專利名稱：一種體外誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為膽堿能神經(jīng)元的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程和發(fā)育生物學(xué)，具體涉及神經(jīng)干細(xì)胞的分化研究，更具體地涉及體外誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為膽堿能神經(jīng)元的方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)是近年來神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的重大突破，已成為近期研究的熱點(diǎn)，不僅因?yàn)槠渚哂醒芯可窠?jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要性，更主要的是其潛在的治療價(jià)值[1]。Mckay[2]等認(rèn)為，神經(jīng)干細(xì)胞指具有自我更新能力和分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞能力的細(xì)胞。自我更新和多分化能力是神經(jīng)干細(xì)胞的2個(gè)基本屬性。
神經(jīng)干細(xì)胞的多分化潛能成為目前研究的熱點(diǎn)之一。神經(jīng)干細(xì)胞當(dāng)移植到發(fā)育中樞神經(jīng)系統(tǒng)或成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)發(fā)生區(qū)域，就能分化成某些特別的神經(jīng)元[3.4]。但是當(dāng)將神經(jīng)干細(xì)胞移植到成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)非神經(jīng)發(fā)生區(qū)域時(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞仍然保持未分化或大部分分化成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。而神經(jīng)元是一種非常重要的細(xì)胞，因此在移植前將神經(jīng)干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化成特定的神經(jīng)元是非常必要的。
誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化的關(guān)鍵問題是如何才能將神經(jīng)干細(xì)胞高效的誘導(dǎo)分化成產(chǎn)生專門遞質(zhì)的功能神經(jīng)元或特定類型的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，如膽堿(Ach)能、多巴胺(DA)能、去甲腎上腺素(NE)能、γ-氨基丁酸(GABA)能、甘氨酸(Glycine)能神經(jīng)元，以及星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等。但目前有關(guān)這方面研究的資料不多，仍然處在探索階段。就科研工作者研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細(xì)胞的分化受外部環(huán)境和自身基因調(diào)控的影響。
影響神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的因素是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，它對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元均有一定的促進(jìn)存活和刺激突起生長(zhǎng)的作用。生長(zhǎng)因子在神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞的分化發(fā)育過程中的作用亦愈來愈受到重視，其中絲裂原樣的生長(zhǎng)因子信號(hào)在增殖過程中起著相當(dāng)重要的作用。已用于維系干細(xì)胞特性的絲裂原信號(hào)主要包括表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)[5]。
神經(jīng)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)為研究神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療提供了一條新的途徑。目前，神經(jīng)干細(xì)胞的來源較廣，根據(jù)起源部位的不同，可以分為紋狀體源、皮層源、腦干源、脊髓源以及骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞。但是起源不同的神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)不同的生長(zhǎng)因子有不同的反應(yīng)特性，根據(jù)一些前期研究發(fā)現(xiàn)，紋狀體源的神經(jīng)干細(xì)胞既可以在EGF的刺激下分裂增殖，又可以在bFGF的刺激下分裂增殖；而脊髓源性的神經(jīng)干細(xì)胞基本就喪失了對(duì)單獨(dú)的EGF的反應(yīng)，只對(duì)bFGF的刺激有反應(yīng)，甚至只有在EGF和bFGF的協(xié)同作用下才能長(zhǎng)出能夠分裂傳代的功能性神經(jīng)干細(xì)胞團(tuán)[6]。研究證據(jù)表明神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)不同種類中樞神經(jīng)元的存活、胞體發(fā)育和突起延伸具有促進(jìn)作用。但神經(jīng)元在發(fā)育分化增殖過程中存活的微環(huán)境及參與調(diào)控的因子十分復(fù)雜，絕非僅受一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的影響。迄今對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子之間的聯(lián)合作用還不甚清楚。同一神經(jīng)元上可以同時(shí)存在不同營(yíng)養(yǎng)因子的受體，當(dāng)不同神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子共同作用于同一個(gè)神經(jīng)元時(shí)，效果互補(bǔ)而增加營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)。
由于膽堿能神經(jīng)元是一種重要的神經(jīng)元，能取代由于肌萎縮或脊髓損傷導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損失，能改善人或動(dòng)物的學(xué)習(xí)、記憶等能力，對(duì)老年癡呆、癲癇等也具有重要的調(diào)節(jié)作用。目前研究膽堿能神經(jīng)元的分化主要是從基因調(diào)控方面來研究的，由于膽堿能神經(jīng)元的分化可能受多個(gè)基因調(diào)控，故而用該方法來研究較為復(fù)雜。而且對(duì)這些神經(jīng)元分化的研究，大多著重于膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的活力研究，而關(guān)于不同神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)神經(jīng)元發(fā)育分化和突起發(fā)育生長(zhǎng)的作用是否相同，以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子間有否協(xié)同作用的研究較少。本發(fā)明者通過在培養(yǎng)基中添加幾種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，以不同的組合方式來改變外部培養(yǎng)條件，研究定向誘導(dǎo)分化膽堿能神經(jīng)元的最佳組合，從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種體外誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為膽堿能神經(jīng)元的方法。
本發(fā)明的方法包括以下步驟(1)神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定；(2)神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化在含1％B27(v/v)、20ng/mL EGF的F12-DMEM(1∶1)培養(yǎng)基中加入bFGF、肝素、層粘連蛋白后，于37℃、50mL/L CO2飽和濕度下將神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為膽堿能神經(jīng)元；(3)膽堿能神經(jīng)元的鑒定。
本發(fā)明方法中，神經(jīng)干細(xì)胞較佳為從胎鼠紋狀體分離得到。
所述神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法將胎鼠紋狀體在含有1％B27、20ng/mL EGF、10ng/mL bFGF的F12-DMEM(1∶1)培養(yǎng)基中，吹打制成細(xì)胞懸液，于37℃、50mL/L CO2飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。
在將神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為膽堿能神經(jīng)元后，再進(jìn)行體外培養(yǎng)7天。
所述神經(jīng)干細(xì)胞和膽堿能神經(jīng)元采用免疫熒光法進(jìn)行鑒定。
本發(fā)明從胎鼠紋狀體中分離培養(yǎng)了神經(jīng)干細(xì)胞并確定了從骨髓中能分離培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞；同時(shí)，以胎鼠紋狀體培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞為材料，從改變外部環(huán)境以及基因水平兩個(gè)方面進(jìn)行定向分化研究，提供了獲得膽堿能神經(jīng)元的一種新途徑，為研究老年癡呆提供了一種重要的思路，為研究與神經(jīng)干細(xì)胞分化相關(guān)基因功能并篩選與其定向分化相關(guān)基因提供了一種有力的工具，為探索其定向分化、調(diào)控機(jī)制提供了一定的線索，并為實(shí)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞的移植和相關(guān)神經(jīng)功能奠定了基礎(chǔ)。
本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，分化率達(dá)30％以上。
具體實(shí)施例方式
1.神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)無菌條件下取出14天大鼠胚胎的紋狀體，放入含有1％B27，20ng/mL EGF，10ng/mL bFGF的F12-DMEM(1∶1)培養(yǎng)基中，吹打制成細(xì)胞懸液，于37℃，50mL/L CO2飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)。
2.神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定將細(xì)胞貼附在載玻片上生長(zhǎng)，2天后取出。吸出培養(yǎng)液，用PBS洗去殘余培養(yǎng)液，4％(m/m)多聚甲醛固定20分鐘。PBS洗2次(每隔10分鐘1次)；10％正常山羊血清封閉1h；PBS洗3次；抗nestin抗體(v/v 1∶100，用抗體緩沖液稀釋)4℃過夜，PBS洗3次；二抗(v/v 1∶50，用抗體緩沖液稀釋)32℃孵育1小時(shí)，PBS洗3次；50％(v/v)甘油封片，觀察熒光。
3.從神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成膽堿能神經(jīng)元本研究是將20ng/mL bFGF(簡(jiǎn)稱F)，5μg/mL肝素(簡(jiǎn)稱H)，1μg/mL層粘連蛋白(簡(jiǎn)稱L)三種物質(zhì)進(jìn)行組合(即FHL，F(xiàn)H，F(xiàn)L，LH四種組合)后，加入到含1％B27(v/v)，20ng/mL EGF的F12-DMEM(1∶1)培養(yǎng)基中而構(gòu)成四種不同成分的培養(yǎng)基，將神經(jīng)干細(xì)胞置于四種不同的培養(yǎng)基中，于37℃、5％CO2飽和濕度下進(jìn)行誘導(dǎo)分化，同時(shí)做空白對(duì)照(培養(yǎng)基置于預(yù)先放有涂有多聚賴氨酸的載波片的培養(yǎng)皿中)。
4.膽堿能神經(jīng)元的免疫鑒定培養(yǎng)7天后，將含有細(xì)胞的載玻片取出，用PBS洗去殘余培養(yǎng)液，4％(m/m)多聚甲醛固定20分鐘。PBS洗2次(每隔10分鐘1次)；10％正常山羊血清封閉1小時(shí)；PBS洗3次；抗膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(ChAT)抗體(v/v 1∶500，用抗體緩沖液稀釋)4℃過夜，PBS洗3次；二抗(v/v 1∶50，用抗體緩沖液稀釋)32℃孵育1小時(shí)，PBS洗3次；50％(v/v)甘油封片，觀察熒光。
5.結(jié)果神經(jīng)干細(xì)胞在分別含F(xiàn)HL、FH、FL和LH的四種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天后，顯微鏡下觀察，結(jié)果在含F(xiàn)HL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的分散程度明顯大于其它三種培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞。培養(yǎng)第三天后，在含F(xiàn)HL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞有部分開始分化，而在分別含F(xiàn)H、FL、LH的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的細(xì)胞仍然處于未分化狀態(tài)。培養(yǎng)7天后，經(jīng)ChAT免疫反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)只有含F(xiàn)HL、FH的培養(yǎng)基誘導(dǎo)的細(xì)胞才檢測(cè)到ChAT+即觀察到綠色熒光。取十個(gè)視野分別在熒光和明光下觀察，F(xiàn)HL混合物誘導(dǎo)的膽堿能神經(jīng)元占總細(xì)胞的30％，但FH混合物誘導(dǎo)的膽堿能神經(jīng)元僅占10％。
由于bFGF、肝素以及層粘連蛋白可作為膽堿能神經(jīng)元分化調(diào)節(jié)因子，這可能對(duì)臨床膽堿能神經(jīng)元性疾病有治療作用。FHL和FH兩種培養(yǎng)液能分化為較多的膽堿能神經(jīng)元其原因可能有兩點(diǎn)第一，bFGF能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分化[7]；第二，bFGF因與肝素親和力高，故又稱為肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，其對(duì)各種體外培養(yǎng)神經(jīng)元具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，表現(xiàn)為促進(jìn)神經(jīng)元的存活與生長(zhǎng)[8]。
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權(quán)利要求
1.體外誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為膽堿能神經(jīng)元的方法，包括以下步驟(1)神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定；(2)神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化在含1％B27(v/v)、20ng/mL EGF的F12-DMEM(1∶1)培養(yǎng)基中加入bFGF、肝素、層粘連蛋白后，于37℃、50mL/L CO2飽和濕度下將神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為膽堿能神經(jīng)元；(3)膽堿能神經(jīng)元的鑒定。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述神經(jīng)干細(xì)胞從胎鼠紋狀體分離得到。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法是將胎鼠紋狀體在含有1％B27、20ng/mL EGF、10ng/mL bFGF的F12-DMEM(1∶1)培養(yǎng)基中，吹打制成細(xì)胞懸液，于37℃、50mL/L CO2飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定采用免疫熒光法。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述神經(jīng)干細(xì)胞在誘導(dǎo)分化后再進(jìn)行體外培養(yǎng)7天。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述膽堿能神經(jīng)元的鑒定采用免疫熒光法。
全文摘要
提供一種體外誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為膽堿能神經(jīng)元的方法，包括神經(jīng)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定后，在含1％B27(v/v)、20ng/mL EGF的F12－DMEM(1∶1)培養(yǎng)基中加入bFGF、肝素、層粘連蛋白后，于37℃、50mL/L CO
文檔編號(hào)C12N5/06GK1673356SQ20051002357
公開日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2005年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月26日
發(fā)明者陳付學(xué), 任雯雯, 楊洋, 過七根, 宋紅生, 文鐵橋 申請(qǐng)人:上海大學(xué)