專利名稱：耐藥基因pcr檢測陽性對照模板、制備方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種耐藥基因PCR檢測陽性對照模板、制備方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
隨著抗生素的普遍應(yīng)用，細菌耐藥問題也日漸嚴重，隨著2010年8月TheLancet Infectious Diseases雜志發(fā)表了一篇由印度、英國、瑞典、巴基斯坦和澳大利亞科學(xué)家聯(lián) 合研究報告，報道了抗生素抗性的一種新機制及其在印度、英國和巴基斯坦的播散情況，耐 藥性問題再一次驚醒世人抗生素濫用會終結(jié)我們依賴抗生素與細菌感染斗爭的威力。早在青霉素尚未臨床應(yīng)用的1940年，科學(xué)家就分離出了水解青霉素的酶，當(dāng)時 稱為青霉素酶，在解析了青霉素為一種β -內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)的抗生素后，此酶也就重新命名為 β-內(nèi)酰胺酶。該酶按照功能和分子結(jié)構(gòu)進行分類。根據(jù)功能特征分成群1 4，其中群2 又分成亞群2a 2e、2f，2b進一步分成2be和2br兩個亞群。根據(jù)該酶的核酸與蛋白序列 進行分子分型，分為A D 4個類型，分子型A、C和D是以絲氨酸為基礎(chǔ)的作用機制，而B 型或金屬- β _內(nèi)酰胺酶以鋅指結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的作用機制。群1是頭孢菌素酶，分子型C，不被 棒酸抑制；群2包括青霉素酶、頭孢菌素酶或二者均有，均被棒酸抑制，屬于分子型A和D， 對應(yīng)原始的TEM和巰基變異(sulfhydryl variable, SHV)基因；群3是金屬酶，分子型B， 不被棒酸抑制；群4是青霉素酶，沒有分子型與之對應(yīng)，不被棒酸抑制。新發(fā)現(xiàn)的NDM-I是 金屬蛋白酶，是一類新型具有廣譜抗生素水解作用的內(nèi)酰胺酶。新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶(New Delhi metallo-beta-lactamase，NDM-1)基因 介導(dǎo)的抗性是一種新報道的耐藥新機制，NDM-I是一種新鑒定的對內(nèi)酰胺抗生素具有 廣譜水解作用的一種酶，是編碼碳青霉烯類酶(Carbapenamase)基因家族成員之一。NDM-I 可以水解碳(雜)青霉烯類抗生素，以及頭孢菌素和青霉素。攜帶該基因的細菌對幾乎所 有一線治療重癥感染的廣譜抗生素都具有抗性，因此，被媒體稱為“超級細菌”。該酶是質(zhì)粒 上bla ^基因編碼的，容易通過基因水平轉(zhuǎn)移在細菌間傳播。該抗性細菌雖然發(fā)現(xiàn)時間不 到1年，但其已經(jīng)擴散到英國、美國、比利時、巴基斯坦等國家，并且從肺炎克雷伯菌擴散到 大腸桿菌和鮑曼不動桿菌。由于從其他國家分離的攜帶NDM-I的耐藥菌株，患者都有到印 度就醫(yī)的歷史，因此，推測表達NDM-I菌株是從印度起源的。國際旅行和患者享受多國醫(yī)療 服務(wù)可能會導(dǎo)致NDM-I的快速擴散，且可能導(dǎo)致潛在的嚴重后果。鑒于我國目前還沒有關(guān)于攜帶NDM-I菌株的報道，所以需要加強監(jiān)測。因為我國 目前對外交往頻繁，尤其是在一些印度和巴基斯坦人聚集的地區(qū)，更應(yīng)密切監(jiān)測；對于往來 印度和巴基斯坦的人員也要監(jiān)測，尤其是在當(dāng)?shù)赜凶≡夯蚓歪t(yī)歷史的人員更要密切監(jiān)測。最簡便的檢測方法就是基于核酸體外擴增的聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChain Reaction, PCR)，雖然NDM-I基因序列網(wǎng)上已經(jīng)公布，在沒有陽性對照模板的情況，會使得 檢測結(jié)果難以判定，而且，如果直接合成公布的基因，會造成合成基因?qū)o抗性菌株的污
^fe ο

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠保證生物安全的耐藥基因 PCR檢測陽性對照模板、制備方法及試劑盒。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案一種耐藥基因PCR檢測陽性對照 模板序列，所述耐藥基因為NDM-1，所述序列含有SEQ ID NO :3所示的序列。所述序列可以 含有SEQ ID NO 2所示的序列。一種耐藥基因PCR檢測陽性對照模板的制備方法，所述耐藥基因為NDM-I，NDM-I 基因序列為SEQ ID NO 1所示的序列，包括如下步驟a)對NDM-I基因序列進行點突變，獲取突變基因，所述突變基因序列含有SEQ ID NO 3所示的序列；b)將所述突變基因合成并克隆入質(zhì)粒；c)將所述質(zhì)粒線性化，得到所述陽性模板。進一步的，所述突變基因序列含有SEQ ID NO 2所示的序列。進一步的，所述步驟a)中，插入一段多克隆位點。進一步的，所述多克隆位點包括多個內(nèi)切酶酶切位點，所述酶切位點選自BamHI、 EcoRI,HindIII0進一步的，所述步驟C)中，將所述質(zhì)粒線性化后，再將所述質(zhì)粒去磷酸化。一種由所述制備方法制備的陽性對照模板。一種陽性對照模板在NDM-I檢測上的應(yīng)用。一種耐藥基因PCR檢測試劑盒，包括所述的陽性對照模板。一種所述的試劑盒在NDM-I檢測上的應(yīng)用。一種引物，所述引物用于檢測一種耐藥基因PCR檢測陽性對照模板序列，所述引
物含有下述至少一_i
ANDM-Pl-L CGACAACGCATTGGCATAAGSEQIDNO 7
NDM-Pl-RCTGGCAGCACACTTCCTATCSEQIDNO8
B:NDM-P2-L :GGCGGAATGGCTCATCACSEQIDNO 9
NDM-P2-RGGCAGCACACTTCCTATCTCSEQIDNO10
C:NDM-P3-L :GATTGCCGAGCGACTTGGSEQIDNO 11
NDM-P3-R:CTGAGCACCGCATTAGCCSEQIDNO12本發(fā)明的有益效果是通過設(shè)置陽性模板，可以快速準確的進行NDM-I檢測；通過 對NDM-I基因進行點突變，可以保證陽性模板不被正確轉(zhuǎn)錄和翻譯，只能作為陽性對照的 序列，從而能夠保證生物安全。


圖 1 是電泳圖，其中，Lane 1 :DL2000 marker ；Lane 2 =NDM-Pl 鑒定產(chǎn)物；Lane 3 NDM-P2鑒定產(chǎn)物；Lane 4 :NDM_P3鑒定產(chǎn)物；Lane 5 陰性對照。
具體實施例方式下面通過具體實施方式
結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。
本發(fā)明所提供的陽性對照模板制備方法是從網(wǎng)上獲得NDM-I基因序列 (FN396876)，將其編碼密碼子進行27處點突變(突變成終止密碼子)并插入一段多克隆位 點(便于對突變序列進行酶切分析)，然后將突變基因合成并克隆入質(zhì)粒中，再將重組質(zhì)粒 線性化后作為陽性對照模板。這樣，可以保證陽性模板不能被正確轉(zhuǎn)錄和翻譯，只能作為陽 性對照的序列，可以絕對保證生物安全。本發(fā)明所提供的陽性對照模板制備方法，包括以下步驟1)從網(wǎng)上獲得NDM-I基因序列(FN396876)并根據(jù)NDM-I基因序列設(shè)計三對PCR 鑒定引物NDM-I基因序列ATGGAATTGCCCAATATTATGCACCCGGTCGCGAAGCTGAGCACCGCATTAGCCGCTGCATTGATGCTGAGCGGGTGCATGCCCGGTGAAATCCGCCCGACGATTGGCCAGCAAATGGAAACTGGCGACCAACGGTTTGGCGATCTGGTTTTCCGCCAGCTCGCACCGAATGT CTGGCAGCACACTTCCTATCTC GACATGCCGGGTTTCGGGGCAGTCGCTTCCAACGGTTTGATCGTCAGGGATGGCGGCCGCGTGCTGGTGGTCGATACCGC
CTGGACCGATGACCAGACCGCCCAGATCCTCAACTGGATCAAGCAGGAGATCAACCTGCCGGTCGCGCTGGCGGTGGTGACTCACGCGCATCAGGACAAGATGGGCGGTATGGACGCGCTGCATGCGGCGGGGATTGCGA CTTAT GCC^T GCGTTGTCG AACCAGCTTGCCCCGCAAGAGGGGATGGTTGCGGCGCAACACAGCCTGACTTTCGCCGCCAATGGCTGGGTCGAACCAGCAACCGCGCCCAACTTTGGCCCGCTCAAGGTATTTTACCCCGGCCCCGGCCACACCAGTGACAATATCACCGTTGGGATCGACGGCACCGACATCGCTTTTGGTGGCTGCCTGATCAAGGACAGCAAGGCCAAGTCGCTCGGCAATCTCGGTGATGCCGACACTGAGCACTACGCCGCGTCAGCGCGCGCGTTTGGTGCGGCGTTCCCCAAGGCCAGCAT GATC GTGATGAGCCATTCCGCC CCCGATAGCCGCGCCGCAATCACTCATACGGCCCGCATGGCCGACAAGCTGCGCTGA(813bp，與 SEQ IDNO 1所示序列一致，其中下劃線和著重號標(biāo)注序列為鑒定引物)。相應(yīng)的氨基酸 序列為MELPNIMHPVAKLSTALAAALMLSGCMPGEIRPTIGQQMETGDQRFGDLVFRQLAPNVWQHTSYLDMPGFGAVASNGLIVRDGGRVLVVDTAWTDDQTAQILNWIKQEINLPVALAVVTHAHQDKMGGMDALHAAGIATYANALSNQLAPQEGMVAAQHSLTFAANGWVEPATAPNFGPLKVFYPGPGHTSDNITVGIDGTDIAFGGCLIKDSKAKSLGNL⑶ADTEHYAASARAFGAAFPKASMIVMSHSAPDSRAAITHTARMADKLR(270aa，即 SEQ IDNO 5所示序列)。NDM-I基因PCR鑒定引物序列如表1所示表1NDM-1基因PCR鑒定引物
權(quán)利要求
一種耐藥基因PCR檢測陽性對照模板序列，所述耐藥基因為NDM 1，所述序列含有SEQ ID NO3所示的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的耐藥基因PCR檢測陽性對照模板序列，其特征在于所述序列 含有SEQ ID NO :2所示的序列。
3.一種耐藥基因PCR檢測陽性對照模板的制備方法，所述耐藥基因為NDM-1，NDM-1基 因序列為SEQ ID NO 1所示的序列，其特征在于包括如下步驟a)對NDM-I基因序列進行點突變，獲取突變基因，所述突變基因序列含有SEQID NO 3所示的序列；b)將所述突變基因合成并克隆入質(zhì)粒；c)將所述質(zhì)粒線性化，得到所述陽性模板。
4.如權(quán)利要求3所述的耐藥基因PCR檢測陽性對照模板的制備方法，其特征在于所 述步驟a)中，插入一段多克隆位點。
5.如權(quán)利要求4所述的耐藥基因PCR檢測陽性對照模板的制備方法，其特征在于所 述多克隆位點包括多個內(nèi)切酶酶切位點，所述酶切位點選自BamHI、EcoRI、HindIII。
6.如權(quán)利要求3-5中任意一項所述的耐藥基因PCR檢測陽性對照模板的制備方法，其 特征在于所述步驟c)中，將所述質(zhì)粒線性化后，再將所述質(zhì)粒去磷酸化。
7.一種權(quán)利要求1或2所述的陽性對照模板在NDM-I檢測上的應(yīng)用。
8.一種耐藥基因PCR檢測試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求1或2所述的陽性對照 模板。
9.一種權(quán)利要求7所述的試劑盒在NDM-I檢測上的應(yīng)用。
10.一種引物，所述引物用于檢測一種耐藥基因PCR檢測陽性對照模板序列，所述引物含有下述至少-- g A=NDM-Pl-L CGACAACGCATTGGCATAAGSEQIDNO 7NDM-Pl-RCTGGCAGCACACTTCCTATCSEQIDNO8B:NDM-P2-L GGCGGAATGGCTCATCACSEQIDNO 9NDM-P2-R:GGCAGCACACTTCCTATCTCSEQIDNO10C:NDM-P3-L GATTGCCGAGCGACTTGGSEQIDNO 11NDM-P3-R:CTGAGCACCGCATTAGCCSEQIDNO1全文摘要
本發(fā)明公開了一種耐藥基因PCR檢測陽性對照模板、制備方法及試劑盒，所述耐藥基因為NDM-1，NDM-1基因序列為SEQ ID NO1所示的序列。一種陽性模板的制備方法包括如下步驟a)對NDM-1基因序列進行點突變，獲取突變基因，所述突變基因序列含有SEQ ID NO3所示的序列；b)將所述突變基因合成并克隆入質(zhì)粒；c)將所述質(zhì)粒線性化，得到所述陽性模板。通過設(shè)置陽性模板，可以快速準確的進行NDM-1檢測；通過對NDM-1基因進行點突變，可以保證陽性模板不被正確轉(zhuǎn)錄和翻譯，只能作為陽性對照的序列，從而能夠保證生物安全。
文檔編號C12Q1/68GK101948920SQ201010278429
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月10日
發(fā)明者彭雁忠, 楊瑞馥, 蔡志明, 覃俊杰, 趙向娜, 郭兆彪 申請人:楊瑞馥;趙向娜;彭雁忠;郭兆彪;蔡志明