專利名稱：一種磷霉素生物轉化菌株的篩選方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物轉化/生物催化技術領域，具體為一種磷霉素生物轉化菌株的新篩選方法。
背景技術：
磷霉素[(-)-順-(1R，2S)-1，2-環(huán)氧丙基磷酸，FOM]是一種抑制細菌生長的廣譜抗生素。FOM可以由順丙烯磷酸(cis-propenylphosphonic acid，cPA)經過微生物轉化作用獲得。傳統(tǒng)的方法是采用振蕩培養(yǎng)方法篩選轉化菌株。該方法采用在液體培養(yǎng)基中添加前體cPA，經振蕩培養(yǎng)后，以發(fā)酵液的離心上清液為測定樣品。這種方法的缺點是需要較多的勞力、設備和時間。
單菌落瓊脂塊培養(yǎng)法是一種高效率的抗生素生產菌篩選方法。該方法的要點是用打孔器在營養(yǎng)瓊脂平板上打取大小均一的瓊脂塊，并分別把它們移入滅過菌的空平皿中，于每個瓊脂塊上接種待測菌株，保持適合的溫度和濕度，經過一定時間培養(yǎng)。把每一個長有大菌落的瓊脂塊轉移到含有指示菌種(即拮抗對象)的瓊脂平板上，以分別測定它們的抗生素抑菌圈的直徑，從而擇優(yōu)取之。該方法的關鍵是將單菌落瓊脂塊分別培養(yǎng)，在這種情況下，各單菌落瓊脂塊的培養(yǎng)條件基本相同，且產生的代謝產物不致擴散，因此測得的數據與振蕩培養(yǎng)條件下十分相似，然而工作效率卻大為提高。
該方法的局限在于它僅適合本身可生物合成抗生素的放線菌的篩選，因為放線菌具有發(fā)達的基內菌絲(生長于瓊脂塊內部)，在這種情況下，其分泌的抗生素可以均勻地擴散于瓊脂塊中，便于檢測。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種快速的、批量篩選FOM生物轉化細菌菌株，又可以在生物鑒定盤上初步區(qū)分單菌落轉化效率的新方法。
本發(fā)明的技術方案是一種磷霉素生物轉化菌株的篩選方法，在含有順丙烯磷酸前體的瓊脂塊上接種待測菌株培養(yǎng)，然后將瓊脂塊倒置于生物鑒定盤上，檢測、篩選出具有轉化能力的菌株。
瓊脂塊的制備與單菌落瓊脂塊培養(yǎng)包括
1)瓊脂塊培養(yǎng)基組成按重量百分數計，瓊脂塊培養(yǎng)基組成為順丙烯磷酸0.3％，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，甘油3％，NaVO30.02％，CoCl20.05％，瓊脂1.8-2.0％，余量為自來水，115℃滅菌30分鐘。
2)瓊脂塊的制備將上述培養(yǎng)基融化，倒入平皿，靜置凝固后，用打孔器打出瓊脂塊，然后在其表面接種待檢測菌株，置于30℃，75％-85％相對濕度下培養(yǎng)4-5天。
磷霉素轉化菌株的篩選包括1)指示菌培養(yǎng)與懸液的配制按重量百分數計，指示菌培養(yǎng)基成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂2％，余量為自來水，加熱溶解后，調pH7.0-7.2，121℃濕熱滅菌20分鐘后，擺斜面?zhèn)溆谩?br> 指示菌培養(yǎng)37℃培養(yǎng)24hr，菌苔呈半透明至白色。
指示菌懸液的制備把滅菌的生理鹽水倒入茄型瓶中，用接種環(huán)刮洗菌苔，再將刮洗液倒入滅菌的生理鹽水中，測定吸光度為0.54-0.57。
2)生物檢定培養(yǎng)基及其平板的制備按重量百分數計，培養(yǎng)基I成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂2.0％，余量為自來水，pH7.0-7.2；按重量百分數計，培養(yǎng)基II成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂1.5％，余量為自來水，pH7.0-7.2；培養(yǎng)基I、培養(yǎng)基II均在121℃滅菌20分鐘；將融化的培養(yǎng)基I倒入生物鑒定盤，制成下層平板；再將融化的培養(yǎng)基II冷卻至55℃，加入指示菌菌懸液，迅速混勻后倒入生物鑒定盤，制成上層平板。
3)磷霉素轉化菌株生物鑒定將培養(yǎng)好的單菌落瓊脂塊置于紫外燈下滅菌20分鐘，再將瓊脂塊倒置于生物鑒定平板上，37℃培養(yǎng)16hr，觀察并測量抑菌圈直徑；依據抑菌圈的有無和抑菌圈直徑的大小來篩選具有磷霉素生物轉化能力的菌株。
生物鑒定盤所用的指示菌為大腸桿菌或其它磷霉素敏感菌。
本發(fā)明通過搖床發(fā)酵法對初篩的菌株復篩，培養(yǎng)基為順丙烯磷酸0.3％，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，甘油3％，NaVO30.02％，CoCl20.02％，余量為自來水，30℃，160rpm培養(yǎng)4天，通過抑菌圈直徑大小，進一步篩選出轉化效率較高的菌株。
本發(fā)明利用薄層層析分析磷霉素，展開劑為正丁醇∶乙酸∶水(體積比3∶1∶1)，將展開后的層析板風干，置于生物鑒定平板上，待浸潤后取下，37℃培養(yǎng)16hr，含有磷霉素部分產生抑菌圈。
本發(fā)明的有益效果是1、本發(fā)明利用圓柱狀固體培養(yǎng)基(瓊脂塊)培養(yǎng)待檢測菌株，利用大腸桿菌為生物鑒定的指示菌，篩選磷霉素轉化菌株。根據在等體積并含有等量前體物的瓊脂塊上生長的待選菌株轉化能力不同，產生的磷霉素濃度不同，進而由磷霉素在指示菌平板上產生的抑菌圈大小也不同，最終篩選出磷霉素轉化優(yōu)勢菌種。
2、本發(fā)明方法的設備要求低，操作簡單，非常適用于抗生素生物轉化細菌的初級批量篩選。


圖1為本發(fā)明順丙烯磷酸(cPA)在微生物的催化作用下轉化為磷霉素(FOM)示意圖。
具體實施例方式
本發(fā)明首先將等量的前體cPA均勻的混入瓊脂塊中并于表面接種待測菌株，生物轉化過程首先需要菌體吸收外源性前體，通過菌體內酶催化作用將其轉化為磷霉素。而由于接種的細菌只生長于瓊脂塊表面，只能吸收并轉化表層的cPA而產生FOM，所以FOM主要積累于瓊脂塊表面。因此，要使篩選靈敏度獲得大幅度提高，將瓊脂塊倒置于生物鑒定平板上作抑菌圈實驗是一個有效途徑，并由抑菌圈大小判斷轉化效率。
本發(fā)明的具體操作步驟如下一、指示菌培養(yǎng)與懸液的配制指示菌為大腸桿菌(E.coli)，中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所保藏。
按重量百分數計，指示菌培養(yǎng)基組成牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂2％，余量為自來水。加熱溶解后，調pH7.0-7.2。裝入茄型瓶90mL，121℃濕熱滅菌20分鐘后，擺斜面?zhèn)溆谩?br> 指示菌培養(yǎng)37℃培養(yǎng)24hr，菌苔呈半透明至白色。
指示菌懸液的制備把100mL滅菌的生理鹽水倒入茄型瓶中，用接種環(huán)刮洗菌苔，再將刮洗液倒入滅菌的空錐瓶中，測定吸光度(O.D.值)為0.54-0.57。
二、瓊脂塊的制備與單菌落瓊脂塊培養(yǎng)按重量百分數計，瓊脂塊培養(yǎng)基組成cPA 0.3％，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，甘油3％，NaVO30.02％，CoCl20.05％，瓊脂1.8％，余量為自來水，115℃滅菌30分鐘。
瓊脂塊的制備將上述培養(yǎng)基融化，于每個Φ90mm平皿倒入25mL，靜置凝固。凝固后，用打孔器打出瓊脂塊(Φ6×6mm)，然后在其表面接種待檢測菌株，置于30℃，75％～85％相對濕度下培養(yǎng)4-5天。
三、磷霉素轉化菌株的篩選生物檢定培養(yǎng)基及其平板的制備按重量百分數計，培養(yǎng)基I成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂2％，余量為自來水，pH7.0-7.2；培養(yǎng)基II成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂1.5％，余量為自來水，pH7.0-7.2；培養(yǎng)基I、培養(yǎng)基II均在121℃滅菌20分鐘。將200mL融化的培養(yǎng)基I倒入生物鑒定盤(20×30cm)，制成下層平板；再將100mL融化的培養(yǎng)基II冷卻至55℃，加入指示菌菌懸液1mL，迅速混勻后倒入生物鑒定盤，制成上層平板。
磷霉素轉化菌株生物鑒定將培養(yǎng)好的單菌落瓊脂塊置于紫外燈下(30W，40cm)滅菌20分鐘，再將瓊脂塊倒置于生物鑒定平板上，37℃培養(yǎng)16hr。觀察并測量抑菌圈直徑。依據抑菌圈的有無和抑菌圈直徑的大小來篩選具有磷霉素生物轉化能力的菌株。
實施例將本實驗室保存的210株細菌接種到瓊脂塊上，于30℃，75％相對濕度培養(yǎng)4天。將經過接種待檢測菌株并培養(yǎng)后的瓊脂塊紫外滅菌后，倒置貼于生物鑒定平板上。37℃培養(yǎng)16hr后觀察抑菌圈的有無和直徑大小，其中有12株細菌有明顯的抑菌圈。
同時作三組平行對照即1)不含有cPA的瓊脂塊對照，用以排除培養(yǎng)基中其它抑菌成分的干擾；2)含有cPA的瓊脂塊對照，用以排除cPA底物的非生物的轉化干擾；3)不含有cPA只接種菌株的瓊脂塊對照，用以排除菌株本身產生抑菌物質的干擾。實驗結果表明三組對照都沒有在鑒定平板上產生抑菌圈。說明篩選出的菌株是通過轉化cPA為FOM而呈現抑菌圈的。
通過搖床發(fā)酵法對初篩的12個菌株復篩，培養(yǎng)基為cPA 0.3％，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，甘油3％，NaVO30.02％，CoCl20.02％，余量為自來水，30℃，160rpm培養(yǎng)4天，通過抑菌圈直徑大小，進一步篩選出轉化效率較高的菌株。
利用薄層層析分析磷霉素，展開劑為正丁醇∶乙酸∶水(體積比3∶1∶1)。將展開后的層析板風干，置于生物鑒定平板上，待浸潤后取下，37℃培養(yǎng)16hr。含有磷霉素部分產生抑菌圈。比較樣品與磷霉素標準品的Rf，樣品的Rf值為3.52；標準品的Rf值為3.53，驗證產生的抗生素為磷霉素。
權利要求
1.一種磷霉素生物轉化菌株的篩選方法，其特征在于在含有順丙烯磷酸前體的瓊脂塊上接種待測菌株培養(yǎng)，然后將瓊脂塊倒置于生物鑒定盤上，檢測、篩選出具有轉化能力的菌株。
2.按照權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，瓊脂塊的制備與單菌落瓊脂塊培養(yǎng)包括1)瓊脂塊培養(yǎng)基組成按重量百分數計，瓊脂塊培養(yǎng)基組成為順丙烯磷酸0.3％，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，甘油3％，NaVO30.02％，CoCl20.05％，瓊脂1.8-2.0％，余量為自來水，115℃滅菌30分鐘2)瓊脂塊的制備將上述培養(yǎng)基融化，倒入平皿，靜置凝固后，用打孔器打出瓊脂塊，然后在其表面接種待檢測菌株，置于30℃，75％-85％相對濕度下培養(yǎng)4-5天。
3.按照權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，磷霉素轉化菌株的篩選包括1)指示菌培養(yǎng)與懸液的配制按重量百分數計，指示菌培養(yǎng)基成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂2％，余量為自來水，加熱溶解后，調pH 7.0-7.2，121℃濕熱滅菌20分鐘后，擺斜面?zhèn)溆?；指示菌培養(yǎng)37℃培養(yǎng)24hr，菌苔呈半透明至白色；指示菌懸液的制備把滅菌的生理鹽水倒入茄型瓶中，用接種環(huán)刮洗菌苔，再將刮洗液倒入滅菌的生理鹽水中，測定吸光度為0.54-0.57；2)生物檢定培養(yǎng)基及其平板的制備按重量百分數計，培養(yǎng)基I成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂2.0％，余量為自來水，pH 7.0-7.2；按重量百分數計，培養(yǎng)基II成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂1.5％，余量為自來水，pH7.0-7.2；培養(yǎng)基I、培養(yǎng)基II均在121℃滅菌20分鐘；將融化的培養(yǎng)基I倒入生物鑒定盤，制成下層平板；再將融化的培養(yǎng)基II冷卻至55℃，加入指示菌菌懸液，迅速混勻后倒入生物鑒定盤，制成上層平板；3)磷霉素轉化菌株生物鑒定將培養(yǎng)好的單菌落瓊脂塊置于紫外燈下滅菌20分鐘，再將瓊脂塊倒置于生物鑒定平板上，37℃培養(yǎng)16hr，觀察并測量抑菌圈直徑；依據抑菌圈的有無和抑菌圈直徑的大小來篩選具有磷霉素生物轉化能力的菌株。
4.按照權利要求1或3所述的篩選方法，其特征在于生物鑒定盤所用的指示菌為大腸桿菌或其它磷霉素敏感菌。
5.按照權利要求1所述的篩選方法，其特征在于通過搖床發(fā)酵法對初篩的菌株復篩，培養(yǎng)基為順丙烯磷酸0.3％，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，甘油3％，NaVO30.02％，CoCl20.02％，余量為自來水，30℃，160rpm培養(yǎng)4天，通過抑菌圈直徑大小，進一步篩選出轉化效率較高的菌株。
6.按照權利要求1或5所述的篩選方法，其特征在于利用薄層層析分析磷霉素，展開劑為正丁醇、乙酸、水的體積比為3∶1∶1，將展開后的層析板風干，置于生物鑒定平板上，待浸潤后取下，37℃培養(yǎng)16hr，含有磷霉素部分產生抑菌圈。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物轉化/生物催化技術領域，具體為一種磷霉素生物轉化菌株的篩選方法。本發(fā)明利用圓柱狀固體培養(yǎng)基(瓊脂塊)培養(yǎng)待檢測菌株，利用大腸桿菌為生物鑒定的指示菌，將瓊脂塊倒置于生物鑒定盤上篩選磷霉素轉化菌株。根據在等體積并含有等量前體物的瓊脂塊上生長的待選菌株轉化能力不同，產生的磷霉素濃度不同，進而由磷霉素在指示菌平板上產生的抑菌圈大小也不同，最終篩選出磷霉素轉化優(yōu)勢菌種。該方法的設備要求低，操作簡單，非常適用于抗生素生物轉化細菌的初級批量篩選。
文檔編號C12Q1/04GK1683553SQ200510045858
公開日2005年10月19日 申請日期2005年2月6日 優(yōu)先權日2005年2月6日
發(fā)明者李智峰, 徐慧, 張雪姝, 張穎, 陳冠雄, 張忠澤, 王蘭君, 陳玉 申請人:中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所