專利名稱：從豬胎盤中提取多種生物活性物質(zhì)的聯(lián)產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種豬胎盤(含產(chǎn)血)綜合利用聯(lián)產(chǎn)工藝，是以豬胎盤為主原料，應(yīng)用現(xiàn)代生物過程集成化技術(shù)，在同一生產(chǎn)工藝流
程中，可生產(chǎn)出免疫球蛋白(lg)、免疫活性肽、超氡化物歧化酶(S0D)、脂多糖、胎盤蛋白共5種系列產(chǎn)品，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健、日化工業(yè)和畜牧業(yè)。
背景技術(shù)：
人類使用胎盤的歷史源遠(yuǎn)流長。約400多年前，李時珍在其集中國古今醫(yī)學(xué)之大成的《本草綱目》中，認(rèn)為人、羊、豬、牛等哺乳動物的胎盤可以入藥，并將胎盤以"紫河車"之名?，F(xiàn)代科學(xué)證明，胎盤中含有50多種生物活性物質(zhì)及氛基酸、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，是一種理想的免疫調(diào)節(jié)劑和營養(yǎng)美容保健劑。迄今為止，已有多種細(xì)胞生長因子從胎盤中被分離出來，如人胎盤源細(xì)胞生長因子(HPGF)、血小板源內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(PD—ECGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G—CSF)等。
目前，我國已經(jīng)有企業(yè)成功研制人胎素活細(xì)胞膠囊、人胎素美之容膠囊、人胎素美之體膠囊、人胎素香之體膠囊、人胎素強之體膠囊、人胎素口服液、人胎素嫩白修復(fù)液、人胎素嫩白修復(fù)霜、人胎素注射液、人胎素脂多糖注射液(人胎素脂多糖針劑、胎盤脂多糖針劑、胎盤脂多糖注射液)等新一代人胎素系列產(chǎn)品?？梢灶A(yù)見，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，更多更好的胎盤制品會不斷涌現(xiàn)。
但由于人胎盤數(shù)量少價植高，使胎盤系列產(chǎn)品的開發(fā)及應(yīng)用受到很大限制。動物胎盤中同樣含有豐富的生物活性物質(zhì)，從動物的胎盤中提取功能成分，制作成本將會大大降低，從而獲得更大的效益。九十年代以來國內(nèi)外大量開發(fā)了羊胎盤系列產(chǎn)品，主要用于營養(yǎng)保健品和化妝品行業(yè)；對鹿胎盤、牛胎盤的研究
4和開發(fā)已有少量報道，而對豬胎盤的研究和開發(fā)僅有零星報道，且工藝均為單
產(chǎn)。我國每年屠宰生豬近5億頭，以此推算，每年至少有5000萬頭母豬產(chǎn)出1億個胎盤(按每頭母豬每胎產(chǎn)10頭仔豬，每年至少懷胎兩次計算)，每個豬胎盤平均約重3公斤，每年至少有30萬噸豬胎盤資源待開發(fā)利用，但目前大部分被廢棄。許多研究已證明，豬胎盤中同樣含有免疫球蛋白，白蛋白、多種活性酶、細(xì)胞生長因子、多肽、核苷酸、脂多糖及多種維生素和微量元素等功效成份，總蛋白質(zhì)含量在80%以上。但截至目前，關(guān)于豬胎盤的系列產(chǎn)品的應(yīng)用開發(fā)尚未見到有較詳細(xì)的研究報道，所以研究開發(fā)數(shù)量多、來源廣、價格低的豬胎盤綜合利用工藝具有重要意義。
據(jù)有關(guān)研究證明以及市場調(diào)查顯示，本工藝提取的免疫球蛋白(lg)、免疫活性肽、超氣化物歧化酶(SOD)、脂多糖等活性成分具有以下功能和市場開發(fā)價值
1. 免疫球蛋白(IG):
免疫球蛋白是直接參與免疫反應(yīng)的抗體蛋白的總稱。豬胎盤和胎盤血含有大量免疫球蛋白，是體液免疫的主要物質(zhì)，它能凝集細(xì)菌、中和細(xì)菌毒素，并能在體內(nèi)其他因素的參與下徹底殺死細(xì)菌和病毒，增強機體的免疫功能，預(yù)防消化道等疾病，促進營養(yǎng)吸收。
據(jù)有關(guān)資料報導(dǎo)，免疫球蛋白可對抗人體24種常見致病菌和病毒?？勺鳛閶胗變菏称诽砑觿?，促進嬰幼兒營養(yǎng)吸收、增強免疫力。同時，免疫球蛋白也可以作為幼畜飼料添加劑，特別是集約化養(yǎng)殖基地，將免疫球蛋白應(yīng)用于早期斷奶幼畜，可減少幼畜疾病，促進生長發(fā)育，目前在動物詞料添加劑市場供不應(yīng)求。
2. SOD (超氣化物歧化酶)
SOD是英文"Superoxide Dismutase"的縮寫，中文名叫"超氣化物歧化酶"。它是一種生物酶，主要應(yīng)用范疇有(1)作為藥用酶，治療多種疾病
研究表明，SOD具有及時清除體內(nèi)超氣陰離子自由基的作用，它使機體保持正常的生理狀態(tài)。但是隨著年齡的增長或處于疾病狀態(tài)時，體內(nèi)產(chǎn)生的自由基會越來越多，而SOD含量卻越來越少，因此及時向體內(nèi)補充SOD是保證人體健康和促進疾病痊愈的必要途徑。
(2) 作為日化工業(yè)產(chǎn)品添加劑
目前國內(nèi)外已將SOD應(yīng)用于化妝品，經(jīng)使用驗證，S0D不僅有抗皺、祛班、色素等作用，還有抗炎、防曬、延緩衰老等作用
(3) 作為食品添加劑，其功能主要有兩個作用， 一是作為抗氧劑，與其它類型抗氧劑一樣，SOD可作為罐頭食品、啤酒、果汁等產(chǎn)品的天然抗氧劑，防止食品變質(zhì)及腐敗，還可作為水果、蔬菜的良好保鮮劑。二是作為食品營養(yǎng)強化劑，S0D的抗病、抗衰老特性可大大提高食品的利用度。目前，國內(nèi)外已將SOD廣泛應(yīng)用于牛奶、咖啡、啤酒、口香糖、果汁、飲料、糖果等產(chǎn)品。
3. 免疫活性版
從胎盤組織、胎盤血和母豬產(chǎn)血中提取的免疫活性肽，是一種核酸肽類，具有傳遞免疫信息、激發(fā)免疫細(xì)胞活性、調(diào)節(jié)免疫功能、增強機體非特異性細(xì)胞免疫等作用，且分子量小、無毒、無抗原性、不引起過敏反應(yīng)、無種屬差異等優(yōu)點。因而，作為一種新型而又安全的免疫制劑廣泛應(yīng)用于人類和動物疾病防治。是一種很有開發(fā)和應(yīng)用前景的生物產(chǎn)品。
4、 脂多糖
脂多糖能增強非特異性免疫防衛(wèi)系統(tǒng)的體液因素使補體的含量增高，也可誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生，使溶菌酶和吞噬細(xì)胞活性增強，提高嗜中性白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的殺菌作用。脂多糖本身就是一種抗原，也影響機體的特異性免疫反應(yīng)，可促進抗體的產(chǎn)生。臨床上對于病毒和細(xì)菌引起的許多疾病有很好的預(yù)防和治療作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是基于上述狀況而專門研究開發(fā)的一種從豬胎盤中提取多種生物活性物質(zhì)的聯(lián)產(chǎn)工藝，該工藝以豬胎盤為原料，應(yīng)用現(xiàn)代生物過程集成化技術(shù)，在同一生產(chǎn)工藝流程中，生產(chǎn)出豬胎盤中具有市場開發(fā)價值的功效成份免疫球蛋白(lg)、免疫活性肽、超氣化物歧化酶(S0D)、脂多糖、胎盤蛋白5種產(chǎn)品。
本發(fā)明的豬胎盤系列產(chǎn)品聯(lián)產(chǎn)工藝包括以下工藝步驟
A、 取新鮮豬胎盤及產(chǎn)仔豬血，去除胎膜和臍帶，加等重量的濃度為1-6%的氯化鈉鹽水浸漬，粉碎，過濾，分別收集濾液(I )和濾渣(I );
B、 將濾液離心，收集上清液(I )和紅色沉淀，將紅色沉淀加等體積去離子水，攪拌，使紅血球充分溶血，然后按體積加疏酸銨至飽和度50-60%,攪拌、靜置，離心，依次加入離心液體積O. 15倍的乙醇、0.08倍的氯仿，攪拌，靜置，離心，收集離心液，水浴加熱至60-65度，保溫10-15分鐘，離心，收集離心液，經(jīng)超濾脫鹽即得SOD粗品溶液；
C、 將上清液(I )按體積加疏酸銨至飽和度50-60%,待疏酸銨完全融解后，靜置2小時，過濾或離心，收集沉淀透析脫鹽即得免疫球蛋白粗品溶液，收集濾液(II );
D、 將濾液(II )通過截留分子量10000的超濾裝置系統(tǒng)，分別收集截留液和透析液；
G、 將D步驟中的透析液進一步超濾、純化處理即得豬胎盤免疫活性肽，D步驟中的截留液為胎盤蛋白液，經(jīng)加熱變性脫鹽處理即得胎盤蛋白粉；
H、 將A步驟中的濾渣(I )加2-3倍的去離子水，調(diào)PH值8. 0-8.5，按每公斤濾渣(I )加胰蛋白酶2克于反應(yīng)液中，水浴加熱至40-50度，保溫，酶消化48小時，過濾或離心，收集濾液加入三氯醋酸沉淀雜蛋白，攬拌均勻，立即離心，分別收集上清液和沉淀物，將上清液用2倍體積的95%乙醇進行沉淀、透析、純化即得脂多糖溶液，收集沉淀物加等重量水，加熱煮沸使蛋白變性，多次水洗除去三氯醋酸，烘干即得胎盤蛋白粉。
在本發(fā)明中，所述新鮮豬胎盤為產(chǎn)后24-48小時內(nèi)的豬胎盤和母豬產(chǎn)血。A步驟中所述過濾過程使用的濾網(wǎng)目數(shù)為20-60。
由上述工藝制備的免疫球蛋白、免疫活性肽、SOD等粗品均可根椐市場需求通過超濾、層析、冷凍干燥進一步純化成精品。整個工藝中所用有機溶劑廢液均可蒸餾回收。
在本發(fā)明中，所述離心時掌握的時間為10-20分鐘，轉(zhuǎn)速每分3000-4000
7轉(zhuǎn)。
本發(fā)明所依據(jù)的技術(shù)原理和創(chuàng)新點
1、 豬胎盤(含產(chǎn)仔豬血)中富含免疫球蛋白、S0D、多肽、脂多糖等活性成份，依據(jù)它們具有不同的結(jié)構(gòu)、分子量、等電點、理化特性、生物活性等，應(yīng)用鹽溶、鹽析、層析、超濾、等現(xiàn)代生化技術(shù)和生物集成技術(shù)，制定出適合工業(yè)化生產(chǎn)的聯(lián)產(chǎn)工藝。該聯(lián)產(chǎn)工藝未見同類專利報導(dǎo)。
2、 該工藝采用傳統(tǒng)工藝與現(xiàn)代工藝相結(jié)合，通過聯(lián)產(chǎn)生產(chǎn)出五種產(chǎn)品，不僅使胎盤資源得到充分利用，而且可以大大降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益。
3、 本發(fā)明工藝對提取5種產(chǎn)品后的廢液和廢渣，采取加熱變性、脫鹽、干燥處理制成優(yōu)質(zhì)的動物蛋白，可以說變廢為寶，有效解決了廢料的排放問題。做到了綠色環(huán)保。
4、 本發(fā)明工藝對豬胎盤原料處理采取常溫下用濃鹽水浸漬、粉碎的方法，可防止在采集和運輸過程中原料腐敗和有效成分失活等問題。與目前許多專利報導(dǎo)的低溫細(xì)胞破壁技術(shù)處理法相比，使原料收集更方便，成本更低，可操作性更強。。
5、 主要活性成分在提取、純化過程中，本發(fā)明工藝采用分級鹽析與層析相結(jié)合，超濾與透析相結(jié)合，簡易設(shè)備與現(xiàn)代設(shè)備相結(jié)合，把細(xì)胞分離技術(shù)、沉淀技術(shù)、膜分離技術(shù)、凝膠過濾層析等技術(shù)進行科學(xué)合理的系統(tǒng)組合，形成一套獨特的生產(chǎn)工藝流程。與目前許多專利報導(dǎo)的低溫超聲波高壓蛋白裂解法、膜分離法、超臨界二氣化碳提取法等相比，具有成本低，投料量大，更適合工業(yè)化、規(guī)模生產(chǎn)的特點。


附圖為本發(fā)明的工藝流程圖。
具體實施例方式
本發(fā)明以下結(jié)合附圖將具體操作步驟做進 一 步描述
1、收集母豬產(chǎn)后24小時內(nèi)的新鮮胎盤(含產(chǎn)仔豬血)，稱重。剪開胎膜和臍帶，加等重量體積的2%的氯化鈉水浸漬約1小時，用絞肉機粉碎，再浸漬約1小時以上，粗濾(20目)，分別收集濾液(I )和濾渣(I )。
2、 將濾液離心(3000轉(zhuǎn)/分)20分鐘，收集上清液(I )和紅色沉淀。將紅色沉淀加等體積去離子水，攪拌30分，使紅血球充分溶血，然后按體積加石危酸銨至飽和度50%，攪拌30分，靜置2小時，離心。量取離心上清液的體積，依次加入O. 15倍體積的乙醇，0.08倍體積的氯仿，邊加邊攪拌，加完后再攪拌30分鐘，靜置2h，離心，收集離心液，水浴加熱至60度，保溫10分鐘左右，離心，收集離心液，經(jīng)超濾脫鹽即得SOD粗品溶液；并測其活性。收集所有離心沉淀加熱變性，水洗脫鹽烘干即為動物蛋白粉。
3、 將上清液(I )按體積加疏酸銨至50%飽和度，待疏酸銨完全溶解后，，靜置2小時以上，過濾(300-400目)，分別收集沉淀和濾液(II)。沉淀裝透析袋用水透析脫鹽即得免疫球蛋白粗品溶液。
4、 將濾液(II )通過截留分子量1萬的超濾裝置系統(tǒng)進行超濾脫鹽、濃縮，分別收集截留液和透析液。透析液即為豬胎盤活性肽粗品。
5、 將截留液經(jīng)加熱變性、脫鹽、真空干燥處理即得胎盤蛋白粉。
6、 將濾法(I )加2倍的去離子水，用氫氣化鈉調(diào)PH值8.0，按每公斤濾渣(I )加胰蛋白酶2克(1: 200的消化力)于反應(yīng)液中，水浴加熱至40度，保溫、消化48小時，離心。收集離心液加入三氯醋酸，攪拌均勻，立即離心，分別收集上清液和沉淀物。將上清液用2倍體積的95%乙醇進行沉淀處理，透析純化即得脂多糖溶液。收集沉淀物加等重量水，加熱使蛋白變性，多次水洗除去三氯醋酸，烘干即得胎盤蛋白粉。
7、 精制純化由上述工藝制備的免疫球蛋白、免疫活性肽、SOD等粗品均可根椐市場需求通過超濾濃縮、親和層析和分子篩層析純化、冷凍干燥進一步制成精品。整個工藝中所用有機溶劑廢液均可蒸餾回收再利用。
9
權(quán)利要求
1、一種從豬胎盤中提取多種生物活性物質(zhì)的聯(lián)產(chǎn)工藝，其特征在于包括以下工藝步驟A、取新鮮豬胎盤及產(chǎn)仔豬血，去除胎膜和臍帶，加等重量的濃度為1-6％的氯化鈉鹽水浸漬，粉碎，過濾，分別收集濾液(I)和濾渣(I)；B、將濾液離心，收集上清液(I)和紅色沉淀，將紅色沉淀加等體積去離子水，攪拌，使紅血球充分溶血，然后按體積加硫酸銨至飽和度50-60％，攪拌、靜置，離心，依次加入離心液體積0.15倍的乙醇、0.08倍的氯仿，攪拌，靜置，離心，收集離心液，水浴加熱至60-65度，保溫10-15分鐘，離心，收集離心液，經(jīng)超濾脫鹽即得SOD粗品溶液；C、將上清液(I)按體積加硫酸銨至飽和度50-60％，待硫酸銨完全融解后，靜置2小時，過濾或離心，收集沉淀透析脫鹽即得免疫球蛋白粗品溶液，收集濾液(II)；D、將濾液(II)通過截留分子量10000的超濾裝置系統(tǒng)，分別收集截留液和透析液；E、將D步驟中的透析液進一步超濾、純化處理即得豬胎盤免疫活性肽，D步驟中的截留液為胎盤蛋白液，經(jīng)加熱變性脫鹽處理即得胎盤蛋白粉；F、將A步驟中的濾渣(I)加2-3倍的去離子水，調(diào)PH值8.0-8.5，按每公斤濾渣(I)加胰蛋白酶2克于反應(yīng)液中，水浴加熱至40-50度，保溫，酶消化48小時，過濾或離心，收集濾液加入三氯醋酸沉淀雜蛋白，攪拌均勻，立即離心，分別收集上清液和沉淀物，將上清液用2倍體積的95％乙醇進行沉淀、透析、純化即得脂多糖溶液，收集沉淀物加等重量水，加熱煮沸使蛋白變性，多次水洗除去三氯醋酸，烘干即得胎盤蛋白粉。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)產(chǎn)工藝，其特征在于所述新鮮豬胎盤及產(chǎn)仔豬血為產(chǎn)后24-48小時內(nèi)的豬胎盤和母豬產(chǎn)血。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)產(chǎn)工藝，其特征在于A步驟中的過濾過程使用的濾網(wǎng)目數(shù)為20-60。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)產(chǎn)工藝，其特征在于免疫球蛋白、免疫活性肽、SOD等粗品均可通過超濾、層析、冷凍干燥進一步純化成精品。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)產(chǎn)工藝，其特征在于所述離心時間為10-20分鐘，轉(zhuǎn)速每分3000-4000轉(zhuǎn)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)產(chǎn)工藝，其特征在于整個工藝中所用有機溶劑廢液均可蒸餾回收。
全文摘要
一種從豬胎盤中提取多種生物活性物質(zhì)的聯(lián)產(chǎn)工藝，是以豬胎盤(含產(chǎn)仔血)為原料，利用其中所富含的免疫球蛋白(Ig)、免疫活性肽、超氧化物歧化酶(SOD)、脂多糖、胎盤蛋白等成份，依據(jù)它們具有不同的結(jié)構(gòu)、分子量、等電點、理化特性、生物活性等，應(yīng)用鹽溶、鹽析、層析、超濾等現(xiàn)代生化技術(shù)和生物集成技術(shù)，制定出適合工業(yè)化生產(chǎn)的聯(lián)產(chǎn)工藝，使得在同一生產(chǎn)工藝流程中，可生產(chǎn)出豬胎盤中具有市場開發(fā)價值的功效成份免疫球蛋白、免疫活性肽、超氧化物歧化酶、脂多糖、胎盤蛋白5種產(chǎn)品。該工藝采用傳統(tǒng)與現(xiàn)代工藝相結(jié)合，通過聯(lián)產(chǎn)生產(chǎn)出多種產(chǎn)品，不僅使胎盤資源得到充分利用，變廢為寶，且無廢液排放，綠色環(huán)保，還可大大降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益。
文檔編號C07K1/14GK101544965SQ200910064789
公開日2009年9月30日 申請日期2009年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月6日
發(fā)明者功 常, 張俊英, 王景仙 申請人:鄭州諾必隆生物科技有限公司