專利名稱：一種來(lái)源于蟲草棒束孢(Isaria farinosa)的胞內(nèi)多糖的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種來(lái)源于蟲草棒束孢(Isaria farinosa)的胞內(nèi)多糖背景技術(shù) 據(jù)本發(fā)明人通過(guò)查閱資料、文獻(xiàn)檢索所知，各種蟲草多糖的研究由來(lái)已久，同一種蟲草的多糖按來(lái)源分為胞外多糖和胞內(nèi)多糖，代謝中分泌到發(fā)酵液或基質(zhì)中的是胞外多糖，而存在于細(xì)胞內(nèi)的為胞內(nèi)多糖。早在上世紀(jì)50年代即已有某些蟲草多糖的分子結(jié)構(gòu)和藥理作用的研究報(bào)道。
日本學(xué)者M(jìn)iyazaki等在1977年報(bào)道了一種水溶性冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)多糖為半乳甘露聚糖，D-甘露糖和D-半乳糖的摩爾比為1∶1；1982年Ukai等從蟬花(Cordycepscicadae)中分離出C-3和CI-5N兩種組分，C-3為水溶性的半乳甘露聚糖，D-甘露糖和D-半乳糖的比例為4∶3，CI-5N為高度分枝的不含蛋白的多糖，所含D-甘露糖∶D-半乳糖∶D-葡萄糖＝1∶0.67∶2.3；1984年Yamada從大團(tuán)囊蟲草(Cordyceps ophioglossoides)培養(yǎng)物濾液中分離出一種水溶性的葡聚糖。1990年龔敏從一株蟲草菌(分類不詳)的發(fā)酵液中分離純化出一種蟲草多糖Cs-81002，單糖組成為甘露糖∶半乳糖∶葡萄糖＝10.3∶3.6∶1，可能還有痕量的阿拉伯糖。1990年華巍巍等從蟲草頭孢菌(Cephalosporinm sinensin chen sp nov)中提取的粗品多糖經(jīng)分析表明含有半乳糖、山梨糖、巖藻糖、葡萄糖。1998年李連德等研究了地生枝孢霉(Acremonium terricola Miller & al)胞內(nèi)多糖，其組成為半乳糖和葡萄糖，摩爾比為3.8∶1，古尼擬青霉小孢變種(Paecilomyces gunnii var.minor Huang.et al)胞內(nèi)多糖組成為甘露糖、葡萄糖和半乳糖，摩爾比為1.5∶1.3∶1。據(jù)研究表明，不同的蟲草多糖具有不同的生物活性。1996年王翎等對(duì)蟲花菌所產(chǎn)胞外多糖做了研究，該多糖經(jīng)氣相色譜和紅外光譜分析表明含有D-甘露糖、D-半乳糖，摩爾比為5.93∶1；該多糖對(duì)小鼠實(shí)體瘤S180有一定的抑制作用，抑瘤率為22.2％。1996年褚西寧等研究了棒束孢胞外多糖，用TLC、GC和IR分析表明該多糖由D-甘露糖和D-半乳糖組成。1996年，西班牙Domenech從粉質(zhì)擬青霉菌體細(xì)胞壁中提取出的水溶性多糖為半乳甘露聚糖。1996年口如琴等將棒束孢菌絲體用40％的乙醇抽提，將抽提物灌胃小鼠，測(cè)定小鼠各臟器中有關(guān)衰老的一些生化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶SOD、過(guò)氧化氫酶CAT活力高于對(duì)照組，丙二醛含量顯著低于對(duì)照組。2000年柴一秋等取粉質(zhì)擬青霉的發(fā)酵上清液，用于小麥牙鞘切段伸長(zhǎng)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)小麥胚牙鞘的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。2003年安建梅測(cè)定粉質(zhì)擬青霉代謝產(chǎn)物的生理活性，將濾去菌絲及孢子的發(fā)酵液用于小麥牙鞘切段伸長(zhǎng)試驗(yàn)和西瓜子葉擴(kuò)張?jiān)囼?yàn)，發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)小麥牙鞘切段的伸長(zhǎng)和促進(jìn)西瓜子葉的擴(kuò)張，具有類似生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的作用。
綜上所述，目前尚未有蟲草棒束孢胞內(nèi)多糖由半乳糖、甘露糖和葡萄糖組成的報(bào)道，而蟲草棒束孢胞內(nèi)多糖的生物活性也尚未有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種具有生物學(xué)活性的真菌多糖，該多糖來(lái)源于蟲草棒束孢(Isariafarinosa)的細(xì)胞內(nèi)，為一種胞內(nèi)多糖，并將其應(yīng)用于生物活性物質(zhì)的開發(fā)。本發(fā)明從蟲草棒束孢(Isaria farinosa)液體深層發(fā)酵得到的菌絲體中分離純化出一種水溶性的胞內(nèi)多糖，該多糖的組成單位為甘露糖、半乳糖和葡萄糖，摩爾比為8.0∶4.8∶1，并結(jié)合有少量蛋白。將該多糖用于生理活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，具有抗腫瘤作用、抗氧化作用、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和對(duì)抗環(huán)磷酰胺引起的免疫抑制作用；通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明該多糖安全無(wú)毒。該純化的多糖可制成口服液、沖劑、片劑、膠囊、粉針劑和注射液。


圖1為標(biāo)準(zhǔn)單糖的氣相色譜分析，峰1-8依次為鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、內(nèi)標(biāo)肌醇；圖2為蟲草棒束孢胞內(nèi)多糖的氣相色譜分析，峰1-4依次為甘露糖、半乳糖、葡萄糖和內(nèi)標(biāo)肌醇。
具體實(shí)施例方式
1.多糖的制備從長(zhǎng)白山余脈采集的蟲草中分離出一株蟲草棒束孢菌(Isariafarinosa)，該菌株用PDA培養(yǎng)基(每升含土豆200g、蔗糖20g、瓊脂15g)活化后，接入裝有100ml種子培養(yǎng)基(每升含土豆200g、蔗糖20g、蛋白胨5g、K2HPO43g、MgSO41.5g)中25℃下150rpm搖瓶培養(yǎng)4d得到液體種子。以5％(v/v)的接種量將液體種子接入含75ml發(fā)酵培養(yǎng)基(每升含蔗糖35g、蛋白胨5g、酵母膏2g、K2HPO41g、MgSO40.5g，初始pH7.0)的250ml三角瓶中，25℃下150rpm搖瓶培養(yǎng)5d，得到的發(fā)酵液4000rpm離心15min，得到的菌絲體水洗、離心兩次，最終獲得的菌絲體80℃烘干并粉碎。粉碎的干菌絲體加入40倍水100℃抽提2h，過(guò)濾，殘?jiān)偌尤肱c前述同樣體積的水抽提2h，過(guò)濾，合并兩次濾液，濃縮，加入3倍乙醇得到粗胞內(nèi)多糖。粗多糖經(jīng)過(guò)Sevag法除蛋白、Q-Sepharose FF陰離子交換柱層析和Sepharose CL-4B凝膠柱層析分離純化，冷凍干燥后得到純度≥99.9％的多糖。用氣相色譜分析(肌醇作內(nèi)標(biāo))可知，該多糖的單糖組成為甘露糖、半乳糖和少量葡萄糖，摩爾比為8.0∶4.8∶1(圖1、2)。用Lowry法測(cè)定，該多糖結(jié)合有蛋白，含量約為8％。該多糖顏色灰白，水溶性很好，不溶于40％的乙醇。
2.應(yīng)用以粉針劑(或注射液)為例蟲草棒束孢胞內(nèi)多糖以99.9％的純度使用，將凍干粉分裝入安培瓶中(或?qū)龈煞廴芙庥谏睇}水，再分裝入安培瓶中)，每支含4mg胞內(nèi)多糖，封口，滅菌，制成粉針劑(或注射液)。
權(quán)利要求
1.對(duì)一種來(lái)源于蟲草棒束孢(Isaria farinosa)的胞內(nèi)多糖(其特征是由甘露糖、半乳糖和葡萄糖組成，摩爾比為8.0∶4.8∶1)實(shí)施保護(hù)。
2.對(duì)一種來(lái)源于蟲草棒束孢(Isaria farinosa)的胞內(nèi)多糖的制備方法實(shí)施保護(hù)。制備方法為菌株用PDA培養(yǎng)基活化后，接入種子培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)得到液體種子。將液體種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)得到的發(fā)酵液離心，得到的菌絲體水洗、離心兩次，最終獲得的菌絲體80℃烘干并粉碎。粉碎的干菌絲體加入40倍水100℃抽提2h，過(guò)濾，殘?jiān)偌尤肱c前述同樣體積的水抽提2h，過(guò)濾，合并兩次濾液，濃縮，加入3倍乙醇得到粗胞內(nèi)多糖。粗多糖經(jīng)過(guò)Sevag法除蛋白、Q-Sepharose FF陰離子交換柱層析和Sepharose CL-4B凝膠柱層析分離純化，冷凍干燥后得到純多糖。
3.對(duì)上述方法制備的蟲草棒束孢(Isaria farinosa)胞內(nèi)多糖制成口服液、沖劑、片劑、膠囊、粉針劑和注射液實(shí)施保護(hù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種來(lái)源于蟲草棒束孢(Isariafarinosa)的胞內(nèi)多糖。本發(fā)明的目的是提供一種具有生物學(xué)活性的真菌多糖，該多糖來(lái)源于蟲草棒束孢(Isaria farinosa)的細(xì)胞內(nèi)，為一種胞內(nèi)多糖，并將其應(yīng)用于生物活性物質(zhì)的開發(fā)。本發(fā)明從自然界分離出蟲草棒束孢菌，從該菌株液體深層發(fā)酵得到的菌絲體中分離純化出一種水溶性的胞內(nèi)多糖，該多糖的組成單位為甘露糖、半乳糖和少量葡萄糖，摩爾比為8.0∶4.8∶1，并結(jié)合有少量的蛋白。將該多糖用于生理活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其具有抗腫瘤作用、抗氧化作用、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和對(duì)抗環(huán)磷酰胺引起的免疫抑制作用；通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明該多糖安全無(wú)毒。將純化的蟲草棒束孢(Isaria farinosa)胞內(nèi)多糖制成口服液、沖劑、片劑、膠囊、粉針劑和注射液。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1844153SQ20051006532
公開日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2005年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月6日
發(fā)明者江曉路, 江艷華 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)