專利名稱：一種快速檢測乙型肝炎病毒耐藥基因變異的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種檢測乙型肝炎病毒相關(guān)基因變異的方法，具體涉及一種檢測乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥相關(guān)基因變異的方法及其快速診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
在歷年法定甲乙類傳染病發(fā)病情況報告中，乙型肝炎一直高居首位，嚴(yán)重威脅人類的健康，估計全球有20億人感染。據(jù)國家衛(wèi)生部2003年8月最新公布的數(shù)字，截至2002年底，全國乙肝病毒攜帶者達(dá)到1.3億人，慢性乙型肝炎患者有2000余萬例，占人口總數(shù)的1.57％。其中50％～75％有活躍的病毒復(fù)制和肝臟炎癥改變，部分慢性肝炎可進(jìn)展為肝硬化、肝衰竭或原發(fā)性肝癌。
乙肝治療的周期長，醫(yī)藥費(fèi)用昂貴，給國家和個人帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前臨床使用的抗病毒藥物主要有α-干擾素(IFN-α)和拉米夫定(Lamivudine，3-TC)。α-干擾素(IFN-α)是目前乙型肝炎治療中抗病毒的首選藥物，其對乙型肝炎的治療效果(HBV DNA消失、HBeAg轉(zhuǎn)陰)報道不一，一般在20-40％之間(Mauracher E，Gut，3499-10，1993；Korenman J et al，Ann Intern Med，114629-634，1991)，除治療應(yīng)答率低下、價格昂貴外，長期使用干擾素具有較大的副作用。拉米夫定(Lamivudine，3-TC)原為抗HIV感染的核苷類藥物，近年發(fā)現(xiàn)短期內(nèi)對乙型肝炎病毒的復(fù)制有較好的抑制作用(Hadziyannis SJ et al，Hepatology，32847-851，2000)。然而它的主要缺點(diǎn)為易產(chǎn)生耐藥，一旦出現(xiàn)耐藥，藥物對病毒復(fù)制無抑制作用，血清HBV DNA的水平回升，對病毒的感染無根除作用。停藥后病毒可高度復(fù)制而導(dǎo)致肝炎的爆發(fā)或加劇(Yuen MF et al，Hepatology，34785-791，2002)。
病毒變異不斷地在自然界中發(fā)生，或在藥物壓力下產(chǎn)生，是病毒遺傳進(jìn)化的基本因素。有報道，乙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HBV)基因的P區(qū)、前S/S區(qū)、前C/C區(qū)、X等區(qū)都會發(fā)生基因變異。P基因區(qū)占整個病毒基因組的75％，分為5個區(qū)(A，B，C，D和E)，主要編碼DNA多聚酶。這些區(qū)域可與核苷酸或模板結(jié)合，具有催化活性，負(fù)責(zé)病毒基因的復(fù)制。近年來，核苷類藥物，如拉米夫定已經(jīng)成為乙型肝炎治療的主要藥物之一，而在用核苷類藥物治療患者中，最大的問題是P區(qū)基因相關(guān)位點(diǎn)發(fā)生突變，導(dǎo)致病毒對核苷類藥物發(fā)生耐藥。拉米夫定能顯著降低HBV DNA水平，并可使ALT正常化和肝組織學(xué)改善。但若長期治療，則在編碼DNA多聚酶的YMDD基序會發(fā)生變異，這種耐藥突變主要是YMDD基序上第552位的蛋氨酸(M)被纈氨酸(V)或異亮氨酸(I)替代(M552I或M552V)，M552V突變常常與L528M的變異聯(lián)合發(fā)生。一般認(rèn)為YMDD突變后HBV DNA常常反跳引起活動性肝炎。YMDD變異株在轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中的復(fù)制活性低于野毒株，然而對拉米夫定敏感性降低1000-10000倍。臨床上，隨著血清YMDD突變株的出現(xiàn)，HBV DNA可重新回升，部分病人出現(xiàn)肝炎急性發(fā)作，甚至肝功能失代償。因此，檢測HBV P區(qū)基因的變異可以及時了解患者治療療效，隨時調(diào)整治療方案，對乙型肝炎臨床核苷類似物藥物治療具有重要的指導(dǎo)意義。
目前檢測HBV基因變異的方法除了基因測序外，還有線性探針法(Line ProbeAssay，LiPA)、雜交雙探針熒光檢測技術(shù)、寡核苷酸基因芯片，限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)、高效液相色譜(DHPLC)和實時熒光定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)技術(shù)等。目前，應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行基因突變分析的方法是基于比較野生型和突變型基因擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線和Tm值，比較二者之間的差異來判斷樣品中病毒基因是否存在變異。由于乙型肝炎患者的體內(nèi)病毒滴度不同，經(jīng)拉米夫定治療后存在的變異常為混合變異，即YMDD、YIDD、和YVDD三者間的共生，加上它們之間的比例不一，高拷貝的毒株會競爭性的掩蓋低拷貝的變異毒株，通過比較熔解曲線和Tm值的差異判斷基因變異的方法難以檢測出HBV基因確切的變異情況，對混合突變的檢測也無能為力。傳統(tǒng)的測序技術(shù)雖然準(zhǔn)確，但由于耗時、實驗繁瑣、對序列進(jìn)行專業(yè)比對等缺點(diǎn)限制了其廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服傳統(tǒng)檢測方法的缺陷，提供一種簡便、快速、準(zhǔn)確率高的檢測乙型肝炎病毒耐藥基因變異的方法，具體涉及一種用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒z測乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥相關(guān)基因變異的方法。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供用于該方法的快速診斷試劑盒。
本方法利用實時熒光定量PCR MGB(minor groove binder)Taqman探針技術(shù)，依據(jù)HBV拉米夫定耐藥主要突變區(qū)YMDD核酸序列，設(shè)計引物及探針檢測HBV YMDD區(qū)域的基因變異。
本方法利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入不同熒光(FAM，HEX)標(biāo)記的兩條探針，分別和同一基因的兩種突變基因序列相對應(yīng)，兩個探針的5’端標(biāo)以熒光發(fā)射基團(tuán)FAM或HEX標(biāo)記，靠近3’端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán)(quencher)，同時3’端結(jié)合上M6B，即DNA小溝結(jié)合物，是源于某些抗菌素分子的化學(xué)基團(tuán)，其能嵌入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝形成非共價結(jié)合，有效提高探針的退火溫度，探針的3’端被磷酸化以防止探針在PCR擴(kuò)增過程中被延伸。反應(yīng)體系中的兩種探針其中一條可與引物包含序列內(nèi)的DNA模板發(fā)生特異性雜交，另外一條探針由于有一個堿基序列不同，雜交溫度大為降低，不能雜交到DNA模板上。當(dāng)探針保持完整時，淬滅基團(tuán)抑制發(fā)射基團(tuán)的熒光發(fā)射。發(fā)射基團(tuán)一旦與淬滅基團(tuán)發(fā)生分離，抑制作用被解除，檢測波長處光密度增加而被熒光探測系統(tǒng)檢測到。復(fù)性期探針與模板DNA發(fā)生雜交，延伸期Taq酶隨引物延伸沿DNA模板移動，當(dāng)移動到探針結(jié)合處切斷探針，淬滅作用被解除，熒光信號釋放出來。模板每復(fù)制一次，就有一個探針被切斷，伴隨一個熒光信號的釋放，結(jié)果中被檢測到的熒光信號所標(biāo)記的探針，對應(yīng)于檢測區(qū)域的突變基因。
本發(fā)明方法包括下述步驟a、根據(jù)乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥性相關(guān)突變位點(diǎn)的靶基因序列設(shè)計、合成一對引物，靶基因片段長度最優(yōu)為50-200個堿基；b、根據(jù)靶基因序列在引物之間設(shè)計、合成多個熒光探針，分別針對不同的變異基因；c、使用步驟a中的引物和步驟b中的熒光探針及其它聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)成份組成熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系，其中鎂離子濃度為5mM，Taq酶的用量為0.25單位/反應(yīng)；d、從待測血清標(biāo)本中采用Chelex100抽提乙型肝炎病毒DNA，加入步驟c中的熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系，在熒光定量PCR儀，或普通PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增實驗；e、進(jìn)行30-50個循環(huán)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，循環(huán)中或循環(huán)結(jié)束后移至可讀終點(diǎn)熒光的儀器上讀取熒光值，將擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號與域值進(jìn)行比較，判定與探針對應(yīng)的突變情況；f、對于存在混合突變的樣品，根據(jù)各探針反應(yīng)時擴(kuò)增曲線的Ct值比較估算出混合突變病毒毒株的大致比例。
步驟a中所述的兩個引物之間相距50-200堿基，擴(kuò)增的靶基因片段長度為92bps。
步驟b中所述的熒光探針為MGB-Taqman探針，長度為15-30堿基，5′端以FAM或HEX標(biāo)記，3′端以MGB-quencher標(biāo)記。
步驟a中所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥性相關(guān)突變位點(diǎn)的特異性基因序列為1 GTAGGGCTTT CCCCCACTGT TTGGCTTTCA GCTATATGGA TGATGTGGTA51 TTGGGGGCCA AGTCTGTACA ACATCTTGAG TCCCTTTTTA CC步驟a中所述的引物序列為引物15′GTA GGG CTT TCC CCC ACT G 3′引物25′GGT AAA AAG GGA YTC AMG ATG 3′步驟b中所述的熒光探針的序列為探針15′ATC ATC CAT ATA ACT GAA A 3′探針25′CAC ATC ATC AAT ATA AC 3′探針35′ATC ATC CAC ATA ACT GA 3′Taq酶是指具有3′→5′DNA聚合酶活性，5′→3′外切酶活性的耐高溫聚合酶，最好是95℃半衰期大于40分鐘的高溫聚合酶。
陰性對照模板為陰性獻(xiàn)血員血清，經(jīng)乙肝兩對半免疫測定和HBV核酸保守區(qū)PCR檢測，各項指標(biāo)均為陰性。
熒光激發(fā)光FAM和HEX熒光基團(tuán)的激發(fā)波長分別為490nm和530nm，二者檢測波長分別為520nm和555nm。
本發(fā)明采用PCR反應(yīng)混合液A、PCR反應(yīng)混合液B、Taq酶、HBV DNA抽提試劑、陰性質(zhì)控品、ddH2O組成PCR試劑盒。
本發(fā)明對上述試劑進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)制備試劑盒，經(jīng)過改進(jìn)的試劑配方具有更高的擴(kuò)增效率，能快速準(zhǔn)確檢測出特定位點(diǎn)基因突變情況，并能對混合突變的病毒基因比例進(jìn)行相對定量。此外本試劑盒不僅可以在實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測，也可在普通PCR儀上擴(kuò)增后將產(chǎn)物移至常規(guī)熒光檢測儀上讀取熒光值，判斷與相應(yīng)探針對應(yīng)的基因突變類型，因此不受醫(yī)療機(jī)構(gòu)儀器設(shè)備的條件限制，易于普及。
選取經(jīng)克隆測序確認(rèn)的臨床乙肝患者拉米夫定治療前及治療不同階段的血清標(biāo)本共68例，用乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥基因突變檢測試劑盒進(jìn)行檢測，檢出率為98.53％，對于YMDD、YIDD、YVDD共生的標(biāo)本也能檢出，準(zhǔn)確率為100％(表1)。對35份YMDD(5份)、YIDD(5份)、YVDD(5份)、YMDD/YIDD(5份)、YMDD/YVDD(5份)、YIDD/YVDD(5份)、陰性血清(5份)標(biāo)本重復(fù)實驗三次，結(jié)果重復(fù)性達(dá)100％，表明試劑盒的重復(fù)性和穩(wěn)定性較好。表1是試劑盒檢測與測序比對表。
表1

本試劑盒與目前市場上檢測突變的試劑盒相比具有以下優(yōu)點(diǎn)1)準(zhǔn)確常規(guī)測序方法往往難以將共生的病毒毒株全部挑出，通常只能測到其中的一種病毒毒株；通過熒光定量PCR、比較熔解曲線和Tm值差異的方法也只能檢測出占優(yōu)勢的病毒毒株，會漏檢所占比例較少的病毒毒株，因此不能代表患者體內(nèi)病毒的真實變異情況。2)可以對共生的病毒毒株的相對比例進(jìn)行估算，了解患者用藥治療后體內(nèi)病毒發(fā)生變異的變化情況，隨時掌握治療的療效，有利于監(jiān)控療效、調(diào)整治療方案。3)快速從抽提HBV DNA到出報告整個過程只需2-3小時，比測序等其他檢測突變的方法省時、簡便。


圖1為熒光探針PCR反應(yīng)檢測YMDD、YIDD、YVDD原理圖。
其中，R熒光報告基團(tuán) Q熒光淬滅基團(tuán)圖2為采用熒光探針技術(shù)檢測乙肝拉米夫定耐藥基因突變型擴(kuò)增曲線其中，A圖是判定為YMDD的熒光擴(kuò)增曲線，即用PCR反應(yīng)液A擴(kuò)增，于FAM-490nm檢測出高于設(shè)定域值的熒光信號，判定標(biāo)本中的HBV DNA為YMDD野生型。
B圖是判定為YIDD的熒光擴(kuò)增曲線，即用PCR反應(yīng)液B擴(kuò)增，于FAM-490nm檢測出高于設(shè)定域值的熒光信號，判定標(biāo)本中的HBV DNA為YIDD突變型。
C圖是判定為YVDD的熒光擴(kuò)增曲線，即用PCR反應(yīng)液B擴(kuò)增，于HEX-530nm檢測出高于設(shè)定域值的熒光信號，判定標(biāo)本中的HBV DNA為YVDD野生型。
D圖是判定為YIDD/YVDD共生的熒光擴(kuò)增曲線，即用PCR反應(yīng)液B擴(kuò)增，于490nm和530nm均檢測出高于設(shè)定域值的熒光信號，判定標(biāo)本中的HBV DNA為YIDD和YVDD共生突變型。二者擴(kuò)增曲線與基線交匯處的Ct值分別為23和25，ΔCt為2，推算YIDD和YVDD病毒變異毒株的相對比例約為22∶1，即4∶1。
具體實施例方式
實施例1 制備試劑盒試劑盒主要成份有PCR反應(yīng)混合液A(其中還含引物1、2和熒光探針M)，PCR反應(yīng)混合液B(其中還含引物1、2和熒光探針I(yè)和V)，Taq酶，HBV DNA抽提試劑，陰性質(zhì)控品和ddH2O。
所述的引物和熒光探針設(shè)計在乙型肝炎病毒P基因區(qū)編碼第552位氨基酸附近，只對乙型肝炎病毒特異，和其它物種沒有交叉反應(yīng)。在EMBL的HBV編碼聚合酶的DNA序列的YMDD區(qū)域附近設(shè)計引物，全長92bps，為單拷貝基因序列。熒光探針設(shè)計位點(diǎn)位于兩個引物之間。
引物序列為引物15′GTA GGG CTT TCC CCC ACT G 3′19bps引物25′GGT AAA AAG GGA YTC AMG ATG 3′21bps針對YMDD、YIDD、YVDD的熒光探針序列分別為探針M5′ATC ATC CAT ATA ACT GAA A 3′19bps
探針I(yè)5′CAC ATC ATC AAT ATA AC 3′17bps探針V5′ATC ATC CAC ATA ACT GA 3′17bps所述PCR反應(yīng)混合液A每人份組份為10×PCR緩沖液 5μlMgcl2(25mM) 10μldNTPs(各10mM) 各1μl引物1、2(20pmol/μl)各1μl熒光探針M(20pmol/μl) 0.2μlTaq酶(5單位/μl)0.5μlddH2O 28.3μl總量 50μl所述PCR反應(yīng)混合液B每人份組份為10×PCR緩沖液 5μlMgcl2(25mM) 10μldNTPs(各10mM) 各1μl引物1、2(20pmol/μl)各1μl熒光探針I(yè)、V(20pmol/μl)各0.2μlTaq酶(5單位/μl)0.5μlddH2O 28.1μl總量 50μl所述HBV DNA抽提試劑組份為I液8％ 聚乙二醇 8000、1M NaCl；II液10％Chelex-100所述陰性質(zhì)控品為陰性獻(xiàn)血員血清，經(jīng)乙肝兩對半免疫測定和HBV核酸保守區(qū)PCR檢測，各項指標(biāo)均為陰性。
實施例2 使用乙型肝炎病毒基因耐藥突變檢測試劑盒進(jìn)行突變檢測取待測血清樣本50μl，加入50μl HBV DNA抽提I液，振蕩混勻15秒，12000rpm離心10min，棄上清。加入HBV DNA抽提II液50μl振蕩混勻，100℃水浴10min。12000rpm離心2min，取上清供PCR擴(kuò)增用，或-20℃儲存?zhèn)溆谩?br> 陰性質(zhì)控品同上處理。
PCR擴(kuò)增2μl經(jīng)上述方法抽提的含HBV DNA的上清加入PCR反應(yīng)混合液A和B中，混勻后放入實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad，iCycler)，按下列循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)94℃預(yù)變性5分鐘→(94℃變性20秒→60℃退火40秒)×40循環(huán)，每次循環(huán)后在60℃采集熒光。
分析擴(kuò)增曲線，做如下結(jié)果判定1.PCR反應(yīng)混合液A管在FAM-490nm波長處有高于域值的熒光信號，表明標(biāo)本中HBV DNA 552位為YMDD野生型(圖2A)；2.PCR反應(yīng)混合液B管在FAM-490nm波長處有高于域值的熒光信號，表明標(biāo)本中HBV DNA 552位為YIDD突變型(圖2B)；3.PCR反應(yīng)混合液B管在HEX-530nm波長處有高于域值的熒光信號，表明標(biāo)本中HBV DNA 552位為YVDD突變型(圖2C)；4.若出現(xiàn)以上三種中任兩種或兩種以上高于域值的熒光信號，表明標(biāo)本中乙型肝炎病毒為共生突變(圖2D)；5.對于共生突變的毒株相對比例可按下列方法進(jìn)行估算從擴(kuò)增曲線上分別讀取共生毒株的Ct值，以2ΔCt進(jìn)行估算兩者的拷貝數(shù)差異(圖2D)。
實施例3同實施例1配置PCR反應(yīng)液，將PCR管放入可讀取熒光的熒光檢測儀上讀取數(shù)值，記下熒光值A(chǔ)0，將PCR管轉(zhuǎn)入普通PCR儀上，按下列循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)94℃預(yù)變性5分鐘→(94℃變性20秒→60℃退火40秒→72℃延伸30秒)×40循環(huán)→72℃延伸2分鐘，再將PCR產(chǎn)物移至熒光檢測儀上讀取熒光值A(chǔ)x。
分析終點(diǎn)熒光值，可做如下結(jié)果判定1.PCR反應(yīng)混合液A管(Ax-A0)數(shù)值高于陰性對照10倍標(biāo)準(zhǔn)差以上認(rèn)為該標(biāo)本中HBV DNA 552位為野生型YMDD；2.PCR反應(yīng)混合液B管在FAM-490nm波長處有熒光信號，并且(Ax-A0)數(shù)值高于陰性對照10倍標(biāo)準(zhǔn)差以上，表明標(biāo)本中HBV DNA 552位為突變型YIDD；3.PCR反應(yīng)混合液B管在HEX-530nm波長處有熒光信號，并且(Ax-A0)數(shù)值高于陰性對照10倍標(biāo)準(zhǔn)差以上表明標(biāo)本中HBV DNA 552位為突變型YVDD；4.若出現(xiàn)以上三種中任兩種或兩種以上情況，表明標(biāo)本中乙型肝炎病毒相應(yīng)突變毒株共生。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測乙型肝炎病毒耐藥基因變異的方法，其特征是利用實時熒光定量PCR MGB Taqman探針技術(shù)，依據(jù)乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥突變區(qū)YMDD核酸序列，設(shè)計引物及探針檢測HBV YMDD區(qū)域的基因變異，包括下述步驟，a、根據(jù)乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥性相關(guān)突變位點(diǎn)的靶基因序列設(shè)計、合成引物和熒光探針，所述的靶基因片段長度為50-200個堿基；b、上述引物和熒光探針與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)成份組成熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系，其中鎂離子濃度為5mM，Taq酶的用量為0.25單位/反應(yīng)；c、采用Chelex100抽提乙型肝炎病毒DNA，加入上述反應(yīng)體系循環(huán)擴(kuò)增；d、讀取熒光值，判定基因變異情況，估算混合突變病毒毒株比例。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥性相關(guān)突變位點(diǎn)的靶基因序列位于兩個引物之間，引物相距50-200堿基。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥性相關(guān)突變位點(diǎn)的靶基因長度為92堿基。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中所述的熒光探針為MGB-Taqman探針，其5′端以FAM或HEX標(biāo)記，3′端以MGB-quencher標(biāo)記。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中所述的引物長度各為15-25堿基。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中所述的熒光探針長度為15-30堿基。
7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟c中所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)為30-50個。
8.按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟c中所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)為40個。
9.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中所述的乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥性相關(guān)突變位點(diǎn)的特異性基因序列為1 GTAGGGCTTT CCCCCACTGT TTGGCTTTCA GCTATATGGA TGATGTGGTA51 TTGGGGGCCA AGTCTGTACA ACATCTTGAG TCCCTTTTTA CC。
10.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中所述的引物序列為引物15′GTA GGG CTT TCC CCC ACT G 3′引物25′GGT AAA AAG GGA YTC AMG ATG 3′。
11.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中所述的熒光探針的序列為探針M5′ATC ATC CAT ATA ACT GAA A 3′探針I(yè)5′CAC ATC ATC AAT ATA AC 3′探針V5′ATC ATC CAC ATA ACT GA 3′。
12.一種檢測權(quán)利要求1的乙型肝炎病毒耐藥相關(guān)基因變異的診斷試劑盒，其特征是由PCR反應(yīng)混合液A，PCR反應(yīng)混合液B，Taq酶，HBV DNA抽提試劑，陰性質(zhì)控品和ddH2O組成，其中所述的反應(yīng)混合液A中還含引物1、2和熒光探針M，反應(yīng)混合液B中還含引物1、2和熒光探針I(yè)和V。
13.按權(quán)利要求12所述的診斷試劑盒，其中所述的引物序列為，引物15′GTA GGG CTT TCC CCC ACT G 3′ 19bps引物25′GGT AAA AAG GGA YTC AMG ATG 3′21bps。
14.按權(quán)利要求12所述的診斷試劑盒，其中所述的熒光探針序列為，探針M5′ATC ATC CAT ATA ACT GAA A 3′19bps探針I(yè)5′CAC ATC ATC AAT ATA AC 3′ 17bps探針V5′ATC ATC CAC ATA ACT GA 3′ 17bps。
15.按權(quán)利要求12所述的診斷試劑盒，其中所述的PCR反應(yīng)混合液A每人份組份為5μl 10×PCR緩沖液，10μl 25mM Mgcl2，各1μl 10mM dNTPs，各1μl20pmol/μl引物1和2，0.2μl 20pmol/μl熒光探針M，0.5μl 5單位/μl Taq酶，28.3μl ddH2O；其中所述的PCR反應(yīng)混合液B每人份組份為5μl 10×PCR緩沖液，10μl 25mM Mgcl2，各1μl 10mM dNTPs，各1μl 20pmol/μl引物1和2，各0.2μl 20pmol/μl熒光探針I(yè)和V，0.5μl 5單位/μl Taq酶，28.1μlddH2O。
16.按權(quán)利要求12所述的診斷試劑盒，其中所述的HBV DNA抽提試劑組份為，I液8％聚乙二醇8000、lM NaCl；II液10％Chelex-100。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種檢測乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥相關(guān)基因變異的方法。本發(fā)明利用實時熒光定量PCR MGB Taqman探針技術(shù)，依據(jù)乙肝病毒拉米夫定耐藥突變區(qū)YMDD核酸序列，設(shè)計引物及探針檢測HBV YMDD區(qū)域的基因變異。采用PCR反應(yīng)混合液A，B、Taq酶、HBV DNA抽提試劑、陰性質(zhì)控品、ddH
文檔編號C12Q1/68GK1737164SQ20051006544
公開日2006年2月22日 申請日期2005年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月27日
發(fā)明者袁正宏, 王 華, 耿海峰, 華兵, 邵醇 申請人:上海復(fù)旦悅達(dá)生物技術(shù)有限公司, 復(fù)旦大學(xué)