專利名稱：一種低變性溫度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)，特別是涉及低變性溫度聚合酶鏈?zhǔn)椒椒ā?br> 背景技術(shù)：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種高效的擴(kuò)增特定DNA的方法，反應(yīng)的每一個(gè)循環(huán)包括變性，退火和延伸三個(gè)步驟。其中，變性使原始模板或擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA雙鏈解開(kāi)然后進(jìn)入下一輪退火和延伸，變性步驟是整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程中不可或缺的一環(huán)。PCR方法的常規(guī)變性溫度在94℃左右。Fuller(美國(guó)專利5432065，1995)和洪國(guó)藩(中國(guó)專利<申請(qǐng)?zhí)?amp;gt;01117603，<公告號(hào)>1384203，)在反應(yīng)液中添加20％左右的高濃度甘油來(lái)降低核酸變性溫度。Lakobashvili等(Nucleic-Acid-Research，1999.，Vol.27(6)1566-1568)和Wijnhoven等(美國(guó)專利，6277605，2001)分別采用添加高濃度脯氨酸和銅離子或鋅離子來(lái)降低核酸的變性溫度。上述方法公開(kāi)的變性溫度範(fàn)圍為70℃以上，能夠用中溫DNA聚合酶完成擴(kuò)增。本發(fā)明提供了一種在45-70℃變性溫度下完成PCR的方法，既使PCR擴(kuò)增專一性大大增強(qiáng)，同時(shí)又可能在反應(yīng)管內(nèi)預(yù)加和PCR技術(shù)密切關(guān)聯(lián)的酶如核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、連接酶、反轉(zhuǎn)錄酶、不耐熱的抗體和酶等PCR檢測(cè)試劑，為拓展PCR技術(shù)的應(yīng)用創(chuàng)造了條件。

發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明提供一種能在45-70℃變性溫度下完成擴(kuò)增的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，突破現(xiàn)有PCR方法中模板變性溫度的常規(guī)和范圍，既克服常規(guī)PCR反應(yīng)不能利用調(diào)節(jié)變性溫度來(lái)排除非專一擴(kuò)增產(chǎn)物以及排除假陰性結(jié)果的缺陷，又為在PCR反應(yīng)液中加入其他不耐受高溫的酶、抗體和其他試劑創(chuàng)造了條件。
發(fā)明構(gòu)思許多類化合物如吡烙烷酮類化合物、甲酰胺類化合物和烷基及環(huán)砜類有比甘油等試劑更強(qiáng)對(duì)降核酸變性溫度對(duì)作用。例如10％甘油使Lambda-DNA變性溫度降低3℃，而同樣濃度二甲亞砜(DMSO)、甲酰胺和N-甲基2-吡烙烷酮(NMP)能使變性溫度分別降低5.8、6.6和10.6℃。但是，這些強(qiáng)核酸變性劑又會(huì)嚴(yán)重破壞DNA聚合酶的耐熱性。例如10％甲酰胺和5％NMP使TaqDNA聚合酶在97.5C時(shí)的半衰期從11分鐘降低至1.5分鐘和零分鐘(Landre等PCR-Strategies，M.A.Innis等編，Academic-Press，1995，P1-16)。所以上述強(qiáng)核酸變性試劑未能應(yīng)用于PCR反應(yīng)或只能應(yīng)用相當(dāng)?shù)偷臐舛?，使核酸變性溫度降低的?shù)值相當(dāng)有限。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)上述強(qiáng)核酸變性劑試對(duì)DNA聚合酶耐熱性的破壞作用隨溫度降低而顯著減弱，在較低的變性溫度下即使上述強(qiáng)變性試劑的濃度超過(guò)20％，TaqDNA聚合酶仍能經(jīng)歷反復(fù)的變性—退火和延伸步驟而仍保持足夠的活力完成擴(kuò)增。添加高濃度強(qiáng)核酸變性劑使核酸變性溫度降低20℃以上，針對(duì)不同的擴(kuò)增產(chǎn)物可在45-70℃變性溫度下完成擴(kuò)增。
技術(shù)方案本發(fā)明提供一種低變性溫度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，PCR反應(yīng)步驟依次包括(1)DNA模板變性解鏈；(2)引物與模板退火；(3)在DNA聚合酶催化下延伸合成互補(bǔ)DNA鏈；(4)按步驟(1)-(3)循環(huán)進(jìn)行合成反應(yīng)；其特征在于步驟(1)DNA模板變性解鏈溫度為45-70℃。反應(yīng)液含有4種脫氧核糖核苷酸、DNA聚合酶、緩沖液、引物、模板核酸和至少一種強(qiáng)核酸變性劑如吡咯烷酮類的N-甲基2-吡咯烷酮(NMP)和2-吡咯烷酮等，酰胺類的二甲基甲酰胺(DMF)和甲酰胺等，砜基類的二甲基亞砜(DMSO)和甜菜鹼等。反應(yīng)液中還可添對(duì)DNA聚合酶活性和耐熱性有保護(hù)作用的試劑如多元醇類的甘油和乙二醇等。
有益效果使用強(qiáng)核酸變性劑在45-70℃低溫下變性提高了擴(kuò)增的專一性，同時(shí)為在PCR反應(yīng)管內(nèi)預(yù)加或PCR反應(yīng)液內(nèi)添加不耐高溫的酶和其他試劑，建立PCR反應(yīng)與其他酶聯(lián)用的技術(shù)擴(kuò)展PCR應(yīng)用創(chuàng)開(kāi)了新路。
具體實(shí)施實(shí)施例1實(shí)施例1目標(biāo)基因?yàn)槿薭eta肌動(dòng)球蛋白基因(美國(guó)國(guó)家生物信息中心基因庫(kù)編號(hào)BC016045。采用ClonTech公司的Advantage2-PCR試劑盒，每管反應(yīng)體積為5ul。核酸模板為人基因組DNA(1ug/100ul)，引物濃度0.4uM。引物順序和特性如表1所示表1，實(shí)施例1引物順序和特性

以基因組DNA為模板時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)295堿基，擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度84℃，在不加核酸變性劑的對(duì)照條件下能夠在85℃變性溫度下完成擴(kuò)增。表2顯示反應(yīng)液添加10％核酸變性劑對(duì)TaqDNA聚合酶耐熱性的影響。試驗(yàn)初次變性80-95℃5分鐘，循環(huán)變性80℃10秒，退火60℃30秒，延伸65℃30秒。共35循環(huán)。
表2，核酸變性試劑對(duì)DNA聚合酶耐熱性的影響

表2說(shuō)明10％濃度的核酸變性試劑都顯著降低聚合酶在95℃左右時(shí)的耐熱性在該變性溫度下不能完成擴(kuò)增，但在80-90℃下連續(xù)加熱5分鐘DNA聚合酶均能保持足夠活性完成擴(kuò)增。
實(shí)施例2實(shí)施例2的目標(biāo)基因，核酸模板等與實(shí)施例1相同。表3顯示不同變性試劑對(duì)完成擴(kuò)增的最低允許變性溫度的影響。變性劑濃度為10％，試驗(yàn)初次變性85℃1分鐘，循環(huán)變性70-80℃10秒，退火55℃30秒，延伸65℃30秒。共35循環(huán)。
表3，不同變性試劑對(duì)完成擴(kuò)增的最低允許變性溫度的影響

表3說(shuō)明10％濃度的表述的各種核酸變性試劑使完成擴(kuò)增所需的變性溫度降低5度以上。
實(shí)施例3實(shí)施例3的目標(biāo)基因，核酸模板等與實(shí)施例1相同。表4顯示不同濃度二甲基甲酰胺(DMF)或N-甲基2-吡咯烷酮(NMP)對(duì)完成擴(kuò)增的最低允許變性溫度的影響。試驗(yàn)初次變性75℃1分鐘，循環(huán)變性60-70℃10秒，退火45℃30秒，延伸60℃30秒。共35循環(huán)。
表4，不同濃度DFM或NMP對(duì)完成擴(kuò)增的最低允許變性溫度的影響


表4說(shuō)明隨核酸變性劑濃度提高能完成擴(kuò)增的最低允許溫度下降。20％DMF和20％NMP使最低允許變性溫度比對(duì)照分別下降19℃和21℃以上。二種不同的核酸變性劑對(duì)降低核酸變性溫度有協(xié)同作用。
實(shí)施例4實(shí)施例4的目標(biāo)基因?yàn)槿说诹旧w中一個(gè)基因片段。(美國(guó)國(guó)家生物信息中心基因庫(kù)編號(hào)GI29801752)。試驗(yàn)試劑和條件與實(shí)施例1相同。引物順序和特性示于表5表5，實(shí)施例3引物順序和特性

擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)131堿基，擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度70.7℃，在不加核酸變性劑的對(duì)照條件下能在72℃變性溫度下完成擴(kuò)增。實(shí)施例3的初次變性80℃2分鐘，循環(huán)變性55-70℃30秒，退火35℃30秒，延伸55℃2分鐘，共35循。表6顯示變性劑NMP與甘油合用對(duì)完成擴(kuò)增最低允許變性溫度的影響。
表6，5-10％NMP和甘油聯(lián)用對(duì)最低允許變性溫度的影響

表6說(shuō)明應(yīng)用10％NMP和20％甘油可以在55℃變性溫度下完成擴(kuò)增。
表7顯示應(yīng)用更高濃度變性劑時(shí)的試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)條件為初次變性80℃2分鐘，循環(huán)變性45-60℃30秒，退火30℃30秒，延伸45℃5分鐘。共35循環(huán)。
表7，10-15％NMP和甘油聯(lián)用對(duì)最低允許變性溫度影響

表7說(shuō)明應(yīng)用15％NMP和20％甘油能在約50℃變性溫度下完成擴(kuò)增。
實(shí)施例5
實(shí)施例5目標(biāo)基因?yàn)槿薭eta肌動(dòng)球蛋白基因(美國(guó)國(guó)家生物信息中心基因庫(kù)編號(hào)BC016045)。引物順序和特性示于表8表8，實(shí)施例4引物順序和特性

擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)62堿基，擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度67.9℃，在不加變性劑的對(duì)照條件下能夠在68℃變性溫度下完成擴(kuò)增。實(shí)施例4的核酸模板為cDNA，由人組織總RNA用ClonTech公司的cDNA合成試劑盒用Oligo(dT)經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成。PCR的試劑和條件與實(shí)施例3相同。結(jié)果表明當(dāng)在PCR反應(yīng)液中加15％NMP和20％甘油，初次變性75℃2分鐘，循環(huán)變性46℃30秒，退火30℃30秒，延伸40℃5分鐘的條件下，經(jīng)共35循環(huán)擴(kuò)增得到目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1，一種低變性溫度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，反應(yīng)依次包括如下步驟(1)DNA模板變性解鏈；(2)引物與模板退火；(3)在DNA聚合酶催化下延伸合成互補(bǔ)DNA鏈；(4)按步驟(1)-(3)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；其特征在于步驟(1)DNA模板變性解鏈溫度為45-70℃。
2，根據(jù)權(quán)利要求1所述的低變性溫度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的反應(yīng)液含有至少一種核酸變性試劑。
3，根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的低變性溫度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的核酸變性試劑包括但不限于吡烙烷酮類化合物。
4，根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的低變性溫度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的核酸變性試劑為2-吡烙烷酮和N-甲基2-吡烙烷酮。
5，根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的低變性溫度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的核酸變性試劑包括但不限于酰胺類化合物。
6，根據(jù)權(quán)利要求1、2和5所述的低變性溫度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的核酸變性試劑為甲酰胺和二甲基甲酰胺。
7，根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的低變性溫度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的核酸變性試劑包括但不限于砜基類化合物。
8，根據(jù)權(quán)利要求1、2和7所述的低變性溫度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的核酸變性試劑為甜菜鹼和二甲基亞砜。
9，根據(jù)權(quán)利要求1至8所述的低變性溫度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的反應(yīng)液含有至少一種DNA聚合酶保護(hù)劑。
10，根據(jù)權(quán)利要求1至9所述的低變性溫度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的反應(yīng)液保護(hù)劑包括但不限于多元醇類化合物。
11，根據(jù)權(quán)利要求1至10所述的低變性溫度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的反應(yīng)液保護(hù)劑為甘油和乙二醇
全文摘要
一種能夠在45－70℃變性溫度下完成擴(kuò)增的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法。PCR反應(yīng)液含有強(qiáng)核酸變性試劑和對(duì)DNA聚合酶有保護(hù)作用的試劑。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1804034SQ20051002329
公開(kāi)日2006年7月19日 申請(qǐng)日期2005年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月13日
發(fā)明者徐定邦, 朱德芬, 謝文凱, 陳有容 申請(qǐng)人:徐定邦, 徐文慧