞增加IL-15/Fc產(chǎn)量的組合。
a)材料用作起始質(zhì)粒的質(zhì)粒是pcDNA3.1hCD5.6Ala7質(zhì)粒。在圖1對其進(jìn)行了示意性描述。其序列公開為SEQ ID No.1。
檢測系統(tǒng)使用CHO-K1細(xì)胞(DSM，Braunschweig，Germany，接受號ACC 110)或者HEK-293細(xì)胞(Qbiogene，Grünberg，Germany，AE80503，QBI-293A)。也使用E.coli細(xì)胞(XL10-GoId，Strategene，LaJolla，USA)。在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)胞(5％CO2，37℃，潮濕空氣)。CHO-K1細(xì)胞以1∶20的比例一周傳代2次，而HEK-293細(xì)胞以1∶6的比例傳代。CHO-K1細(xì)胞使用的培養(yǎng)基是DMEM-F 12+10％FKS+1％PEN/Strep，而HEK-293細(xì)胞使用的培養(yǎng)基是DMEM+Glutamax+10％FKS+1％ PEN/Strep。使用Optimeml培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染。所有的培養(yǎng)基購自Invitrogen，Karlsruhe，Germany(目錄號31331-028；32430-027；51985-018)。使用的質(zhì)粒是pCl-Neo(Promega)，其含有CMV啟動子和嵌合內(nèi)含子，人β球蛋白基因的5’剪切供體位點(diǎn)和可變區(qū)的IgG重鏈的3’剪切受體位點(diǎn)。pMG(Invivogen)是含有包括來自CMV的內(nèi)含子A的延長的CMV啟動子。pSwitch(Valentis)是合成內(nèi)含子，IVS8。而且，使用下述酶和限制性內(nèi)切酶ApaI，EcoRV，XbaI，Nrul，PacI，Smal，XhoI，T4-DNA連接酶，T4-DNA聚合酶，來自牛小腸的堿性磷酸酶。這些和其它的分子生物學(xué)的試劑(Lipofectamin2000)購自Invitrogen.NheI購自Amersham-Pharmacia(Uppsala，Sweden)，而質(zhì)粒純化試劑盒購自Qiagen，Hilden，Germany。擴(kuò)展的高保真PCR系統(tǒng)(目錄號1732641)購自Roche，Mannheim，Germany。
b)方法i)pcDNA3.1hCD5.6Ala7質(zhì)粒的IL-15/Fc插入通過NheI/ApaI消化而分離。質(zhì)粒首先通過ApaI限制酶消化而線性化，而且通過T4-聚合酶處理而使5’突出端平端化。然后通過隨后的NheI消化而分離IL-15/Fc插入片段。將該片段與用NheI和SmaI消化的pcl Neo連接。
ii)除去pcDNA3.1hCD5.6Ala7的CMV啟動子并用源自pMG的延伸的含有內(nèi)含子A的CMV啟動子取代該pMG質(zhì)粒用PacI切割并通過T4-聚合酶處理而使突出端平端化。第二次XbaI處理之后，獲得1.7kb的片段，其含有CMV啟動子+內(nèi)含子A，通過瓊脂糖凝膠電泳純化該片段。通過NheI和隨后的NruI的限制性內(nèi)切將CMV啟動子從pcDNA3.hCD5.6Ala7中除去。將獲得的片段在4℃與pMG-啟動子-內(nèi)含子過夜連接。
iii)通過PCR方法擴(kuò)增IVS8內(nèi)含子，并克隆到pcDNA3.1hCD5.6Ala7中的CMV啟動子的3’端和IL-15插入片段之間。通過NheI限制內(nèi)切酶消化而將質(zhì)粒線性化，然后用來自牛小腸的堿性磷酸酶處理。通過PCR擴(kuò)增內(nèi)含子，使用含有XbaI限制內(nèi)切酶剪切位點(diǎn)的引物，并使用擴(kuò)展的高保真PCR系統(tǒng)在下述條件下擴(kuò)增使用的反應(yīng)混合物含有2μl dNTPs(Qiagen，Taq core kit，2mmol/每個(gè))，25pmol引物，5μl 10x緩沖液，0.75μl高保真Taq聚合酶，1μl(大約15ng)pSwitch-XhoI/EcoRV片段，并用水補(bǔ)足終體積為50μl。PCR程序如下(25個(gè)循環(huán))95℃5min，94℃15s，55℃30s，72℃30s，72℃5min。使用XbaI剪切PCR產(chǎn)物，從0.8％-瓊脂糖凝膠上洗脫，并與線性化的質(zhì)粒連接。將獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli XL10 Gold中，并用小量分析法分析獲得的質(zhì)粒。顯示合適的限制內(nèi)切酶圖譜的每個(gè)質(zhì)粒的一個(gè)克隆被用于隨后的沒有內(nèi)毒素的質(zhì)粒制備。
在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK-293或CHO-K1細(xì)胞后分析IL-15/Fc的表達(dá)。轉(zhuǎn)染前一天，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞一式兩份的接種于6孔組織培養(yǎng)盤中。根據(jù)Felgner等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，847413-7417；1987)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使用分別稀釋在250μl Optimem1培養(yǎng)基中的2μg質(zhì)粒和4μl Lipofectamin2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染?；旌蟽蓚€(gè)溶液，在室溫孵育30分鐘后，將混合液滴加到細(xì)胞培養(yǎng)盤的細(xì)胞培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染2天后，除去培養(yǎng)基并通過針對IL-15/Fc的Fc部分的ELISA方法分析其IL-15/Fc含量。
c)結(jié)果轉(zhuǎn)染有不同表達(dá)構(gòu)建體的HEK-293細(xì)胞的IL-15/Fc的分泌幾乎不受其它載體組分的影響。相反，由CHO-K1細(xì)胞表達(dá)的IL-15/Fc在將內(nèi)含子插入IL-15/Fc構(gòu)建體之后，以200-300的系數(shù)增加。原始構(gòu)建體pcDNA3.1hCD5.6Ala7獲得的分泌蛋白水平很難被檢測到(低于10ng/ml)，當(dāng)用pMG10Ala7轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，插入的內(nèi)含子則導(dǎo)致IL-15/Fc的水平大約為300ng/ml(圖4-6；SEQ ID No.2)。顯示IL-15/Fc在CHO-K1細(xì)胞中的表達(dá)水平的ELISA數(shù)據(jù)在圖4中描述。由于在轉(zhuǎn)染pMG構(gòu)建體之后的表達(dá)水平是最高的，選用后者制備穩(wěn)定的CHO-K1表達(dá)細(xì)胞系。
最后，第一次對質(zhì)粒進(jìn)行單鏈測序。構(gòu)建體中的兩條鏈均在含有IL-15/Fc盒、新插入的CMV啟動子和內(nèi)含子片段的區(qū)域被測序。含有IL-15/Fc盒的質(zhì)粒在CMV啟動子的調(diào)控下。源自CMV(質(zhì)粒MG)的內(nèi)含子A位于啟動子和翻譯起始之間。質(zhì)粒含有位于IL-15/Fc片段下游的BGHpolyA位點(diǎn)；新霉素抗性基因由SV40啟動子調(diào)控并且含有SV40 polyA位點(diǎn)。質(zhì)粒含有用于在E.coli中選擇和增殖的氨芐青霉素抗性基因。
d)討論和結(jié)論為了增加穩(wěn)定的CHO-K1-IL-15/Fc轉(zhuǎn)染體的蛋白產(chǎn)量，通過在啟動子和IL-15/Fc盒之間插入內(nèi)含子來修飾質(zhì)粒。重組的內(nèi)含子-轉(zhuǎn)基因-宿主細(xì)胞大大影響了蛋白表達(dá)，并且因此不可能預(yù)測內(nèi)含子對在兩種分析的細(xì)胞類型中增加IL-15/Fc表達(dá)最有效。
然而，通過插入內(nèi)含子很難影響HEK-293細(xì)胞，大量增加的IL-15/Fc分泌在CHO-K1細(xì)胞中檢測到。相比較于原始的IL-15/Fc表達(dá)載體，使用含有CMV啟動子和來源于pMG的內(nèi)含子A的質(zhì)粒的CHO-K1細(xì)胞中的IL-15/Fc蛋白的表達(dá)增加了多于一個(gè)數(shù)量級。該質(zhì)?？梢杂糜谥苽渖a(chǎn)IL-15/Fc的細(xì)胞系，該細(xì)胞系可以用于制備用于臨床前和臨床研究中的IL-15/Fc，或用于工業(yè)生產(chǎn)的IL-15/Fc。
序列表序列表<110>豪夫邁-羅氏公司<120>用于制備IL-15/Fc融合蛋白的表達(dá)系統(tǒng)及其用途<130>C62387PC<150>04008881.7<151>2004-04-14<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>6458<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>質(zhì)粒pcDNA3.1hCD5.6Ala7<400>1gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg60ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg120cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc180ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt240gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata300tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc360cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc420attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt480atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt540atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca600tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg660actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc720aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg780gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca840
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<223>質(zhì)粒pMG10Ala7<400>2gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg60ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg120cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc180ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgta agctgcaata aacaatcatt attttcattg240gatctgtgtg ttggtttttt gtgtgggctt gggggagggg gaggccagaa tgactccaag300agctacagga aggcaggtca gagaccccac tggacaaaca gtggctggac tctgcaccat360aacacacaat caacagggga gtgagctgga tcgagctaga gtccgttaca taacttacgg420taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt480atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac540ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg600acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact660ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt720ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc780ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc840gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata900taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg960acctccatag aagacaccgg gaccgatcca gcctccgcgg ccgggaacgg tgcattggaa1020cgcggattcc ccgtgccaag agtgacgtaa gtaccgccta tagagtctat aggcccaccc1080ccttggcttc ttatgcatgc tatactgttt ttggcttggg gtctatacac ccccgcttcc1140tcatgttata ggtgatggta tagcttagcc tataggtgtg ggttattgac cattattgac1200
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<223>具有CD5引導(dǎo)子的突變的IL-15/Fc DNA<400>3atgcccatgg ggtctctgca accgctggcc accttgtacc tgctggggat gctggtcgct60tcctgcctcg gaaactgggt gaatgtaata agtgatttga aaaaaattga agatcttatt120caatctatgc atattgatgc tactttatat acggaaagtg atgttcaccc cagttgcaaa180gtaacagcaa tgaagtgctt tctcttggag ttacaagtta tttcacttga gtccggagat240gcaagtattc atgatacagt agaaaatctg atcatcctag caaacaacag tttgtcttct300aatgggaatg taacagaatc tggatgcaaa gaatgtgagg aactggagga aaaaaatatt360aaagaatttt tggacagttt tgtacatatt gtcgacatgt tcatcaacac ttcggatccc420aaatctgctg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga480ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct540
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg600tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac660agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag720gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc780aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag840ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc900gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg960ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg1020cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg1080cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1113<210>4<211>370<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有CD5引導(dǎo)子的人CRB-15的氨基酸序列<400>4Met Pro Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly1 5 10 15Met Leu Val Ala Ser Cys Leu Gly Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp20 25 30Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr35 40 45Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met50 55 60Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp65 70 75 80Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn85 90 95
Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys100 105 110Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Asp Ser Phe Val115 120 125His Ile Val Asp Met Phe Ile Asn Thr Ser Asp Pro Lys Ser Ala Asp130 135 140Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly145 150 155 160Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile165 170 175Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu180 185 190Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His195 200 205Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg210 215 220Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys225 230 235 240Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu245 250 255Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr260 265 270Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu275 280 285Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp290 295 300Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val305 310 315 320Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp325 330 335Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
340 345 350Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro355 360 365Gly Lys370<210>5<211>371<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有CD15引導(dǎo)子的鼠IL-15/Fc的氨基酸序列(人突變的IL-15，鼠IgG2A)<400>5Met Pro Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly1 5 10 15Met Leu Val Ala Ser Cys Leu Gly Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp20 25 30Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr35 40 45Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met50 55 60Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp65 70 75 80Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn85 90 95Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys100 105 110Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Asp Ser Phe Val115 120 125His Ile Val Asp Met Phe Ile Asn Thr Ser Asp Pro Arg Gly Pro Thr
130 135 140Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly145 150 155 160Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met165 170 175Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu180 185 190Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val195 200 205His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu210 215 220Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly225 230 235 240Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile245 250 255Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val260 265 270Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr275 280 285Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu290 295 300Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro305 310 315 320Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val325 330 335Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val340 345 350His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr355 360 365Pro Gly Lys370
權(quán)利要求
1.含有一個(gè)或多個(gè)核酸的表達(dá)系統(tǒng)，其包括a)至少一個(gè)編碼IL-15/Fc融合蛋白的核酸，b)至少一個(gè)啟動子，c)至少一個(gè)編碼CD5引導(dǎo)子的核酸，該啟動子和該編碼CD5引導(dǎo)子的核酸被功能性的連接到編碼該IL-15/Fc融合蛋白的核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中該啟動子是CMV啟動子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中該啟動子是轉(zhuǎn)錄調(diào)控單位的一部分，該轉(zhuǎn)錄調(diào)控單位還包括內(nèi)含子，特別是內(nèi)含子A。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任何一項(xiàng)所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中該融合蛋白的Fc部分是免疫球蛋白G的Fc片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任何一項(xiàng)所述的表達(dá)系統(tǒng)，另外還包括d)至少一個(gè)編碼選擇標(biāo)記基因的核酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任何一項(xiàng)所述的表達(dá)系統(tǒng)，另外還包括至少一個(gè)多聚腺苷酸信號的核酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任何一項(xiàng)所述的表達(dá)系統(tǒng)，另外還包括核糖體、氨基酸和/或tRNAs。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任何一項(xiàng)所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中僅包括一個(gè)核酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8任何一項(xiàng)所述的表達(dá)系統(tǒng)，其含有具有SEQ ID No.1，SEQ ID No.2或SEQ ID No.3的序列的核酸或編碼SEQID No.4或SEQ ID No.5的多肽的核酸。
10.一種核酸，其包括權(quán)利要求1至4所述的組分a)到c)以及可選擇的包括權(quán)利要求5的組分d)。
11.一種核酸，其包括SEQ ID No.1，SEQ ID No.2或SEQ IDNo.3的序列，或者編碼SEQ ID No.4或SEQ ID No.5的多肽的核酸。
12.一種宿主細(xì)胞，其含有根據(jù)權(quán)利要求1至9任何一項(xiàng)所述的表達(dá)系統(tǒng)或者根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的核酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的宿主細(xì)胞，其是哺乳動物細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的宿主細(xì)胞，其是CHO細(xì)胞系或其衍生物，特別是CHO-K1細(xì)胞系的細(xì)胞。
15.一種制備IL-15/Fc融合蛋白的方法，其包括a.提供根據(jù)權(quán)利要求12至14任何一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，b.培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，c.選擇，如果需要并d.分離表達(dá)的IL-15/Fc融合蛋白。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中該宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選CHO細(xì)胞系或其衍生物的細(xì)胞，特別優(yōu)選CHO-K1細(xì)胞系的細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其中制備的IL-15/Fc融合蛋白的量至少為10pg/(細(xì)胞x天)，優(yōu)選的量為至少15pg/(細(xì)胞x天)。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至9任何一項(xiàng)所述的表達(dá)系統(tǒng)、根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的核酸、或根據(jù)權(quán)利要求12至14任何一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞在制備IL-15-Fc融合蛋白中的用途。
19.CD5引導(dǎo)子在CHO細(xì)胞及其衍生物，特別是在CHO-K1細(xì)胞中表達(dá)蛋白的用途。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的用途，其中該蛋白的表達(dá)受CMV啟動子的調(diào)控，特別是與內(nèi)含子A聯(lián)合的CMV啟動子的調(diào)控。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有一個(gè)或多個(gè)核酸的表達(dá)系統(tǒng)，其包括至少一個(gè)編碼白細(xì)胞介素15/Fc(IL－15/Fc)融合蛋白的核酸，至少一個(gè)啟動子，至少一個(gè)編碼CD5引導(dǎo)子的核酸，如果需要，至少一個(gè)編碼選擇標(biāo)記基因的核酸；本發(fā)明涉及包括所述表達(dá)系統(tǒng)的組分的核酸，并且涉及含有該表達(dá)系統(tǒng)或該核酸的宿主細(xì)胞。而且，本發(fā)明涉及使用該表達(dá)系統(tǒng)制備IL－15/Fc融合蛋白的方法，并涉及該表達(dá)系統(tǒng)、該核酸、該宿主細(xì)胞或用于在宿主細(xì)胞表達(dá)CD5引導(dǎo)子的用途。
文檔編號C12N15/62GK1942481SQ200580011056
公開日2007年4月4日 申請日期2005年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月14日
發(fā)明者A·埃爾曼, I·德勒埃, T·莫爾, S·扎恩 申請人:豪夫邁－羅氏公司