專利名稱：定量檢測轉基因水平的方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及轉基因水平的定量檢測方法，特別是涉及一種使用攜帶內源和外源基因的重組質粒混合物制備的標準品檢測轉基因植物的轉基因水平的方法，以及用于完成所述的定量檢測的試劑盒。
背景技術：
由于轉基因植物具有原品種所不具備的抗旱、抗病、抗蟲、抗病毒或抗除草劑等優(yōu)良生物學品質，所以轉基因植物的生產(chǎn)面積逐年增加。例如，2002年全球轉基因谷物(主要是大豆和玉米)的種植總面積達1.45億英畝(約5867萬公頃)。目前，全球已有16個國家約600萬農(nóng)民以種植轉基因作物為生。
然而，世界上有些國家和地區(qū)，特別是歐洲至今仍對轉基因食品采取強烈抵制態(tài)度。歐洲抵制美國等國家的轉基因食品主要出于兩方面的原因一是來自綠色和平組織的抵制；另一方面主要是國際貿易的影響。
正是由于轉基因食品的支持者和反對者之間的爭論不休，各國政府對轉基因食品上市過程采取了一些具體措施。2001年，由113個國家和地區(qū)簽署的聯(lián)合國《生物安全議定書》明確規(guī)定，必須對轉基因產(chǎn)品進行安全評價，在轉基因產(chǎn)品越境轉移時，應該征得進口國的同意，并進行標識。根據(jù)歐盟國家的新的轉基因食品法規(guī)，凡含有0.9％以上轉基因DNA或蛋白質的農(nóng)作物或食品，在市場上銷售時，必須貼上“GMO(轉基因)”字樣的標簽。中國也于2002年3月開始實施轉基因食品標識制度，并于2004年開始實施《進出境轉基因產(chǎn)品檢驗檢疫管理辦法》。因此，迫切要求建立一種切實可靠的轉基因產(chǎn)品的定量檢測手段。
目前，用于轉基因檢測的已有方法主要有兩類一是在核酸水平上進行檢測，即通過PCR和Southern雜交方法檢測基因組DNA中的轉基因片段，或用RT-PCR和Northern雜交方法檢測轉基因植物的mRNA和反義RNA水平；二是在蛋白水平上進行檢測，包括檢測轉基因植物中目的基因表達產(chǎn)物的酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法，和檢測蛋白質表達產(chǎn)物的生物化學性質的生化檢測法。
其中，聚合酶鏈反應(PCR)方法是目前應用于檢測轉基因植物或其產(chǎn)品的最常用方法。雖然理論上PCR方法能用于檢測所有的轉基因產(chǎn)品，但較易出現(xiàn)假陽性。另外，雖然ELISA方法具有很強的特異性，但無法檢測未表達的目的基因。
由于目前所使用的轉基因熒光定量檢測試劑盒的的標準品幾乎全部來自歐洲，所以檢測試劑盒的生產(chǎn)成本很高，導致轉基因產(chǎn)品的檢測費用過大。為了減少轉基因的檢測費用，更好的推廣轉基因食品的標識制度，本發(fā)明人在基于原有歐洲標準品的轉基因試劑盒的基礎上，通過DNA重組技術成功地制備了用于轉基因水平檢測的質粒定量標準品，不但簡化的標準品的制作工藝，而且大大降低了轉基因試劑盒的生產(chǎn)和使用成本。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種轉基因含量的定量檢測方法，特別是使用一種含有待檢測轉基因作物內源基因的重組質粒和含有待檢測轉基因植物插入片段的重組質粒的混合質粒定量檢測轉基因植物中的轉基因水平的方法。本發(fā)明進一步提供基于所說的標準品的轉基因水平檢測試劑盒。
目前已有的轉基因定量檢測試劑盒中所使用的標準品大都是由Fluka公司提供的定量檢測標準品(以下稱為現(xiàn)有標準品)。該標準品在轉基因檢測試劑盒的生產(chǎn)成本中占很大比例，而且其基因提取過程繁雜，提取的數(shù)量也很有限，因此不利于轉基因水平定量檢測試劑盒的大批量生產(chǎn)。為了克服現(xiàn)有技術的缺陷和不足，本發(fā)明人在現(xiàn)有標準品的基礎上，設計并制備了由分別攜帶植物固有內源基因和外源基因的重組質粒DNA的混合物構成的轉基因水平檢測標準品。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種用于檢測轉基因植物的轉基因水平的方法，特征在于其中所使用的轉基因標準品是分別攜帶植物特有的內源基因和被轉移的外源基因的重組質粒的混合物。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的轉基因植物是轉基因大豆。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于檢測轉基因植物的轉基因水平的試劑盒，特征在于其中所使用的轉基因標準品是分別攜帶植物特有的內源基因或被轉移的外源基因的重組質粒的混合物。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的轉基因植物是轉基因大豆。
轉基因作物本身具有的固有基因稱為內源基因，外源插入的基因稱為外源基因?，F(xiàn)有的定量標準品是由一定量的轉基因作物和一定量的非轉基因作物按比例混合而成的。
本發(fā)明的重組質粒標準品包含兩個部分一是將內源基因插入質粒中制備內源基因重組質粒，二是將轉基因植物中的插入片段導入質粒中制備外源基因重組質粒，內源基因參照重組質粒和外源基因重組質粒按一定的比例模擬現(xiàn)有標準品混合均勻，即得到轉基因水平檢測的定量標準品。一般說來，可以按照下述步驟制備本發(fā)明的標準品1)分別將轉基因植物內源基因片段和外源插入片段克隆到適當?shù)馁|粒載體中，然后將所得到的重組質粒導入大腸桿菌宿主細胞。大量培養(yǎng)所獲得的陽性菌落并提取和純化質粒DNA后，測定并計算重組質粒的拷貝數(shù)。梯度稀釋已知拷貝數(shù)的重組質粒分別制備內源和外源重組質粒的線性梯度制劑。
2)用內源基因線性梯度制劑對一定量和已知濃度的現(xiàn)有標準品中的內源基因進行定量分析，獲得該含量下內源基因的拷貝數(shù)；用外源基因線性梯度制劑對一定量和已知濃度的現(xiàn)有標準品中的外源基因進行定量分析，獲得該含量下外源基因的拷貝數(shù)。
3)根據(jù)該含量現(xiàn)有標準品的外源基因的拷貝數(shù)推算其它定量標準品中的外源基因的拷貝數(shù)。
4)按一定的比例將適當拷貝數(shù)的外源基因重組質粒和內源基因重組質?；旌暇鶆蚣吹玫奖景l(fā)明的質粒定量標準品。
用于轉基因植物中轉基因水平檢測的方法是熒光PCR方法。眾所周知，熒光定量PCR技術是在常規(guī)PCR的基礎上，加入一個與靶序列互補的、一端標記有熒光發(fā)射基團，另一端標記有熒光淬滅基團的熒光標記探針。當探針未與靶基因相結合時，發(fā)射基團與淬滅基團相對接近，因受淬滅基團的抑制而不產(chǎn)生熒光。如果熒光標記探針與靶基因互補結合，則熒光發(fā)射基團與淬滅基團相對分離，導致淬滅作用解除，熒光發(fā)射基團產(chǎn)生熒光。由于熒光發(fā)射基團產(chǎn)生的熒光的強度與PCR產(chǎn)物的量成正比，因而可以實時地檢測PCR擴增情況。熒光PCR方法采用完全閉管檢測，不需PCR后處理，避免了交叉污染。同時采用實時檢測技術，所得Ct值和原始模板數(shù)量完全線性相關，所以其定量準確率極高。
為了方便起見，雖然以上主要以轉基因大豆為例，描述了本發(fā)明方法和試劑盒的原理和基本精神，但本領域技術人員應該理解到，本發(fā)明的方法和試劑盒并不僅適用于轉基因大豆的轉基因水平的定量檢測，而且可用于其他轉基因植物，例如轉基因玉米、小麥、大麥、水稻、番茄等轉基因水平定量檢測。本發(fā)明的方法不僅適用于轉基因植物中CaMV 35S啟動子的定量檢測，也適用于Nos終止子和CP4 EPSPS、CryIA(b)、Pat、Bar等外源插入基因的定量檢測。
可以使用Excel辦公軟件分析本發(fā)明轉基因水平檢測方法和試劑盒的可靠性和準確性。例如，可以使用本發(fā)明的標準品和基于該標準品的試劑盒，按常規(guī)方法檢測并記錄具有不同轉基因水平的標準品及待測樣品中的外源基因和內源基因的Ct值(循環(huán)域值)，然后將所得數(shù)據(jù)輸入Excel文件，分別計算出定量標準品和各待測樣品的平均Ct值(Ct)和ΔCt值(ΔCt＝FamCt-JoeCt)。根據(jù)標準品GMO水平的對數(shù)值及相應的ΔCt值，做出回歸曲線方程LogX＝Y-b/m，并計算出它們之間的線性關系。
我們的分析結果表明，本發(fā)明的質粒標準品具有良好的檢測靈敏度，可檢測的轉基因水平甚至低達如0.1％。分析還顯示，使用本發(fā)明的質粒標準品測得的標準曲線的相關系數(shù)大于0.96。與現(xiàn)有試劑盒的標準品相比，兩者的定量偏差≤20％。
特別是，與目前常用的轉基因定量標準品相比，本發(fā)明的標準品無須進行復雜的DNA提取，可以一次性大量制備質粒標準品，所以大大節(jié)省了基于該標準品的試劑盒的生產(chǎn)和使用成本。


圖1是Fluka生產(chǎn)的定量標準品外源基因的PCR擴增曲線圖。
圖2是Fluka生產(chǎn)的定量標準品內源基因的PCR擴增曲線圖。
圖3是本發(fā)明的定量標準品外源基因的PCR擴增曲線圖。
圖4是本發(fā)明的定量標準品內源基因的PCR擴增曲線圖。
具體實施例方式
實施例1轉基因大豆CaMV 35S啟動子熒光PCR定量檢測試劑盒中使用的質粒標準品的制備本實施例以轉基因大豆的檢測為例，具體說明本發(fā)明的質粒標準品及其試劑盒的制備和使用效果。
(1)重組質粒的制備采用特異性引物分別擴增轉基因大豆(IRMM-410S，購自Fluka公司)煙草花葉病毒(CaMV)35S啟動子和大豆外源凝集素(Lectin)基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，與puCm-T質粒(購買自上海生工生物技術服務有限公司)連接并將連接產(chǎn)物轉入大腸桿菌感受態(tài)DH5α中。37℃過夜培養(yǎng)后，利用藍白斑篩選法挑選白色陽性菌落(具體操作方式參見《分子克隆》第三版第8章方案4)。
陽性菌落經(jīng)37℃培養(yǎng)16小時后，使用堿裂解法提取質粒DNA，以進一步鑒定陽性菌落。
(2)線性質粒梯度制劑的制備將如上獲得的含有CaMV 35S啟動子和Lectin基因片段的重組質粒經(jīng)純化后，以紫外分光光度法測定質粒DNA的OD260值(重復測10次的平均值)，獲得質粒濃度。根據(jù)插入片段和PuCm-T載體片段的大小估算出重組質粒的堿基數(shù)，并將質粒的濃度轉換成質?？截悢?shù)。
對重組質粒10×梯度稀釋(5次)，分別獲得具有已知拷貝數(shù)的、攜帶CaMV 35S啟動子基因和攜帶Lectin基因片段之質粒的梯度制劑。經(jīng)熒光PCR檢測，測知兩種質粒線性梯度制劑間的線性關系(參見表1)。
表1CaMV 35S啟動子質粒和Lectin基因片段質粒各梯度拷貝數(shù)及線性關系 (3)2％轉基因大豆標準品中CaMV 35S啟動子和Lectin基因拷貝數(shù)的定量檢測利用改良的CTAB提取方法提取100mg 2％的轉基因大豆標準品(Fluka公司生產(chǎn)，簡稱Fluka標準品)的DNA，并將其融解于100μl 1×TE(10mM Tris，1mM EDTA pH8.0)中。
使用如上制得的分別攜帶CaMV 35S啟動子和Lectin基因的重組質粒線性梯度制劑，分別對該標準中的CaMV 35S啟動子和Lectin基因的拷貝數(shù)進行定量分析(重復10次)。經(jīng)計算，上述標準品中CaMV 35S啟動子的濃度為6.09E+008拷貝/ml，Lectin基因的拷貝數(shù)為3.91E+010拷貝/ml。
(4)本發(fā)明的用于大豆轉基因水平檢測的質粒標準品的獲得根據(jù)上述結果，將分別攜帶CaMV 35S啟動子基因和Lectin基因的重組質粒按照一定的比例混合，得到用于大豆轉基因水平檢測的2％質粒標準品。
根據(jù)5％、1％、0.5％、0.1％Fluka標準品與2％Fluka標準品中CaMV 35S啟動子的倍數(shù)關系，將已知拷貝數(shù)的含CaMV 35S啟動子基因的重組質粒與含Lectin基因的重組質粒按照一定的比例混合，即可得到5％、1％、0.5％、0.1％轉基因水平的質粒標準品。將上述的標準品組合起來，即得到完整的5％、2％、1％、0.5％和0.1％轉基因的本發(fā)明的質粒標準品。
(5)本發(fā)明質粒標準品的使用效果用改良的CTAB提方法提取公司5％、2％、1％、0.5％、0.1％Fluka標準品各10份。分別配制轉基因大豆CaMV 35S啟動子擴增體系和Lectin基因擴增體系。擴增所使用的反應體系如下列表2中所示
表2轉基因大豆CaMV 35S啟動子反應液和Lectin基因反應液

PCR反應中，用于擴增待檢外源基因CaMV 35S啟動子基因的上游和下游引物分別是5’-GCC TCT GCC GAC AGT GGT-3’(SEQ ID NO1)和5’-AAGACG TGG TTG GAACGT CTT C-3’(SEQ ID NO2)；探針序列是5’-(FAM)-CAA AGA TGG ACC CCC ACC CAC G-(TAMRA)-3’待用于擴增待檢內源基因Lectin基因的上游和下游引物分別是5’-TCCACC CCC ATC CAC ATT T-3’和5’-GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAAGGA-3’；探針是5’-(FAM)-AAC CGG TAG CGT TGC CAG CTT CG-(TAMRA)-3’。
以上引物及探針序列均引自歐盟委員會轉基因檢測引物和探針數(shù)據(jù)庫。
對轉基因大豆的實際檢測結果表明，本發(fā)明的質粒標準品和基于這些標準品制備的檢測試劑盒可檢測的大豆轉基因水平低達0.1％以下，并且其標準曲線的線性關系大于0.96。另外，以Fluka標準品為待檢品，使用本發(fā)明的標準品和試劑盒檢測的結果顯示，各定量點(5％、2％、1％、0.5％、0.1％)的定量偏差均小于20％(參見表3)。
表3以Fluka定量標準品為待測品，用質粒定量標準品進行定量的結果 (6)質粒標準品的穩(wěn)定性試驗將本發(fā)明的轉基因大豆35S啟動子熒光PCR定量檢測試劑盒中的質粒標準品于37℃分別放置0、1、3、5、7天后，對上述Fluka標準品(5％、2％、1％、0.5％、0.1％)進行轉基因水平檢測。試驗結果顯示放置0-7天后，本發(fā)明的質粒定量標準品，在對各不同轉基因水平的Fluka標準品的定量偏差≤20％；質粒定量標準品的標準曲線的線性關系大于0.96。該質粒標準品在4℃或-20℃下的保存期限為1年以上。
權利要求
1.一種用于檢測轉基因植物的轉基因含量的方法，特征在于其中所使用的轉基因含量定量標準品是分別攜帶植物特有的內源基因和被轉移的外源基因的兩個重組質粒的混合物。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中所說的轉基因植物是轉基因大豆。
3.一種用于檢測轉基因植物的轉基因水平的試劑盒，特征在于其中所使用的轉基因標準品是分別攜帶植物特有的內源基因或被轉移的外源基因的重組質粒的混合物。
4.根據(jù)權利要求4的方法，其中所說的轉基因植物是轉基因大豆。
全文摘要
本發(fā)明提供了轉基因水平的定量檢測方法，特別是提供了一種使用攜帶內源和外源基因的兩個重組質粒定量檢測轉基因植物的轉基因水平的方法，本發(fā)明進一步提供了用于完成所述的定量檢測方法的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK1840692SQ200510063648
公開日2006年10月4日 申請日期2005年3月29日 優(yōu)先權日2005年3月29日
發(fā)明者宋慶濤, 黃奇林 申請人:英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司