專(zhuān)利名稱(chēng)：脂族二腈到氰基羧酸的立體選擇性生物轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于將經(jīng)選擇的脂族二腈區(qū)域選擇和立體選擇性轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的氰基羧酸的新型生物催化方法。更具體地，本發(fā)明提供了將2-異丁基-丁二腈轉(zhuǎn)化成(S)-3-氰基-5-甲基己酸的方法，該(S)-3-氰基-5-甲基己酸在(S)-3-(氨基甲基)-5-甲基己酸(pregabalin)的合成中是有用的中間體。Pregabalin可用于治療某些大腦疾病，例如，治療和預(yù)防癲癇、疼痛和精神病。因?yàn)閜regabalin對(duì)改善大腦功能有效，因此，它也可用在老年病患者的治療中。
背景技術(shù)：
將有機(jī)腈酶水解成相應(yīng)的羧酸和酰胺對(duì)多種有用化合物提供了一種重要的可替換合成方法。傳統(tǒng)的腈到相應(yīng)的羧酸和酰胺的化學(xué)水解通常使用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿催化劑在高反應(yīng)溫度下實(shí)施，這使該合成與包含敏感官能團(tuán)的化合物無(wú)法相容。而且，化學(xué)水解的差選擇性可以導(dǎo)致不令人希望的副產(chǎn)物以及大量無(wú)機(jī)鹽。與此相反，在溫和條件下(中性pH，30℃)進(jìn)行的酶腈水解為高度化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性和立體選擇性提供了可能。作為附加的優(yōu)點(diǎn)，避免了副產(chǎn)物無(wú)機(jī)鹽的形成。
腈轉(zhuǎn)化酶最著名的工業(yè)應(yīng)用是利用得自紫紅紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)J1的腈水合酶制備丙烯酰胺(T.Nagasawa等，Tibtech.，1992，vol.10，402-408)和煙酰胺(T.Nagasawa等，Appl.Environ.Microbiol.，1998，vol 54，1766-1769)。近來(lái)一些綜述(L.Marinková等，CurrentOrganic Chemistry，2003，vol.7，1279-1295和D.Cowan等，Extremophiles，1998，vol.2，207-216)描述了腈轉(zhuǎn)化酶的生物化學(xué)應(yīng)用和潛在的工業(yè)應(yīng)用。
酶腈水解通過(guò)腈水解酶(將腈轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的羧酸)和腈水合酶(將腈轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的酰胺)進(jìn)行催化。酰胺酶(將酰胺水解成相應(yīng)的羧酸)可以與腈水合酶組合使用以將腈轉(zhuǎn)化成羧酸。
WO 02/072856中公開(kāi)了腈水解酶用于由腈制備相應(yīng)的羧酸的用途。將酶結(jié)合到交聯(lián)的聚合物基質(zhì)中提供了具有改進(jìn)的物理和生物化學(xué)完整性的催化劑。
U.S.專(zhuān)利5,814,508公開(kāi)了采用生物催化劑由脂族∝、ω-二腈到ω-腈羧酸的區(qū)域選擇性制備方法。例如，具有腈水解酶活性的催化劑用于將2-甲基戊二腈轉(zhuǎn)化成4-氰基戊酸。
K.Yamamoto等的J.Ferment.Bioengineering，1992，vol.73，125-129描述了具有腈水合酶活性和酰胺酶活性的微生物細(xì)胞將反式-1，4-二氰基環(huán)己烷轉(zhuǎn)化成反式-4-氰基環(huán)己烷羧酸的用途。
對(duì)于一系列脂族α，ω-二腈化合物，已經(jīng)報(bào)道了利用具有脂族腈水解酶活性或具有腈水合酶和酰胺酶活性組合的微生物細(xì)胞，將二腈區(qū)域選擇性生物催化轉(zhuǎn)化成經(jīng)氰基取代的羧酸的方法(J.E.Gavagan等J.Org.Chem.，1998，vol.63，4792-4801)。
已經(jīng)描述了腈的立體選擇酶轉(zhuǎn)化用于制備富集一種對(duì)映異構(gòu)體的手性羧酸和酰胺(M Wieser等，Chapter in Stereoselective Biocatalysis，MarcelDekker Inc.New York，2000，461-486)。得自糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)ATCC 8750的立體選擇性腈水解酶用于由外消旋扁桃腈制備(R)-扁桃酸(K.Yamamoto等，Appl.Environ.Microbiol.，1991，vol.57，3028-3032)。得自紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)NCIMB 11216的腈水解酶優(yōu)先水解2-甲基己腈外消旋混合物中的(+)-2-甲基己腈，留下未反應(yīng)的(-)-2-甲基己腈(M.Gradley等，Biotechnology Lett.，1994，vol.16，41-46)。U.S.專(zhuān)利5,593,871公開(kāi)了利用包含立體選擇性腈水合酶的微生物由腈制備富集一種對(duì)映異構(gòu)體的2-烷酸酰胺的方法。對(duì)映異構(gòu)純的α-氨基酸和酰胺，利用包含立體選擇性腈水合酶和立體選擇酰胺酶的紅球菌屬(Rhodococcus sp)AJ270，由外消旋經(jīng)α-芳基取代的和經(jīng)α-烷基取代的甘氨酸腈制備(M.-C.Wang等，J.Org.Chem.，2002，vol.67，6542)。上述參考文獻(xiàn)全文插入此處。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)外消旋pregabalin的治療價(jià)值(具體的是作為抗痙攣藥物的療效)主要?dú)w因于(S)-對(duì)映異構(gòu)體。為了達(dá)到提供劃算的pregabalin藥品治療的目的，已經(jīng)研究了大量合成富集(S)-對(duì)映異構(gòu)體化合物的路線。例如，將適當(dāng)?shù)慕?jīng)氰基取代的烯烴不對(duì)稱(chēng)氫化，接著將氰基還原成相應(yīng)的酰胺，這提供了一種基本上富集(S)-對(duì)映異構(gòu)體的pregabalin(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)2003/0212290)。
美國(guó)專(zhuān)利6,642,398，6,635,673和6,046,353公開(kāi)了通過(guò)純化學(xué)方法合成pregabalin、其衍生物和類(lèi)似物的方法。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明的方法中，將脂族二腈區(qū)域和立體選擇生物催化轉(zhuǎn)化成氰基羧酸的方法利用具有腈水解酶活性的酶催化劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明涉及用于制備式I化合物的(S)-對(duì)映異構(gòu)體的新方法 其中，C3具有(S)構(gòu)型；R1是氫、(C1-C6)烷基或苯基；和R2是(C1-C8)烷基、(C2-C8)鏈烯基、(C3-C8)環(huán)烷基、-O(C1-C6)烷基、-CH2-CH2-O-(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基-OH、-苯基-(C1-C6)烷基-OH、-苯基-O-(C1-C6)烷基、苯基或經(jīng)取代的苯基；條件是，當(dāng)R2是甲基時(shí)，R1是氫、(C1-C6)烷基或苯基，所述方法包括如下步驟(1a)將式II化合物與具有腈水解酶活性的酶催化劑在反應(yīng)介質(zhì)中接觸；
(1b)從反應(yīng)介質(zhì)回收式I化合物的(S)-異構(gòu)體；并且，任選地，回收未變化的化合物II的(R)-異構(gòu)體。
式I化合物可用于合成具有藥學(xué)活性的化合物(例如，pregabalin)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，R1和R2獨(dú)立的是C1-C3烷基。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，式II化合物是包括3R和3S異構(gòu)體的外消旋混合物。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式是如下方法，其中，外消旋2-異丁基丁二腈(式II化合物，其中，R1是H，R2是甲基)被轉(zhuǎn)化成(S)-3-氰基-5-甲基己酸(式I化合物，其中，R1是H，R2是甲基)，該方法包括以下步驟(2a)將外消旋的2-異丁基-丁二腈與具有腈水解酶活性的酶催化劑在反應(yīng)介質(zhì)中接觸；并(2b)從水性混合物回收(S)-3-氰基-5-甲基己酸；并且，任選地，回收未變化的(R)-2-異丁基丁二腈。
優(yōu)選地，反應(yīng)介質(zhì)是水性介質(zhì)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，將回收的和未變化的化合物II的(R)-異構(gòu)體隨后通過(guò)與弱堿在有機(jī)溶劑的存在下進(jìn)行加熱外消旋化。優(yōu)選的堿是1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0.]十一碳-7-烯，優(yōu)選的溶劑是甲苯。任選地，所得的II的外消旋物可以回收到以上所記載的方法的步驟(1a)中或回收到(2a)中。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，酶催化劑為完整微生物細(xì)胞、微生物細(xì)胞萃取物、部分純化的酶、純化酶或固定在載體上的酶催化劑的形式。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，酶催化劑是部分純化的酶。部分純化的酶的實(shí)例包括，但不限于，NIT-101、NIT-102、NIT-103(BioCatalyticsInc.，Pasadena，CA)和得自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的腈水解酶(Jülich Fine Chemicals，Jülich，Germany)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，腈水解酶催化劑固定在載體上。被固定的腈水解酶催化劑的實(shí)例包括，但不限于，NIT-102 C2(BioCatalics Inc.，Pasadena，CA)、固定在Eupergit上的NIT-102(Rhm GmbH & Co.KG，Darmstadt，Germany)和固定在Eupergit上得自擬南芥的腈水解酶。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，被固定的腈水解酶催化劑是NIT-102 C2。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，反應(yīng)介質(zhì)由蒸餾水或緩沖水組成。優(yōu)選地，緩沖水被緩沖到約5.0-約10.0的pH范圍，最優(yōu)選地，被緩沖到約6.0-約8.0的pH范圍。
本發(fā)明還涉及用于制備(S)-3-(氨基甲基)-5-甲基己酸(pregabalin)的方法，所述方法包括如下步驟a)將外消旋2-異丁基-丁二腈與具有腈水解酶活性的酶催化劑在反應(yīng)介質(zhì)中接觸；(b)從所述反應(yīng)介質(zhì)回收(S)-3-氰基-5-甲基己酸；(c)將(S)-3-氰基-5-甲基己酸轉(zhuǎn)化成酸鹽；和(d)將所述酸鹽氫化以形成(S)-3-(氨基甲基)-5-甲基己酸(pregabalin)。
優(yōu)選地，酸鹽具有下式 其中，M是Na、K、Li、NH4、NH2R6R7、NH3R1或NH(R6)2R7，其中，R6和R7各自獨(dú)立的是(C1-C6)烷基。
為了方便，此處集合了在本說(shuō)明書(shū)、實(shí)施例和所附權(quán)利要求書(shū)中所用的某些術(shù)語(yǔ)。除非另有聲明，此處所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常的理解相同的意義。
術(shù)語(yǔ)“烷基”，是1-8個(gè)碳原子的直鏈或支化基團(tuán)，包括，但不限于，甲基、乙基、丙基、丁基、異丁基和叔丁基。
此處所用術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”，包括得自含3-7個(gè)環(huán)碳原子的環(huán)烴的部分，包括，被直鏈或支化烷基取代的環(huán)烴部分。
此處所用術(shù)語(yǔ)“烷氧基”，意指“烷基-O-”，其中，“烷基”如上定義。
術(shù)語(yǔ)“鏈烯基”，指包括直鏈或支化構(gòu)型的烴鏈，該鏈包括一個(gè)或更多個(gè)可以存在于鏈的任何穩(wěn)定點(diǎn)中的碳碳雙鍵，例如，乙烯基和丙烯基。鏈烯基通常具有2-約12個(gè)碳原子，更典型的是具有2-約8個(gè)碳原子。
此處所用術(shù)語(yǔ)外消旋物，意指一對(duì)對(duì)映異構(gòu)體的等摩爾混合物。當(dāng)合成導(dǎo)致立體中心產(chǎn)生時(shí)，通常形成外消旋物。此處所用術(shù)語(yǔ)外消旋混合物，意指外消旋物。
此處所用術(shù)語(yǔ)對(duì)映異構(gòu)體，指在分子水平上與鏡像不能重合的化合物。對(duì)映異構(gòu)體可以存在(R)或(S)構(gòu)型。
此處所用術(shù)語(yǔ)立體選擇性合成，指由兩種或更多種可能的立體異構(gòu)體形成單一立體異構(gòu)體或?qū)τ钞悩?gòu)體富集的異構(gòu)體混合物的化學(xué)反應(yīng)。
此處所用術(shù)語(yǔ)區(qū)域選擇性，指在兩個(gè)或更多個(gè)可能的原子或原子團(tuán)之中的單一原子或原子團(tuán)上發(fā)生的反應(yīng)。二腈的區(qū)域選擇性水解導(dǎo)致單一腈基轉(zhuǎn)化成羧基。
“℃”意指攝氏度。
此處所用術(shù)語(yǔ)“酶催化劑”，意指其特征為具有腈水解酶活性或腈水合酶活性和酰胺酶活性組合的催化劑。催化劑可以為完整微生物細(xì)胞、透性化微生物細(xì)胞、微生物細(xì)胞萃取物的一種或更多種細(xì)胞組分、部分純化的酶或純化酶的形式。
此處所用術(shù)語(yǔ)對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量，指在對(duì)映異構(gòu)體混合物中主要對(duì)映異構(gòu)體的摩爾分?jǐn)?shù)(以百分率表示)。
術(shù)語(yǔ)“水性反應(yīng)混合物”，意指底物和酶催化劑在大量水介質(zhì)中的混合物。
術(shù)語(yǔ)“腈水解酶活性”，意指將腈基轉(zhuǎn)化到羧酸基的酶活性。
此處所用術(shù)語(yǔ)“腈水合酶活性”，意指將腈基轉(zhuǎn)化到酰胺基的酶活性。
術(shù)語(yǔ)“酰胺酶活性”，意指將酰胺基轉(zhuǎn)化到羧酸基的酶活性。
ATCC是坐落于10801 University Boulevard，Manassas，Va.，20110-2209，U.S.A的American Type Culture Collection。BioCatalytics Inc.坐落于129 N.Hill Avenue，Suite 103，Pasadena，CA，91106，U.S.A。Jülich Fine ChemicalsGmbH坐落于Rudolf-Schulten-Straβe 5，D-52428 Jülich，Germany。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供了由式II的二腈制備式I的脂族氰基羧酸的酶催化方法。通常用在本領(lǐng)域中的任意合適的方法可以用于制備二腈(II)原料。
示意

圖1指本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，其中，化學(xué)酶方法用于將2-異丁基-丁二腈(V)轉(zhuǎn)化成(S)-3-氰基-5-甲基己酸(VI)。如示意圖2所示，化合物VI在pregabalin(VII)的合成中可用作中間體。示意圖1的步驟3描述了副產(chǎn)物(R)-異構(gòu)體(Va)的外消旋化并隨后回收到步驟2中。
在示意圖1的步驟1中，外消旋2-異丁基-丁二腈(V)由如下過(guò)程形成將異戊醛(III)與氰基乙酸乙酯(IV)縮合，接著添加KCN。外消旋物由在V的C3碳原子上產(chǎn)生的立體中心而產(chǎn)生。
示意圖1的步驟2描述了二腈V外消旋物的區(qū)域和立體選擇性水解，該步驟得到了(S)-3-氰基-5-甲基己酸(VI)和未變化的V的(R)-異構(gòu)體。
2-異丁基-丁二腈(V)到(S)-3-氰基-5-甲基己酸(VI)的經(jīng)腈水解酶催化的水解是區(qū)域選擇性的和立體選擇性的。區(qū)域選擇性是基于氰基到羧基的轉(zhuǎn)化僅在C1碳原子上。該反應(yīng)是立體選擇性的，是因?yàn)檗D(zhuǎn)化主要涉及V的(S)-對(duì)映異構(gòu)體，而留下基本上未變化的(R)-對(duì)映異構(gòu)體。
如示意圖2所示，將S-氰基酸(VI)的酸鹽VIa在隨后的步驟中氫化以得到(S)-3-(氨基甲基)-5-甲基己酸(pregabalin)。該反應(yīng)在氫化催化劑的存在下實(shí)施，優(yōu)選的是Raney鎳。可接受的酸鹽包括式VIa化合物，其中，M是Na、K、Li、NH4、NH2R6R7、NH3R6或NH(R6)2R7，其中，R6和R7獨(dú)立的是(C1-C6)烷基。
示意圖1 示意圖2 如示意圖I所示，在外消旋物V到(S)-氰基酸VI的區(qū)域和立體選擇轉(zhuǎn)化中，腈水解酶主要與(S)對(duì)映異構(gòu)體反應(yīng)。因此，隨著轉(zhuǎn)化進(jìn)行，反應(yīng)混合物逐漸富集(R)對(duì)映異構(gòu)體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于通過(guò)回收或重復(fù)使用未變化的(R)-二腈Va來(lái)避免經(jīng)濟(jì)上浪費(fèi)。因此，本發(fā)明提供了一種用于外消旋化(R)-二腈(步驟3，示意圖1)和隨后通過(guò)示意圖1的步驟2回收的方法。
本發(fā)明具有腈水解酶活性或具有腈水合酶和酰胺酶活性組合的各種酶可以通過(guò)篩選方案(例如，富集分離技術(shù))找到，該技術(shù)首先根據(jù)微生物在含富集腈的介質(zhì)中的生長(zhǎng)能力來(lái)對(duì)其進(jìn)行選擇。富集分離技術(shù)通常包括使用補(bǔ)充有富集腈的碳受限或氮受限介質(zhì)，該富集腈可以是希望生物轉(zhuǎn)化的腈底物或結(jié)構(gòu)上類(lèi)似的腈化合物。可以首先根據(jù)具有腈水解酶活性的微生物在含富集腈的介質(zhì)中的生長(zhǎng)能力對(duì)其進(jìn)行選擇。Gavagan等(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)vol.52，654-659)使用富集技術(shù)，從土壤中，利用2-乙基丁二腈作為唯一氮源分離了革蘭陰性桿菌敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)72W(ATCC 55746)。敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)被顯示可用于2-甲基戊二腈到4-羥基戊酸的選擇性轉(zhuǎn)化。富集技術(shù)還可用于分離嗜熱細(xì)菌Bacillus pallidus Dac521，該細(xì)菌催化3-羥基吡啶到煙酸的轉(zhuǎn)化(Almatawah和Cowan，Enzyme Microb.Technol.(1999)vol.25，718-724)。通過(guò)將微生物細(xì)胞的懸浮液與腈化合物接觸并利用分析方法(例如，高效液相色譜、氣液相色譜或液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LCMS))測(cè)試相應(yīng)羧酸的存在，可以測(cè)試通過(guò)富集技術(shù)分離的微生物的腈水解活性。US專(zhuān)利5,814,508報(bào)道了用于測(cè)試敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解活性的技術(shù)。
一旦已經(jīng)分離了具有腈水解酶活性或具有腈水合酶和酰胺酶活性的微生物，就可以采用酶工程改進(jìn)酶的各個(gè)方面。這些改進(jìn)可用于本發(fā)明，包括增加酶的選擇性、催化效率，對(duì)更高溫度和更寬的pH范圍的穩(wěn)定性和使酶能在反應(yīng)介質(zhì)(包括水緩沖液和有機(jī)溶劑的混合物)中進(jìn)行操作。
可以用在本發(fā)明中以生產(chǎn)酶催化劑(除了具有改進(jìn)的適于特定生物轉(zhuǎn)化工藝的產(chǎn)率、生產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量以外，還具有腈水解酶活性或腈水合酶和酰胺酶活性)的各種技術(shù)包括，但不限于，酶工程技術(shù)(例如，合理設(shè)計(jì)方法，該方法包括定點(diǎn)突變和利用無(wú)規(guī)突變的或DNA改組技術(shù)的定向進(jìn)化技術(shù))。
用于式II化合物到式I化合物的轉(zhuǎn)化的合適酶催化劑為完整微生物細(xì)胞、透性化微生物細(xì)胞、微生物細(xì)胞萃取物、部分純化的酶、純化酶的形式，并且這些催化劑可以固定在載體上。
這個(gè)方法可以在單相中通過(guò)將2-異丁基-丁二腈與酶催化劑在蒸餾水或在緩沖水溶液中接觸來(lái)實(shí)施，該緩沖水溶液將保持反應(yīng)的初始pH為5.0-10.0，優(yōu)選為6.0-8.0。合適的緩沖試劑包括磷酸鈉和乙酸鈣。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)混合物的pH可以由于二腈的相應(yīng)腈官能團(tuán)形成羧酸的銨鹽而變化。進(jìn)行該反應(yīng)可以不需采用pH控制，或者合適的酸或堿可以在反應(yīng)過(guò)程中加入以維持所希望的pH。然而，如上述，可以采用各種技術(shù)(例如，酶工程和定向進(jìn)化技術(shù))生產(chǎn)酶催化劑，該酶催化劑將在更寬的pH范圍內(nèi)有效操作。
這個(gè)方法可以在由兩相組成的反應(yīng)混合物中實(shí)施水相(開(kāi)始包含酶和被溶解的2-異丁基-丁二腈)和有機(jī)相(主要由外消旋2-異丁基-丁二腈組成)。該兩相反應(yīng)混合物通過(guò)如下步驟制備將2-異丁基-丁二腈加到酶和緩沖試劑的水性溶液中，使得所添加的2-異丁基-丁二腈的量超過(guò)水溶解度極限。在50mM磷酸鉀(30℃，pH 7.5)中2-異丁基-丁二腈的水溶解度極限為約0.06M。在反應(yīng)過(guò)程中，(S)-3-氰基-5-甲基己酸銨鹽形成，并且在水相中的濃度增加，同時(shí)有機(jī)相的體積減小并富集(R)-2-異丁基-丁二腈?？商鎿Q地，這個(gè)方法還可以在由三相組成的反應(yīng)混合物中實(shí)施水相(開(kāi)始包含溶解的2-異丁基-丁二腈)、有機(jī)相(主要由外消旋2-異丁基-丁二腈組成)和固相(由固定在不溶載體上的酶組成)。除了用固定在不溶載體上的酶替代非固定酶以外，三相反應(yīng)混合物通過(guò)對(duì)于兩相反應(yīng)混合物所描述的過(guò)程來(lái)制備。
任選地，酶可以固定在聚合物基質(zhì)上或在不溶載體上。被固定的酶催化劑可以重復(fù)使用和在連續(xù)工藝中使用，并可以比未固定酶催化劑更易于從酶工藝的產(chǎn)品中分離。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知在聚合物基質(zhì)(例如，褐藻酸鈣或聚丙烯酰銨)或在不溶載體(硅藻土)上固定酶的方法。固定在不溶載體上的腈水解酶NIT-102 C2(BioCatalytics Inc.，Pasadena，CA)特別可用于II到III的轉(zhuǎn)化，因?yàn)樗梢栽陂g歇或連續(xù)工藝中重復(fù)使用。選擇用在反應(yīng)中的NIT-102 C2的濃度以得到所希望的反應(yīng)速率，并且該濃度依賴(lài)于催化劑的具體活性和底物的濃度。通常，所用的NIT-102 C2為0.001g-0.3g濕重/mL反應(yīng)體積，優(yōu)選的是0.01-0.15g濕重/mL反應(yīng)體積。
另外，由微生物細(xì)胞制備并被命名為NIT-101、NIT-102、NIT-103(BioCatalytics Inc.，Pasadena，CA)和得自擬南芥的腈水解酶(Jülich FineChemicals，Jülich，Germany)的數(shù)種經(jīng)凍干的溶胞產(chǎn)物也可用于II到III的轉(zhuǎn)化。將NIT-101、NIT-102、NIT-103和A.thaliana腈水解酶與I在水性反應(yīng)混合物中接觸形成II。利用NIT-101、NIT-102、NIT-103和得自擬南芥的腈水解酶的反應(yīng)可以在兩相反應(yīng)混合物中，采用0.001-0.04g干重/ml反應(yīng)體積，優(yōu)選0.002-0.02g干重/ml反應(yīng)體積的催化劑濃度來(lái)實(shí)施。
選擇水解反應(yīng)的溫度以最優(yōu)化反應(yīng)速率和酶催化劑活性的穩(wěn)定性。反應(yīng)溫度可以為僅高于懸浮液的凝固點(diǎn)(約0℃)-60℃，優(yōu)選的反應(yīng)溫度為5℃ to 35℃。
式I化合物的(3S)異構(gòu)體的回收和式II化合物的未變化的(3R)異構(gòu)體的回收可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的合適的分離、離析和純化技術(shù)實(shí)施。
在回收的優(yōu)選方法中，式II化合物的未變化(3R)異構(gòu)體通過(guò)采用有機(jī)溶劑(例如，乙酸乙酯)進(jìn)行萃取從堿性水性反應(yīng)混合物中分離。式I化合物的(3S)異構(gòu)體的酸鹽優(yōu)選溶于水層中，并接著通過(guò)酸化并采用有機(jī)溶劑(例如，乙酸乙酯)萃取而離析。
式I化合物可以用于合成諸如pregabalin的化合物，該化合物可用于治療如癲癇癥、痙攣、焦慮、疼痛和神經(jīng)退行性失調(diào)的失調(diào)癥，包括，Alzeimer氏癥、Huntington氏癥和Parkinson氏癥。
式I具體化合物的實(shí)例是如下化合物(S)-3-氰基-5-甲基-辛酸；(S)-3-氰基-5-甲基-庚酸；(S)-3-氰基-5-甲基-己酸；(S)-3-氰基-5-甲基-壬酸；(S)-3-氰基-5-乙氧基-己酸；(S)-3-氰基-5-環(huán)己基-己酸；和(S)-3-氰基-5-三氟甲基-己酸。
實(shí)施例1制備2-異丁基-丁二腈將氰基乙酸乙酯(733g，6.48mol)，異戊醛(613.9g，7.13mol)、哌啶(5.5g，0.065mol)和己烷(0.5L)的混合物回流連續(xù)除水。當(dāng)沒(méi)有另外的水被收集到時(shí)，將混合物冷卻并在真空下蒸餾以除去溶劑。將異丙醇(1L)加到剩余的油中，接著加入氰化鉀(422g，6.48mol)的水(2L)溶液。在添加氰化鉀溶液期間，將反應(yīng)混合物保持在35℃以下，然后在約35℃下保持4小時(shí)。將反應(yīng)混合物在大氣壓下蒸餾直到溫度達(dá)到95℃，然后在這個(gè)溫度下回流5小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻，用水(0.5L)稀釋并用1L甲基叔丁基醚(MTBE)萃取。將MTBE萃取液用水(0.5L)洗滌，用無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾并在真空下濃縮得到873.4g油狀2-異丁基-丁二腈。通過(guò)真空蒸餾(90℃，在0.275mm Hg下)可以得到2-異丁基-丁二腈的純化樣品。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ0.93-0.99(m，6H)，1.43-1.50(m，1H)，1.71-1.78(m，1H)，1.81-1.91(m，1H)，2.69(d，2H，J＝6.5Hz)，2.90-2.97(m，1H)。
實(shí)施例2采用NIT-101、NIT-102、NIT-103和擬南芥腈水解酶由2-異丁基-丁二腈制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸在三個(gè)8mL螺旋蓋的玻璃試管的每個(gè)中裝入2-異丁基-丁二腈(20mg)，1mL 50mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.5，2mM二硫蘇糖醇(DTT))和10mg選自NIT-101、NIT-102或NIT-103(Biocatalytics Inc.，Pasadena，CA)的腈水解酶。在一個(gè)8mL螺旋蓋的玻璃試管中裝入2-異丁基-丁二腈(20mg)和1mL擬南芥腈水解酶在50mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.8)(包含100mM乙二胺四乙酸(EDTA)和2mM DTT)中的溶液(Jülich FineChemicals，Jülich，Germany)。將四種反應(yīng)混合物在30℃下采用磁力攪拌棒攪拌15小時(shí)，然后各自采用乙酸乙酯(2×6mL)萃取。在除去乙酸乙酯萃取液后，將水性部分用4N HCl(0.15mL)進(jìn)行處理并用乙酸乙酯(3×6mL)萃取。將經(jīng)酸化的水性部分的乙酸乙酯萃取液在真空下濃縮得到7.8mg(34.2％產(chǎn)率)，8.8mg(38.6％產(chǎn)率)，8.1mg(35.5％產(chǎn)率)和4.0mg(17.5％產(chǎn)率)(S)-3-氰基-5-甲基己酸((S)-CMHA)(分別采用NIT-101、NIT-102、NIT-103和擬南芥(A.thaliana)腈水解酶進(jìn)行反應(yīng))。將由各個(gè)反應(yīng)得到的(S)-3-氰基-5-甲基己酸樣品采用過(guò)量的(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷進(jìn)行處理以得到它們的甲酯衍生物并通過(guò)氣相色譜(GC)在ChiraldexTMG-TA柱(30M×0.25mm ID，125微米膜厚)上分析以確定對(duì)映異構(gòu)體的純度。NIT-101、NIT-102、NIT-103和擬南芥腈水解酶反應(yīng)產(chǎn)物的對(duì)映異構(gòu)純度分別是96.3％，91.1％，95.5％和98.5％e.e.。(e.e.意指“對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量”)實(shí)施例3采用NIT-102由2-異丁基-丁二腈制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸在被維持在30℃的125mL加套的反應(yīng)器中裝入2-異丁基-丁二腈(3.33g)，NIT-102(0.5g)和122mL的包含5mM DTT和1mM EDTA的50mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.5)(反應(yīng)緩沖液)。在攪拌12.5h后，將產(chǎn)物混合物用乙酸乙酯(4×50mL)萃取。將乙酸乙酯萃取液除去并將水性部分用4M HCl調(diào)整到pH 2.5，并用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。將經(jīng)酸化的水性部分的乙酸乙酯萃取液合并，用無(wú)水MgSO4干燥，過(guò)濾并在真空下濃縮得到1.56g(S)-CMHA(41.1％)。將反應(yīng)產(chǎn)物的樣品采用(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷進(jìn)行處理并通過(guò)實(shí)施例2所描述的GC分析，得到98.5％e.e.的對(duì)映異構(gòu)純度。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ0.93-0.97(m，6H)，1.30-1.37(m，1H)，1.61-1.68(m，1H)，1.82-1.89(m，1H)，2.57-2.63(m，1H)，2.72-2.78(m，1H)，2.98-3.06(m，1H)。
實(shí)施例4采用NIT-102 C2由2-異丁基-丁二腈制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸鉀在兩個(gè)被維持在30℃的125mL加套的反應(yīng)器的每個(gè)中裝入2-異丁基-丁二腈(6.81g)，NIT-102 C2(1.70g)和118.2mL反應(yīng)緩沖液。在攪拌24h后，將產(chǎn)物混合物輕輕倒出，在反應(yīng)器中留下酶催化劑。將反應(yīng)緩沖液(20mL)加到每個(gè)反應(yīng)器中，攪拌約2分鐘，然后倒出并加到反應(yīng)混合物中。通過(guò)將2-異丁基-丁二腈(6.81g)和反應(yīng)緩沖液(118.2mL)加到每個(gè)反應(yīng)器中并將反應(yīng)混合物攪拌24小時(shí)來(lái)重復(fù)反應(yīng)。在各個(gè)容器中的四個(gè)反應(yīng)完成(總共八個(gè)間歇反應(yīng))后，將產(chǎn)物混合物合并，并用MTBE(3×500mL)萃取。將MTBE萃取液除去，并將水性部分用磷酸調(diào)節(jié)到pH 2.1，并用MTBE(2×500mL)萃取。將經(jīng)酸化的水性部分的MTBE萃取液在真空下濃縮得到油，將該油用水(100mL)和KOH(8.5g)進(jìn)行處理。將所得溶液在真空下濃縮得到24.2g(31.3％)(S)-3-氰基-5-甲基己酸鉀。(S)-3-氰基-5-甲基己酸甲酯由(S)-3-氰基-5-甲基己酸鉀制備，并通過(guò)手性GC分析得到99.1％e.e.的對(duì)映異構(gòu)純度。
1H NMR(D2O，400MHz)δ0.75-0.78(m，6H)，1.18-1.25(m，1H)，1.43-1.50(m，1H)，1.53-1.68(m，1H)，2.28-2.38(d，2H，J＝6.5Hz)，2.86-2.93(m，1H)。
實(shí)施例5采用NIT-102 C2在氮?dú)夥障掠?-異丁基-丁二腈制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸在被維持在30℃的125mL加套的反應(yīng)器中裝入2-異丁基-丁二腈(6.53g)，NIT-102 C2(2.61g)，120g反應(yīng)緩沖液，并用氮?dú)鈨艋?。將所得混合物攪?4小時(shí)，然后倒入250mL玻璃瓶中，在反應(yīng)器中留下催化劑。通過(guò)在包含用過(guò)的催化劑的反應(yīng)器中再裝入2-異丁基-丁二腈(6.53g)和120g反應(yīng)緩沖液，用氮?dú)鈨艋?，并將所得混合物攪?4小時(shí)來(lái)重復(fù)反應(yīng)。將反應(yīng)樣品(0.1mL)與0.4mL水∶甲醇∶三氟乙酸(60∶40∶0.09，v/v/v)混合，并通過(guò)HPLC在保持在30℃的SymmetryTMC8柱(150×3.9mm)上分析。該柱采用水∶甲醇∶三氟乙酸(60∶40∶0.09，v/v/v)洗脫，探測(cè)采用折光率檢測(cè)器實(shí)施。
全部50個(gè)間歇反應(yīng)采用催化劑再循環(huán)實(shí)施。將兩個(gè)連續(xù)的間歇反應(yīng)的產(chǎn)物混合物合并并用乙酸乙酯(2×150mL)萃取。將水性部分用4MHCl調(diào)節(jié)到pH 2，并用乙酸乙酯(2×150mL)萃取。將經(jīng)酸化的水性部分的乙酸乙酯萃取液合并，用無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾并在真空下濃縮得到(S)-CMHA。由50個(gè)間歇反應(yīng)得到總共160.8g(43.2％產(chǎn)率)(S)-CMHA。對(duì)于第一個(gè)、第二十六個(gè)和第五十個(gè)反應(yīng)，初始速率分別為14.8、17.4和15.1mM(S)-CMHA/h。由間歇反應(yīng)39-50離析出的(S)-CMHA的甲酯衍生物的手性GC分析表明平均對(duì)映異構(gòu)純度為99.0％e.e。
實(shí)施例6采用NIT-102 C2在大氣氛中由2-異丁基-丁二腈制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸除了該反應(yīng)在大氣氛下實(shí)施而不是在氮?dú)夥障聦?shí)施以外，采用NIT-102 C2的2-異丁基-丁二腈到(S)-CMHA的轉(zhuǎn)化的一系列間歇反應(yīng)如實(shí)施例5所述地實(shí)施。如實(shí)施例5所述，反應(yīng)樣品通過(guò)HPLC分析。
全部50個(gè)間歇反應(yīng)在大氣下采用催化劑再循環(huán)實(shí)施。對(duì)于第一個(gè)、第二十六個(gè)和第五十個(gè)反應(yīng)，由在4個(gè)小時(shí)時(shí)取出的樣品測(cè)定的初始反應(yīng)速率分別為14.2、13.2和9.3mM(S)-CMHA/h。
實(shí)施例7制備(S)-3-氰基-5-甲基己酸叔丁銨將由2-異丁基-丁二腈到(S)-CMHA的轉(zhuǎn)化(實(shí)施例6，反應(yīng)37-44)的產(chǎn)物混合物合并，并用乙酸乙酯(2×250mL)萃取。將乙酸乙酯萃取液用無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾并在真空下濃縮得到油(32.5g，62.2％產(chǎn)率)，該油主要是(R)-異丁基-丁二腈。水性部分用4M HCl調(diào)節(jié)到pH 2，并用乙酸乙酯(2×250mL)萃取。將乙酸乙酯萃取液濃縮到體積為470mL，然后在滴加叔丁胺(15.9mL 151.5mmol)的同時(shí)攪拌。將形成的白色晶體鹽通過(guò)過(guò)濾收集，并空氣干燥整夜得到30.0g(S)-3-氰基-5-甲基己酸叔丁銨。(S)-3-氰基-5-甲基己酸甲酯由(S)-3-氰基-5-己基己酸叔丁銨制備并通過(guò)手性GC分析表明對(duì)映異構(gòu)純度為99.5％e.e。
1H NMR(CDCl3，400MHz)δ0.90-0.94(m，6H)，1.26-1.32(m，10H)，1.54-1.61(m，1H)，1.78-1.88(m，1H)，2.30-2.35(m，1H)，2.43-2.50(m，1H)，2.96-3.04(m，1H)。
實(shí)施例8由(S)-3-氰基-5-甲基己酸鉀制備(S)-3-氨基甲基-5-甲基己酸將(S)-3-氰基-5-甲基己酸鉀(20g，103.5mmol)，水(50mL)，45％KOH(12g)異丙醇(12g)和Raney鎳的混合物在50psi氫氣下在Parr Shaker中搖動(dòng)整夜。將混合物過(guò)濾，加熱至約50℃，用乙酸(6.5mL)進(jìn)行處理并在室溫下攪拌整夜。然后，將混合物用45％KOH調(diào)節(jié)到略高于pH 7并在真空下濃縮以除去大部分異丙醇。將異丙醇(20mL)加到混合物中，該混合物然后用乙酸酸化，在室溫下攪拌整夜并過(guò)濾得到4.3g白色結(jié)晶固體狀(S)-3-氨基甲基-5-甲基己酸。通過(guò)利用Marfey試劑(Nα-(2，4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺)制備(S)-3-氨基甲基-5-甲基己酸衍生物并通過(guò)HPLC在BDS Hypersil C18柱(250×4.6mm，5μ)上，采用乙腈∶1％三乙胺(pH 3)(38∶62，v/v)洗脫來(lái)分析確定對(duì)映異構(gòu)純度為100％e.e。
實(shí)施例9由(S)-3-氰基-5-甲基己酸叔丁銨制備(S)-3-氨基甲基-5-甲基己酸將(S)-3-氰基-5-甲基己酸叔丁銨(26g，113.9mmol)，水(48.8mL)，乙醇(35.8mL)，KOH(7.2g，91％薄片)和Sponge NickelTM(A-7000，16.3g濕重，Activated Metals & Chemicals，Inc.，Sevierville，TN)的混合物在50psi氫氣下Parr Shaker中搖動(dòng)整夜。將混合物過(guò)濾(硅藻土)，并將濾餅用水(10mL)和乙醇(5mL)洗滌。將乙酸(9.4mL)加到濾液中，并將所得混合物在4℃攪拌整夜。將產(chǎn)物過(guò)濾，用10mL異丙醇沖洗并在真空下干燥得到11.1g(61％)白色固體。將這個(gè)材料的一部分(10.0g)由1∶1的異丙醇和水混合物結(jié)晶得到8.8g 100％ee的(S)-3-氨基甲基-5-甲基己酸。
實(shí)施例10利用DBU外消旋化(R)-2-異丁基-丁二腈
(R)-2-異丁基-丁二腈的外消旋化在由外消旋2-異丁基-丁二腈的生物轉(zhuǎn)化(采用NIT-102 C2)回收的材料中實(shí)施。將(R)-2-異丁基-丁二腈(1.36g，10mmol，69％ee)，甲苯(5mL)和1，8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU，0.076g，5mmol)的混合物回流2小時(shí)。將水(10mL)加到反應(yīng)中，并將所得混合物用乙酸乙酯(2×10mL)萃取，將合并的有機(jī)萃取液依次采用5％HCl(20mL)和飽和氯化鈉水溶液(20mL)洗滌，用無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾并在真空下濃縮得到外消旋2-異丁基-丁二腈(1.14g，84％)。通過(guò)GC，利用ChiraldexTMG-TA柱(30M×0.25mmID，125微米膜厚)確定對(duì)映異構(gòu)純度。
實(shí)施例11利用AmberliteIRA-400外消旋化(R)-2-異丁基-丁二腈將AmberliteIRA-400樹(shù)脂(1g濕重，Rohm & Haas，Philadelphia，PA)用5％NaOH(10mL)攪拌10分鐘并用水洗滌直到洗滌物為中性。將乙醇(25mL)和(R)-2-異丁基-丁二腈(69％ee)加到樹(shù)脂中，并將所得混合物回流2小時(shí)。將反應(yīng)混合物過(guò)濾并在真空下濃縮。將殘余物用乙酸乙酯(25mL)吸收并用水(3×100mL)洗滌。將有機(jī)相用無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾并在真空下濃縮得到外消旋2-異丁基-丁二腈(0.81g，81％)。
權(quán)利要求
1.一種用于制備式I化合物的方法 其中，C3具有(S)構(gòu)型；R1是氫、(C1-C6)烷基或苯基；和R2是(C1-C8)烷基、(C2-C8)鏈烯基、(C3-C8)環(huán)烷基、-O(C1-C6)烷基、-CH2-CH2-O-(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基-OH、-苯基-(C1-C6)烷基-OH、-苯基-O-(C1-C6)烷基、苯基或經(jīng)取代的苯基；條件是，當(dāng)R2是甲基時(shí)，R1是氫、(C1-C6)烷基或苯基，所述方法包括如下步驟(a)將式II化合物與具有腈水解酶活性的酶催化劑在反應(yīng)介質(zhì)中接觸； (b)從所述反應(yīng)介質(zhì)回收所述式I化合物的(3S)異構(gòu)體；并且，任選地，回收所述式II化合物的未變化(3R)異構(gòu)體。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(b)的所述回收的式II化合物的未變化(3R)異構(gòu)體通過(guò)將所述(3R)異構(gòu)體與堿在有機(jī)溶劑的存在下進(jìn)行加熱外消旋成式II化合物的外消旋物。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，利用由步驟(b)的所述回收的未變化(3R)異構(gòu)體外消旋的外消旋物重復(fù)步驟(a)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述酶催化劑選自由NIT-101、NIT-102、NIT-103和得自擬南芥的腈水解酶組成的組。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述反應(yīng)介質(zhì)由蒸餾水或緩沖到約5.0-約10.0的pH范圍的水組成。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述式I化合物是(S)-3-氰基-5-甲基己酸，所述式II化合物是外消旋的2-異丁基-丁二腈，步驟(b)的所述回收的未變化異構(gòu)體是(R)-2-異丁基-丁二腈。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，步驟(b)的所述回收的未變化(R)-2-異丁基-丁二腈通過(guò)與堿在溶劑中進(jìn)行加熱被外消旋成外消旋2-異丁基-丁二腈。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，利用由步驟(b)的所述回收的未變化(R)-2-異丁基-丁二腈外消旋的外消旋2-異丁基-丁二腈重復(fù)步驟(a)。
9.用于制備(S)3-(氨基甲基)-5-甲基己酸(pregabalin)的方法，所述方法包括以下步驟(a)將2-異丁基-丁二腈與具有腈水解酶活性的酶催化劑在反應(yīng)介質(zhì)中接觸；(b)從所述反應(yīng)介質(zhì)回收(S)-3-氰基-5-甲基己酸；(c)將(S)-3-氰基-5-甲基己酸轉(zhuǎn)化成酸鹽；和(d)將所述酸鹽氫化以形成(S)3-(氨基甲基)-5-甲基己酸(pregabalin)。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，從步驟(a)的所述反應(yīng)介質(zhì)回收未變化的(R)-3-氰基-5-甲基己酸。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，步驟(a)的所述未變化(R)-3-氰基-5-甲基己酸通過(guò)與堿在有機(jī)溶劑的存在下進(jìn)行加熱被外消旋以形成外消旋2-異丁基-丁二腈，并且利用所述外消旋2-異丁基-丁二腈重復(fù)步驟(a)。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述酶催化劑是完整微生物細(xì)胞、透性化微生物細(xì)胞、微生物細(xì)胞萃取物、部分純化的酶、純化酶或固定在載體上的酶催化劑的形式的腈水解酶。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述酶催化劑選自由NIT-101、NIT-102、NIT-103和得自擬南芥的腈水解酶組成的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及將經(jīng)選擇的脂族二腈區(qū)域和立體選擇性生物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)氰基羧酸的方法。更具體地，本發(fā)明提供了一種將2－異丁基－丁二腈轉(zhuǎn)化成(S)－3－氰基－5－甲基己酸的方法，所述(S)－3－氰基－5－甲基己酸在(S)－3－(氨基甲基)－5－甲基己酸(pregabalin)的合成中是可用的中間體。pregabalin可用于治療某些大腦疾病，例如，治療和預(yù)防癲癇、疼痛和精神病。
文檔編號(hào)C12P7/40GK1942587SQ200580010928
公開(kāi)日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2005年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月14日
發(fā)明者邁克爾·保羅·伯恩斯, 賈斯廷·凱尼·威維爾, 約翰·文·王 申請(qǐng)人:輝瑞產(chǎn)品公司