專(zhuān)利名稱(chēng)：乙肝病毒x蛋白及其編碼基因在制備治療肝癌的藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于疾病基因治療領(lǐng)域。涉及乙肝病毒X蛋白基因(HBx)在制備治療肝癌及肝癌 并發(fā)癥的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
腫瘤是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康和人們生命的常見(jiàn)疾病，肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，從發(fā) 現(xiàn)肝癌發(fā)現(xiàn)到死亡時(shí)間一般不超過(guò)半年，已成為人類(lèi)主要死因之一。中國(guó)是肝癌發(fā)病大國(guó)， 發(fā)病率和死亡率占全球45%。肝癌在我國(guó)的發(fā)病率居癌癥的第二位，是第二位的癌癥殺手， 其惡性程度很高、病情發(fā)展很快、治療難度較大、預(yù)后較差。因此，研究治療肝癌的藥物具 有重要的意義。隨著分子生物學(xué)，免疫學(xué)、細(xì)胞生物的快速發(fā)展，以腫瘤免疫治療、基因治 療為代表的腫瘤生物治療有望成為繼手術(shù)治療、化療和放療后腫瘤治療的新武器。
乙肝病毒是一種嗜肝病毒科，小嗜肝病毒中一各成員，是引起人罹患肝炎的最主要的原 因， 一旦感染人類(lèi)，病毒會(huì)長(zhǎng)期停留在肝組織。肝癌發(fā)病與肝炎病毒關(guān)系密切。肝炎病毒 很多，有甲肝、乙肝、丙肝等等，在我國(guó)比較多見(jiàn)的是乙肝，我國(guó)乙肝病毒表面抗原陽(yáng)性( HBsAg)的人群很多。據(jù)調(diào)査，我國(guó)乙肝高發(fā)區(qū)與肝癌高發(fā)區(qū)是一致的，而肝癌組織內(nèi)，也 可以發(fā)現(xiàn)乙肝病毒，說(shuō)明肝癌和乙肝病毒關(guān)系密切， 一般90% 95%肝癌患者的肝炎病毒呈 陽(yáng)性。 一般認(rèn)為，乙肝病毒可以入侵肝細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，整合到肝細(xì)胞的DNA上，導(dǎo)致肝細(xì) 胞在分裂和復(fù)制的時(shí)候出現(xiàn)突變，突變以后就變成癌細(xì)胞了。但是，乙肝病毒引起肝癌的真 正原因和具體過(guò)程尚不清楚。乙肝病毒X蛋白(X蛋白或HBx蛋白)是一種多功能蛋白，可能 通過(guò)作為病毒啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活因子參與了病毒致病，被一些學(xué)者認(rèn)為可能是參與了乙肝病 毒引起肝癌的因素之一，當(dāng)前研究也主要集中關(guān)注乙肝病毒HBx蛋白基因的致肝癌作用。本 領(lǐng)域目前沒(méi)有乙肝病毒HBx蛋白用于防治慢性肝炎、肝癌及其并發(fā)癥的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是為治療肝癌的藥物的制備提供新的思路。本發(fā)明的技術(shù)方 案提供乙肝病毒X蛋白基因在制備治療肝癌或其并發(fā)癥的藥物中的用途。
本發(fā)明所解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供了乙肝病毒X蛋白在制備治療肝癌或其并發(fā)癥的 藥物中的用途。
本發(fā)明所解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供了一種治療肝癌的藥物。該治療肝癌的藥物是由是由乙肝病毒X蛋白或裝載有乙肝病毒X蛋白基因的表達(dá)載體添加藥學(xué)上可以接受的輔助性成 分制備而成。
進(jìn)一步的，上述表達(dá)載體是腺病毒。
更進(jìn)一步的，上述腺病毒是血清型5的腺病毒。
優(yōu)選的，上述裝載乙肝病毒X蛋白基因的表達(dá)載體由下列步驟制備而成
a、 利用酶切位點(diǎn)將乙肝病毒X蛋白編碼基因連接入入門(mén)載體；
b、 再利用基因同位重組原理，將含有X蛋白基因的入門(mén)載體與包含腺病毒基因組的載 體在重組酶的作用下進(jìn)行體外的同位重組，構(gòu)建含有目的基因和腺病毒基因組的重組質(zhì)粒；
c、 將含有目的基因和腺病毒基因組的重組質(zhì)粒經(jīng)Pac I線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝成 為含有目的基因的重組腺病毒；
d、 利用整合了Ad5 DNA片段E1區(qū)的人胚胎腎細(xì)胞293包裝重組腺病毒；
e、 收集純化重組腺病毒，添加輔料，分裝，即得。
其中，上述乙肝病毒X蛋白基因具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。 其中，上述乙肝病毒X蛋白具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。 本發(fā)明內(nèi)容的一種具體實(shí)現(xiàn)方式如下 乙肝病毒HBx蛋白基因經(jīng)過(guò)PC財(cái)廣增后，發(fā)現(xiàn)由465個(gè)核苷酸組成，由154個(gè)氨基酸編碼
乙肝病毒HBx蛋白基因的核苷酸序列如下(SEQ ID NO. 1):
乙肝病毒HBx蛋白基因編碼的氨基酸序列如下(SEQ ID NO. 2):
采用Gateway技術(shù)利用Ncol和Xhol酶切位點(diǎn)將上述X蛋白基因連接入入門(mén)載體。再利用 基因同位重組的原理，將含有HBx蛋白基因入門(mén)載體與包含腺病毒基因組的載體在重組酶的 作用下進(jìn)行體外的同位重組，構(gòu)建含有目的基因和腺病毒基因組(El， E3缺失)的重組質(zhì)粒。將含有目的基因和腺病毒基因組(El， E3缺失)的重組質(zhì)粒經(jīng)Pac I線性化后轉(zhuǎn)染整合了 Ad5 DNA片段E1區(qū)人胚胎腎293細(xì)胞，包裝成為含有目的基因重組腺病毒(Ad—X)。
本發(fā)明的有益效果在于創(chuàng)造性地將本領(lǐng)域一般認(rèn)為作為病毒啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活因子參 與了病毒致病的HBx蛋白用于制備治療肝癌的藥物，并通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明具有良好的效果 ，能很好的治療肝癌及由肝癌引起的并發(fā)癥肝腹水，為本領(lǐng)域肝癌的治療提供了一種新的選 擇。


圖l 簡(jiǎn)要構(gòu)建技術(shù)路線。
圖2 X蛋白基因的凝膠電泳圖譜。
圖3 表達(dá)載體X蛋白體外表達(dá)的驗(yàn)證。
3-A . Western-blot鑒定AD-HBX感染細(xì)胞后目的基因的表達(dá)1. AD-LacZ感染H印a細(xì)胞 ;2. AD-HBX感染H印a細(xì)胞；
3-B. RT-PCR鑒定AD-HBX感染細(xì)胞后目的基因的表達(dá)1. AD-LacZ感染H印a細(xì)胞；2、 3. AD-HBX感染H印a細(xì)胞。
圖421天的的小鼠成瘤率。
圖536天的的小鼠成瘤率。
圖6小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線l。
圖7小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線2。
圖8小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線3。
圖9小鼠生存曲線l。
圖10小鼠生存曲線2。
圖ll小鼠生存曲線3。
圖12HBx抑制H印al-6細(xì)胞的增值。
圖13HBx抑制H印G2細(xì)胞的增值。
圖14Ad-HB抑制H印a1-6和H印G2細(xì)胞的平板克隆形成能力。
圖15Ad-HBx抑制H印a1-6和H印G2細(xì)胞的體外成瘤能力。
圖16Ad-HBx誘導(dǎo)H印al-6和H印G2細(xì)胞G2/M期阻滯。
圖17Ad-HBx抑制動(dòng)物模型腫瘤生長(zhǎng)。
圖18Ad-HBx延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存時(shí)間。
圖19HBx對(duì)腹膜通透性的抑制作用。圖20 HBx對(duì)H22誘導(dǎo)的惡性腹水的抑制作用。 圖21腹水中腫瘤細(xì)胞紅細(xì)胞計(jì)數(shù)。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖通過(guò)對(duì)具體實(shí)施方式
的描述以詳細(xì)說(shuō)明但不限制本發(fā)明。 具體而言
實(shí)施例一 重組腺病毒Ad-X的制備 構(gòu)建過(guò)程的簡(jiǎn)要技術(shù)路線見(jiàn)圖l。主要包括以下步驟
a、 采用Gateway技術(shù)利用Ncol和Xhol酶切位點(diǎn)將乙肝病毒X蛋白基因連接進(jìn)入門(mén)載體；
b、 再利用基因同位重組的原理，將含有X蛋白基因的入門(mén)載體與包含腺病毒基因組的 載體在重組酶的作用下進(jìn)行體外的同位重組(請(qǐng)核實(shí)同位重組這種說(shuō)法)，構(gòu)建含有目的基 因和腺病毒基因組(El， E3缺失)的重組質(zhì)粒；
c、 將含有目的基因和腺病毒基因組(El， E3缺失)的重組質(zhì)粒經(jīng)Pac I線性化后轉(zhuǎn)染 293細(xì)胞，包裝成為含有目的基因的重組腺病毒(Ad—X);
d、 利用整合了Ad5 DNA片段E1區(qū)的人胚胎腎細(xì)胞293包裝重組腺病毒；
e、 收集純化重組腺病毒，添加輔料，分裝，即得。
1、 克隆的構(gòu)建和鑒定
重組腺病毒的構(gòu)建過(guò)程按Gateway試劑盒——AdenoVator Vector Systems的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行
2、 X基因的擴(kuò)增及克隆的構(gòu)建 2. 1 X基因的擴(kuò)增
2.1.1引物設(shè)計(jì)
根據(jù)X基因序列(見(jiàn)圖5)設(shè)計(jì)并合成PCR引物， 上游引物(SEQ ID NO. 3):TTMCCATQXTQCTAGGCTGTGCTGC' 3 NC01酶切位點(diǎn) 下游引物(SEQ ID NO. 4): 5 、 GGCTCGA3TTAGOCAGAGGTGAMMGTTG、 3 化01 酶切位點(diǎn) 2. 1. 2 X基因的擴(kuò)增
使用TaKaRa公司的T叫DNA聚合酶擴(kuò)增X cDNA^段， 按照說(shuō)明進(jìn)行操作，PCR反應(yīng)條件如下 DdH20 63 W 1
IOX擴(kuò)增緩沖液 10 tU 50iaM MgCL 5 " 1
2. 5 mM dWTF 2 4 1
上游引物(IO JiM) 2 Ul 下游引物(IO 4M) 2 tU 模板cDNAflng) 1 tU Taq DNA polymerase (1U/" 1)1 " 1
PCR反應(yīng)混合物在94'C變性5分鐘后，按下列條件進(jìn)行反應(yīng)
94。C變性30秒；5(TC退火45秒；72。C延伸60秒。反應(yīng)30個(gè)循環(huán)。然后72。C再延伸10分鐘
1% Agarose電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小。 2. 1.3 X基因的回收和純化
PCR產(chǎn)物用NCOl和Xhol雙酶切，37。C作用2小時(shí)，1% Agarose電泳后，使用Promega公司 試劑盒，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的方法回收PCR片段； X基因片段大小為465bp。 2.2擴(kuò)增入門(mén)載體——pENTR ll 2.2.1入門(mén)載體的細(xì)菌培養(yǎng)
將本實(shí)驗(yàn)室保存的入門(mén)載體——pENTRTMlW々E.Coli接種于含有Kanamycin LB液體培 養(yǎng)基中，37"C搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜。2.2.2入門(mén)載體提取
以O(shè)mega試劑公司的質(zhì)粒提取試劑盒(Promega. E. N. N. A. Plasmid Minipr印Kit D6942)提取質(zhì)粒。
1% Agarose電泳檢測(cè)質(zhì)粒載體出現(xiàn)線型、開(kāi)環(huán)、超螺旋結(jié)構(gòu)的三條帶。 2.2.3入門(mén)載體的酶切分析
以NC01酶切入門(mén)載體，以確定入門(mén)載體大小是正確。
NC01 1 y 1
10X K Buffer 2y 1
0. 1% BSA 2 y 1
Plasmid DNA 5y 1
DW 10 yl
Total volume20 y 1 37°C作用l小時(shí)，1% Agarose電泳檢測(cè)質(zhì)粒大小。 出現(xiàn)2. 7Kb—條帶。
2.2.4 入門(mén)載體經(jīng)NC01和Xhol雙酶切，37"C作用2小時(shí)，1% Agarose電泳后，使用 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2. 0按試劑盒的方法回收載體片段；
2.2.5 X基因與入門(mén)載體的連接
將回收的X基因片段和載體的片段按一定比例，在T4 DNA連接酶連接，16'C溫育過(guò) 夜連接。轉(zhuǎn)染T叩10細(xì)胞。
X基因片段0.68y 1 pENTll 5yl Ligation Sol5.68 y 1 輕輕混勻上述反應(yīng)體系后，置16'C連接過(guò)夜。 2.2.6轉(zhuǎn)化大腸桿菌T叩IO感受態(tài)細(xì)胞
連接混合物l 3u l加入至100 200y l感受態(tài)細(xì)胞中，在冰上冷卻10分鐘，42。C熱休克 90秒，再冰上放置2分鐘，力nS0C培養(yǎng)基400 700y 1， 37°C培養(yǎng)45分鐘后圖布于平版 LB-Kanamycine+ ，結(jié)果出現(xiàn)了克隆。
2. 2. 7重組單克隆鑒定
2.2.7.1酶切分析
10X Buffer 2y 110%BSA 0.2yl DNA 5 y 1
NC01 1 y 1
DW to 20 y 1
37。C作用2小時(shí)，1% Agarose電泳后，出現(xiàn)了與理想的片段大小一致。
2.2.7.2 PCR特異性條帶的擴(kuò)增
采用X基因特異性引物進(jìn)行PC財(cái)廣增，結(jié)果擴(kuò)增出了465bp的片段。
2.2.7.3 X基因的序列測(cè)定
酶切驗(yàn)證重組成功的陽(yáng)性克隆送上海博亞生物技術(shù)有限公司自動(dòng)測(cè)序儀(ABI PRISM 3730 DNA sequencer)測(cè)序。獲得了與預(yù)測(cè)的序列完全相同的片段。
3. 包含腺病毒基因組的重組質(zhì)粒的構(gòu)建
將含有腺病毒基因組(E1， E3缺失)目的質(zhì)粒(AmpK)轉(zhuǎn)化入BD.3. l感受態(tài)細(xì)胞，制備目 的載體。
3.1目的載體的鑒別 3.1.1酶切
以BamH l單酶切，切出了大小分別為19000bp， 14000bp， 1900bp， 465bp四個(gè)條帶
10x Buffer 2y 1
DNA 5 y 1
BamHI 1 y 1
DW 12 yl
Total volume 20 y 1 37。C作用2小時(shí)，0.8%瓊脂糖電泳。 3.1.2 PCR檢測(cè)，確認(rèn)為目標(biāo)產(chǎn)物。
4. 表達(dá)載體的構(gòu)建
4. 1采取同位重組的方法，利用Invitrogene公司的Gateway技術(shù)將入門(mén)載體和目的載 體在重組酶的作用下進(jìn)行體外的同位重組，獲得含有腺病毒基因組(El， E3缺失)的環(huán)狀質(zhì) 粒pAdenoVator AE1E3，篩選重組子-pAd-F或pAd-P或pAd-FP，再進(jìn)行鑒定。
Entry Clone 10 y 1
Destination Vector 2yl5XLR clonase buffer 4yl TE Buffer pH 8. 0 to 16y 1
TM
LR clonaseenzyme 4yl 輕輕混勻上述反應(yīng)體系后，置25'C作用過(guò)夜。 加蛋白酶K2yl， 37。C作用10分鐘，轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)細(xì)胞。
4.2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞 將同位重組連接混合物ly l加入50y 1的感受態(tài)DH5a細(xì)胞中，輕輕混勻后，冰上放置 30分鐘，在42。C熱休克30秒，再冰上放置2分鐘，加入450SOC (Amp—)培養(yǎng)基，37。C搖 動(dòng)培養(yǎng)1小時(shí)。取20y l涂布LB(Ampr)， 37r培養(yǎng)過(guò)夜，出現(xiàn)了菌落。 4. 3篩選重組克隆pAd-X
4.3.1檢査平版上的克隆，對(duì)照組沒(méi)有克隆生長(zhǎng)，重組平板上長(zhǎng)出了克隆。 4.3.2挑取2個(gè)較小的克隆接種于5ml LB，振搖培養(yǎng)16-18小時(shí)； 4.3.3立即抽提質(zhì)粒，0. 7% Agarose電泳檢査質(zhì)粒的大小；
4.3.4以X蛋白基因進(jìn)行特異引物進(jìn)行PC財(cái)廣增，檢査是否有465bp的特異性條帶擴(kuò)增 出來(lái)。
將提取的質(zhì)粒用于PC財(cái)廣增，以鑒別是否重組成功。 10X PCR Buffer 5y 1
25mM MgCl2 5 y 1
dNTPmix 8 y 1
10ym Pr lyl
10ym Pf lyl
Taq 0. 8 y 1
Plasmid 1 y 1
DW 29 y 1
Total Volume 50 y 1
90'C 5min
94*C 30sec 1
50C 45 sec f 3Q個(gè)循環(huán)
72'C lmin
72C 5min4. 3. 5將篩選到的重組子分別轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，大量擴(kuò)增并制備重組質(zhì)粒。
6.重組質(zhì)?！猵Ad-X轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，篩選重組腺病毒Ad-X
6. 1脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞 按照試劑盒方法進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞置于孵箱，37°C， 5%(]02培養(yǎng)，5 10天，直至所有 細(xì)胞出現(xiàn)CPE。收獲細(xì)胞及其上清，-20卩/371:反復(fù)凍融三次，離心去細(xì)胞碎片，上清即為 病毒種子液，保存于-8(TC。
6. 2單克隆重組腺病毒的篩選——重組腺病毒空斑的形成
1) 將消化后的293接種6孔板，置于孵箱，37°C， 5%(]02培養(yǎng)；
2) 待細(xì)胞貼壁后，將6. 1制備的病毒種子液用DMEM做5個(gè)稀釋度1:10—3、 1:10—4、 1:10—5、 1:10—6、 1:10—7，將6孔板中細(xì)胞，每孔加入lml的病毒稀釋液，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照孔 ，只加入lml DMEM 2%，置于孵箱，37。C， 5%(]02培養(yǎng)1小時(shí);
3) l小時(shí)后，在單層細(xì)胞上均勻覆蓋一層5ml 1. 25% agarose/DMEM 5%，置于孵箱，37 °C， 5%(]02培養(yǎng)直至空斑形成；
4) 其中每隔4-5天，再在細(xì)胞及瓊脂表面覆蓋一層l. 5ml 1.25% agarose/DMEM 5%以提 供細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；
5) 大約在第7天形成在顯微鏡下可見(jiàn)的空斑，第10天就可形成在顯微鏡下非常明顯的空 斑及從培養(yǎng)皿底部看過(guò)去得到肉眼可見(jiàn)的白色點(diǎn)狀，第14天就可挑取空斑。
6. 3小規(guī)模擴(kuò)增重組腺病毒
1) 在培養(yǎng)皿上各選擇6個(gè)邊界清晰，做好標(biāo)記；
2) 無(wú)菌條件下，挑取空斑，轉(zhuǎn)移至24孔板，每孔加入O. 5ml DMEM 5%;
3) 37°C放置24小時(shí)以使病毒顆粒從瓊脂中釋放出來(lái)；
4) 同時(shí)，接種293細(xì)胞于24孔板；
5) 第二天，移去培養(yǎng)基，小心加入100yl的病毒液，輕輕在單層細(xì)胞表面混勻，置于 孵箱，37°C， 5%(]02培養(yǎng)90分鐘；
6) 加入DMEM 5。/。補(bǔ)足lml，輕輕混勻；
7) 將24孔板置于孵箱，37°C， 5。/。C02培養(yǎng)直至完全CPE出現(xiàn)；
8) 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到完全CPE時(shí)，收獲細(xì)胞及其上清，-20卩/371:反復(fù)凍融三次，離心去細(xì)胞 碎片，上清即為病毒種子液，保存于-8(TC。
6. 4大規(guī)模培養(yǎng)HBx重組腺病毒
利用生物反應(yīng)器進(jìn)行病毒規(guī)?；囵B(yǎng)，收獲病毒液和細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)三次反復(fù)凍融后，離心，收集上清進(jìn)行病毒純化。
病毒純化工藝為病毒液一經(jīng)過(guò)O. 8/0. 45 y m過(guò)濾一300kD超濾一陰離子交換一步柱層析 —300kD超濾/脫鹽濃縮一過(guò)濾除菌一病毒原液。
6.5獲得的X蛋白基因和蛋白的驗(yàn)證
6.5.1 X蛋白基因的苷酸序列(SEQ ID NO. 1 ):由465個(gè)核苷酸組成，編碼154個(gè)氨 基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO. 2)。
6. 5. 2表達(dá)載體中X蛋白基因的驗(yàn)證
回收目標(biāo)蛋白帶，用于基因序列測(cè)定(見(jiàn)圖2)，結(jié)果證明該目標(biāo)蛋白由465個(gè)核苷酸組 成，由154個(gè)氨基酸編碼，核苷酸和氨基酸序列也與報(bào)道一致。
6.5.3 X蛋白體外表達(dá)的驗(yàn)證見(jiàn)圖3，結(jié)果表明有X蛋白表達(dá)。
因?yàn)橄俨《揪哂兴拗鞣秶鷱V，可以感染非分裂和分裂時(shí)期的細(xì)胞；感染效率高，可得到 高滴度的腺病毒(1012pfu/ml);插入的外源基因片段可以達(dá)到7.5kb，可介導(dǎo)外源基因瞬 時(shí)高表達(dá)；復(fù)制過(guò)程中不整合到宿主細(xì)胞染色體中，無(wú)插入突變的危險(xiǎn)；易于操作等生物學(xué) 特性，所以，本發(fā)明選用復(fù)制缺陷型的血清5型腺病毒作為基因治療的載體，創(chuàng)新性利用 HBx作為乙肝病毒的一種抗原物質(zhì)，開(kāi)發(fā)治療肝癌的藥物。
本發(fā)明利用Gateway技術(shù)，將HBx蛋白基因連接到入門(mén)載體，再將帶有目的基因的入門(mén)載 體與帶有腺病毒基因信息的目的載體進(jìn)行體外重組，選用帶有包裝腺病毒的293細(xì)胞包裝完 整的重組腺病毒。通過(guò)CsCL密度梯度離心和柱層析純化，獲得質(zhì)量較好的純化病毒，并對(duì) 病毒質(zhì)量按照《人基因治療及制劑質(zhì)量控制原則》進(jìn)行了病毒的各項(xiàng)質(zhì)量控制。
通過(guò)蝕斑篩選和PCR鑒定本發(fā)明得到的重組腺病毒為復(fù)制缺陷型，未含有具復(fù)制活性的 腺病毒(R印lication competent adenovirus, RCA)。然后用RT-PCR和Western blot方法 對(duì)Ad-HBx的體外表達(dá)進(jìn)行了研究。利用篩選出的病毒進(jìn)行肝癌的治療，并對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行 研究。
實(shí)施例二本發(fā)明X蛋白重組腺病毒的功效實(shí)驗(yàn) 所用的主要儀器設(shè)備 1) PCR儀Hybaid公司，型號(hào)PxE 。
2) 恒溫?fù)u床Forma公司，型號(hào)4580 。
3) 凝膠成像系統(tǒng)Bio-Rad公司，型號(hào)Fluor-S 。
4) 電穿孔儀Bio-Rad公司，型號(hào)Gene Pulser Xcell 。
5) 生物安全柜Forma公司，型號(hào)A/B3 。6) C02孵箱Forma公司，型號(hào)3111 。
7) 液氮罐Forma公司，型號(hào)8031 。
8) 倒置相差顯微鏡Olympus公司，型號(hào)CK40 。
9) 倒置相差顯微鏡Nikon公司，型號(hào)TE2000U 。
10) 冷凍高速離心機(jī)Beckman公司，型號(hào)J25 。
11) 冷凍超速離心機(jī)Beckman公司，型號(hào)Optima L-100XP 。
12) 超低溫冰箱SANYO公司，型號(hào)MDF-382E 。
13) 紫外分光光度儀Bio-Rad公司，型號(hào)SmartSpec 3000 。
14) 酶標(biāo)儀Bio-Rad公司，型號(hào)550 。
15) 核酸水平電泳系統(tǒng)Bio-Rad公司。
16) 蛋白垂直電泳系統(tǒng)Bio-Rad公司，型號(hào)Mini PROTEIN 3 。
17) 純水儀Millipore公司，型號(hào)EASYpure UF 07412 。
1、 X蛋白重組腺病毒的對(duì)小鼠肝癌的成瘤性的影響
將小鼠(C57)接種小鼠肝癌細(xì)胞后，以HBx蛋白重組腺病毒分別對(duì)小鼠進(jìn)行治療。不同 時(shí)間的小鼠成瘤率見(jiàn)圖4、圖5。不同時(shí)間的小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖6、圖7及圖8，不同時(shí)間 的小鼠生存曲線見(jiàn)圖9、圖10及圖11。
2、 X蛋白重組腺病毒對(duì)肝癌荷瘤小鼠的治療
(1) .細(xì)胞增殖活力檢測(cè)
MTT: 1.0X1()4個(gè)H印al-6和H印aG2細(xì)胞接種到96孔板過(guò)夜貼壁后用Ad-HBx或 Ad-null (M0I=30， 50 and 100)感染，4h后棄病毒，感染72h后加入MTT孵育4小時(shí)，加入 DMSO，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處吸光值。
MTT結(jié)果表明HBx能夠抑制H印a1-6 (圖12)和H印G2 (圖13)細(xì)胞的增值(P 〈 0.01)，抑制率為15% 35%。
平板克隆實(shí)驗(yàn)H印al-6和H印aG2細(xì)胞接種到6孔板，待長(zhǎng)至 95。/。融合時(shí)用AchHBx或 Ad-null (M0I=30)感染，4h后將細(xì)胞消化、重懸，分別按2， 000個(gè)/孔和1， 000個(gè)/孔接 種于6孔板。10天后，4%多聚甲醛固定染色，光鏡下計(jì)克隆數(shù)(〉50個(gè)細(xì)胞為一克隆)。
Ad-HBx能夠明顯抑制H印al-6和H印G2細(xì)胞的平板克隆形成能力(P 〈 0.01)(圖14)。
(2) 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)(體外成瘤)
6孔板中鋪2. OmLO. 5%下層瓊脂糖培養(yǎng)基，5乂103個(gè)H印al-6， H印aG2細(xì)胞或Ad-皿ll或 Ad-HBx感染的H印al-6， H印aG2細(xì)胞重懸在l mL 0.375%上層瓊脂糖培養(yǎng)基中，鋪于下層培養(yǎng)基之上。37°C， 5% C02培養(yǎng)2周后，體視顯微鏡下計(jì)克隆數(shù)OIOO細(xì)胞為一個(gè)克隆)。 Ad-HBx能夠明顯抑制H印al-6和H印G2細(xì)胞的體外成瘤能力(P 〈 0.01)(圖15)。
(3) 流式細(xì)胞術(shù)分析
2.0X105 and 5.0X1()5個(gè)H印G2或H印al-6細(xì)胞接種于6孔板過(guò)夜貼壁后用Ad-HBx或 Ad-皿ll (M0I=30)感染。72h后收集細(xì)胞，加PI染色后上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和凋亡。
Ad-HBx能夠明顯誘導(dǎo)H印a1-6和H印G2細(xì)胞G2/M期阻滯(P 〈 0.01)(圖16)。
(4) .細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
Ad-HBx或Ad-null (M0I=30)感染72h后的H印G2或H印al-6細(xì)胞用4%多聚甲醛固定和 PI染色后，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞核的形態(tài)。
Ad-HBx能夠明顯誘導(dǎo)細(xì)胞變圓和細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核呈巨大核和多核。
(5) .體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
1.5Xl()6個(gè)H印al-6細(xì)胞接種于6 — 8周齡C57小鼠皮下，接種6天后待形成皮下瘤后，隨 機(jī)分成三組并給予瘤內(nèi)注射治療，每3天1次，共4次
① 生理鹽水組(n=8， 100yl/只，瘤內(nèi)注射)
② 空病毒Ad-null對(duì)照組(n=7， 2X108 pfu/100yl/只，瘤內(nèi)注射)
③ Ad-HBx治療組(n=8， 2X108 pfu/100yl/只，瘤內(nèi)注射) 觀察小鼠腫瘤體積和荷瘤小鼠生存時(shí)間。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Ad-HBx能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)(圖17)，并且顯著延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存時(shí)間 (圖1S)。
(6) .組織學(xué)分析
治療結(jié)束后3天將小鼠處死，剝離腫瘤組織固定、包埋、切片行H&E和CD31免疫組織化
學(xué)染色。
組織學(xué)分析表明Ad-HBx在體內(nèi)不經(jīng)能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還能夠誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及 腫瘤新生血管形成，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。
實(shí)施例三本發(fā)明X蛋白重組腺病毒抗肝癌腹水的治療作用實(shí)驗(yàn)研究 1. 方法
1.1鼠肝癌細(xì)胞株(H22)的培養(yǎng)取保存于液氮中的小鼠肝癌H22細(xì)胞，37。C復(fù)蘇，含 10。/。胎牛血清的1640培養(yǎng)基37。C， 5%(]02的孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，收集細(xì)胞，無(wú)血清 1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，取1X1()7個(gè)H22細(xì)胞接種于小鼠腹腔中，腹腔傳代3次。1.2腹水模型的建立抽取適量腹水，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用生理鹽水稀釋腹水濃度為2.5X 106 /ml，每只小鼠腹腔內(nèi)接種細(xì)胞5X105 /個(gè)。
1.3惡性腹水的治療接種三天有腹水形成后，將小鼠隨機(jī)分組，每組7只。第一組為 AD-HBX治療組；每三天腹腔注射3X108pfu重組HBx腺病毒，共3次.
1.4腹膜滲透性的觀察治療結(jié)束后第3天每組隨機(jī)取5只從小鼠的尾靜脈注射0.2 ml Evan藍(lán)(5 g/L) ，2 h后處死小鼠并收集腹水，將腹水離心后用酶標(biāo)儀檢測(cè)Evan藍(lán)的濃度， 檢測(cè)波長(zhǎng)為540 nm，從而分析腹膜滲透性。
1.5細(xì)胞計(jì)數(shù)腹水涂片同時(shí)處死其他小鼠。收集、計(jì)量腹水，并計(jì)數(shù)腹水中紅細(xì)胞 、腫瘤細(xì)胞。取少量腹水，涂片，室溫放置5 min，瑞氏染液染色lmin，自來(lái)水沖洗，晾干， 封片。
1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞周期和凋亡每組小鼠收集等體積腹水，3000 r/m，離心3 min， PBS洗滌細(xì)胞三次，制成單細(xì)胞懸液，每個(gè)樣本細(xì)胞總數(shù)為l X 106再加入碘化丙錠(PI) 避光染色30 min，采用美國(guó)BD公司FACSort型流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。
1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法各組測(cè)定數(shù)據(jù)間的顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)。
2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2. 1 對(duì)腹膜滲透性的影響
結(jié)果顯示重組人HBx腺病毒治療組小鼠的Evan藍(lán)OD值明顯低于空載組及生理鹽水對(duì)照組 (P〈0.05)，見(jiàn)圖19。從圖上我們可以看出，Ad-HBx明顯延緩了腫瘤細(xì)胞對(duì)腹膜的侵犯，顯示 了Ad-HBx對(duì)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖的抑制作用。
2. 2 對(duì)腹水的抑制作用
治療結(jié)束后第三天將全部小鼠處死，量取各組小鼠腹水總量，求平均值，見(jiàn)圖20.結(jié)果 顯示重組人HBx腺病毒處理組與腺病毒空載組及生理鹽水對(duì)照組相比，小鼠的腹水量均受到 明顯的抑制(P〈0.05)。
2.3細(xì)胞計(jì)數(shù)及腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)
將各組小鼠腹水細(xì)胞分別集中，5000 r/m，離心10 min，生理鹽水洗滌并稀釋合適濃度， 細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示重組人HBx腺病毒處理組小鼠腹水中的紅細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞明顯少于空載 組及生理鹽水對(duì)照組(P〈0.05)，見(jiàn)圖21。根據(jù)前面所得的結(jié)果，不難看出HBx首先抑制腫瘤 細(xì)胞的惡性增殖，遏制其對(duì)腹膜的侵犯，最終延緩血性腹水的發(fā)生。
2. 6腹水涂片觀察腫瘤細(xì)胞和紅細(xì)胞
HBx處理組的腫瘤細(xì)胞可見(jiàn)較多類(lèi)似于凋亡的細(xì)胞，而僅有少量紅細(xì)胞存在；而在對(duì)照組可見(jiàn)正在分裂的腫瘤細(xì)胞，且有大量紅細(xì)胞的存在，進(jìn)一步證實(shí)了HBx抑制腫瘤細(xì)胞，進(jìn) 而延緩對(duì)腹膜的侵犯的結(jié)論。
2. 7腹水中腫瘤細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞周期改變的測(cè)定
細(xì)胞流式結(jié)果表明，重組人HBx腺病毒治療組腫瘤細(xì)胞較空載腺病毒及生理鹽水組有明 顯的G2/M期阻滯，并未見(jiàn)明顯的細(xì)胞凋亡。
HBx重組腺病毒用于治療小鼠肝癌作用研究，主要觀察了HBx對(duì)小鼠成瘤性的影響。首先 將轉(zhuǎn)化有HBx基因的小鼠肝癌細(xì)胞(H印al-6)皮下接種小鼠，設(shè)立轉(zhuǎn)化有空腺病毒小鼠肝 癌細(xì)胞以及沒(méi)有轉(zhuǎn)化任何基因的正常的肝癌細(xì)胞。再分別以Ad—HBx、 Ad—皿ll、 PBS分別對(duì) 小鼠進(jìn)行治療。通過(guò)觀察小鼠形成腫瘤早遲、腫瘤生長(zhǎng)大小、小鼠的生存期等方面指標(biāo)，對(duì) HBx重組腺病毒的抗腫瘤活性進(jìn)行研究。采集HBx重組腺病毒免疫小鼠的脾組織，分離淋巴細(xì) 胞，測(cè)定小鼠特異性的T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷作用以及參與治療肝癌的主要的 一些細(xì)胞因子進(jìn)行了研究。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBx對(duì)小鼠成瘤性有顯著的抑制作用，實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤形成遲，接種腫瘤細(xì)胞 后21天時(shí)，80%小鼠沒(méi)有腫瘤，對(duì)照組卻有100%小鼠形成了腫瘤；實(shí)驗(yàn)組少數(shù)部分小鼠在 中后期長(zhǎng)出了腫瘤，但是，腫瘤生長(zhǎng)速度較對(duì)照組小鼠腫瘤生長(zhǎng)慢、體積?。粚?shí)驗(yàn)組小鼠生 存期比對(duì)照組小鼠生存期長(zhǎng)。免疫小鼠T淋巴細(xì)胞對(duì)肝腫瘤細(xì)胞具有明顯的特異性的殺傷作 用，其中008+ T淋巴細(xì)胞主要參與了HBx重組腺病毒誘導(dǎo)的對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。IFN-y ，IL-2等細(xì)胞因子參與了HBx抗腫瘤活性的作用。本研究表明HBx重組腺病毒具有良好的殺傷 腫瘤細(xì)胞的作用。結(jié)果表明HBx在制備治療肝癌的生物基因藥物上前景很大。
另外，還將本發(fā)明HBx蛋白重組腺病毒在體外對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表 明HBx對(duì)肝癌細(xì)胞具有殺傷作用，主要是通過(guò)干擾細(xì)胞生長(zhǎng)周期達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。 利用HBx重組腺病毒治療小鼠肝腹水試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HBx對(duì)小鼠腹水的治療作用也很明顯。
總之，本發(fā)明利用HBx重組腺病毒治療肝癌及肝癌引起的肝腹水，收到了明顯的抑制腫 瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為肝癌治療生物藥物的制備提供了新的選擇。SEQUENCE LISTING
110>四川大學(xué)
〈120>乙肝病毒x蛋白及其編碼基因在制備治療肝癌的藥物中的用途
〈130> A090063k
〈150> CN 2008/10304972. 4
〈151> 2008-10-17
〈160> 4
〈170> Patentln version 3.4
〈210> 1
〈211> 465
〈212> DNA
〈213> artificial
〈220>
〈223> artificial
〈400> 1
atggctgctaggctgtgctgccaactggatcctgcgcgggacgtcctttgtttacgtccc60
gtcggcgctgaatcctgcggacgacccttctcggggtcgcttgggactctctcgtcccct120
tctccgtctgccgttccgaccgaccacggggcgcacctctctttacgcggactccccgtc180
tgtgccttctcatctgccggaccgtgtgcacttcgcttcacctctgcacgtcgcatggag240
accaccgtga3CgCCC3CC3aatattgcccaaggtcttactcttggactc300
tcagcaatgtC肌Cg3CCg3ccttgaggcatacttca肌gactgtttgtttaaagactgg360
gaggagttggtaggttaaaggtctttgtactaggaggctg420
ttggtctgcgC3CC3gC3CCatgcaactttttcacctctg465
〈210> 2
〈211> 154
〈212> PRT
〈213> artificial
〈220>〈223> artificial 〈400> 2
Met 1
Cys
Ala Ala Arg
Leu
Ser Leu
His
Ser
65
Thr
Gly
50
Ala
Arg Pro
20 Gly Thr 35
Ala His Gly Pro
Thr Val Asn
Thr Leu
Lys Asp
Leu
Pro 145
Lys 130 Ala
Leu Cys 5
Val Gly
Gly Leu 100 Cys Leu 115
Val Phe Pro Cys
Cys Gin Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
Ala Glu
Leu Ser Ser
Leu Ser
Cys Ala
70 Ala His 85
Ser Ala
Leu
55
Leu
Val Leu
Asn Phe 150
Gly 135 Phe
Pro
40
Arg
Ser
25
Ser
10
Cys
Gly Arg Pro
Pro Ser Ala
Gly Leu Pro
Arg Phe Thr
Glu lie Leu
Met Ser
Phe Lys Asp
Trp 120 Gly
Thr 105 Glu
Pro
90
Thr
Ser
75
Lys
Val
60
Ala
Val
45
Cys
Phe
30
Pro
15
Ser
Gly
Thr Asp
Ala Phe Ser
Arg Arg Met
Val Leu His
Asp Leu Glu
Glu Leu Gly
Cys Arg His
Lys 140
Glu 125 Leu
Ala 110 Glu
Lys
95
Tyr
Glu
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Arg
Phe
lie Arg
Val Cys Ala
Thr Ser Ala
〈210> 3
〈211> 27
〈212> DNA
〈213> artificial
〈220>
〈223> artificial〈400> 3
ttaaccatgg ctgctaggct gtgctgc 27
〈210> 4
〈211> 30
〈212> DNA
〈213> artificial
〈220>
〈223> artificial
〈400> 4
ggctcgagtt aggc卿ggt gaaaaagttg 30
權(quán)利要求
權(quán)利要求1乙肝病毒X蛋白編碼基因在制備治療肝癌或肝癌并發(fā)癥的藥物中的用途。
2.乙肝病毒X蛋白在制備治療肝癌或肝癌并發(fā)癥的藥物中的用途。
3.治療肝癌或肝癌并發(fā)癥的藥物，是由乙肝病毒X蛋白或裝載有乙肝 病毒X蛋白編碼基因的表達(dá)載體添加藥學(xué)上可以接受的輔助性成分制備而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的治療肝癌或肝癌并發(fā)癥的藥物，其特征在于 所述的乙肝病毒X蛋白編碼基因具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的治療肝癌或肝癌并發(fā)癥的藥物，其特征在于 所述的表達(dá)載體是腺病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的治療肝癌或肝癌并發(fā)癥的藥物，其特征在于 所述的腺病毒是血清型5的腺病毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的治療肝癌或肝癌并發(fā)癥的藥物，其特征在于 所述裝載乙肝病毒X蛋白基因的表達(dá)載體由下列步驟制備而成a、 利用酶切位點(diǎn)將乙肝病毒X蛋白編碼基因連接入入門(mén)載體；b、 再利用基因同位重組原理，將含有X蛋白基因的入門(mén)載體與包含腺病毒基因組的載 體在重組酶的作用下進(jìn)行體外的同位重組，構(gòu)建含有目的基因和腺病毒基因組的重組質(zhì)粒；c、 將含有目的基因和腺病毒基因組的重組質(zhì)粒經(jīng)Pac I線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝成 為含有目的基因的重組腺病毒；d、 利用整合了Ad5 DNA片段E1區(qū)的人胚胎腎細(xì)胞293包裝重組腺病毒；e、 收集純化重組腺病毒，添加輔料，分裝，即得。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的乙肝病毒X蛋白 具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的治療肝癌或肝癌并發(fā)癥的藥物，其特征在于所述的乙肝病毒X蛋白具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列
全文摘要
本發(fā)明屬于疾病基因治療領(lǐng)域。涉及乙肝病毒X蛋白基因(HBx)在制備治療肝癌及肝癌并發(fā)癥的藥物中的用途。本發(fā)明的技術(shù)方案是提供乙肝病毒X蛋白基因(HBx)及其編碼的蛋白在制備治療肝癌及肝癌并發(fā)癥的藥物中的用途。本發(fā)明將將乙肝病毒X蛋白基因重組入腺病毒載體，用于肝癌的治療的藥物。本發(fā)明創(chuàng)造性地將本領(lǐng)域一般認(rèn)為作為病毒啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活因子參與了病毒致病的HBx蛋白用于制備治療肝癌的藥物，并通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明具有良好的效果，能很好的治療肝癌及由肝癌引起的并發(fā)癥肝腹水，為本領(lǐng)域肝癌的治療提供了一種新的選擇。
文檔編號(hào)C12N15/51GK101502642SQ200910300989
公開(kāi)日2009年8月12日 申請(qǐng)日期2009年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月17日
發(fā)明者文艷君, 李玉華, 莉 楊, 霞 趙, 魏于全 申請(qǐng)人:四川大學(xué)