專利名稱：用基因工程方法大量生產高活性的胸腺素a1的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于重組蛋白質藥物生產領域。通過對前體融合蛋白的基因工程構建，實現了目的蛋白的高效表達，該方法具有表達量高，操作簡便，成熟蛋白活性高的特點。
二.
背景技術：
免疫系統是人體的防御系統。參于免疫反應的主要細胞有T淋巴細胞、B淋巴細胞和巨噬細胞。而胸腺是T淋巴細胞發(fā)育、分化的免疫中樞器官。胸腺分泌的胸腺因子(或激素)是T淋巴細胞發(fā)育分化所需的一系列必需物質，其中胸腺素α1(Tα1)是現已結構和功能較為明確的一種主要的胸腺因子。
Tα1是Goldstein等最早從小牛胸腺中提取的胸腺素組分5(TF5)中分離出來的一種多肽，含28個氨基酸，分子量3.108KD，等電點4.2，無二硫鍵與糖基化。Tα1的氨基酸序列與原胸腺素α的N端一致，后者是Haritos等從大鼠胸腺中分離出來的，含109～112個氨基酸，不同種屬，不同組織來源的原胸腺素α基因序列略有異。Tα1是一種免疫活性肽，它主要作用于胸腺細胞成熟的早期和晚期，可增加T細胞表面Thy-1，Thy-2.3和Lyt-1.2.3表達，能促進T淋巴細胞的增殖，提高淋巴細胞產生干擾素和白介素2等細胞因子的能力，提高機體抗菌和抗感染的能力。因此胸腺素α1是一種重要的免疫調節(jié)劑和增強劑。臨床上主要作為原發(fā)性或繼發(fā)性免疫功能缺陷病，腫瘤和慢性活動性肝炎的免疫調節(jié)劑，其安全性和有效性已經超萬例臨床應用所證實，長期使用，無蓄積性，無抗原性，并得到國內外相關領域專家的公認。
目前，Ta1的生產主要是來源于生物提取、化學合成、基因工程。其中，生物提取得到的Ta1純度最低安全隱患最大；化學合成方法中原料藥采用固相合成法制成，用高效液相色譜提純精制，純度在95％以上，制劑有效成份穩(wěn)定均一。這種制備方法對原料純度要求高，合成儀器和設備投資大，生產工藝(合成和化學修飾等)復雜，產品活性較低，成本高等不足；基因工程方法用生物工程技術構建胸腺素α1基因表達載體，在大腸桿菌中表達，經分離純化而制成，得到的產品純度與活性高，但由于小肽分子表達后易被降解且不易被檢測，其產率和收率均達不到產業(yè)化要求。
三.

發(fā)明內容
本發(fā)明的特點是利用一段能在細菌體內大量穩(wěn)定表達、存在的蛋白作先導。將Tα1在表達過程中帶出來，產生“Tα1人工前體蛋白”，再經過體外酶切回收，得到高純度的Ala-Tα1，且Ala-Tα1與Tα1相比較生物活性相當。但在生產成本上遠低于化學合成方法和常規(guī)的基因工程表達方法。首先，我們選用的先導蛋白是谷脫甘肽轉硫酶(GST)的一段，而這段蛋白在大腸桿菌BL21的胞質中，能大量的以可溶形式穩(wěn)定存在，比GST完整序列可溶形式表達、存在率高1-2倍，最大量約為菌體蛋白總量的45％-60％。剛好Tα1不能在大腸桿菌內大量可溶表達的原因，很有可能是它本身的結構以及種屬關系，不能在大腸桿菌內高產量表達，這就大大降低了產量及增加了生產工藝難度。當我們把Tα1接到先導蛋白后面以后，發(fā)現“Tα1人工前體蛋白”也可以在大腸桿菌內超量表達且以可溶性形式存在。又因為我們選用的這段先導蛋白，在一定條件下仍能與谷脫甘肽親和柱結合，這就進一步提高了生產量、減少工藝難度，從而降低生產成本，使用這套工藝使得1g濕菌體可最終得到約1mg成品蛋白Ala-Tα1，純度大于98％。雖然終產品的N未端多了一個Ala，但是它是小分子氨基酸不會對Tα1結構產生影響，這點從生物活性上的恒定可以看出。本發(fā)明生產的Ala-Tα1與化學合成的Tα1(邁普新)活性相當或高于它。發(fā)明通過表達Tα1人工前體蛋白的方法，在大腸桿菌內高效生產人Tα1使生產成本大大降低。更利于取代化學合成的Tα1。
本發(fā)明中Ta1人工前體的產生及Ala-Tα1的制備方法為先以Ta1氨基酸序列為模板選用大腸桿菌偏好密碼子全基因合成Tα1DNA序列且在N、C末端加上限制性酶切位點，以GST氨基酸序列為模板選用大腸桿菌偏好密碼子全基因合成先導肽DNA序列且在N、C末端加上限制性酶切位點，再將先導肽、Tα1以及篩選質粒pBSK用限制性內切酶處理好，經計算各樣品濃度后按一定摩爾比加入T4連接體系。經轉化、篩選出一成功重組子命為PSK-T。用限制性酶切下融合蛋白基因，再將該基因與用限制性酶處理好的本公司質粒PGM連接，經篩選得到正確重組子命名為PGMT。將PGMT轉化到表達宿主菌BL21中，經表達篩選出高表達工程菌PGMT/BL21，然后在30升發(fā)酵罐中對PGMT/BL21進行高密度發(fā)酵，經12小時發(fā)酵，最終得到目的蛋白表達量占菌體總蛋白量60％(見

圖1)的工程菌體濕重約100g/L，再經離心得到含目的前體蛋白上清液，將上清液上樣到GST親和柱上，通過柱中在位酶切、洗脫得到純度大于85％的目的蛋白，再將樣品通過陰離子柱，使得最終蛋白純度大于95％。用E玫瑰藥結實驗對樣品進行生物活力測試首先分離健康人外周血單核細胞，使用小牛血清調整細胞數至2×10-6/ml。各取200μl細胞液加入EP管中，再分別加入等量的測試樣品Ala-Tα與日達仙，37℃水浴90分鐘，每支EP管中加入200μl，綿羊紅細胞(2×106/ml)，4℃放置3小時，涂片、染色后放于高倍鏡下計數200個，淋巴細胞中形成玫瑰花結的細胞數(結合3或以上的為一個玫瑰花結)。計算玫瑰藥形成細胞的百分數。按以下公式計算激活率。
經測試，本發(fā)明生產的Ala-Tα活性大于化學合成Ta1。
從結果可以看出，本發(fā)明在不降低生物活性的基礎上大大提高Ala-Ta1的生產量、降低生產成本，有利于最終取代Ta1的化學合成，從而減少由于生產Ta1給自然界帶來的污染。
四.
具體實施例方式
1.胸腺素a1前體蛋白表達質粒的構建與工程菌的獲得
首先通過全基因和成擴增出胸腺素a1前體蛋白的全基因序列，設計如下
GGA TCC CCG CGT GCG TCG GAT GCG GCC GTG GAT
ACC TCG TCG GAA ATT ACC ACG AAA GAT CTG AAA
GAA AAA AAG GAA GTG GTT GAA GAG GCG GAA AAT
TAA TGA CTC GAG
以GST基因為模板，PCR擴增獲得500bp左右的產物，經測序質?？寺?、基因測序，得到設計序列備用。
目的片段經BamH I、EcoR I、XhoI雙酶切后分別回收小片段，質粒PGM經XhoI和EcoRI雙酶切后回收大片段，18℃在T4連接酶體系中三段目的基因片斷進行連接，經篩選得到的重組質粒命名為PGMT。然后用CaCl2法轉化大腸桿菌BL21，涂布在含有50ug/ml卡那霉素的LB平板，挑選陽性菌落在LK中培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8時加入IPTG 0.1mM誘導3-4小時離心收集菌體，8M尿素破菌后15％SDS-PAGE電泳時出現一條18KD左右的蛋白帶，表達量為40％。經胸腺素a1的單克隆抗體免疫印跡檢定，顯示陽性反應。所獲得的高效表達胸腺素a1前體蛋白的工程菌命名為PGMT/BL21。
2.發(fā)酵
1).搖瓶表達含胸腺素a1前體蛋白基因的PGMT/BL21，在含50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中搖瓶過夜(37℃，200rpm)，再按1∶30接種含有50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3小時后，加入0.1mM IPTG誘導4小時。收集菌體經SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現含胸腺素a1前體蛋白(20KD)以可溶性表達為主，表達量占菌體總蛋白的60％。
2)發(fā)酵工藝
a.培養(yǎng)基
a)種子液培養(yǎng)基(LK)
胰蛋白胨10克/升、酵母粉5克/升、氯化鈉10克/升、卡那霉素50微克/毫升。
b)種養(yǎng)基(15升)
磷酸氫二鈉315克、磷酸二氫鉀100克、氯化鈉10.05克、氯化銨50克、胰蛋白胨90克。
以上成分一起在罐中滅菌；下面的成分單獨滅菌后加入發(fā)酵罐。
硫酸鎂15克、葡萄糖450克、補料(500克/升)葡萄糖
b.發(fā)酵過程
1.種子培養(yǎng)
從已鑒定的平皿上劃取菌種，接種到50毫升(250毫升的三角瓶)LC中，36度、200轉/分、8小時后將這50毫升種子液轉接到700毫升LC中，36度、200轉/分，過夜。
2.發(fā)酵過程
將培養(yǎng)好的種子液(od600＝3-4)加入罐中，調好各參數，36度、150轉、溶氧100％，開始發(fā)酵；5小時后開始以2.5速流加2小時，約加入800毫升補料，加入1克IPTG誘導(三小時)。
2.層析
(1)親和層析
采用GSH-Agrose層析介質(Sigma公司)，平衡液采用25mM Tris-HCl，pH8，上樣平衡后，裂菌的離心上清上Glutathione Sepharose層析柱，平衡后用含10mM還原型谷胱甘肽(GSH)的洗脫液洗下融合蛋白。
(2)酶解
上一步的洗脫液加入凝血酶(5NIHU/mL)37℃酶切2小時。
(2)陰離子交換層析
采用Source30Q層析介質，平衡液為20mM PB，pH7，上一步得到的樣品用水稀釋1倍進行上樣，平衡后采用20mM PB，pH7，0-1M NaCl的梯度洗脫，收集目的蛋白洗脫峰。
3.檢測
得到的胸腺素α1通過SDS-PAGE純度檢測和反相HPLC檢測，純度大于95％。
4.活性檢測
E玫瑰藥結實驗對樣品進行生物活力測試
基礎細胞培養(yǎng)液1640基礎培養(yǎng)基10.0g，NaHCO32.2g，Hepes5.9g，丙酸鈉0.11g，0.05M巰基乙醇2.0ml，ddH2O 1000ml；細胞培養(yǎng)基基礎細胞培養(yǎng)基90ml，小牛血清10ml，雙抗(青霉素+鏈霉素)100U/ml，谷胱甘肽0.03g/ml；測活培養(yǎng)基基礎培養(yǎng)基95ml小牛血清5.0ml，雙抗及谷胱甘肽濃度與上相同。過濾滅菌；裂解液SDS 10g，，DMSO 25ml，ddH2O 19ml，調PH＝4.7。
方法首先分離健康人外周血單核細胞，使用小牛血清調整細胞數至2×10-6/ml。各取200μl細胞液加入EP管中，再分別加入等量的測試樣品Ala-Tα與日達仙，37℃水浴90分鐘，每支EP管中加入200μl，綿羊紅細胞(2×106/ml)，4℃放置3小時，涂片、染色后放于高倍鏡下計數200個，淋巴細胞中形成玫瑰花結的細胞數(結合3或以上的為一個玫瑰花結)。計算玫瑰藥形成細胞的百分數。
按以下公式計算激活率。
樣品對E玫瑰花結形成率的影響
N＝5，**P＜0.01，與對照比
由上表可知，Ala-Ta1可顯著提高人外周血淋巴細胞E玫瑰花結形成數量，且作用大于合成的Ta1。
權利要求
1.一種用融合表達的方式生產胸腺素a1的方法，其特征為一段能在大腸桿菌胞質中超量穩(wěn)定表達、存在的蛋白與28個氨基酸的胸腺素a1融合后在大腸桿菌胞質中超量穩(wěn)定表達；該前體融合蛋白經發(fā)酵、酶切、純化后得到高活性的成熟蛋白29肽胸腺素a1衍生物氨基酸序列為Ala-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn。
2.權利要求1中的前體蛋白以大腸桿菌或酵母為宿主菌用基因工程的方法進行可溶性表達。
全文摘要
本發(fā)明涉及一段能在細菌體內大量穩(wěn)定表達、存在的蛋白與天然胸腺素a1形成的，能在大腸桿菌中進行高產量可溶表達的融合蛋白，以及由上述融合蛋白酶切加工后產生的具有高生物活性的胸腺素a1衍生物。本發(fā)明可以使該融合蛋白在大腸桿菌中得到穩(wěn)定高效的表達。經過表達后的前體蛋白經過切割加工后，得到了超高效生物活性的有效成分蛋白，可用于癌癥的輔助治療。
文檔編號C12N15/09GK1840682SQ20051005990
公開日2006年10月4日 申請日期2005年4月1日 優(yōu)先權日2005年4月1日
發(fā)明者許松山, 宣鍾健, 馬素永, 聶李亞 申請人:北京諾思蘭德生物技術有限責任公司