專利名稱：海洋生物抗氧化活性肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物肽領(lǐng)域，特別是涉及從海洋動(dòng)物貝類提取的海洋生物抗氧化活性肽及其制備方法。
背景技術(shù)：
眾所周知，海洋生物產(chǎn)品是人們?nèi)粘Ｉ钪兄匾鞍踪|(zhì)來源，說明海洋產(chǎn)品中含有各種各樣豐富的蛋白質(zhì)。據(jù)報(bào)道，來自海洋產(chǎn)品貝類中具有抗氧化活性的蛋白為一類含有酸性雜多糖的蛋白質(zhì)，耐熱性強(qiáng)。海洋貝類內(nèi)臟中也含有大量的糖元及其它多糖，以及豐富蛋白質(zhì)，以往多采用鹽析及丙酮沉淀等步驟將多糖成分從抽取物中分離出來。
酶促活性多肽作為蛋白質(zhì)的后加工產(chǎn)物，多為一類小分子的多肽，具有與蛋白質(zhì)分子相同的正常的氨基酸結(jié)構(gòu)。這類多肽多數(shù)都是在生命活動(dòng)過程中起著重要的功能調(diào)節(jié)作用，因此結(jié)構(gòu)一旦闡明，借助于化學(xué)途徑，可合成拮抗劑、活性中心片斷等類似物。同時(shí)研究活性多肽在降解代謝過程中的酶切位點(diǎn)、維持其構(gòu)象的必要條件以及它們與特異受體結(jié)合的主要部位和發(fā)動(dòng)或傳導(dǎo)信息的活性中心，從而可有意識(shí)地將整個(gè)分子改貌，制備出比天然肽效價(jià)更高和選擇性更強(qiáng)的藥物。
目前國內(nèi)外有關(guān)多肽類蛋白質(zhì)的分離、純化已有廣泛的研究，一般普遍采用HPLC進(jìn)行肽類物質(zhì)的純化，其活性回收率可達(dá)到80％以上。國內(nèi)馬建農(nóng)等人采用CM-52、Bio-Gel P-6、DEAE-52及R-HPLC各步層析，從豬胰臟的酸醇提取液中純化得到了純的胰島素拮抗肽；董文玉等人采用高效液相色譜法對組合化學(xué)合成結(jié)構(gòu)小分子多肽進(jìn)行了分析，結(jié)果成功地將10種目標(biāo)多肽與其它雜質(zhì)分離，提供了一種常規(guī)的分析手段。但從海洋動(dòng)物貝類中分離、純化抗氧化活性肽而言，目前尚屬空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在不足，經(jīng)發(fā)明人長期從事海洋生物、微生物及其后續(xù)加工處理的開發(fā)研究中，提供一種從海洋貝類內(nèi)臟團(tuán)中制得的一種新的海洋生物抗氧化活性肽及其制備方法。
本發(fā)明提供的海洋生物抗氧化活性肽，其特征為一小分子量多肽類物質(zhì)，分子量為794Dal；由7種氨基酸組成，分別為天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、纈氨酸(Val)和賴氨酸(Lys)，其物質(zhì)的量之比為Asp∶Gly∶Thr∶Ala∶Pro∶Val∶Lys＝1∶1∶1∶1∶2∶1∶1。含有8個(gè)氨基酸殘基。其中酸性氨基酸的相對含量為9.22％，堿性氨基酸的相對含量為12.62％，極性氨基酸的相對含量為44.8％，各氨基酸相對含量如表1，表1.
氨基酸 相對含量(mol％)Asp 9.2Gly 10.3Thr 12.6Ala 14.9Pro 27.6Val 12.6Lys 12.6該多肽酸性氨基酸和堿性氨基酸含量相對平衡，所以酸堿性不強(qiáng)，極性氨基酸和非極性氨基酸相對含量也較平衡，所以不顯示出較強(qiáng)或者是較弱的疏水作用。
茚三酮反應(yīng)呈陽性，表明該肽N端未被封閉且為鏈狀多肽。
吸收光譜掃描結(jié)果表明，該肽的最大吸收為280nm，與典型蛋白質(zhì)吸收峰相同。
純度鑒定純度大于96.42％，達(dá)到高效液相純。
抗氧化生物活性采用亞鐵離子催化過氧化氫產(chǎn)生羥自由基(Fenton反應(yīng))，該反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基可使番紅花紅褪色。
取0.025M，pH7.4的磷酸緩沖液1ml，40ug/ml的番紅花紅1ml，供試藥品0.5ml，3％過氧化氫1ml(新鮮配制)，0.945mM EDTA-Fe(II)1ml(新鮮配制)，混合后在37℃水浴中反應(yīng)30min后在520nm處測定吸收度?？瞻捉M以0.5ml蒸餾水代替供試樣品，對照組以1.5ml蒸餾水代替EDTA-Fe(II)和供試樣品。并按下式計(jì)算清除率 在Fenton反應(yīng)中亞鐵離子與過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，羥自由基可使番紅花紅褪色。在加入扇貝抗氧化活性肽后，通過消除羥自由基，從而抑制番紅花紅褪色。根據(jù)對褪色的抑制程度計(jì)算清除羥自由基能力的強(qiáng)弱。
結(jié)果表明，海洋生物抗氧化活性肽在試驗(yàn)濃度(0.1～1.0mg/mL)范圍內(nèi)對羥自由基有極強(qiáng)的清除作用，并且隨著濃度的增加，清除率持續(xù)增大。并且在低濃度時(shí)，抗氧化活性增加迅速，濃度增高時(shí)，活性增加速度降低不明顯。根據(jù)所得曲線進(jìn)行對數(shù)回歸，經(jīng)計(jì)算得到IC50為0.39mg/mL。
通過一系列抗氧化活性的特異性化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)該肽對番紅花紅褪色反應(yīng)有抑制作用而對其它抗氧化反應(yīng)無明顯的作用，但此多肽是否真正具有抗羥自由基活性還無法確定。因?yàn)橛幸韵聨追N可能是該多肽對褪色反應(yīng)有抑制作用1.多肽能夠捕獲羥自由基，從而抑制了番紅花紅的褪色；2.多肽與H2O2或EDTA-Fe(II)結(jié)合，破壞了Fenton羥自由基反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致番紅花紅無法褪色；3.多肽在513nm處有強(qiáng)烈的吸收，在反應(yīng)時(shí)抵消了番紅花紅褪色的程度；4.多肽與番紅花紅結(jié)合成化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的物質(zhì)，從而屏蔽了羥自由基與番紅花紅的反應(yīng)。鑒于以上四種可能，我們有針對性的作了一些實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見下表2表2番紅花紅褪色機(jī)理測定結(jié)果加樣 量A513nmA513nm平均值1ml EDTA-Fe(II)1mlH2O 0.1ml肽 0.709； 0.710； 0.711 0.7101mll EDTA-Fe(II) 1mlH2O 0.1mlH2O0.700； 0.704； 0.697 0.7001mlH2O1mlH2O20.1ml肽 0.680； 0.683； 0.684 0.6821mlH2O1mlH2O20.1ml H2O 0.620； 0.624； 0.626 0.623從上表2數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)1.番紅花紅的褪色確實(shí)是由于Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基引起的，因?yàn)镋DTA-Fe(II)或H2O2在單獨(dú)作用時(shí)都無法使番紅花紅褪色；多肽的加入基本上不會(huì)引起反應(yīng)體吸光度的較大增加。因此，通過Fenton反應(yīng)引起的番紅花紅褪色反應(yīng)完全可以用來檢測抗羥自由基多肽的活性。
同時(shí)，采用ESR自旋捕集技術(shù)和化學(xué)發(fā)光法對扇貝抗氧化多肽的抗氧化活性進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該小肽對Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基清除能力非常強(qiáng)，進(jìn)一步證實(shí)該多肽對羥自由基的捕獲作用。
本發(fā)明提供的海洋生物抗氧化活性肽的制備方法包括(1)氧化活性蛋白的制備①將貝類如新鮮扇貝類內(nèi)臟團(tuán)絞碎，然后按濕重1∶1(w/w)加入1.0％的NaCl溶液(內(nèi)含0.2％Triton-100；0.1mmol/L EDTA)置組織勻漿器中制成勻漿；②調(diào)pH為5.6，70℃水浴加熱5min，迅速冷卻。冷卻液經(jīng)如15000rpm離心10min，收集上清液，調(diào)pH至6.7后收取60～90％飽和度的(NH4)2SO4沉淀，沉淀用5mmol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)-HCl(pH7.5)緩沖液溶解、透析。
③將離心透析液取上清液，加入1.5倍預(yù)冷丙酮。將丙酮沉淀物再溶解于5mmol/L的Tris-HCl(pH7.5)緩沖液中并充分透析得粗蛋白液；④粗蛋白液經(jīng)聚乙二醇20000濃縮、離心除不溶物，取上清液上DEAE-Sephadex A-50柱(20×400mm)。先用5mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)充分平衡，再用含0～0.2M氯化鈉的上述緩沖液梯度洗脫，流速20ml/h。收集在280nm有吸收的餾份，合并具SOD活性的餾份，濃縮并用雙蒸水充分透析、凍干保存(以上試驗(yàn)溫度條件除特別注明外均為4℃)。
(2)抗氧化活性多肽制備①根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)選取酶解貝類如扇貝內(nèi)臟團(tuán)制得抗氧化肽的最佳條件為向抗氧化蛋白，加入0.016g低溫堿性蛋白酶，蛋白質(zhì)與酶重量比為33∶1.6調(diào)pH為9.0，于30℃恒溫水浴中酶解24小時(shí)；將酶解液置于沸水浴中加熱如10分鐘使酶失活，冷卻。離心除去變性的大分子蛋白，取上清冷凍干燥。
②酶解后粗品用去離子水溶解，經(jīng)Sephadex G-25凝膠柱層析進(jìn)一步去除大分子蛋白用Tris-HCl緩沖液(pH7.2)平衡后裝柱(18×1000mm)，上樣后用平衡緩沖液洗脫，流速為3ml/min，280nm處檢測。
(3)提純①CM Sepharose陽離子交換柱層析陽離子交換劑CM Sepharose Fast Flow，經(jīng)預(yù)處理后用2mM磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH3.0)平衡后裝柱(30×160mm)，上樣后用緩沖液洗脫到出現(xiàn)基線，再用含0～0.5M氯化鈉的上述緩沖液梯度洗脫。收集活性峰。
②反相高效液相色譜(RP-HPLC)分析Waters 2690高效液相色譜系統(tǒng)，Symmetry C18分析型色譜柱(5um，3.9×150mm)，上樣溶液為過膜去離子水，洗脫液為30％乙腈-水溶液。0％～100％洗脫液洗脫15ml。樣品收集后真空冷凍干燥，得純海洋生物抗氧化活性肽。
根據(jù)本發(fā)明提供的海洋生物抗氧化活性肽及其制備方法中，所述貝類內(nèi)臟團(tuán)包括各種貝類內(nèi)臟團(tuán)，例如蛤蜊、球母、刀蚌、文蛤、扇貝等，特別是扇貝如櫛孔扇貝，通常剝離扇貝柱后剩余的全部內(nèi)臟團(tuán)，以利于經(jīng)濟(jì)實(shí)用，優(yōu)選采用新鮮貝類如新鮮扇貝剝離扇貝柱后剩余的全部內(nèi)臟團(tuán)。另外也可采用各種漁類加工后剩余的下腳料。
所述本發(fā)明提供的海洋生物抗氧化活性肽(PCF)的動(dòng)物生理活性①抗氧化物活性采用地塞米松(DEX)與脾臟和胸腺淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)，建立了淋巴細(xì)胞免疫抑制試驗(yàn)?zāi)Ｐ?。?shí)驗(yàn)結(jié)果，DEX能顯著降低脾臟和胸腺淋巴細(xì)胞的活性，而PCF不僅能顯著地減輕其對免疫細(xì)胞的抑制作用，同時(shí)還可以促進(jìn)免疫細(xì)胞的活性，表明PCF對DEX引起的淋巴細(xì)胞抑制具有保護(hù)作用。
②采用噻唑鹽比色法探討了在60Co輻射損傷條件下貝類如扇貝多肽對胸腺細(xì)胞的保護(hù)作用，和對60Co輻射損傷的胸腺細(xì)胞修復(fù)能力的影響。結(jié)果提示提示扇貝多肽具有抵抗60Co輻射對胸腺細(xì)胞的損傷作用，并且呈劑量依賴性；而且在一定的時(shí)間范圍內(nèi)對受到輻射損傷后的胸腺細(xì)胞具有促進(jìn)其修復(fù)的作用。
③探究了扇貝多肽對大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型(MCAO)損傷后神經(jīng)元的保護(hù)作用，結(jié)論扇貝多肽對大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷后的神經(jīng)元具有保護(hù)作用，其機(jī)制與扇貝多肽能提高抗氧化酶含量，抑制脂質(zhì)過氧化有關(guān)。
④所述海洋肽能明顯增加衰老皮膚的的表皮平均厚度和成纖維細(xì)胞數(shù)目。提高真皮內(nèi)彈性纖維含量，具有顯著的抗皮膚老化作用。并且皮膚毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，該海洋肽未引起皮膚急性毒性反應(yīng)，無刺激性，為輕度致敏物。
⑤扇貝多肽具有抗紫外線UVA對無毛小鼠皮膚氧化損傷的作用。其機(jī)制與扇貝多肽上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)NOS蛋白的表達(dá)，提高抗氧化酶含量，抑制脂質(zhì)過氧化有關(guān)。
通過生物及動(dòng)物生理活性測定確定所得到的多肽為抗氧化活性多肽。
在抗氧化活性蛋白制備中，勻漿通常采用市售勻漿機(jī)如組織勻漿機(jī)(如海鷗YQ-3型勻漿機(jī)，江陰市新北五金皮塑廠銷售)。
收集具有抗氧化活性的扇貝蛋白為酶解目標(biāo)，制備抗氧化多肽，這樣提高了以后的各步操作的目標(biāo)性和可行性。
本實(shí)驗(yàn)采用較長時(shí)間加熱的步驟，使不需要的雜蛋白變性、沉淀，進(jìn)而提高了產(chǎn)物的純度，有利于后續(xù)操作步驟(圖1)。
海產(chǎn)貝類內(nèi)臟中含有大量的糖元及其它多糖，多糖的存在使成分的吸濕性、粘性增大，不易凍干保存，采用鹽析及丙酮沉淀等步驟將多糖成分從抽提物中分離出來。
海洋堿性低溫蛋白酶因其來自海洋低溫環(huán)境，所以與陸地蛋白酶相比，在酶的性質(zhì)方面具有特殊性。酶解制備多肽類活性物質(zhì)時(shí)，各種酶的反應(yīng)條件各異，影響底物蛋白構(gòu)象的變化，并且各種酶專一性促使產(chǎn)物多肽的N-末端、C-末端氨基酸組成及排列各異。選取海洋低溫堿性蛋白酶對扇貝進(jìn)行酶解，目標(biāo)性較強(qiáng)。
酶解得到的抗氧化肽粗品經(jīng)Sephadex G-25分析，記錄顯示有兩個(gè)峰(圖2)。
根據(jù)分子篩的作用原理，物質(zhì)出峰時(shí)間與分子量大小呈負(fù)相關(guān)。與未經(jīng)酶解的抗氧化蛋白比較表明圖中蛋白吸收曲線的第一個(gè)峰與肽吸收曲線的第一個(gè)峰為同一物質(zhì)，而肽吸收曲線第二個(gè)峰為比第一個(gè)峰具有更小分子量的物質(zhì)。因此圖中蛋白吸收曲線的第二個(gè)峰為扇貝抗氧化蛋白經(jīng)堿性蛋白酶酶解后的產(chǎn)物，系小肽類物質(zhì)。將多肽峰收集凍干保存。
該步實(shí)驗(yàn)主要是為了使酶解后的雜蛋白和多肽分離，并且蛋白和酶解后的多肽分子量差別較大，所以在進(jìn)行分子篩純化時(shí)，選取了較大的流速，使蛋白較快的流出。經(jīng)過該步純化，實(shí)現(xiàn)了快速的蛋白與多肽分離。將目標(biāo)成分進(jìn)行了濃縮，便于進(jìn)一步的操作。
將海洋肽上CM Sepharose FF陽離子交換層析柱后的結(jié)果見圖3。
較低pH值可確保大部分多肽分子與陽離子交換樹脂產(chǎn)生較好的吸附作用，但考慮到樹脂的耐受pH值范圍及為避免多肽被水解，因此，確定上樣緩沖液的pH值為3.0，作為洗脫液，應(yīng)為高鹽濃度的緩沖液，以確保將被吸附的多肽分子全部洗脫下來。
陽離子交換得到的第二峰經(jīng)RP-HPLC分析，結(jié)果如圖4，保留時(shí)間為20.919min的峰為活性峰。因該峰與雜峰臨近并有部分交叉，所以只收集峰尖部分并凍干保存。
反相高效液相方法是目前用于分離小分子肽類物質(zhì)最常用的方法之一。
海洋抗氧化肽粗制品經(jīng)CM Sepharose陽離子柱層析、RP-HPLC柱層析等步驟，該活性肽被提純了35.88倍，結(jié)果見表3。
表3純化結(jié)果

本發(fā)明提供海洋生物抗氧化活性肽及其制備方法是一種快速、方便可靠的方法，得到具有對Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基清除能力非常強(qiáng)其清除的EC50＝0.39Mg/ml左右具有顯著的抗氧化作用。氧自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)與許多疾病的發(fā)生有密切的聯(lián)系。其中羥自由基是已知的最強(qiáng)的氧化劑，它幾乎可以和所有的細(xì)胞成分發(fā)生反應(yīng)，對機(jī)體危害極大。因此，海洋抗氧化肽可能被作為天然的食品抗氧化劑用于抑制脂質(zhì)自氧化。羥自由基能使透明質(zhì)酸解聚，涵水力下降導(dǎo)致皮膚干燥出現(xiàn)皺紋，海洋抗氧化肽還可認(rèn)為是一種有效的抗皮膚老化的海洋活性物質(zhì)。另外，研究表明具有較強(qiáng)抗氧化作用的肽分子量一般較小，因此它們易被腸道吸收而直接在機(jī)體起作用，又安全、無毒、無副作用。目前，自由基學(xué)說及其有關(guān)指標(biāo)測定已成為闡述抗衰老物質(zhì)作用機(jī)制的通用方法。另外，海洋蛋白資源酶解后普遍呈現(xiàn)出溶解性好，乳化性強(qiáng)，流動(dòng)性增加等優(yōu)點(diǎn)。因此，該抗氧化肽作為天然抗氧化劑在藥物、日用化工、食品等方面均具有廣闊的開發(fā)利用前景。


圖1為抗氧化蛋白的DEAE-Sephadex A-50柱層析曲線。
圖2為扇貝抗氧化蛋白與肽的凝膠層析曲線。
圖3為抗氧化肽CM Sepharose陽離子柱層析曲線。
圖4為抗氧化肽RP-HPLC分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明用下列實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于實(shí)施例。
實(shí)施例1抗氧化活性蛋白的制備(1)將600克新鮮扇貝內(nèi)臟團(tuán)絞碎，然后按濕重1∶1(w/w)加入1.0％的NaCl溶液(內(nèi)含0.2％Triton-100；0.1mmol/L EDTA)置組織勻漿器中制成勻漿。調(diào)pH為5.6，70℃水浴加熱5min，迅速冷卻。冷卻液經(jīng)15000rpm離心10min，收集上清液，調(diào)pH至6.7后收取60～90％飽和度的(NH4)2SO4沉淀，沉淀用5mmol/L的Tris-HCl(pH7.5)緩沖液溶解、透析。將離心透析液取上清液，緩緩加入1.5倍預(yù)冷丙酮。將丙酮沉淀物再溶解于5mmol/L的Tris-HCl(pH7.5)緩沖液中并充分透析得粗蛋白液，凍干保存(樣品I)。
(2)粗蛋白液經(jīng)聚乙二醇20000濃縮、離心除不溶物，取上清液上DEAE-Sephadex A-50柱(20×400mm)。先用5mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)充分平衡，再用含0～0.2M氯化鈉的上述緩沖液梯度洗脫，流速20ml/h。收集在280nm有吸收的餾份，合并具SOD活性的餾份，濃縮并用雙蒸水充分透析、凍干保存(樣品II)。
酶解取樣品II 90ml(含蛋白質(zhì)為0.33g)，加入0.016g海洋低溫堿性蛋白酶(黃海水產(chǎn)研究所產(chǎn)品)，調(diào)節(jié)pH＝9.0，30℃恒溫水浴中酶解24小時(shí)。酶解結(jié)束，將酶解液置于沸水浴中加熱10分鐘使酶失活。冷卻，離心除去變性的大分子蛋白。取上清冷凍干燥、真空封裝(樣品III)。
分離酶解后粗品用去離子水溶解，經(jīng)Sephadex G-25凝膠柱層析進(jìn)一步去除大分子蛋白用Tris-HCl緩沖液(pH7.2)平衡后裝柱(18×1000mm)，上樣后用平衡緩沖液洗脫，收集多肽峰，凍干保存(樣品IV)。
提純(1)陽離子交換劑CM Sepharose Fast Flow，經(jīng)預(yù)處理后用2mM磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH3.0)平衡后裝柱(30×160mm)，上樣后用緩沖液洗脫到出現(xiàn)基線，再用含0～0.5M氯化鈉的上述緩沖液梯度洗脫。收集活性峰(樣品V)。
(2)Waters 2690高效液相色譜系統(tǒng)，Symmetry C18分析型色譜柱(5um，3.9×150mm)，上樣溶液為過膜去離子水，洗脫液為30％乙腈-水溶液。0％～100％洗脫液洗脫15ml。樣品收集后真空冷凍干燥(樣品VI)，得純海洋生物抗氧化活性肽。
權(quán)利要求
1.一種海洋生物抗氧化活性肽，其特征在于為一小分子量多肽類物質(zhì)，分子量為794Dal；由天冬氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸和賴氨酸組成，其相對mol％含量分別為天冬氨酸9.2、甘氨酸10.3、蘇氨酸12.6、丙氨酸14.9、脯氨酸27.6、纈氨酸12.6、賴氨酸12.6，其物質(zhì)的量之比為天冬氨酸∶甘氨酸∶蘇氨酸∶丙氨酸∶脯氨酸∶纈氨酸∶賴氨酸＝1∶1∶1∶1∶2∶1∶1，含有8個(gè)氨基酸殘基，其中酸性氨基酸的相對含量為9.22％，堿性氨基酸的相對含量為12.62％，極性氨基酸的相對含量為44.8％；該多肽酸性氨基酸和堿性氨基酸含量相對平衡，所以酸堿性不強(qiáng)，極性氨基酸和非極性氨基酸相對含量也較平衡，所以不顯示出較強(qiáng)或者是較弱的疏水作用；茚三酮反應(yīng)呈陽性，表明該物質(zhì)N端未被封閉且為鏈狀多肽；吸收光譜掃描結(jié)果表明，該物質(zhì)的最大吸收為280nm，與典型蛋白質(zhì)吸收峰相同；純度鑒定純度大于96.42％，達(dá)到高效液相純；抗氧化生物活性該抗氧化活性肽對Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基清除能力極強(qiáng)，其清除的EC50＝0.39mg/mL。
2.一種海洋生物抗氧化活性肽的制備方法，包括(1)抗氧化活性蛋白的制備①將貝類內(nèi)臟團(tuán)絞碎，然后按濕重1∶1(w/w)加入含0.2％Triton-100；0.1mmol/L EDTA的1.0％的NaCl溶液置組織勻漿器中制成勻漿；②調(diào)pH為5.6，70℃水浴加熱5min，迅速冷卻。冷卻液經(jīng)離心10min，收集上清液，調(diào)pH至6.7后收取60～90％飽和度的(NH4)2SO4沉淀，沉淀用5mmol/L pH7.5的三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖液溶解、透析；③將離心透析液取上清液，加入1.5倍預(yù)冷丙酮。將丙酮沉淀物再溶解于5mmol/L pH7.5的三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖液中并充分透析得粗蛋白液；④粗蛋白液經(jīng)聚乙二醇20000濃縮、離心除不溶物，取上清液上DEAE-Sephadex A-50 20×400mm柱，先用5mmol/L pH7.5的三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖液充分平衡，再用含0～0.2M氯化鈉的上述緩沖液梯度洗脫，流速20ml/h，收集在280nm有吸收的餾份，合并具SOD活性的餾份，濃縮并用雙蒸水充分透析、凍干保存；(2)抗氧化活性多肽制備①向抗氧化蛋白加入海洋低溫堿性蛋白酶，蛋白質(zhì)與酶重量比為33∶1.6，調(diào)pH為9.0，于30℃恒溫水浴中酶解24小時(shí)，酶解結(jié)束后，將酶解液置于沸水浴中加熱使酶失活，冷卻，離心除去變性的大分子蛋白，取上清液冷凍干燥；②酶解后粗品用去離子水溶解，經(jīng)Sephadex G-25凝膠柱層析進(jìn)一步去除大分子蛋白用pH7.2三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖液平衡后裝18×1000mm柱，上樣后用平衡緩沖液洗脫，流速為3ml/min，280nm處檢測；(3)提純①CM Sepharose陽離子交換柱層析陽離子交換劑CM Sepharose Fast Flow，經(jīng)預(yù)處理后用pH3.0的2mM磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液平衡后裝30×160mm柱，上樣后用緩沖液洗脫到出現(xiàn)基線，再用含0～0.5M氯化鈉的上述緩沖液梯度洗脫，收集活性峰；②反相高效液相色譜(RP-HPLC)Waters 2690高效液相色譜系統(tǒng)，Symmetry C18分析型色譜5um，3.9×150mm柱，上樣溶液為過膜去離子水，洗脫液為30％乙腈—水溶液，0％～100％洗脫液洗脫15ml，樣品收集后真空冷凍干燥，得純海洋生物抗氧化活性肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型海洋生物抗氧化活性肽及其制備方法，該海洋生物抗氧化活性肽，其特征為一小分子量多肽類物質(zhì)，分子量為794Da1；由7種氨基酸組成，分別為天冬氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸和賴氨酸，其物質(zhì)的量之比為1∶1∶1∶1∶2∶1∶1。含有8個(gè)氨基酸殘基。其中酸性氨基酸的相對含量為9.22％，堿性氨基酸的相對含量為12.62％，極性氨基酸的相對含量為44.8％。本發(fā)明提供的海洋生物抗氧化活性肽具有如下明顯的優(yōu)點(diǎn)抗氧化活性強(qiáng)、水溶性好及安全、無毒、無副作用等，適宜應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1660892SQ20051000003
公開日2005年8月31日 申請日期2005年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月5日
發(fā)明者王躍軍, 孫謐, 鄒建, 王海英 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所