專利名稱：靶配體的篩選方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2003年3月21日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序號(hào)60/456,816的優(yōu)先權(quán)，和2003年3月21日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序號(hào)60/456,901的優(yōu)先權(quán)，所述每件申請(qǐng)記載的內(nèi)容通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。
背景隨著人類基因組的闡明使得發(fā)現(xiàn)治療多種疾病的小分子藥物的努力發(fā)生了徹底變革?；蚪M學(xué)和生物學(xué)篩選兩方面的高通量技術(shù)與組合化學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)一起使得大量篩選新藥更加容易。
科學(xué)家在尋找單一有效的藥物時(shí)，必須篩分大量的潛在候選藥物。當(dāng)組合化學(xué)和平行合成提供了大量的化合物作為潛在的篩選庫(kù)的同時(shí)，現(xiàn)行篩選方法成為發(fā)現(xiàn)新機(jī)制的先導(dǎo)藥物的瓶頸。目前最流行的篩選方法是基于功能的并且需要提供生物化學(xué)的信息或報(bào)道分子的信息。就酶而言，報(bào)道分子可以是底物的消耗或產(chǎn)物的生成，而對(duì)于最佳性能，則需要目標(biāo)酶的最大活化型來(lái)構(gòu)成基于功能的測(cè)定?；诠δ艿暮Y選方法偏向只鑒定出那些直接干擾活化型酶的活性的化合物。因此，失活型如未活化型或基礎(chǔ)型以及酶原型的酶都將不適宜采用基于功能的篩選。然而，與失活型相結(jié)合并阻止其活化的化合物可能是很新和很有用的先導(dǎo)藥物，而采用許多現(xiàn)有的篩選方法可能被忽略。此外，如果酶的活性需要輔因子，那么基于功能的篩選方法就難以發(fā)現(xiàn)那些可以與只在酶為輔因子-游離型時(shí)方存在的變構(gòu)部位相結(jié)合的化合物。
如果配體受體的加工包括單體蛋白的多聚化，那么傳統(tǒng)篩選方法的另一種情況是可能忽略潛在的候選藥物。基于功能的篩選方法不能檢測(cè)與單體結(jié)合的化合物；而與單體結(jié)合并阻止其多聚化的化合物可能是非常有用的先導(dǎo)藥物。例如當(dāng)受體蛋白為G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)和核-激素受體(NHR)時(shí)，基于功能的篩選拮抗劑至少需要一種已知的激動(dòng)劑作為受體。因此，基于功能的篩選孤兒(或無(wú)配體的)受體時(shí)，只能發(fā)現(xiàn)刺激受體活性的化合物。即使如此，已與受體結(jié)合但不干擾配體與受體結(jié)合的化合物，通過(guò)與在受體功能中起作用的其它生物分子相互作用，仍然可能影響受體的功能。顯然，孤兒受體不可能構(gòu)成基于功能的篩選。同樣，功能不明的蛋白質(zhì)也不能成為基于功能的篩選的靶標(biāo)。通過(guò)基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了許多新的功能不明的蛋白質(zhì)。因此，為了發(fā)現(xiàn)與靶標(biāo)所有型相結(jié)合的化合物就需要與功能無(wú)關(guān)的篩選方法，本文所報(bào)道的基于親和力的篩選方法可能即是與功能無(wú)關(guān)的。
概述本發(fā)明在某種程度上涉及用一種新方式篩選靶(例如生物分子)的通用系統(tǒng)，所述系統(tǒng)用以發(fā)現(xiàn)能與天然存在的低活性或無(wú)活性狀態(tài)靶結(jié)合的化合物并且可作為靶功能抑制劑的化合物，如同在后續(xù)生物學(xué)測(cè)定中所見(jiàn)到的一樣。該系統(tǒng)可適用于所有類型的生物學(xué)靶，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)(例如膜結(jié)合蛋白、酶、核激素受體和G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR))。另外，該系統(tǒng)不需要生物化學(xué)測(cè)定其輸出值而僅用很少量的純化蛋白質(zhì)或其它生物分子受體，典型的是每次實(shí)驗(yàn)少于1μg。而且該系統(tǒng)的實(shí)施，無(wú)需受體結(jié)構(gòu)的知識(shí)。此外，本文描述的方法的所需輸出值可以用化合物的混合物就可達(dá)到。同樣，可以將多種形式的給定靶一起多路傳輸以提高該方法的效率。
一方面，本發(fā)明提供一種親和篩選方法，該方法針對(duì)未活化型或失活型靶部分篩選化合物的混合物(例如具有2-25,000、約5-10,000、約5-5,000、約5-1,000、約20-500或約100-300個(gè)化合物的混合物)。當(dāng)未活化型或失活型靶部分在反應(yīng)中占優(yōu)勢(shì)時(shí)進(jìn)行所述篩選。另一方面，在缺乏或沒(méi)有任何一種或多種可以激活靶的組分時(shí)進(jìn)行所述篩選，例如缺乏底物(例如ATP、GTP)、輔因子、金屬離子時(shí)。另一方面，對(duì)靶進(jìn)行修飾或突變以使它不能被激活(例如，發(fā)生突變的蛋白酶不能切割它自身)。另一方面，靶混合物缺乏任何高活性或生理活性靶。綜合所有的這些方面，所述方法包括下述步驟提供化合物的混合物；將所述混合物與未活化型靶部分一起孵育以形成化合物靶復(fù)合物。
使化合物靶復(fù)合物與未結(jié)合的化合物和靶分離；使化合物靶復(fù)合物解離；用質(zhì)譜儀鑒定曾經(jīng)與所述靶結(jié)合但現(xiàn)在已解離的化合物，其中經(jīng)鑒定的化合物能與所述靶部分結(jié)合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)鑒定的化合物可以與靶部分結(jié)合，其親和力Kd介于1pM(皮摩爾)和50μM(微摩爾)之間?？蓪⑺龌衔锏幕旌衔镞M(jìn)行質(zhì)量-編碼以確保用質(zhì)譜法可以檢測(cè)至少90％具有獨(dú)特離子質(zhì)量的化合物。所述靶可以是任何生物分子，例如核酸(例如DNA或RNA)或酶(例如激酶、合酶、磷酸酶、甲基化酶)。
另一方面，本發(fā)明提供一種親和篩選方法，該方法針對(duì)不同型靶部分的混合物篩選化合物的混合物(例如具有2-25,000、約5-10,000、約5-5,000、約5-1,000、約20-500或約100-300個(gè)化合物的混合物)。另一方面，未活化型或失活型在靶混合物中占優(yōu)勢(shì)。另一方面，在反應(yīng)中沒(méi)有或缺乏任何激活組分，例如缺乏底物(例如ATP、GTP)、輔因子、金屬離子。綜合這些方面，所述方法包括下述步驟提供化合物的混合物；提供活化型靶部分(例如配體-結(jié)合型)和未活化型或失活型靶部分(例如配體-游離型)的混合物；將所述化合物的混合物和所述靶部分的混合物一起孵育以形成化合物靶復(fù)合物；使化合物靶復(fù)合物與未結(jié)合的化合物和靶部分分離；使化合物靶復(fù)合物解離；用質(zhì)譜儀鑒定曾經(jīng)與靶結(jié)合但現(xiàn)在已分解離的化合物，其中經(jīng)鑒定的化合物能與靶部分結(jié)合，其親和力Kd介于1pM和50μM之間。
從化合物靶復(fù)合物中存在的化合物鑒定出結(jié)合任何型靶部分的新配體，即將化合物靶復(fù)合物通過(guò)質(zhì)譜儀以鑒定結(jié)合任何型靶部分的配體，其中經(jīng)鑒定的配體能與靶部分結(jié)合，其親和力Kd介于1pM和50μM之間；和所述方法可以任選包括將所鑒定的新配體與配體-結(jié)合型靶部分和配體-游離型靶部分一起孵育的步驟，其中重復(fù)形成化合物靶復(fù)合物和鑒定作為配體的化合物的步驟以描繪出哪些化合物與配體-結(jié)合型靶部分結(jié)合，哪些化合物與配體-游離型靶部分結(jié)合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將所述化合物的混合物進(jìn)行質(zhì)量-編碼以確保至少90％的化合物具有獨(dú)特的可用質(zhì)譜法檢測(cè)的離子質(zhì)量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述靶型的混合物包括未活化型(例如未磷酸化型、磷酸化型、無(wú)配體型、負(fù)調(diào)節(jié)物結(jié)合型)、失活型(例如突變型和截短型)和活化型(例如磷酸化型、未磷酸化型、激動(dòng)劑結(jié)合型、組成活化型)的生物分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述靶型的混合物包括單體型和多聚體型。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述靶型的混合物包括配體-結(jié)合型和配體-游離型。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述靶型的混合物包括輔因子-結(jié)合型和輔因子-游離型。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物的混合物是經(jīng)質(zhì)量-編碼的而靶型的混合物包括未活化型、失活型、活化型、多聚體型、單體型、配體-結(jié)合型、配體-游離型、輔因子-結(jié)合型和/或輔因子-游離型?；衔锏幕旌衔镆M(jìn)行質(zhì)量-編碼，這種方法可確保至少90％的化合物具有獨(dú)特的可用質(zhì)譜法檢測(cè)的離子質(zhì)量。
本發(fā)明也提供一種發(fā)現(xiàn)激酶配體的方法。這些配體對(duì)于目標(biāo)激酶具有選擇性并且可以用來(lái)抑制所述激酶。通過(guò)篩選激酶(即靶)的基礎(chǔ)型或未活化型(例如未磷酸化型、非二聚型或磷酸化型)，能夠鑒定出選擇性激酶抑制劑。在這些條件下所篩選的激酶優(yōu)先靶向DFG為DFG-向外位置時(shí)所形成的變構(gòu)部位。在所述變構(gòu)部位占優(yōu)勢(shì)的條件下，采用親和方法進(jìn)行篩選。例如，當(dāng)激酶沒(méi)有催化活性(例如激酶是未活化型、基礎(chǔ)低活性狀態(tài)或失活型)時(shí)，所述變構(gòu)部位可以占優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)抑制劑的直接檢測(cè)和結(jié)構(gòu)排布還具有能大量篩選化合物的混合物。當(dāng)激酶為DFG-向外構(gòu)象時(shí)，根據(jù)所形成的變構(gòu)部位建模，本發(fā)明也能夠合理設(shè)計(jì)支架、化合物和文庫(kù)。由本發(fā)明所獲得的抑制劑優(yōu)先靶向所述變構(gòu)部位而且明顯地改進(jìn)了選擇性。
一方面，本發(fā)明提供一種從文庫(kù)或化合物的混合物(例如質(zhì)量-編碼文庫(kù))中鑒定或發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)激酶抑制劑的方法。該方法通常包括使文庫(kù)成員或化合物的混合物與試驗(yàn)激酶(例如未活化型激酶)接觸或孵育。然后將結(jié)合化合物與未結(jié)合化合物分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，任選將結(jié)合化合物與未結(jié)合化合物分離。然后可以對(duì)結(jié)合化合物(即潛在的抑制劑)進(jìn)行鑒定(例如用質(zhì)譜法)。該方法還可以包括測(cè)定潛在的結(jié)合劑是抑制還是降低試驗(yàn)激酶的活性(例如使用常規(guī)測(cè)定，例如生物化學(xué)測(cè)定或基于細(xì)胞的測(cè)定)，該方法包括下述步驟在條件和時(shí)間都充分容許抑制劑與試驗(yàn)激酶結(jié)合的情況下，使抑制劑與試驗(yàn)酶接觸；然后確定試驗(yàn)激酶是否因抑制劑而變得無(wú)功能或者功能減弱。在一個(gè)實(shí)施方案中，在缺乏ATP和/或肽底物時(shí)孵育或接觸化合物的混合物(例如質(zhì)量-編碼文庫(kù))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在有ATP和/或肽底物時(shí)孵育或接觸化合物的混合物(例如質(zhì)量-編碼文庫(kù))。在一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)激酶是全長(zhǎng)激酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)激酶包括全長(zhǎng)激酶的截短片段，其含有催化結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)激酶是激酶變異體或激酶突變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)激酶是未活化的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)激酶是活化的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)激酶相對(duì)于其生理激活狀態(tài)是部分活化的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)激酶為基礎(chǔ)型，表現(xiàn)出低催化活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可用質(zhì)譜法鑒定能結(jié)合試驗(yàn)激酶的化合物，這可以通過(guò)比較質(zhì)量-編碼化合物的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)進(jìn)行。
本發(fā)明提供一種通過(guò)確定DFG基序?yàn)镈FG-向外構(gòu)象中的位置來(lái)鑒定激酶抑制劑的方法，致使如果DFG基序?yàn)镈FG-向外構(gòu)象，那么所形成的凹口袋作為抑制劑結(jié)合部位。一方面，本發(fā)明提供一種設(shè)計(jì)抑制劑的方法。該方法包括下述步驟a)比較未活化型試驗(yàn)激酶和已知其三維結(jié)構(gòu)的參照激酶(例如蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)識(shí)符1kv1鏈a、1kv2鏈a、1iep鏈a、1iep鏈b、1fpu鏈a、1fpu鏈b和1irk；在URL網(wǎng)址，rcsb.org/pdb/中可以找到該蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù))；b)鑒定變構(gòu)結(jié)合部位(例如相對(duì)于DFG基序和螺旋α-C定位的變構(gòu)結(jié)合部位)；c)根據(jù)變構(gòu)結(jié)合部位設(shè)計(jì)抑制劑。設(shè)計(jì)該抑制劑可以包括根據(jù)變構(gòu)結(jié)合部位的拓?fù)湫再|(zhì)和電子性能設(shè)計(jì)支架，然后根據(jù)支架設(shè)計(jì)質(zhì)量-編碼文庫(kù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟c)包括提供質(zhì)量-編碼文庫(kù)或化合物的混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法還包括篩選(例如使用試驗(yàn)激酶進(jìn)行親和篩選)質(zhì)量-編碼文庫(kù)中與試驗(yàn)激酶結(jié)合的化合物，然后在有或沒(méi)有抑制劑時(shí)進(jìn)行激酶測(cè)定以確定激酶結(jié)合劑是否抑制激酶，從而設(shè)計(jì)或發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)激酶的抑制劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，已知其三維結(jié)構(gòu)的參照激酶是具有以下蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)識(shí)符的激酶1g3n鏈a、1g3n鏈b、1kv1鏈a、1kv2、鏈a、1iep鏈a、1iep鏈b、1fpu鏈a和1fpu鏈b或1irk。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)激酶是具有以下蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)識(shí)符激酶1g3n鏈a、1g3n鏈b、1kv1鏈a、1kv2、鏈a、1iep鏈a、1iep鏈b、1fpu鏈a和1fpu鏈b或1irk。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)DFG基序的定位和測(cè)定DFG基序?yàn)镈FG-向外位置來(lái)鑒定變構(gòu)結(jié)合部位。相對(duì)于DFG-向外構(gòu)象的DFG基序以及相對(duì)于螺旋α-C可以確定變構(gòu)部位的位置。在另一個(gè)實(shí)施方案中，DFG-向外位置中的DFG基序與α螺旋C之間的距離大于11而小于20。在另一個(gè)實(shí)施方案中，α螺旋C與含有Val1050-Met1051的胰島素受體激酶α螺旋C在相對(duì)的三維位置中是相似的。α螺旋C在相對(duì)的三維位置中與含有Val289-Met290的c-ab1α螺旋C可以是同源的。DFG基序可能有序列DWG或DLG。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)激酶是c-ab1、p38MAPK或胰島素受體酪氨酸激酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述變構(gòu)結(jié)合部位在空間上不同于與ATP結(jié)合部位和活化環(huán)。
另一方面，本發(fā)明提供一種從化合物的混合物(例如文庫(kù)，例如質(zhì)量-編碼文庫(kù))中鑒定試驗(yàn)激酶的抑制劑的方法，所述抑制劑根據(jù)激酶(例如未活化型激酶)的DFG為DFG-向外構(gòu)象時(shí)所形成的變構(gòu)結(jié)合部位(例如凹口袋)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和靜電性能進(jìn)行設(shè)計(jì)。該方法通常包括制備具有通式A(B)n的質(zhì)量-編碼的化合物組，其中A為支架，每個(gè)B獨(dú)立地為外周部分，n為大于1、典型的是2至約6的整數(shù)。該方法包括從外周部分前體組選擇外周部分前體亞組，這基于DFG為DFG-向外構(gòu)象時(shí)所形成的激酶(例如未活化型激酶)變構(gòu)部位的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和靜電性能。所述亞組包括足夠數(shù)量的外周部分前體，即在亞組中至少有約50、100、250或500種源于外周部分前體的n外周部分的不同組合。選擇外周部分前體的亞組，使得源自外周部分前體亞組的n外周部分所有可能的全部組合的至少90％所具有的分子質(zhì)量總和不同于n外周部分所有的其它組合的分子質(zhì)量總和。該方法還包括使外周部分前體亞組與具有n個(gè)活性基團(tuán)的支架前體接觸，其中的每個(gè)基團(tuán)至少能與一個(gè)外周部分前體反應(yīng)形成共價(jià)鍵。在每個(gè)活性基團(tuán)與外周部分前體充分反應(yīng)的條件下，使外周部分前體亞組與支架前體接觸，生成了通式A(B)n化合物的質(zhì)量-編碼組。
準(zhǔn)確地說(shuō)，通式A(B)n化合物的質(zhì)量-編碼組的制備方法包括下述步驟(a)從外周部分前體組中選擇每組有兩個(gè)不同的外周部分前體，其中選擇的方式是兩個(gè)為一組，如果兩個(gè)外周部分前體具有相等的分子質(zhì)量，那么就去掉一個(gè)，形成保留組；(b)從保留組中，選擇每組有四個(gè)外周部分前體，包括已知的四個(gè)的組，如果所確定的有四個(gè)外周部分前體的組中前兩個(gè)前體的分子質(zhì)量總和與所確定的有四個(gè)外周部分前體的組中后兩個(gè)前體的分子質(zhì)量總和相等，那么就去掉四個(gè)外周部分前體中的一個(gè)，所述選擇后形成保留組。(c)從保留組中，選擇每組中有六個(gè)不同外周部分前體，包括已知的六個(gè)的組，如果所確定的六個(gè)的組中前三個(gè)前體的分子質(zhì)量總和與所確定的六個(gè)的組中后三個(gè)前體的分子質(zhì)量總和相等，那么就去掉六個(gè)外周部分前體中的一個(gè)，所述選擇后形成外周部分前體的工作選擇組；(d)從外周部分前體的工作選擇組中選擇外周部分前體亞組，因此所述亞組就包括足夠數(shù)量的外周部分前體，即至少有約250種源于所述亞組的n外周部分的不同組合，其中源于所述亞組的n外周部分的至少約90％的組合具有的分子質(zhì)量總和，與源于所述亞組的n外周部分的所有的其它組合的分子質(zhì)量總和不同。e)將所述外周部分前體亞組與支架前體接觸，所述支架前體有n活性基團(tuán)，其中每個(gè)活性基團(tuán)能夠和至少一個(gè)外周部分前體反應(yīng)形成共價(jià)鍵，在每個(gè)活性基團(tuán)與外周部分前體充分反應(yīng)的條件下，由此產(chǎn)生通式A(B)n化合物的質(zhì)量-編碼組。
另一方面，可以通過(guò)篩選產(chǎn)生于各不相同的試驗(yàn)激酶抑制劑組中的質(zhì)量-編碼文庫(kù)(例如現(xiàn)有的質(zhì)量-編碼文庫(kù))鑒定試驗(yàn)激酶抑制劑，即通過(guò)用逆向合成確定含于各不相同的化合物的組內(nèi)的支架和構(gòu)件并如上述使用算法(Corey and Cheng，1995，The Logic of ChemicalSynthesis，John Wiley & Sons，Inc.)。
另一方面，可以通過(guò)篩選化合物文庫(kù)鑒定試驗(yàn)激酶抑制劑?？梢杂?jì)算文庫(kù)中每個(gè)成員的分子量以及以質(zhì)量-編碼格式所組合的文庫(kù)成員，即可以制備化合物的文庫(kù)，致使每個(gè)成員(或幾乎全部成員，例如至少90％的成員，或至少在90-100％之間的整數(shù)百分比，90％和100％也包括在內(nèi))相對(duì)于文庫(kù)的其它成員都具有與單一質(zhì)量。該方法通常包括使質(zhì)量-編碼文庫(kù)的成員與試驗(yàn)激酶(例如未激活狀態(tài)的激酶)接觸。然后使結(jié)合化合物與未結(jié)合化合物分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，任選使結(jié)合化合物與未結(jié)合化合物分離。然后可以鑒定(例如用質(zhì)譜法)結(jié)合的化合物(即潛在的抑制劑)。該方法還可包括確定潛在的結(jié)合劑是否抑制(例如使其無(wú)功能或功能減弱)試驗(yàn)激酶(例如使用常規(guī)測(cè)定，例如生化測(cè)定或基于細(xì)胞的測(cè)定)，其中包括在條件和時(shí)間足以容許抑制劑與試驗(yàn)激酶結(jié)合的情況下，使抑制劑與試驗(yàn)激酶接觸的步驟。
另一方面，本發(fā)明提供一種設(shè)計(jì)試驗(yàn)激酶的抑制劑的方法，該方法包括下述步驟a)使用試驗(yàn)激酶的三維結(jié)構(gòu)確定DFG基序的位置；b)鑒定在DFG基序?yàn)镈FG-向外構(gòu)象時(shí)形成的變構(gòu)結(jié)合部位，其中變構(gòu)結(jié)合部位在空間上可區(qū)別于或不同于ATP結(jié)合部位和活化環(huán)；c)根據(jù)變構(gòu)結(jié)合部位設(shè)計(jì)抑制劑。試驗(yàn)激酶可以是已知其三維結(jié)構(gòu)的激酶，例如p38MAP激酶、c-ab1或胰島素受體激酶且其為未活化型。該方法還可包括確定潛在的結(jié)合劑是否抑制試驗(yàn)激酶，其中包括下述步驟d)在條件和時(shí)間足以容許抑制劑與激酶結(jié)合的情況下，使抑制劑與激酶接觸；e)確定激酶是否因?yàn)橐种苿┳饔枚兊脽o(wú)功能或功能減弱。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)激酶不是c-ab1、p38MAPK或胰島素受體酪氨酸激酶。
另一方面，本發(fā)明提供一種鑒定試驗(yàn)激酶的抑制劑的方法，該方法包括下述步驟a)提供試驗(yàn)化合物，該化合物能與試驗(yàn)激酶結(jié)合但物理上不與試驗(yàn)激酶上的ATP結(jié)合部位結(jié)合(例如僅部分結(jié)合或者完全不結(jié)合)，其中當(dāng)試驗(yàn)激酶的DFG基序?yàn)镈FG-向外位置時(shí)，試驗(yàn)化合物與變構(gòu)部位結(jié)合；b)確定ATP是否可以與試驗(yàn)激酶上的ATP結(jié)合部位結(jié)合，其中由于試驗(yàn)化合物與試驗(yàn)激酶的變構(gòu)部位的結(jié)合證明了試驗(yàn)化合物是作為激酶抑制劑，因此間接地干擾了ATP與試驗(yàn)激酶的結(jié)合；c)在有或沒(méi)有結(jié)合試驗(yàn)激酶的抑制劑時(shí)任選進(jìn)行激酶測(cè)定，其中如果有試驗(yàn)化合物時(shí)的激酶活性低于無(wú)試驗(yàn)化合物時(shí)的激酶活性，就進(jìn)一步證明試驗(yàn)化合物是試驗(yàn)激酶的抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)激酶不是c-ab1、p38MAPK或胰島素受體酪氨酸激酶。
另一方面，本發(fā)明提供一種鑒定試驗(yàn)激酶的抑制劑的方法，該方法包括下述步驟a)提供試驗(yàn)化合物，該化合物能與試驗(yàn)激酶結(jié)合但物理上不與試驗(yàn)激酶上的ATP結(jié)合部位結(jié)合(例如僅部分結(jié)合ATP結(jié)合部位或者不結(jié)合ATP結(jié)合部位)；b)確定ATP是否可以與試驗(yàn)激酶上的ATP結(jié)合部位結(jié)合，其中由于試驗(yàn)化合物與試驗(yàn)激酶的結(jié)合干擾了ATP與試驗(yàn)激酶的結(jié)合，就證明了激酶的抑制劑，其中試驗(yàn)化合物限定(例如鎖定或固定)試驗(yàn)激酶的DFG基序?yàn)镈FG-向外位置。在另一個(gè)實(shí)施方案中，還有一個(gè)步驟包括在有或沒(méi)有試驗(yàn)化合物時(shí)進(jìn)行激酶測(cè)定，證明試驗(yàn)化合物是激酶的抑制劑，其中有試驗(yàn)化合物時(shí)的激酶活性低于無(wú)試驗(yàn)化合物時(shí)的激酶活性從而證明了激酶抑制劑的鑒定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)激酶不是c-ab1，、p38MAPK或胰島素受體酪氨酸激酶。
另一方面，本發(fā)明提供一種鑒定在空間上可區(qū)別于或不同于ATP結(jié)合部位或活化環(huán)的變構(gòu)結(jié)合部位的方法，該方法包括a)比較試驗(yàn)激酶與已知其三維結(jié)構(gòu)的參照激酶；b)定位試驗(yàn)激酶中的DFG基序根據(jù)其在參照激酶中的位置(例如由計(jì)算覆蓋的試驗(yàn)激酶和參照激酶和/或由多重序列比對(duì)(Peitsch等，1995，ProModautomated knowledge-based protein modelling tool.PDB Quarterly Newsletter 724；Marti-Renom等，2000，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.29，291-325，2000))；c)測(cè)算α螺旋C中的α碳?xì)埢c試驗(yàn)激酶的DFG基序的苯丙氨酸、亮氨酸或色氨酸的非主鏈重原子之間的最短距離，其中大于11而小于20的距離是試驗(yàn)激酶的DFG基序?yàn)镈FG-向外構(gòu)象的特征，其中DFG基序?yàn)镈FG-向外構(gòu)象時(shí)鑒定變構(gòu)結(jié)合部位。當(dāng)DFG基序?yàn)镈FG-向外位置時(shí)，它可以誘導(dǎo)凹口袋的形成，其中凹口袋的表面部分由一連串連續(xù)氨基酸(設(shè)定為X至Y)如c-ab1中的氨基酸104-111(就c-ab1來(lái)說(shuō)，X為氨基酸104，Y為氨基酸111)形成。在一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)激酶的氨基酸X至Y與參照激酶的氨基酸X至Y可以是同源的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，氨基酸X至Y可由蛋白質(zhì)的Leu104至Ala111所組成的連續(xù)氨基酸序列組成，該蛋白質(zhì)的PDB檢索代碼通過(guò)序列比對(duì)分析定為1kv1(鏈A)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，氨基酸X至Y可由蛋白質(zhì)的Leu104至Ala111所組成連續(xù)氨基酸序列組成，該蛋白質(zhì)的PDB檢索代碼通過(guò)序列比對(duì)分析定為1kv2(鏈A)，試驗(yàn)激酶的氨基酸X至Y由蛋白質(zhì)的Leu104至Ala111所組成的連續(xù)氨基酸序列同源的氨基酸組成，該蛋白質(zhì)的PDB檢索代碼通過(guò)序列比對(duì)分析定為1kv1(鏈A)或1kv2(鏈A)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)激酶的氨基酸X至Y由連續(xù)氨基酸序列組成，該序列由與1iep(鏈A)、1iep(鏈B)、1fpu(鏈A)或1fpu(鏈B)的Ile313至Asn322同源的氨基酸組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)激酶的氨基酸X至Y由連續(xù)氨基酸序列組成，該序列由與1irk的Leu1073至1080同源的氨基酸組成。
另一方面，本發(fā)明提供一種鑒定在空間上可區(qū)別于或不同于ATP結(jié)合部位和活化環(huán)的變構(gòu)結(jié)合部位的方法，對(duì)于試驗(yàn)激酶抑制劑該方法包括下述步驟a)定位(例如通過(guò)多重序列比對(duì))試驗(yàn)激酶中的DFG基序，通過(guò)將試驗(yàn)激酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)與已知其三維結(jié)構(gòu)的激酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較；b)當(dāng)DFG基序?yàn)镈FG-向外位置時(shí)，使試驗(yàn)化合物與變構(gòu)部位結(jié)合；c)確定試驗(yàn)化合物是否抑制試驗(yàn)激酶的活性(例如通過(guò)激酶測(cè)定或與激酶結(jié)合的試驗(yàn)化合物X-射線晶體的生成和分析)；d)確定在DFG基序?yàn)镈FG-向外構(gòu)象時(shí)所形成的變構(gòu)部位上，試驗(yàn)化合物是否結(jié)合試驗(yàn)激酶(例如通過(guò)標(biāo)記試驗(yàn)化合物)，其中試驗(yàn)化合物的結(jié)合使得DFG基序被限定在DFG-向外位置上，證明了試驗(yàn)激酶的變構(gòu)結(jié)合部位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)激酶不是c-ab1、p38MAPK或胰島素受體酪氨酸激酶。
另一方面，本發(fā)明提供一種鑒定抑制劑的方法，該方法包括a)將試驗(yàn)激酶(例如表2的那些激酶)與已知其三維結(jié)構(gòu)的激酶進(jìn)行比較；b)鑒定激酶上的變構(gòu)結(jié)合部位；c)設(shè)計(jì)靶向變構(gòu)結(jié)合部位的支架；d)提供基于支架的化合物的混合物；e)通過(guò)對(duì)激酶的親和篩選鑒定變構(gòu)部位的配體。該方法還可包括步驟f)證明抑制劑的激酶抑制劑活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)激酶不是c-ab1、p38MAPK或胰島素受體酪氨酸激酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，已知其三維結(jié)構(gòu)的激酶選自具有以下蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)識(shí)符的激酶1iep鏈a、1iep鏈b、1fpu鏈a、1fpu鏈b、1kv1鏈a、1kv2鏈、1irk、1gn3n鏈a和1g3n鏈b。在另一個(gè)實(shí)施方案中，變構(gòu)結(jié)合部位在空間上可區(qū)別于ATP結(jié)合部位和活化環(huán)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)定位DFG基序(例如DFG、DLG或DWG)以及在DFG基序?yàn)镈FG向構(gòu)象時(shí)鑒定變構(gòu)結(jié)合部位。
另一方面，本發(fā)明提供一種鑒定在空間上可區(qū)別于ATP結(jié)合部位和活化環(huán)的變構(gòu)結(jié)合部位的方法，對(duì)于試驗(yàn)激酶抑制劑該方法包括a)使試驗(yàn)化合物與其DFG基序?yàn)橄蛲馕恢玫募っ附Y(jié)合；b)確定試驗(yàn)化合物是否抑制試驗(yàn)激酶的活性；c)確定已知的試驗(yàn)激酶抑制劑即已知的抑制劑是否與DFG基序?yàn)镈FG-向外位置時(shí)形成的變構(gòu)部位結(jié)合。已知的抑制劑可以和試驗(yàn)化合物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)激酶，其中對(duì)于試驗(yàn)激酶抑制劑，已知抑制劑的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合鑒定了在空間上可區(qū)別于或不同于ATP結(jié)合部位和活化環(huán)的變構(gòu)結(jié)合部位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)激酶不是c-ab1、p38MAPK或胰島素受體酪氨酸激酶。
另一方面，本發(fā)明提供一種合成激酶抑制劑的方法，該方法包括a)將試驗(yàn)激酶與已知其三維結(jié)構(gòu)的激酶進(jìn)行比較；b)鑒定變構(gòu)結(jié)合部位；c)根據(jù)變構(gòu)結(jié)合部位設(shè)計(jì)抑制劑；d)合成抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)激酶不是c-ab1、p38MAPK或胰島素受體酪氨酸激酶。
另一方面，本發(fā)明提供采用下述方法設(shè)計(jì)的抑制劑a)比較試驗(yàn)激酶與已知其三維結(jié)構(gòu)的激酶(例如蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)識(shí)符1kv1鏈a、1kv2鏈a、1iep鏈a、1iep鏈b、1fpu鏈a、1fpu鏈b和1irk)；b)鑒定變構(gòu)結(jié)合部位；c)根據(jù)變構(gòu)結(jié)合部位設(shè)計(jì)抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)激酶不是c-ab1、p38MAPK和胰島素受體酪氨酸激酶。
另一方面，本發(fā)明提供一種包含采用下述方法設(shè)計(jì)的抑制劑的藥用組合物a)比較試驗(yàn)激酶與已知其三維結(jié)構(gòu)的激酶(例如參照激酶)(例如蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)識(shí)符1kv1(鏈A)、1kv2(鏈A)、1iep(鏈A)、1iep(鏈B)、1fpu(鏈A)、1fpu(鏈B)和1irk)；b)鑒定變構(gòu)結(jié)合部位(例如由于試驗(yàn)激酶氨基酸與參照激酶(見(jiàn)表1)的氨基酸X至Y類似而鑒定的凹口袋；c)根據(jù)變構(gòu)結(jié)合部位(例如凹口袋)設(shè)計(jì)抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥用組合物可以包含采用下述方法設(shè)計(jì)的抑制劑a)利用參照激酶的三維結(jié)構(gòu)確定試驗(yàn)基酶中的DFG基序的位置；b)鑒定DFG基序?yàn)镈FG-向外構(gòu)象時(shí)形成的變構(gòu)結(jié)合部位，其中變構(gòu)結(jié)合部位在空間上可區(qū)別于與ATP結(jié)合部位和活化環(huán)；c)根據(jù)變構(gòu)結(jié)合部位設(shè)計(jì)抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)激酶不是c-ab1、p38MAPK或胰島素受體酪氨酸激酶。
另一方面，本發(fā)明提供包含采用本文所述方法設(shè)計(jì)、發(fā)現(xiàn)或鑒定的抑制劑的試劑盒。例如，所述方法包括a)比較試驗(yàn)激酶與已知其三維結(jié)構(gòu)的激酶(例如蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)識(shí)符1kv1(鏈A)、1kv2(鏈A)、1iep(鏈A)、1iep(鏈B)、1fpu(鏈A)、1fpu(鏈B)和1irk)；b)鑒定變構(gòu)結(jié)合部位；c)根據(jù)變構(gòu)結(jié)合部位設(shè)計(jì)抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒可以包含采用下述方法設(shè)計(jì)的抑制劑a)利用試驗(yàn)激酶的三維結(jié)構(gòu)定位DFG基序；b)鑒定DFG基序?yàn)镈FG-向外構(gòu)象時(shí)所形成的變構(gòu)結(jié)合部位，其中變構(gòu)結(jié)合部位(例如DFG為DFG-向外位置時(shí)誘導(dǎo)的凹口袋)在空間上可區(qū)別于ATP結(jié)合部位和活化環(huán)；c)根據(jù)變構(gòu)結(jié)合部位(例如DFG為DFG-向外位置時(shí)誘導(dǎo)的凹口袋)設(shè)計(jì)抑制劑(例如計(jì)算的)。
另一方面，本發(fā)明提供抑制激酶活性或治療患者(例如哺乳動(dòng)物，例如人)的激酶介導(dǎo)的疾病或疾病癥狀的方法，所述方法包括給予患者包含采用下述方法設(shè)計(jì)的抑制劑的化合物的步驟a)比較試驗(yàn)激酶與已知其三維結(jié)構(gòu)的激酶(例如蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)識(shí)符1kv1(鏈A)、1kv2(鏈A)、1iep(鏈A)、1iep(鏈B)、1fpu(鏈A)、1fpu(鏈B)和1irk)；b)鑒定變構(gòu)結(jié)合部位(例如DFG為DFG-向外位置時(shí)誘導(dǎo)的凹口袋)；c)根據(jù)變構(gòu)結(jié)合部位(例如DFG為DFG-向外位置時(shí)誘導(dǎo)的凹口袋)設(shè)計(jì)抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抑制患者(例如哺乳動(dòng)物，例如人)的激酶活性的方法可以包括采用下述方法設(shè)計(jì)的抑制劑a)利用試驗(yàn)激酶的三維結(jié)構(gòu)定位DFG基序；b)鑒定DFG為DFG-向外構(gòu)象時(shí)所形成的變構(gòu)結(jié)合部位(例如DFG為DFG-向外位置時(shí)誘導(dǎo)的凹口袋)，其中變構(gòu)結(jié)合部位(例如DFG為DFG-向外位置時(shí)誘導(dǎo)的凹口袋)在空間上可區(qū)別于ATP結(jié)合部位和活化環(huán)；c)根據(jù)變構(gòu)結(jié)合部位設(shè)計(jì)抑制劑(例如計(jì)算的)。
另一方面，本發(fā)明提供一種制備藥用組合物的方法，該方法包括將抑制劑(例如采用任一本文所述方法鑒定的抑制劑)與一種或多種藥物可接受的載體混合并且任選還包括聯(lián)合應(yīng)用其它治療藥。該藥用組合物可以含有不止一種激酶抑制劑和/或不止一種其它治療藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)鑒定的抑制劑可以用于制備用來(lái)治療疾病(例如癌癥(例如乳腺癌、前列腺癌、肺癌)、炎癥(例如關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、神經(jīng)科疾病(例如阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease))和肥胖癥等各種疾病)的藥物。
定義生物分子例如酶(即靶部分，例如激酶)的“未活化型”或“基礎(chǔ)型”是靶部分處于不能或幾乎不能執(zhí)行其生理功能的構(gòu)象的狀態(tài)。通常，需要進(jìn)一步轉(zhuǎn)化生物分子的未活化型或基礎(chǔ)型以獲得完全生物活性。進(jìn)一步的步驟包括，例如在激酶或其它生物分子中適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行磷酸化、去磷酸化、其它修飾、結(jié)合另外的單體、多聚化、定位、移位、結(jié)合輔因子或結(jié)合底物，以及能激活未活化生物分子的其它事件。因此，未活化生物分子能被這些事件中的任一事件或其它事件完全激活。如果靶部分是酶，則未活化型或基礎(chǔ)型通常為不能作用于其底物的酶狀態(tài)(例如激酶為不能或幾乎不能將其底物磷酸化的狀態(tài)；甲基化酶為不能或幾乎不能將其底物甲基化的狀態(tài)；磷酸酶為不能或幾乎不能將其底物去磷酸化的狀態(tài)；蛋白酶為不能或幾乎不能執(zhí)行其蛋白酶解功能的狀態(tài)；多肽為不與另外的多肽或分子締合的狀態(tài)；多肽不會(huì)選擇性突變或誘導(dǎo)成特定構(gòu)象(例如由于溫度變化或其它因素誘導(dǎo)的構(gòu)象)。在某些情況下，未活化型或基礎(chǔ)型不與ATP結(jié)合。在其它情況下，未活化型或基礎(chǔ)型是單體狀態(tài)而非多聚體狀態(tài)，或者反之亦然。仍然在其它情況下，未活化型或基礎(chǔ)型與或不與執(zhí)行其功能所必需的輔因子或其它分子結(jié)合，或者說(shuō)在誘導(dǎo)的構(gòu)象中沒(méi)有未活化型或基礎(chǔ)型。未激活狀態(tài)或基礎(chǔ)狀態(tài)的靶部分仍然可以具有活性或功能，但是相對(duì)于其激活狀態(tài)的活性或功能有所減少或降低，無(wú)論是其活性或功能的大小和/或持續(xù)時(shí)間。本文所用的“未活化型”是指不是靶部分的未活化型就是靶部分的基礎(chǔ)型。盡管這兩項(xiàng)術(shù)語(yǔ)的含意不同，但是在描述方法和組合物的上下文中都可以等同地使用它們。即所述方法可以使用未活化型的靶部分或者可以使用基礎(chǔ)型的靶部分，并且無(wú)論發(fā)生兩種情況中的哪一種情況皆可達(dá)到同樣的結(jié)果；即，鑒定在特定狀態(tài)下與靶部分結(jié)合的化合物。
另一方面，生物分子可以是“失活的”，這是指生物分子缺乏被激活的能力?？赡芤鹕锓肿邮Щ畹氖录ㄍ蛔?、截短或其它修飾，它們使得生物分子在任何情況下或有任何活化劑時(shí)都不被激活。
“未活化型激酶”是與ATP結(jié)合的能力和/或執(zhí)行其功能活性(包括其體內(nèi)功能活性)都較弱的激酶。因此，相對(duì)于當(dāng)執(zhí)行其體內(nèi)功能時(shí)，未活化型激酶很少或無(wú)激酶活性。為了變成完全活化的，未活化型激酶可以是需要任一或若干下述事件的激酶修飾(例如磷酸化、去磷酸化、其它修飾)、與調(diào)節(jié)部分(例如輔因子、蛋白質(zhì)/脂質(zhì)調(diào)節(jié)劑)接觸或結(jié)合或其它事件(例如多聚化、定位、移位)。因此，一旦完成上述一個(gè)或多個(gè)事件，未活化的激酶完全可以變得功能完全或完全活化。然而，失活激酶不可能被活化，無(wú)論是通過(guò)突變、截短、錯(cuò)折疊、不能適當(dāng)?shù)囟ㄎ换蛘卟荒芙Y(jié)合所需的輔因子或其它活性所需的分子。總之，可以應(yīng)用本文描述的方法，例如鑒定結(jié)合激酶上的新變構(gòu)部位的激酶抑制劑，所述新變構(gòu)部位可能存在于激酶的未活化型或失活型。
術(shù)語(yǔ)“校準(zhǔn)”是指通過(guò)測(cè)量或與標(biāo)準(zhǔn)比較所確定的計(jì)量器或其它測(cè)量?jī)x器上每一刻度讀數(shù)的正確數(shù)值。例如分析或測(cè)量?jī)x器(例如質(zhì)譜儀)可以通過(guò)測(cè)量或確定已知真實(shí)值的分析物(例如配體濃度)的多個(gè)數(shù)值來(lái)校準(zhǔn)。
術(shù)語(yǔ)“質(zhì)譜儀“是指一種利用電離原子或電離分子不同的質(zhì)荷比(m/e)將它們彼此分開(kāi)的分析裝置。因此質(zhì)譜法可用于測(cè)定原子或分子的數(shù)量而且也可用于確定分子的化學(xué)和結(jié)構(gòu)信息。分子具有特征性碎裂方式，從而為鑒定結(jié)構(gòu)組分提供結(jié)構(gòu)信息。質(zhì)譜儀的常規(guī)操作是a)產(chǎn)生氣-相離子；b)這些離子按其質(zhì)荷比在空間或時(shí)間上進(jìn)行分離；c)測(cè)量每一質(zhì)荷比的離子數(shù)量。通過(guò)對(duì)其解析描述質(zhì)譜儀的離子分離能力。
本領(lǐng)域有很多已知的電離源，例如電噴霧電離(ESI)、電子電離(EI)、快速原子轟擊電離(FAB)、基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)、電子-捕獲(有時(shí)稱為負(fù)離子化學(xué)電離或NICI)以及大氣壓化學(xué)電離(ApCI)。使上述任一電離方法產(chǎn)生的離子通過(guò)質(zhì)量分離器，典型的是磁場(chǎng)、四極電磁或飛行時(shí)間質(zhì)量分離器，以便于區(qū)分離子質(zhì)量以及每一質(zhì)量水平的離子數(shù)量。
質(zhì)譜法(MS)是一種有機(jī)化學(xué)和無(wú)機(jī)化學(xué)領(lǐng)域中廣泛使用的用于分子表征和分子鑒定的技術(shù)。MS提供有關(guān)分子的分子量信息。分子的分子量是鑒定分子混合物中的具體分子的關(guān)鍵信息。MS分析可以用于例如藥物開(kāi)發(fā)和制備、污染控制分析和化學(xué)質(zhì)量控制。
術(shù)語(yǔ)“配體“是指與受體締合或結(jié)合(例如以共價(jià)或非共價(jià)方式相互作用)的分子。在一些情況下，配體與受體的結(jié)合可能有生物效應(yīng)(例如激動(dòng)作用或拮抗作用)。例如，配體可以是與生物分子(例如DNA分子)結(jié)合的多肽(例如蛋白質(zhì))，其中蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合啟動(dòng)mRNA的合成。配體也可以是與酶(例如HIV蛋白酶)結(jié)合的有機(jī)分子(例如藥物化合物)，其中有機(jī)分子和酶的結(jié)合能抑制酶的活性。
當(dāng)配體是“結(jié)合劑”或者“結(jié)合”靶或是靶的配體時(shí)，締合可以通過(guò)共價(jià)相互作用、非共價(jià)相互作用或其它相互作用，包括各種形式的相互作用(例如空間相互作用、范德瓦爾斯(van der Waals)相互作用、靜電相互作用、溶劑化相互作用、電荷相互作用、共價(jià)鍵相互作用、非共價(jià)鍵相互作用(例如氫鍵相互作用)、熵或焓有利的相互作用)。
“抑制劑”是一種分子(例如一種小分子，例如約小于5kDa的分子)，當(dāng)它與靶(例如激酶)結(jié)合時(shí)可以降低靶的生理活性(例如使激酶功能減弱)或阻斷其活性(例如使激酶無(wú)功能)。抑制劑可以是小于1000道爾頓的小分子、小于750道爾頓、600道爾頓或500道爾頓的小分子、天然存在或非天然存在氨基酸的多肽、天然存在或非天然存在氨基酸的肽、擬肽、肽模擬物、合成的化合物、合成的有機(jī)化合物等等。例如，由于抑制劑而使“功能減弱”的靶(例如酶，例如激酶)，是指具有可檢測(cè)活性的靶(例如酶，例如激酶)，所述可檢測(cè)活性小于其生理?xiàng)l件下的活性。如果通過(guò)生物測(cè)定(例如酶抑制測(cè)定，例如激酶抑制測(cè)定)不能察覺(jué)靶的活性，那么該靶(例如酶，例如激酶)由于抑制劑而成為“無(wú)功能”的。
靶上的“變構(gòu)部位”，以激酶為例，如本文所述，就是在空間上不同于靶(例如激酶)的ATP結(jié)合部位的部位，當(dāng)該部位被配體(變構(gòu)配體)占據(jù)時(shí)，調(diào)節(jié)(例如抑制)或阻止ATP結(jié)合也就影響激酶功能。靶(例如激酶)上的在空間上不同的“變構(gòu)部位”也可以調(diào)節(jié)或阻止底物的結(jié)合，而對(duì)靶(例如激酶)的功能有著同樣的影響?！霸诳臻g上不同于ATP結(jié)合部位”所指的結(jié)合部位是與ATP結(jié)合部位分離并限于激酶內(nèi)的氨基酸殘基，總體上是不同于限定ATP結(jié)合部位的氨基酸序列。在空間上不同于ATP結(jié)合部位的部位可以在氨基酸長(zhǎng)度上與ATP結(jié)合部位有區(qū)別，可以在單個(gè)氨基酸上有區(qū)別，還可以在包含該部位的氨基酸序列的順序上有區(qū)別。因此變構(gòu)部位在空間上不同于或可區(qū)別于ATP結(jié)合部位(例如ATP結(jié)合部位和變構(gòu)結(jié)合部位不是同一個(gè))。本發(fā)明的變構(gòu)部位與ATP部位部分地重疊也是可行的，但是不能把變構(gòu)部位和ATP結(jié)合部位認(rèn)作是同一個(gè)。本文描述的方法可以用于鑒定在變構(gòu)部位上與靶(例如激酶)結(jié)合的配體(例如抑制劑)，而且由于結(jié)合變構(gòu)部位，這些配體(例如抑制劑)鎖定、限制或保持DFG基序?yàn)镈FG-向外位置。DFG為DFG-向外位置在物理上阻止ATP與靶(例如激酶)結(jié)合，因而有可能以這種新方式抑制靶(例如激酶)。
本文描述的方法可以用于鑒定酶(例如激酶)的抑制劑?！案鶕?jù)變構(gòu)結(jié)合部位設(shè)計(jì)抑制劑”是指根據(jù)變構(gòu)結(jié)合部位(例如DFG為DFG-向外位置時(shí)誘導(dǎo)的凹口袋)使用計(jì)算機(jī)建模確定潛在酶(例如激酶)結(jié)合劑的最佳特征，并用這些信息合成潛在酶(例如激酶)結(jié)合劑。將潛在酶(例如激酶)結(jié)合劑設(shè)計(jì)為與存在于DFG基序?yàn)镈FG-向外構(gòu)象時(shí)的變構(gòu)結(jié)合部位(例如由DFG-向外位置中的DFG誘導(dǎo)的凹口袋)結(jié)合。設(shè)計(jì)抑制劑也意指設(shè)計(jì)具有正確的拓?fù)湫再|(zhì)(形狀)和靜電性能，適合變構(gòu)結(jié)合部位的支架。一旦支架設(shè)計(jì)完成，就可以提供或合成質(zhì)量-編碼文庫(kù)(例如基于支架的文庫(kù))，并且在變構(gòu)部位(即存在于DFG為DFG-向外位置時(shí)的)起主要作用(即沒(méi)有ATP和底物時(shí)未活化的激酶)的條件下，通過(guò)用激酶的親和篩選鑒定源于此文庫(kù)的變構(gòu)結(jié)合劑(例如抑制劑)。這是個(gè)驚人的結(jié)果，也是本發(fā)明的關(guān)鍵方面，在激酶為未活化型條件下，親和篩選方法提供了優(yōu)先靶向DFG-向外構(gòu)象的激酶的抑制劑。
術(shù)語(yǔ)“有機(jī)分子”是指化合物，其中所述分子包括碳和氫，并且也可以包括另外的元素，例如氮、氧、磷、鹵素或硫(例如藥物化合物)。藥物可接受的鹽(例如馬來(lái)酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、富馬酸鹽、水楊酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、扁桃酸鹽、酒石酸鹽和甲磺酸鹽)也包括在術(shù)語(yǔ)“有機(jī)分子”含義之內(nèi)。
術(shù)語(yǔ)“受體”是指在細(xì)胞內(nèi)配體可以結(jié)合且發(fā)揮信號(hào)功能的生物分子。配體可以刺激或激活正常的生理功能?；蛘哒f(shuō)，配體可以調(diào)節(jié)或抑制生理功能。受體一旦與第二個(gè)分子締合，就能夠或引發(fā)一種效應(yīng)(例如生物學(xué)活性或可檢測(cè)信號(hào))。例如，受體可以是蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)結(jié)合特異性胞外信號(hào)分子(例如配體)并且在細(xì)胞里誘導(dǎo)反應(yīng)。細(xì)胞表面受體的實(shí)例包括乙酰膽堿受體和胰島素受體。胞內(nèi)受體的實(shí)例包括激素，其可以結(jié)合配體穿過(guò)質(zhì)膜擴(kuò)散到細(xì)胞里。受體的其它實(shí)例包括多肽、蛋白質(zhì)、酶、核酶、RNA、DNA和生物分子模擬物。
術(shù)語(yǔ)“生物分子”是指影響生物活性(例如代謝、拮抗作用、激動(dòng)作用、信號(hào)傳導(dǎo)或轉(zhuǎn)錄)的分子。當(dāng)可能在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)生物分子時(shí)，那么術(shù)語(yǔ)生物分子就不僅限于天然存在的生物分子，而是還包括合成的天然存在的生物分子及其片段和修飾。生物分子的實(shí)例包括多肽、蛋白質(zhì)、酶、核酶、RNA和DNA。
術(shù)語(yǔ)“多肽”是指由多個(gè)氨基酸組成的聚合物。蛋白質(zhì)可以是多肽的一個(gè)實(shí)例。
術(shù)語(yǔ)“酶”是指大分子，通常是蛋白質(zhì)，其功能是作為(生物)催化劑以增加反應(yīng)速率。通常，一種酶只催化一個(gè)反應(yīng)(即反應(yīng)選擇性)并且只作用于一種底物(即底物選擇性)。底物分子通常是在同一的部位轉(zhuǎn)化(區(qū)域選擇性)；而且通常只轉(zhuǎn)化一種外消旋底物對(duì)的手性底物(對(duì)映選擇性，特殊形式的立體選擇性)。
術(shù)語(yǔ)“核酸”是指由核苷酸亞單位組成的聚合物。該核苷酸亞單位可以通過(guò)磷酸二酯鍵結(jié)合在一起。
術(shù)語(yǔ)“受體-配體對(duì)”是指由受體和配體組成的復(fù)合物，一般通過(guò)非共價(jià)作用(例如氫鍵，離子相互作用或疏水相互作用)以可逆方式保持在一起。
術(shù)語(yǔ)“平衡”是指可逆的化學(xué)反應(yīng)和/或生化反應(yīng)和/或相互作用的狀態(tài)，在此狀態(tài)反應(yīng)物轉(zhuǎn)向產(chǎn)物的速率與產(chǎn)物回轉(zhuǎn)成反應(yīng)物的速率相同，以致每種反應(yīng)物和產(chǎn)物的數(shù)量基本恒定。在一段時(shí)間內(nèi)采集混合物樣品并確定初始原料與產(chǎn)物的比率不會(huì)改變，這樣可以精確地證明反應(yīng)達(dá)到了平衡。
術(shù)語(yǔ)“大小排阻層析”(SEC)是指使用多孔顆粒分離大小不同的分子。通常用于分離生物分子，以及確定聚合物的分子量和分子量分布。通常，比孔徑小的分子可以進(jìn)入顆粒內(nèi)，因此，與不能進(jìn)入顆粒的較大分子相比，就有著更長(zhǎng)的通徑和更長(zhǎng)的過(guò)渡時(shí)間。比孔徑大的分子不能進(jìn)入孔內(nèi)而一起洗脫成為層析圖里的第一個(gè)峰。這種狀況稱為總排阻?？梢赃M(jìn)入孔內(nèi)的分子在顆粒中會(huì)有取決于分子大小和形狀的平均停留時(shí)間。因此，不同的分子具有不同的通過(guò)柱子的總過(guò)渡時(shí)間。小于孔徑的分子可以進(jìn)入所有的孔，且在柱上具有最長(zhǎng)的停留時(shí)間而一起一起洗脫成為層析圖里的最后一個(gè)峰。
術(shù)語(yǔ)“液相層析”是指一種用于分離溶解于溶劑中的離子和/或分子的分析型層析技術(shù)。如果將樣本溶液與第二固相或液相接觸，那么由于吸附、離子交換、分配或大小的差異，不同的溶質(zhì)會(huì)不同程度地與其它相互相作用。這些差異使得混合物的組成成分彼此分開(kāi)，用這些差異確定溶質(zhì)過(guò)柱的過(guò)渡時(shí)間。高效液相層析(HPLC)是分離溶液內(nèi)化合物的液相層析的一種。HPLC儀器由流動(dòng)相容器、泵、注射器、分離柱和檢測(cè)器組成。將樣本混合物注入柱子來(lái)分開(kāi)化合物。因?yàn)樗鼈冊(cè)诹鲃?dòng)液相和固定相間的分配行為的差異，所以混合物里的不同成分以不同的速率通過(guò)柱子。
術(shù)語(yǔ)“競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合劑”是指在特定部位(例如酶的催化部位)與受體結(jié)合的配體，其中該競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合劑在動(dòng)態(tài)的、平衡樣過(guò)程中與其它配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。
術(shù)語(yǔ)“靶部分”是指可以應(yīng)用篩選方法發(fā)現(xiàn)結(jié)合的配體的生物分子或其片段。
術(shù)語(yǔ)“靶型”是指生物分子(例如激酶)的區(qū)別生化狀態(tài)或生物物理狀態(tài)，例如不同的構(gòu)象、聚集狀態(tài)、化學(xué)修飾、與其它生物分子或輔因子締合以及與一個(gè)或多個(gè)配體締合。
本文所述的靶可以指激酶?！癉FG基序”是指激酶中的保守基序，它由三個(gè)連續(xù)氨基酸組成，前面是天冬氨酸后跟苯丙氨酸、色氨酸或亮氨酸，其后跟甘氨酸(即Asp-Phe/Leu/Trp-Gly)。因而DFG基序可以有氨基酸序列DFG、DWG或DLG。例如，Asp1150-Phe1151-Gly1152是胰島素受體激酶中的DFG基序；Asp381-Phe382-Gly383是c-ab1中的DFG基序；Asp168-Phe169-Gly170是p38MAPK中的DFG基序。將已知其DFG基序位置的蛋白質(zhì)與待測(cè)DFG基序的蛋白質(zhì)進(jìn)行多重序列比對(duì)，可以鑒定這個(gè)基序。
特異性靶中的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，激酶是“螺旋alpha-C”(也稱為螺旋α-C)?！奥菪?C”是指激酶中的保守螺旋。例如在胰島素受體激酶中，該螺旋由氨基酸序列LRERIEFLNEASVM(氨基酸1038-1051)組成，在1050-1051處有Val-Met基序。另一個(gè)例子，在c-ab1中，該螺旋由氨基酸序列VEEFLKEAAVM(氨基酸280-290)組成，在氨基酸289-290處有Val-Met基序。試驗(yàn)激酶的螺旋α-C與胰島素受體激酶中的螺旋α-C是“同源的”，其含有位于1050的纈氨酸后跟位于1051的甲硫氨酸，并且與c-ab1中的螺旋α-C也是“同源的”，其含有位于289的纈氨酸和位于290的甲硫氨酸。1irk是胰島素受體激酶在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)中的檢索代碼，可以在萬(wàn)維網(wǎng)上找到，網(wǎng)址為rcsb.org/pdb/，在此網(wǎng)址也可以找到1iep，而且是與STI-571(即甲磺酸伊馬替尼(Gleevec))結(jié)合的c-ab1的PDB的檢索代碼。
具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族已經(jīng)在本領(lǐng)域限定。這些相似性可允許氨基酸在激酶的三維結(jié)構(gòu)內(nèi)起“類似”作用。這些家族成員包括帶堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、帶酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、帶非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、帶β-分枝側(cè)鏈的氨基酸(蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和帶芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，舉例說(shuō)明，與賴氨酸類似的氨基酸必定是精氨酸或組氨酸。如另一個(gè)實(shí)例，天冬氨酸如本文所述與谷氨酸類似。
下面給出了本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的細(xì)節(jié)。根據(jù)說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)勢(shì)將會(huì)是顯而易見(jiàn)的。
詳述本文描述的方法是根據(jù)以下發(fā)現(xiàn)除活化型以外的靶(例如生物分子)型，對(duì)于鑒定靶(例如生物分子)功能的新抑制劑是非常有用的。所述方法提供用新的方式篩選靶以發(fā)現(xiàn)結(jié)合靶的低活性或無(wú)活性狀態(tài)的化合物，并且在后續(xù)生物測(cè)定中作為靶功能的抑制劑。該方法適用于生物靶的所有類型，包括核酸(例如DNA或RNA)或蛋白質(zhì)(例如膜結(jié)合蛋白、酶、核激素受體(NHR)和G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR))。所描述的方法不需要生化測(cè)定其輸出值而只用很少量提純的靶。本文描述的方法具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，包括無(wú)需預(yù)先了解靶的結(jié)構(gòu)；可以使用化合物的混合物；已知靶的許多型可一起進(jìn)行(例如在一個(gè)普通的結(jié)合反應(yīng)可以將兩個(gè)或更多個(gè)不同形式的蛋白質(zhì)混合在一起并對(duì)其進(jìn)行篩選)以提高該方法的效率。本文描述的方法可以利用質(zhì)量-編碼組合文庫(kù)和配體自動(dòng)鑒定系統(tǒng)(ALIS)，如下所述。
美國(guó)專利第6,207,861號(hào)涉及制備質(zhì)量-編碼組合文庫(kù)的方法和鑒定(即篩選)在那些質(zhì)量-編碼組合文庫(kù)中的與一個(gè)或多個(gè)生物分子締合的化合物的方法?？梢栽O(shè)計(jì)并合成質(zhì)量-編碼文庫(kù)，致使至少約90％的單一化合物具有的分子質(zhì)量總和不同于質(zhì)量文庫(kù)中其它單一化合物的分子質(zhì)量總和，在這種情況下允許豐余(例如對(duì)于質(zhì)量單一支架+外周部分組合的質(zhì)量-編碼類別，及因此產(chǎn)生的計(jì)算的位置異構(gòu)體間的質(zhì)量豐余)。在其它情況下，可以將質(zhì)量-編碼文庫(kù)設(shè)計(jì)為至少90％的單一化合物具有的分子質(zhì)量總和不同于質(zhì)量-編碼文庫(kù)的其它單一化合物的分子質(zhì)量總和，其中不允許豐余(例如對(duì)于質(zhì)量單一支架+外周部分組合的質(zhì)量-編碼類別，及因此產(chǎn)生的不計(jì)算的位置異構(gòu)體間的質(zhì)量豐余)。
在美國(guó)專利第6,207,861號(hào)中的篩選方法描述了一個(gè)稱為配體自動(dòng)鑒定系統(tǒng)(ALIS)的系統(tǒng)。ALIS系統(tǒng)通常功能如下(1)在有配體(有機(jī)小分子或其文庫(kù))時(shí)，按規(guī)定的時(shí)間孵育目標(biāo)生物分子(例如蛋白質(zhì))的稀釋液，使生物分子-配體復(fù)合物形成反應(yīng)達(dá)到平衡；(2)將生物分子、未結(jié)合的配體的和生物分子-配體復(fù)合物的溶液通過(guò)大小排阻層析，將生物分子加上生物分子-配體復(fù)合物與未結(jié)合的配體按分子大小進(jìn)行分離，其中生物分子加上生物分子-配體復(fù)合物在洗脫流的前部共同洗脫；(3)將含有生物分子加上生物分子-配體復(fù)合物但卻不含有任何未結(jié)合的配體的洗脫流部分進(jìn)行反相層析脫鹽及洗脫進(jìn)入質(zhì)譜儀，在那里對(duì)小分子可根據(jù)其分子量或質(zhì)譜法-質(zhì)譜法碎裂方式進(jìn)行鑒定并按所測(cè)得的信號(hào)反應(yīng)進(jìn)行定量。
如前所述，當(dāng)鑒定靶配體(例如激酶抑制劑)時(shí)，將化合物的混合物、支架或文庫(kù)與試驗(yàn)靶一起孵育，然后在用質(zhì)譜法鑒定前，將結(jié)合靶的化合物與未結(jié)合的化合物分離。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了鑒定結(jié)合組分，將結(jié)合靶的化合物進(jìn)行分離?？梢杂枚喾N方法例如使用層析(例如高溫下的高分辨率反相層析)改變壓力、pH、鹽濃度、溫度或有機(jī)溶劑濃度破壞靶-化合物結(jié)合對(duì)；或者用已知的靶結(jié)合劑競(jìng)爭(zhēng)，或者這些技術(shù)的任何組合來(lái)破壞靶-化合物的結(jié)合對(duì)。
一旦結(jié)合靶的化合物與靶分離，那么就可以用質(zhì)譜法鑒定化合物。美國(guó)專利第6,147,344號(hào)描述了分析質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)的方法，進(jìn)行對(duì)照樣本的測(cè)量提供了本底噪聲校驗(yàn)。每一m/z比的峰高值和峰寬值作為時(shí)間的函數(shù)保存在存儲(chǔ)器中。將質(zhì)譜儀用于待分析的材料并且將每一m/z比的峰高值和峰寬值對(duì)時(shí)間保存在第二存儲(chǔ)器位置。以固定時(shí)間重復(fù)操作質(zhì)譜儀對(duì)材料進(jìn)行分析，并且將每一時(shí)間增量、每一m/z比的所存儲(chǔ)的對(duì)照樣本值，從測(cè)試的每一相應(yīng)值里扣除，從而獲得每一時(shí)間增量、多次測(cè)試中每次的質(zhì)量比的差值。如果MS值減去本底噪聲未超過(guò)預(yù)置值，那么m/z比數(shù)據(jù)點(diǎn)不予記錄，因此將本底噪聲、化學(xué)噪聲和假正峰從質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)中排除。然后將多次測(cè)試中每次的存儲(chǔ)的數(shù)據(jù)與每一m/z比的預(yù)置和所得的一系列峰相比較，此時(shí)可確定高于背景的峰，并將數(shù)據(jù)存儲(chǔ)在峰是顯著性的那些m/z點(diǎn)。
具體地說(shuō)，美國(guó)專利第6,147,344號(hào)描述了一種自動(dòng)分析質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)的技術(shù)，這些數(shù)據(jù)來(lái)自由系列篩選而組成的化合物的混合物，這些篩選是設(shè)計(jì)用來(lái)消除或減少由于本底噪聲、系統(tǒng)分辨、系統(tǒng)污染、多電荷離子和同位素取代引起的錯(cuò)誤峰鑒定。該方法可以在有機(jī)化合物的復(fù)雜混合物中鑒定出有機(jī)化合物并且這對(duì)于本文描述的一些方法是有用的。使用該技術(shù)對(duì)對(duì)照樣本進(jìn)行質(zhì)譜操作，產(chǎn)生第一組輸出值。然后，對(duì)待分析樣本進(jìn)行質(zhì)譜操作，產(chǎn)生第二組輸出值。為預(yù)期存在已計(jì)算的質(zhì)譜儀輸出光譜的預(yù)置文庫(kù)中的混合物里的材料選擇第一個(gè)m/z比，從所分析的樣本數(shù)值中減去在預(yù)期輸出數(shù)值上的對(duì)照樣本值，并比較與預(yù)期數(shù)值的差異。如果所述值大于預(yù)定值，就表明信號(hào)大于本底噪聲，因此產(chǎn)生所期望材料m/z值的記錄。進(jìn)行相同的質(zhì)量光譜操作數(shù)次消除隨機(jī)噪聲和背景污染。其次，對(duì)一些不具預(yù)期峰寬或沒(méi)有分離方法所需要的適當(dāng)時(shí)間的峰值作了鑒定。通過(guò)檢驗(yàn)峰分離鑒定多電荷離子。檢驗(yàn)所期望材料的m/z定位并且將所期望的m/z定位的強(qiáng)度與下一個(gè)低一些的m/z記錄峰的強(qiáng)度進(jìn)行比較，鑒定與原子同位素取代有關(guān)的一些峰。由于該項(xiàng)技術(shù)，對(duì)于鑒定可能的假信號(hào)質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)分析可能會(huì)簡(jiǎn)單得多，而且分析將變得更簡(jiǎn)單和更加準(zhǔn)確。
計(jì)算機(jī)建模一旦確定了參考靶-配體復(fù)合物或參考靶的晶體的三維結(jié)構(gòu)，就可以通過(guò)幾種方法的單獨(dú)使用或是結(jié)合使用來(lái)測(cè)定潛在的抑制劑。根據(jù)本文描述的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，可以利用目測(cè)檢查計(jì)算機(jī)屏幕上的相關(guān)位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)表現(xiàn)度。使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通曉的計(jì)算機(jī)建模技術(shù)、硬件和軟件完成所述評(píng)價(jià)或建模。同時(shí)這又涉及模型建立、模型對(duì)接或靶-配體相互作用的其它分析，所用軟件包括例如QSC、FlexX(Lengauer，Rarey，1996)或Autodock(Morris等，1998)，GLIDE，Modeler或Sybyl，還有能量最低化和具備包括有例如CHARMM和AMBER標(biāo)準(zhǔn)分子力學(xué)場(chǎng)的分子動(dòng)力學(xué)。還可以利用靶-配體復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)信息和計(jì)算機(jī)建模一起建立其它靶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)模型，尤其是那些與已測(cè)定三維結(jié)構(gòu)信息的靶同源的?？梢杂帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法和技術(shù)(包括本文描述的軟件包)建立靶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)模型。
一旦確定包含靶和靶的標(biāo)準(zhǔn)配體的晶體間所形成的蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的晶體的三維結(jié)構(gòu)，通過(guò)使用對(duì)接程序例如QSC、FlexX或Autodock的計(jì)算機(jī)建模的應(yīng)用鑒定潛在的變構(gòu)結(jié)合部位的配體和/或抑制劑，用以確定潛在的配體形狀和化學(xué)結(jié)構(gòu)與結(jié)合部位相互作用的程度。計(jì)算機(jī)程序也可用來(lái)評(píng)價(jià)兩個(gè)結(jié)合配偶體(即變構(gòu)結(jié)合部位和潛在配體)的引力、斥力和立體位阻。一般來(lái)說(shuō)，潛在的配體和變構(gòu)結(jié)合部位間的互補(bǔ)擬合、較低立體位阻、較高吸引力是與兩者牢固結(jié)合一致的。此外，所設(shè)計(jì)的潛在藥物特異性越高，則藥物越難以完成與其它蛋白質(zhì)相互作用。這將使與其它蛋白質(zhì)不想要的相互作用所致的潛在的副作用降至最小。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用多種方法評(píng)價(jià)和實(shí)際上篩選適合與蛋白質(zhì)締合的分子或化學(xué)片段，尤其是例如激酶、磷酸酶、轉(zhuǎn)移酶、GPCR、NHR等等。所述締合可以是多種形式的締合，包括例如空間相互作用、范德瓦爾斯相互作用、靜電相互作用、溶劑化相互作用、電荷相互作用、共價(jià)鍵相互作用、非共價(jià)鍵相互作用(例如氫鍵相互作用)、焓或熵有利的相互作用等等。
許多計(jì)算機(jī)程序可以利用并適用于合理藥物設(shè)計(jì)和計(jì)算機(jī)建模、模型建立以及用本文描述的方法計(jì)算鑒定、選擇和評(píng)價(jià)潛在的抑制劑的過(guò)程。這些包括例如QSC(WO 01/98457)、FlexX、Autodock、Glide、Accelrys′Discovery Studio或Sybyl。也可以運(yùn)用這些軟件包，例如QSC(WO01/98457)、Accelrys′Discovery Studio、Sybyl、ISIS、ChemDraw或Daylight，“從頭”計(jì)算設(shè)計(jì)潛在的抑制劑?？梢赃\(yùn)用例如GAUSSIAN 92、AMBER、QUANTA/CHARMM和INSIGHTII/DISCOVER等程序評(píng)價(jià)化合物形變能和靜電排斥。
這些計(jì)算機(jī)的評(píng)價(jià)和建模技術(shù)可在任何合適的硬件上進(jìn)行，例如包括Silicon Graphics、Sun Microsystems等提供的工作站。這些技術(shù)、方法、硬件和軟件包都是極具代表性的就不一一列舉。根據(jù)本發(fā)明也采用本領(lǐng)域已知的其它建模技術(shù)。參見(jiàn)QSC(WO 01/98457)、FlexX、Autodock、Glide、Accelrys′Discovery Studio或Sybyl和各個(gè)因特網(wǎng)站經(jīng)標(biāo)識(shí)的軟件例如netsci.org/Resources/Software/Modeling/CADD/ch.cam.ac.uk/SGTL/software.htmlcmm.info.nih.gov/modeling/universal_software.htmldasher.wustl.edu/tinker/zeus.polsl.gliwice.pl/～nikodem//linux4chemistry.htmlnyu.edu/pages/mathmol/software.htmlmsi.umn.edu/user_support/software/MolecularModeling.htmlus.expasy.org/
sisweb.com/software/model.htm由于結(jié)合使用或單獨(dú)使用計(jì)算機(jī)建模和上述方法測(cè)定了本文描述靶的變構(gòu)部位的三維結(jié)構(gòu)，就可以進(jìn)行合理藥物設(shè)計(jì)，從而選出潛在的抑制劑。然后就可以從商業(yè)渠道獲得潛在的抑制劑，或者用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)和方法用易得的原料合成獲得潛在的抑制劑。然后，如上所述測(cè)定潛在的抑制劑，以確定其抑制靶酶(例如激酶)和/或酶途徑(例如激酶途徑)的能力。
也可如上述，通過(guò)篩選化合物的文庫(kù)(例如組合文庫(kù)，例如質(zhì)量-編碼組合文庫(kù))選擇潛在的抑制劑。可以用親和篩選方法篩選化合物的文庫(kù)，從中選擇出對(duì)于新變構(gòu)部位上的特異蛋白質(zhì)具有最慢解離速率和最大親和力的成員。如上所述，ALIS也可以用于篩選化合物的文庫(kù)。由于當(dāng)靶為未激活狀態(tài)時(shí)，很多靶中都存在變構(gòu)部位，因此ALIS是特別有用的?？梢詫LIS和化合物的混合物一起使用并且當(dāng)靶為未激活狀態(tài)時(shí)尤其可以允許使用它們鑒定結(jié)合的配體。常規(guī)靶篩選常常依賴于為激活狀態(tài)的目標(biāo)靶。
藥用組合物本發(fā)明的藥用組合物包括采用本文描述的一種或多種方法所鑒定的化合物或其藥物可接受的鹽；任選的其它藥物，該藥物選自靶抑制劑(小分子、多肽、抗體等)、免疫抑制藥、抗癌藥、抗炎藥或抗血管過(guò)度增生化合物、治療神經(jīng)障礙的化合物、抗肥胖癥化合物；以及任何藥物可接受的載體、輔料或賦形劑?；蛘?，本發(fā)明的組合物包括采用本文描述的一種或多種方法所鑒定的化合物或其藥物可接受的鹽；以及藥物可接受的載體、輔料或賦形劑。
術(shù)語(yǔ)“藥物可接受的載體或輔料”是指能與本發(fā)明的化合物一起給予患者的載體或輔料，而且當(dāng)給予足夠遞送化合物的治療量時(shí)，它們既不破壞其藥理活性而且無(wú)毒。
可能用于本發(fā)明的藥用組合物的藥物可接受的載體、輔料和賦形劑包括但不限于離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、自乳化遞藥系統(tǒng)(SEDDS)例如琥珀酸d-α-生育酚聚乙二醇1000，以藥學(xué)劑形使用的表面活性劑例如吐溫或其它類似的高分子遞藥基質(zhì)，血清蛋白質(zhì)，例如人血清白蛋白、緩沖物質(zhì)例如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、及飽和植物脂肪酸的部分甘油酯的混合物、水、鹽或電介質(zhì)，例如硫酸魚(yú)精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠態(tài)二氧化硅、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮，基于纖維素的物質(zhì)、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、臘、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。環(huán)糊精例如α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精或化學(xué)改性衍生物例如羥基烷基環(huán)糊精，包括2-羥丙基-β-環(huán)糊精和3-羥丙基-β-環(huán)糊精或其它的增溶衍生物，它們可能用來(lái)提高采用本文描述的一種或多種方法所鑒定的化合物的遞送。
本發(fā)明的藥用組合物可以通過(guò)口服給藥、胃腸外給藥、吸入噴霧給藥、局部給藥、直腸給藥、鼻腔給藥、口腔含化給藥、陰道給藥或經(jīng)植入的貯庫(kù)給藥，優(yōu)選口服給藥或注射給藥。本發(fā)明的藥用組合物可含有任何常用的無(wú)毒藥物可接受的載體、輔料或賦形劑。本文所用的術(shù)語(yǔ)胃腸外包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、損害內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。
本發(fā)明的藥用組合物可以用可接受的任一口服劑型口服給藥，所述口服劑型包括但不限于膠囊劑、片劑、乳劑、水性混懸劑、分散劑和溶液劑。如果是口服片劑，常用載體包括乳糖和玉米淀粉。通常也可以加入潤(rùn)滑劑例如硬脂酸鎂。對(duì)于口服膠囊劑，有效的稀釋劑包括乳糖和干的玉米淀粉。當(dāng)口服給予水性混懸劑和/或乳劑時(shí)，將懸浮或溶于油相的活性成分與乳化劑和/或懸浮劑混合在一起。如果需要，可以加入甜味劑和/或矯味劑和/或著色劑。
本發(fā)明的藥用組合物可以包括使用脂質(zhì)體或微膠囊化技術(shù)的制劑。這些技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。
本發(fā)明的藥用組合物也可以是直腸給藥用栓劑。將本發(fā)明的組合物與適當(dāng)?shù)臒o(wú)刺激性賦形劑混合可以制備這類栓劑，所述賦形劑室溫時(shí)為固體，但在直腸溫度時(shí)為液體，因而會(huì)在直腸內(nèi)熔化釋放活性化合物。這些物質(zhì)包括但不限于可可脂、蜂蠟和聚乙二醇。
如果所需治療的部分或器官可接受局部用藥時(shí)，那么本發(fā)明藥用組合物的局部給藥就會(huì)特別有用。對(duì)于皮膚的局部施用，就應(yīng)該用含有懸浮于或溶于載體的活性組分的適當(dāng)?shù)能浉鄤┡渲扑幱媒M合物。適于本發(fā)明化合物局部給藥的載體包括但不限于礦物油、液體石油、白石油、聚乙二醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯化合物、乳化臘和水。另一個(gè)辦法是，藥用組合物可用合適的活性化合物的洗劑或乳膏配制，該化合物懸浮于或溶解于含適合乳化劑的載體內(nèi)。合適的載體包括但不限于礦物油、單硬脂山梨坦、聚山梨酯60、十六烷基酯蠟、西替烷基醇(cetearyl alcohol)、辛基十二烷醇、苯甲醇和水。本發(fā)明的藥用組合物也可以直腸栓劑或合適的灌腸劑局部用于腸道下部。
本發(fā)明也包括局部透皮貼劑。
可以通過(guò)鼻氣霧劑或吸入方式給予本發(fā)明的藥用組合物。這些組合物按藥物制劑領(lǐng)域通曉的技術(shù)制備，也可以使用苯甲醇或其它合適的防腐劑、提高生物利用度的吸收促進(jìn)劑、碳氟化合物和/或其它本領(lǐng)域通曉的增溶劑或分散劑制備成鹽溶液。
在用單一療法和/聯(lián)合療法預(yù)防和治療靶介導(dǎo)的疾病時(shí)，本文描述的靶抑制化合物的有效日劑量水平介于約0.01mg/kg體重和約100mg/kg體重之間，或者介于約0.5mg/kg體重和約75mg/kg體重之間。通常，本發(fā)明的藥用組合物日給藥次數(shù)是約1次至約6次，或者是連續(xù)輸注。這種給藥可用作慢性或急性治療。與載體物質(zhì)混合在一起以生產(chǎn)單劑型的活性成分的用量將隨待治療患者和具體給藥方式而變化。典型的制劑含有約5％至約95％的活性化合物(w/w)。或者，這些制劑含有約20％至約80％的活性化合物。
正如技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到的，可能需要低于或高于上述記載的劑量。任一具體患者的準(zhǔn)確劑量和治療方案將取決于諸多因素，包括所用具體化合物的活性、年齡、體重、一般健康狀態(tài)、性別、飲食、給藥時(shí)間、排泄率、藥物組合、疾病嚴(yán)重程度和病程、病癥或癥狀、對(duì)患者疾病的處置、病癥或癥狀以及治療醫(yī)師的判斷。
實(shí)施例實(shí)施例1篩選單體型靶酶以鑒定抑制多聚體酶活性的配體已知人誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)在炎癥中起重要作用，因此iNOS活性的抑制劑是發(fā)現(xiàn)抗炎藥物的候選藥物。iNOS酶必須是荷載輔因子的同型二聚體，以便每個(gè)多聚體能提供兩個(gè)功能活性部位，當(dāng)缺乏一個(gè)所需輔因子四氫生物蝶呤(THB)時(shí)，已知該酶以低活性態(tài)存在，在無(wú)活性單體和活性二聚體之間找到平衡點(diǎn)(Ghosh等，Biochemistry，351444-9(1996))。因此，采用基于功能的篩選發(fā)現(xiàn)結(jié)合THB的高活性二聚體的抑制劑。然而對(duì)未結(jié)合THB的低活性態(tài)的iNOS的基于親和力的篩選獲得新的配體，該配體能與單體型iNOS結(jié)合并減弱二聚化。在生化和細(xì)胞兩種測(cè)定中，這些配體均作為iNOS的功能抑制劑，用放射性配體置換測(cè)定(用已知的單體特異性配體)，其IC50范圍介于30nM至30μM之間，用LPS-刺激RAW細(xì)胞測(cè)定，其EC50范圍介于100nM至50μM之間。
實(shí)施例2缺乏所需輔因子時(shí)篩選靶酶以鑒定抑制不依賴輔因子的酶活性的配體已知人肌苷一磷酸脫氫酶(IMPDH)在炎癥中起重要作用，因此IMPDH活性的抑制劑是發(fā)現(xiàn)抗炎藥物的侯選藥物。全活性時(shí)，IMPDH酶利用輔因子NAD+氧化底物IMP，得到產(chǎn)物黃苷一磷酸(XMP)和NADH。已知的IMPDH抑制劑如麥考酚酸(MPA)以依賴IMP和NAD的方式與IMPDH結(jié)合(Fleming等，Biochemistry，356990-7(1996))，因而當(dāng)有IMP和NAD時(shí)，必須對(duì)IMPDH進(jìn)行基于功能的篩選。然而。當(dāng)有IMP但沒(méi)有NAD+時(shí)，對(duì)IMPDH的基于親和力的篩選獲得新的配體，該配體以依賴IMP而不依賴NAD的方式結(jié)合IMPDH。在生化測(cè)定中，這些配體用作IMPDH的功能抑制劑，隨后生成熒光NADH，其IC50范圍介于50nM至10μM之間，而在細(xì)胞測(cè)定例如PHA刺激抑制PBMC細(xì)胞增殖時(shí)，其EC50范圍介于500nM至50μM之間。
實(shí)施例3篩選基礎(chǔ)非活化型靶激酶以鑒定抑制酶活性的配體已知人激酶p38在炎癥中起重要作用，因此p38活性的抑制劑是發(fā)現(xiàn)抗炎藥物的侯選藥物(REF)。全活性時(shí)，基礎(chǔ)型p38激酶必須在氨基酸殘基Thr180和Tyr182被MKK6/MEK6磷酸化才被激活，Wilson等(J.Biol.Chem.，27127696-27700(1996))。p38的磷酸化將DFG環(huán)的優(yōu)選平衡構(gòu)象從低活性“DFG-向外”構(gòu)象移向高活性“DFG-向內(nèi)”構(gòu)象(Knighton等，Science 253407-414(1997)，Yamaguchi等，Nature 384484-489(1996))。當(dāng)有底物和ATP時(shí)，p38的基于功能的篩選就典型地利用了活化型p38以確保增強(qiáng)而且可靠的功能信息。然而，當(dāng)沒(méi)有ATP和底物肽時(shí)，對(duì)基礎(chǔ)未磷酸化p38激酶的基于親和力的篩選獲得新的配體，該配體結(jié)合并穩(wěn)定p38激酶的DFG-向外無(wú)活性構(gòu)象。在生化測(cè)定中，這些配體用作p38高選擇性功能抑制劑，據(jù)報(bào)道，能將放射性標(biāo)記ATP轉(zhuǎn)移到MAPKAPK-2底物肽，其IC50范圍介于50nM至10μM之間，而在THR.1全細(xì)胞測(cè)定中，據(jù)報(bào)道，抑制LPS-介導(dǎo)的THFα的釋放，其EC50范圍介于500nM至50μM之間。通過(guò)阻止活化(磷酸化)、阻止底物的結(jié)合和/或阻止ATP的結(jié)合，這些配體能夠機(jī)械地抑制活性。
實(shí)施例4缺乏所需蛋白伙伴時(shí)篩選靶酶以鑒定抑制酶活性的配體已知人細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)在癌細(xì)胞增殖中起重要作用，因此CDK2活性的抑制劑是發(fā)現(xiàn)抗癌藥物的候選藥物(Knockaert等，TIPS，23417-425(2002))。全活性時(shí)，基礎(chǔ)型CKD2激酶必定以1∶1化學(xué)計(jì)量與蛋白細(xì)胞周期蛋白伙伴結(jié)合(Knockaert等，TIPS，23417-425(2002))。兩種已知的與CDK2結(jié)合并形成活性CDK2-細(xì)胞周期蛋白復(fù)合物的細(xì)胞周期蛋白是細(xì)胞周期蛋白A和細(xì)胞周期蛋白E。細(xì)胞周期蛋白與CDK2的結(jié)合需要激酶活性，因此，當(dāng)有底物肽和ATP時(shí)，對(duì)CDK2的基于功能的篩選必定利用細(xì)胞周期蛋白-CDK2復(fù)合物來(lái)獲取功能信息。然而，當(dāng)沒(méi)有細(xì)胞周期蛋白也沒(méi)有ATP和底物肽時(shí)，對(duì)基礎(chǔ)未磷酸化CDK2的基于親和力的篩選獲得新的配體，該配體選擇性地與無(wú)細(xì)胞周期蛋白失活型CDK2結(jié)合。在使用癌細(xì)胞系的常規(guī)細(xì)胞增殖測(cè)定中，這些配體用作CDK2的功能抑制劑，其EC50范圍介于500nM至50μM之間。通過(guò)阻止細(xì)胞周期蛋白與CDK2的結(jié)合、阻止活化(磷酸化)、阻止底物的結(jié)合和/或阻止ATP的結(jié)合，這些配體能夠機(jī)械地抑制活性。
實(shí)施例5篩選無(wú)配體型靶NHR以鑒定抑制受體活性的配體已知人核激素受體(NHR)肝X受體β(LXRβ)在脂質(zhì)體內(nèi)平衡中起重要作用，因此LXRβ活性的調(diào)節(jié)劑是發(fā)現(xiàn)血脂異常和心血管藥物的候選藥物。全活性時(shí)作為轉(zhuǎn)錄激活因子，基礎(chǔ)型LXRβ必定以1∶1化學(xué)計(jì)量與小分子激動(dòng)劑結(jié)合才被激活。24-羥基膽固醇是一種天然存在的LXRβ的小分子激動(dòng)劑。(REFLehmann等，J.Biol.Chem，2723137-40(1997))。為了鑒定LXRβ的拮抗劑或反激動(dòng)劑(inverseagonist)，當(dāng)有激動(dòng)劑時(shí)必須進(jìn)行基于功能的篩選以獲得增強(qiáng)的功能信息。然而，當(dāng)沒(méi)有24-羥基膽固醇時(shí)，對(duì)基礎(chǔ)無(wú)配體LXRβ的基于親和力的篩選獲得新的配體，該配體與無(wú)激動(dòng)劑基礎(chǔ)型LXRβ結(jié)合。在全細(xì)胞報(bào)道細(xì)胞測(cè)定(其中LXRβ活性驅(qū)動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)蛋白報(bào)道分子例如螢光素酶的表達(dá))和測(cè)量天然存在的LXRβ依賴性轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄作用的全細(xì)胞測(cè)定中，這些配體用作LXRβ的反激動(dòng)劑和拮抗劑，其EC50范圍介于50nM至50μM之間。通過(guò)穩(wěn)定LXRβ的無(wú)活性構(gòu)象(反激動(dòng)作用)和通過(guò)阻止天然存在的激動(dòng)劑與LXRβ結(jié)合(拮抗作用)，這些配體能夠機(jī)械地抑制活性。
實(shí)施例6篩選無(wú)配體型靶GPCR以鑒定抑制受體活性的配體已知人G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)m2毒蕈堿性乙酰膽堿受體(m2R)在心血管病程和精神分裂癥中起重要作用，因此m2R活性的調(diào)節(jié)劑是發(fā)現(xiàn)心血管和CNS疾病藥物的候選藥物(Brown，J.H. & P.Taylor(1996) Muscarinic Receptor Agonists and Agtagonists.ThePharmacological Basis of Therapeutics(Hardman，J.G.等編著)，第九版，New York，NYMcGraw-Hill)。全活性時(shí)，基礎(chǔ)型m2R必定因小分子激動(dòng)劑的結(jié)合才被激活，而乙酰膽堿是一種天然存在的m2R的小分子激動(dòng)劑(Ashkenazi，A. & E.G.Peralta(1994)Muscarinic AcetylcholineReceptors.Handbook of Receptors and Channels(S.J.Peroutka編著)，第1卷，Boca Raton，F(xiàn)LCRC Press)。為了鑒定m2R的拮抗劑或反激動(dòng)劑，當(dāng)有激動(dòng)劑時(shí)必須進(jìn)行基于功能的篩選以獲得增強(qiáng)的功能信息。然而，當(dāng)沒(méi)有乙酰膽堿時(shí)，對(duì)基礎(chǔ)無(wú)配體型m2R的基于親和力的篩選獲得新的配體，該配體與無(wú)激動(dòng)劑基礎(chǔ)型m2R結(jié)合。在測(cè)量細(xì)胞對(duì)添加的乙酰膽堿反應(yīng)的全細(xì)胞測(cè)定中，這些配體用作m2R的反激動(dòng)劑和拮抗劑，其EC50范圍介于100nM至50μM之間。通過(guò)穩(wěn)定m2R的無(wú)活性構(gòu)象(即反激動(dòng)作用)和阻止天然存在的激動(dòng)劑與m2R結(jié)合(即拮抗作用)，這些配體能夠機(jī)械地抑制活性。
實(shí)施例7篩選酶原型靶蛋白酶以鑒定抑制蛋白酶活性的配體在血液凝固過(guò)程中，蛋白酶活性的級(jí)聯(lián)啟動(dòng)催化凝塊的形成。這些蛋白酶的抑制劑可以是抗凝藥。在該級(jí)聯(lián)中，一種蛋白酶通過(guò)酶促切割激活其“下游”蛋白酶，導(dǎo)致低活性酶原型下游蛋白酶轉(zhuǎn)變成完全活化型(Davie等，Biochemistry，3010363-10370(1991))。酶促切割通常會(huì)導(dǎo)致內(nèi)部剪接或者從酶原釋放肽片段。采用基于功能的篩選蛋白酶解的高活性型凝固蛋白酶以發(fā)現(xiàn)抑制劑。然而，對(duì)低活性酶原型凝固蛋白酶的基于親和力的篩選可獲得新的配體，該配體與失活型蛋白酶結(jié)合。在凝血測(cè)定中，通過(guò)阻止蛋白水解的活化作用(例如經(jīng)上游蛋白酶加工)或在酰胺水解顯色測(cè)定中阻止底物肽的結(jié)合(通過(guò)直接競(jìng)爭(zhēng)或變構(gòu)抑制)，這些配體能夠作為該蛋白酶的功能抑制劑。
實(shí)施例8篩選失活突變型靶蛋白酶以鑒定抑制蛋白酶活性的配體人蛋白酶因子VIIa(fVIIa)是血液凝固級(jí)聯(lián)的關(guān)鍵組分，因此fVIIa蛋白酶的抑制劑可以是抗凝藥。采用基于功能的篩選在含有可溶性組織因子(sTF)的復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)了野生型高活性型fVIIa的抑制劑。然而，可以使用失活突變型fVIIa蛋白酶對(duì)fVIIa/sTF進(jìn)行基于親和力的篩選。失活突變體阻止親和篩選過(guò)程的結(jié)合反應(yīng)時(shí)的自動(dòng)蛋白水解，但它仍然能夠呈現(xiàn)幾乎所有關(guān)鍵活性部位殘基與配體結(jié)合。對(duì)失活突變型fVIIa/sTF復(fù)合物的親和篩選獲得新的配體，該配體與失活型蛋白酶結(jié)合。在酰胺水解顯色測(cè)定中，這些配體用作野生型高活性蛋白酶的功能抑制劑，其IC50范圍介于1-50μM之間。
實(shí)施例9鑒定作為激酶抑制劑的配體本發(fā)明可適用于篩選未活化激酶的抑制劑。令人驚奇的是，與依賴于需要使用活化激酶的功能性生化信息的常規(guī)篩選方法不同，篩選未活化激酶提供了更多的選擇性抑制劑。活化型激酶主要以稱為DFG-向內(nèi)構(gòu)象存在，而未活化型激酶主要以DFG-向外構(gòu)象存在。本發(fā)明也部分基于以下發(fā)現(xiàn)當(dāng)DFG以DFG-向外構(gòu)象存在時(shí)，在未活化型激酶中形成不同于ATP結(jié)合部位的變構(gòu)結(jié)合口袋(例如凹口袋)，并且當(dāng)這種變構(gòu)結(jié)合口袋被結(jié)合(例如被配體結(jié)合，例如被抑制劑結(jié)合)時(shí)，間接阻止了ATP與激酶上ATP部位的結(jié)合。當(dāng)沒(méi)有ATP和底物時(shí)，激酶未被活化，因而不能用基于活性的常規(guī)測(cè)定進(jìn)行篩選，令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是，激酶優(yōu)先呈DFG-向外構(gòu)象。由于變構(gòu)結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)特征在結(jié)構(gòu)上顯著不同于大多數(shù)ATP結(jié)合部位，因此通常發(fā)現(xiàn)該新的變構(gòu)結(jié)合口袋(例如凹口袋)的結(jié)合劑是更具選擇性的激酶抑制劑。
本發(fā)明可適用于鑒定新的抑制劑結(jié)合部位、設(shè)計(jì)激酶抑制劑和包含這些抑制劑的組合物的方法。試驗(yàn)激酶抑制劑的鑒定方法包括分別利用未活化參照激酶的三維結(jié)構(gòu)，例如絲氨酸/蘇氨酸激酶或酪氨酸激酶，例如p38MAPK或與其抑制劑例如BIRB 796或STI-571或其變異體(即Gleevec或其變異體)結(jié)合的c-ab1。根據(jù)參照激酶DFG(例如Asp-Phe/Leu/W-Gly，例如DFG、DLG或DWG)的位置，可以對(duì)未活化試驗(yàn)激酶的DFG基序進(jìn)行定位(例如通過(guò)多重序列比對(duì)和/或?qū)⒃囼?yàn)激酶重疊在參照激酶的結(jié)構(gòu)上)。參照激酶的一個(gè)實(shí)例是未活化胰島素激酶(1irk)。在1irk中，DFG基序?qū)?yīng)于Asp1150-Phe1151-Gly1152。參照激酶的另一個(gè)實(shí)例是c-ab1。1fpu(與STI-571變異體結(jié)合的c-ab1的PDB檢索代碼)或1iep(與STI-571結(jié)合的c-ab1的PDB檢索代碼)的DFG基序包括Asp381-Phe382-Gly383。中間殘基苯丙氨酸有時(shí)可以是色氨酸(Trp，W)或亮氨酸(Leu，L)。因此，DFG基序的氨基酸序列可以是DFG、DWG或DLG?？梢詫⒃囼?yàn)激酶(例如未活化試驗(yàn)激酶)與參照激酶(例如未活化參照激酶)進(jìn)行比對(duì)，因?yàn)樵谛蛄卸嘀乇葘?duì)中，DFG的位置是已知的(例如與相應(yīng)抑制劑BIRB796和STI-571變異體結(jié)合的p38MARK或c-ab1)，所以可以確定DFG基序在試驗(yàn)激酶中的位置。例如采用CLUSTALW、FASTA或HMMER可以完成多重序列比對(duì)。
參照激酶(例如未活化參照激酶)的α-C螺旋可以用于給試驗(yàn)激酶(例如未活化試驗(yàn)激酶)的α-C螺旋定位。例如在1IRK中，包含Val1050-Met1051的α螺旋對(duì)應(yīng)于α-C螺旋。在另一個(gè)實(shí)例中，1IEP的α-C螺旋包含Val289-Met290。由于α-C螺旋的位置是已知的(例如已經(jīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定了其三維結(jié)構(gòu))，因此序列的多重序列比對(duì)可以用來(lái)確定其它序列在其三維結(jié)構(gòu)尚未經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定的情況下α-C螺旋的位置。
一旦將DFG基序定位，就能確定DFG基序是否為向外構(gòu)象(DFG-向外)。如果激酶為全活性狀態(tài)，則活化環(huán)通常發(fā)現(xiàn)呈外展式或開(kāi)放式構(gòu)象而DFG基序通常發(fā)現(xiàn)呈DFG-向內(nèi)構(gòu)象(Knighton等，Science253407-414(1997)，Yamaguchi等，Nature 384484-489(1996))。本文描述的新方法用于鑒定呈DFG-向外構(gòu)象的DFG基序。為了確定試驗(yàn)激酶的DFG基序是否為DFG-向外構(gòu)象，就要測(cè)量試驗(yàn)激酶的DFG基序和α-C螺旋間的距離。準(zhǔn)確地說(shuō)，要測(cè)量下述兩組原子間的最短距離1)DFG基序的Phe/Leu/Trp殘基(中央殘基)的非主鏈重原子和2)α-C螺旋的任何殘基中的α碳。距離大于或等于11而小于或等于20(例如11.0、11.2、11.4、11.6、11.8、11.9、12、13、14、15、16、17、18、19?；?0)限定DFG基序?yàn)镈FG-向外構(gòu)象。例如1iep代表與其抑制劑STI-571變異體結(jié)合的c-ab1。在1iep中，Phe的非主鏈重原子與其α-C螺旋α碳之間的最短距離測(cè)量值為11.9，因此1iep的DFG基序認(rèn)定為DFG-向外。少有的情況是，參照激酶可發(fā)現(xiàn)呈DFG-向外構(gòu)象但為活化狀態(tài)。由于DFG-向外構(gòu)象仍然可以構(gòu)成抑制劑能夠結(jié)合的變構(gòu)口袋，因此使用DFG-向外構(gòu)象的活化參照激酶仍然可以用于鑒定激酶抑制劑。
當(dāng)DFG基序?yàn)镈FG-向外位置時(shí)，它可誘導(dǎo)凹口袋(例如變構(gòu)結(jié)合部位)的形成，其中凹口袋的表面部分由本文稱為X至Y的氨基酸構(gòu)成。凹口袋(例如變構(gòu)結(jié)合部位)，可以設(shè)計(jì)抑制劑與之結(jié)合，可以用比對(duì)法進(jìn)行定位。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)激酶抑制劑結(jié)合(例如試驗(yàn)激酶抑制劑結(jié)合)的凹口袋的定位可包括將試驗(yàn)激酶氨基酸序列X至Y與一個(gè)或多個(gè)參照激酶(其中的一些見(jiàn)表1)序列X至Y進(jìn)行比對(duì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，依據(jù)序列比對(duì)分析測(cè)定，X至Y可由蛋白質(zhì)Leu104至Ala111組成，其PDB檢索代碼是1kv1(鏈A)(見(jiàn)下表1)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，依據(jù)序列比對(duì)分析測(cè)定，參照激酶氨基酸X至Y可由蛋白質(zhì)Leu104至Ala111組成，其PDB檢索代碼是1kv2(鏈A)。依據(jù)序列比對(duì)分析測(cè)定(例如用蛋白質(zhì)序列比對(duì)的Smith-Waterman算法(例如參見(jiàn)Smith等，1981，J Mol Biol 147195-197和Pearson，1991，Genomics 11635-650)，試驗(yàn)激酶氨基酸X至Y由與蛋白質(zhì)Leu104至Ala111類似的氨基酸，其PDB檢索代碼是1kv1(鏈A)或1kv2(鏈A)；1iep(鏈A)、1iep(chain B)、1fpu(鏈A)或1fpu(鏈B)的Ile313至Asn322和/或1irk的Leu1073至Ala1080所組成。
“與……類似的氨基酸”，是指氨基酸殘基相似但不相同。因此，具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基可以說(shuō)是類似的，本領(lǐng)域也這樣定義。這些相似性使氨基酸能在激酶的三維結(jié)構(gòu)內(nèi)“類似地”起作用(例如在近似的三維中與其它氨基酸的相互作用也相似)。這些家族包括帶堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、帶酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、帶非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、帶β-分枝側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和帶芳族側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，例如，與賴氨酸類似的氨基酸是精氨酸或組氨酸。作為另一個(gè)例子，如本文所述天冬氨酸與谷氨酸類似。因此試驗(yàn)激酶與參照激酶氨基酸序列X至Y(例如參見(jiàn)表1)進(jìn)行比對(duì)(例如用蛋白質(zhì)序列比對(duì)的Smith-Waterman算法)的區(qū)(包括空位(gap))，是部分構(gòu)成DFG-向外構(gòu)象的DFG所誘導(dǎo)的凹結(jié)合口袋的同源區(qū)。通過(guò)鑒定同源的試驗(yàn)激酶氨基酸并因而鑒定DFG-向外誘導(dǎo)的試驗(yàn)激酶凹口袋，可以鑒定出變構(gòu)結(jié)合部位，進(jìn)而可以設(shè)計(jì)與試驗(yàn)激酶在該部位結(jié)合的抑制劑。在該同源位點(diǎn)內(nèi)，一定存在某些在試驗(yàn)激酶和參照激酶間類似的氨基酸。
一旦確定了未活化試驗(yàn)激酶的“同源”氨基酸，它們就可用來(lái)設(shè)計(jì)具有正確拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(形狀)和電子性能來(lái)擬合變構(gòu)結(jié)合部位(例如凹口袋)的支架。然后可以根據(jù)支架提供并合成文庫(kù)(例如質(zhì)量-編碼文庫(kù)，參見(jiàn)美國(guó)專利第6,207861號(hào)和第6,147,344號(hào))。當(dāng)變構(gòu)部位(例如當(dāng)DFG基序?yàn)镈FG-向外構(gòu)象時(shí)存在的)占優(yōu)勢(shì)(例如在沒(méi)有ATP和底物時(shí)試驗(yàn)激酶為未活化狀態(tài))的條件下，用未活化試驗(yàn)激酶對(duì)文庫(kù)(例如所提供的質(zhì)量-編碼文庫(kù)或所設(shè)計(jì)的質(zhì)量編碼-文庫(kù))進(jìn)行親和篩選，因而能鑒定出變構(gòu)配體(例如抑制劑)。
另一方面，在需要ATP位點(diǎn)結(jié)合劑的情況下，可以根據(jù)活化型試驗(yàn)激酶對(duì)文庫(kù)(例如質(zhì)量-編碼文庫(kù))進(jìn)行篩選。這樣，在試驗(yàn)激酶為活化狀態(tài)而且有能力結(jié)合ATP和/或底物的條件下，進(jìn)行文庫(kù)篩選。任選在有ATP和/或底物時(shí)進(jìn)行篩選。一種情形是，可以提供文庫(kù)。另一種情形是，可以根據(jù)DFG-向外構(gòu)象的試驗(yàn)激酶所形成的變構(gòu)部位的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)或電子性能設(shè)計(jì)文庫(kù)。無(wú)論何種情形，文庫(kù)成員都可以在合成后進(jìn)行質(zhì)量-編碼。
表1
*PDB檢索代碼因?yàn)槌Ｒ?guī)篩選方法通常采用需要主要為DFG-向內(nèi)構(gòu)象的活化激酶的功能測(cè)定，這樣篩選所鑒定的抑制劑大體上都靶向ATP結(jié)合部位，因而是ATP競(jìng)爭(zhēng)性的。以這種方式與抑制劑結(jié)合的激酶呈DFG-向內(nèi)構(gòu)象，這類抑制劑的缺點(diǎn)通常是選擇性降低，而副作用和毒性增加。設(shè)計(jì)激酶抑制劑或激酶結(jié)合劑的常用方法一直依賴于激酶呈激活狀態(tài)并具有DFG-向內(nèi)構(gòu)象。相反，本文描述的方法的優(yōu)點(diǎn)在于能設(shè)計(jì)DFG-向外構(gòu)象的未活化激酶的抑制劑，從而提供了具有更高選擇性的抑制劑。本文的方法能夠鑒定激酶抑制劑而不依賴呈激活狀態(tài)的激酶，如果需要，該方法也適用于呈激活狀態(tài)的激酶。
在DFG-向內(nèi)構(gòu)象中，中心殘基(Phe、Leu或Trp)全都埋在兩葉激酶之間的溝內(nèi)的疏水口袋里(Frantz，2002，Nature Reviews 1253)。然而，當(dāng)DFG基序?yàn)镈FG-向外構(gòu)象時(shí)，中心殘基(Phe、Leu或Trp)側(cè)鏈的一面有助于屏蔽抑制劑，而另一面向溶劑暴露。該中心殘基在結(jié)合二價(jià)離子時(shí)也同樣重要，大多數(shù)情況下，二價(jià)離子為激酶活性所需要。中心殘基協(xié)調(diào)天冬氨酸即DFG基序的第一個(gè)殘基的位置，該天冬氨酸是鎂(或錳)離子協(xié)調(diào)范圍的配體之一。該二價(jià)離子(鎂或錳)進(jìn)而協(xié)調(diào)ATP的β和γ磷酸酯，因而支持ATP結(jié)合。值得注意的是，二價(jià)離子并不絕對(duì)需要DFG與ATP磷酸酯相互作用。這種構(gòu)象露出激酶內(nèi)的大疏水口袋，該疏水口袋空間上不同于結(jié)合ATP的口袋。當(dāng)與這個(gè)大疏水口袋或變構(gòu)點(diǎn)結(jié)合時(shí)，抑制劑鎖緊DFG-向外構(gòu)象的DFG基序。這種構(gòu)象中DFG的物理定位(例如DFG-向外)阻止ATP結(jié)合，隨之抑制激酶功能。
可以從化合物的混合物(例如小分子化合物文庫(kù)，例如質(zhì)量-編碼組合文庫(kù))中篩選(例如用計(jì)算建模或親和篩選)那些能結(jié)合試驗(yàn)激酶(例如未活化試驗(yàn)激酶，例如沒(méi)有ATP和/或底物時(shí))的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)激酶的DFG為DFG-向外構(gòu)象時(shí)，激酶內(nèi)所形成的新變構(gòu)結(jié)合部位(例如凹口袋)，可以根據(jù)其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和靜電性能所決定的支架設(shè)計(jì)質(zhì)量-編碼文庫(kù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以提供質(zhì)量-編碼文庫(kù)并篩選抑制或調(diào)節(jié)激酶活性的激酶結(jié)合劑。在又一個(gè)實(shí)施方案中，可以用本發(fā)明的方法篩選各不相同的化合物，本發(fā)明的方法包括首先通過(guò)計(jì)算各化合物的分子量，然后將合適的化合物混合在一起，從而創(chuàng)建化合物的質(zhì)量-編碼混合物。根據(jù)本文所述方法鑒定的變構(gòu)部位(例如凹結(jié)合口袋)進(jìn)行計(jì)算機(jī)建模，也可設(shè)計(jì)結(jié)合變構(gòu)部位(例如凹口袋)的化合物，然后根據(jù)該信息合成潛在的結(jié)合劑。
美國(guó)專利第6,207,861號(hào)和第6,147,344號(hào)(參見(jiàn)上文)描述了篩選化合物文庫(kù)(例如根據(jù)擬合新變構(gòu)結(jié)合部位的支架而設(shè)計(jì)的質(zhì)量-編碼文庫(kù))的有效方法，該方法也適用于本文描述的方法。這些方法可適用于根據(jù)變構(gòu)部位或者根據(jù)靶向變構(gòu)部位的支架設(shè)計(jì)化合物的混合物。
靶抑制劑的合成靶(例如激酶)抑制劑可用有機(jī)合成文獻(xiàn)中很好建立的方法(Gazit等，1989，J.Med.Chem.322344-2352；McKenna等，2002，J.Med.Chem.452173-2184；Levitzki，2002，Eur.J.Cancer 38，增刊5S11-8)進(jìn)行合成。此外，化合物的混合物(包括質(zhì)量-編碼文庫(kù))的合成方法也有描述(Shipps等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci USA 9411833-11838；Shipps等，1996，Bioorg.Med.Chem.4655-657；Makara等，2002，Org.Lett.41751-1754；Makara，2001，J.Org.Chem.665783-5789)。用于合成本文描述的抑制劑化合物的合成化學(xué)轉(zhuǎn)化和保護(hù)基方法(保護(hù)和脫保護(hù))已為本領(lǐng)域所周知，包括例如在以下文獻(xiàn)中有描述R.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCH Publishers(1989)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第二版，John Wiley and Sons(1991)；L. Fieser和M. Fieser，F(xiàn)ieser and Fieser′sReagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1994)；和L.Paquette編著.，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，JohnWiley and Sons(1995)，及其后續(xù)版本。
本文所述的抑制劑可含一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱中心，并因此呈外消旋體或外消旋混合物、單一對(duì)映體、單一非對(duì)映體和非對(duì)映體混合物。這些化合物的所有這些異構(gòu)體明確地包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。本文描述的抑制劑可用多重互變異構(gòu)體代表，其全部均包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。所述抑制劑也可呈順式或反式或E-或Z-雙鍵異構(gòu)體。這些抑制劑的所有這些異構(gòu)體都明確地包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
用ALIS(參見(jiàn)上文)等方法篩選化合物的混合物(例如化合物文庫(kù)，例如組合文庫(kù)，例如質(zhì)量-編碼組合文庫(kù))，可以鑒定并選出抑制劑，所述方法是一種親和篩選方法，能鑒定未活化狀態(tài)激酶的變構(gòu)配體，例如，采用本領(lǐng)域已知的常規(guī)文庫(kù)篩選方法篩選化合物的混合物，也可以鑒定并選出抑制劑。
靶抑制測(cè)定可以對(duì)用上述方法選擇、鑒定或設(shè)計(jì)的潛在抑制劑進(jìn)行測(cè)定，以確定其抑制試驗(yàn)靶和/或取決于靶的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的能力。所述測(cè)定可以是體外或是體內(nèi)的?？捎貌煌椒y(cè)定抑制作用，所述方法包括例如磷酸化測(cè)定法、閃爍親近測(cè)定法(Amersham)、DELFIA測(cè)定法(Perkin Elmer)或連續(xù)分光光度測(cè)定法以及細(xì)胞功能和腫瘤細(xì)胞測(cè)定法(Spencer-Fry，J.等，1997，Journal of Biomolecular Screening 2(1)25-32；Braunwalder等，1996，Anal.Biochem.238；159-64；Barker等，1995，Biochemistry 3414843-51)。
本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)方法也可用來(lái)確定激酶的抑制作用。這些方法包括將放射性標(biāo)記ATP和底物加入到反應(yīng)混合物中，該反應(yīng)混合物由待抑制激酶、潛在抑制劑和提供類似于生理?xiàng)l件的組分組成。相對(duì)于對(duì)照，測(cè)量摻入到底物中的放射性標(biāo)記磷酸，則能夠提供鑒定潛在抑制劑為確認(rèn)的激酶抑制劑的信息。
對(duì)于所有潛在抑制劑和用本文描述的測(cè)定確認(rèn)的抑制劑，對(duì)所述潛在抑制劑的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步精修以改進(jìn)親和力、抑制活性和/或體內(nèi)特性總的來(lái)講是必需的。這可用藥物化學(xué)中所用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)完成這一步，并且可以通過(guò)本文描述的抑制劑篩選測(cè)定所提供的任一和/或所有步驟的連續(xù)重復(fù)來(lái)進(jìn)行。
靶抑制劑的用途通過(guò)本文描述的方法所發(fā)現(xiàn)的配體可用于抑制能活化的靶。例如，所述配體可以是G蛋白偶聯(lián)受體、磷酸酶、轉(zhuǎn)移酶、合酶、激酶、蛋白酶、核激素受體、二聚化受體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、異構(gòu)酶、聚合酶、蛋白-蛋白結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄因子、水解酶和膜結(jié)合蛋白和酶的抑制劑。若靶在一定程度上與疾病相關(guān)，可以將用本文描述的方法發(fā)現(xiàn)的配體配制成藥用組合物，用于診斷和/治療哺乳動(dòng)物例如人的疾病。這類疾病可包括癌癥、炎癥、神經(jīng)障礙、肥胖癥、衰老、病毒感染、細(xì)菌感染以及與生物戰(zhàn)攻擊有關(guān)的疾病。
用本文描述的方法所發(fā)現(xiàn)的配體也可用于抑制任何包含其序列與靶序列有大于90％、或大于85％、或大于70％同源性的靶的生物活性。本文所述的抑制劑也可用于抑制其序列與激酶亞序列(包括本文提及的激酶的亞序列)有大于90％、或大于85％、或大于70％同源性的任何靶(例如酶，例如激酶)、包括任何靶(例如酶，例如激酶)的亞序列或其變異體的生物活性。這些亞序列優(yōu)選包含其序列與酶(例如激酶)的活性部位或亞結(jié)構(gòu)域有大于90％、或大于85％、或大于70％同源性的序列。這些亞序列或其變異體至少包含約250個(gè)氨基酸或至少包含約120個(gè)氨基酸。
激酶抑制劑的用途用本文描述的方法鑒定的抑制劑可用于抑制一種或多種酶的激酶活性。準(zhǔn)確地說(shuō)，本文所述的化合物可用作酪氨酸、絲氨酸/蘇氨酸、脂質(zhì)或組氨酸激酶的抑制劑。本文所述的化合物和組合物所抑制的同時(shí)也適用本文所述的方法的激酶(例如試驗(yàn)激酶)的實(shí)例包括但不限于絲氨酸激酶、蘇氨酸激酶、酪氨酸激酶和/或脂質(zhì)激酶。能夠設(shè)計(jì)抑制劑的潛在試驗(yàn)激酶的具體實(shí)例見(jiàn)表2?？梢院Y選這些激酶的基礎(chǔ)和活化兩種狀態(tài)。用本文所述的方法鑒定的抑制劑適用于治療包括一種或多種上述蛋白激酶在內(nèi)的疾病或疾病癥狀。在一個(gè)實(shí)施方案中，用本文所述的方法鑒定的抑制劑特別適合抑制或治療由激酶介導(dǎo)的疾病或疾病癥狀。
本文所述的抑制劑也用于抑制任何包含其序列與激酶(包括本文所述的激酶)序列有大于90％、或大于85％、或大于70％同源性的酶(例如激酶)的生物活性。本文所述的抑制劑也用于抑制任何包含其序列與激酶亞序列(包含本文提及的激酶的亞序列)有大于90％，或大于85％，或大于70％同源性的酶(例如激酶)、包括所述激酶的亞序列或其變異體的生物活性。這些亞序列優(yōu)選與酶(例如激酶)的活性部位或亞結(jié)構(gòu)域有大于90％、或大于85％、或大于70％序列同源性的亞序列。這些亞序列或其變異體至少包含約250個(gè)氨基酸或至少包含約120個(gè)氨基酸。
本文所述的抑制劑可用于抑制激酶活性。因此，本發(fā)明的化合物、組合物和方法可用于治療哺乳動(dòng)物(特別是人)的激酶介導(dǎo)的疾病或疾病癥狀。激酶介導(dǎo)的疾病是指蛋白激酶參與疾病過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、介導(dǎo)、調(diào)節(jié)或調(diào)控的那些疾病。激酶介導(dǎo)的疾病的實(shí)例包括但不限于癌癥、炎癥、神經(jīng)障礙和肥胖癥。
表2
本文所引用的全部文獻(xiàn)，無(wú)論是印刷版的、電子版的、計(jì)算機(jī)可讀的儲(chǔ)存媒介或其它形式，全都通過(guò)引用結(jié)合到本文中，其中包括但不限于文摘、論文、雜志、刊物、教科書(shū)、條約、因特網(wǎng)站、數(shù)據(jù)庫(kù)、軟件包、專利和專利刊物。業(yè)已描述了本發(fā)明的許多實(shí)施方案。不用說(shuō)，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改。因此，其它實(shí)施方案都是在所附權(quán)利要求書(shū)和上文的發(fā)明概述的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種篩選針對(duì)未活化型靶部分的化合物的混合物的方法，所述方法包括a.提供化合物的混合物；b.將所述混合物與所述未活化型靶部分一起孵育以形成化合物靶復(fù)合物；c.使化合物靶復(fù)合物與未結(jié)合的化合物和靶分離；d.使化合物靶復(fù)合物解離；e.用質(zhì)譜儀鑒定曾經(jīng)與所述靶結(jié)合但現(xiàn)在已解離的化合物，其中經(jīng)鑒定的化合物能與所述靶部分結(jié)合，其親和力Kd介于1pM和50μM之間。
2.一種篩選由針對(duì)不同型的靶部分的混合物的化合物組成的混合物的方法，所述方法包括a.提供化合物的混合物；b.提供配體-結(jié)合型靶部分和配體-游離型靶部分的混合物；c.將所述化合物的混合物與所述靶部分的混合物一起孵育以形成化合物靶復(fù)合物；d.使化合物靶復(fù)合物與未結(jié)合的化合物和靶部分分離；e.使化合物靶復(fù)合物解離；其中與所述靶分離的解離化合物稱為新配體；f從化合物靶復(fù)合物中存在的化合物中鑒定出結(jié)合任何型靶部分的新配體，即將化合物靶復(fù)合物通過(guò)質(zhì)譜儀以鑒定結(jié)合任何型靶部分的配體，其中經(jīng)鑒定的配體能與所述靶部分結(jié)合，其親和力Kd介于1pM和50μM之間；g.將步驟f中所鑒定的新配體與配體-結(jié)合型靶部分和配體-游離型靶部分一起孵育，其中重復(fù)步驟e至f以描繪出哪些化合物與配體-結(jié)合型靶部分結(jié)合，哪些化合物與配體-游離型靶部分結(jié)合。
3.權(quán)利要求1的方法，其中對(duì)所述化合物的混合物進(jìn)行質(zhì)量-編碼以確保至少90％的所述化合物具有獨(dú)特的可用質(zhì)譜儀檢測(cè)的離子質(zhì)量。
4.權(quán)利要求2的方法，其中對(duì)所述化合物的混合物進(jìn)行質(zhì)量-編碼以確保至少90％的所述化合物具有獨(dú)特的可用質(zhì)譜儀檢測(cè)的離子質(zhì)量。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述靶型的混合物包括未活化型、失活型和活化型。
6.權(quán)利要求2的方法，其中所述靶型的混合物包括單體型和多聚體型。
7.權(quán)利要求2的方法，其中所述靶型的混合物包括配體-結(jié)合型和配體-游離型。
8.權(quán)利要求2的方法，其中所述靶型的混合物包括輔因子-結(jié)合型和輔因子-游離型。
9.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述靶型的混合物包括未活化型和活化型。
10.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述靶型的混合物包括單體型和多聚體型。
11.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述靶型的混合物包括配體-結(jié)合型和配體-游離型。
12.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述靶型的混合物包括輔因子-結(jié)合型和輔因子-游離型。
13.一種發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)激酶抑制劑的方法，所述方法包括a)在沒(méi)有ATP和/或肽底物時(shí)，將所述試驗(yàn)激酶與化合物的質(zhì)量-編碼文庫(kù)一起孵育；b)使結(jié)合化合物與未結(jié)合化合物分離；c)用質(zhì)譜儀鑒定所述結(jié)合化合物；d)用激酶抑制測(cè)定證明所述結(jié)合化合物的試驗(yàn)激酶抑制活性。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述試驗(yàn)激酶是全長(zhǎng)激酶。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述試驗(yàn)激酶包括含催化結(jié)構(gòu)域的全長(zhǎng)激酶的截短片段。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述激酶是激酶變異體或激酶突變體。
17.權(quán)利要求13的方法，其中采用大小排阻層析法使結(jié)合化合物與未結(jié)合化合物分離。
18.權(quán)利要求13的方法，其中通過(guò)與質(zhì)量-編碼化合物的數(shù)據(jù)庫(kù)相比較來(lái)進(jìn)行質(zhì)譜法。
19.權(quán)利要求13的方法，其中所述試驗(yàn)激酶是未活化的。
20.權(quán)利要求13的方法，其中所述試驗(yàn)激酶呈表現(xiàn)出低催化活性的基礎(chǔ)型。
21.權(quán)利要求13的方法，其中所述試驗(yàn)激酶是活化的。
22.權(quán)利要求14的方法，其中所述試驗(yàn)激酶相對(duì)于其生理激活狀態(tài)是部分活化的。
23.一種設(shè)計(jì)抑制劑的方法，所述方法包括a)將未活化試驗(yàn)激酶與已知其三維結(jié)構(gòu)的未活化參照激酶進(jìn)行比較；b)鑒定變構(gòu)結(jié)合部位；c)根據(jù)所述變構(gòu)結(jié)合部位設(shè)計(jì)抑制劑。
24.權(quán)利要求23的方法，其中步驟c)包括下述步驟c1)根據(jù)所述變構(gòu)結(jié)合部位的拓?fù)湫再|(zhì)和電子性能設(shè)計(jì)支架；c2)根據(jù)所述支架設(shè)計(jì)質(zhì)量-編碼文庫(kù)。
25.權(quán)利要求23的方法，其中步驟c)包括提供質(zhì)量-編碼文庫(kù)。
26.權(quán)利要求24的方法，所述方法還包括下述步驟d)從質(zhì)量-編碼文庫(kù)中篩選結(jié)合所述試驗(yàn)激酶的化合物；和e)確定激酶結(jié)合劑是否抑制所述試驗(yàn)激酶，從而設(shè)計(jì)試驗(yàn)激酶抑制劑。
27.權(quán)利要求25的方法，其中篩選包括用試驗(yàn)激酶進(jìn)行親和篩選。
28.權(quán)利要求23的方法，其中所述參照激酶選自具有以下蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)識(shí)符的激酶1kv1鏈a和1kv2鏈a。
29.權(quán)利要求23的方法，其中所述參照選自具有以下蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)識(shí)符的激酶1iep鏈a、1iep鏈b、1fpu鏈a和1fpu鏈b。
30.權(quán)利要求23的方法，其中所述參照激酶具有蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)識(shí)符1irk。
31.權(quán)利要求23的方法，其中所述參照選自具有以下蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)識(shí)符的激酶1g3n鏈a和1g3n鏈b。
32.權(quán)利要求23的方法，其中所述變構(gòu)結(jié)合部位在空間上不同于ATP結(jié)合部位和活化環(huán)。
33.權(quán)利要求23的方法，其中所述變構(gòu)結(jié)合部位通過(guò)定位DFG基序進(jìn)行鑒定。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述DFG基序包括DWG序列或DLG序列。
35.權(quán)利要求33的方法，其中所述DFG基序與α-C螺旋的距離大于11而小于20，并且所述DFG基序是DFG-向外構(gòu)象。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述α-C螺旋在相對(duì)的三維位置與含有Val1050-Met1051的胰島素受體激酶α-C螺旋同源。
37.權(quán)利要求35的方法，其中所述α-C螺旋在相對(duì)的三維位置與含Val289-Met290的c-ab1α-C螺旋同源。
38.權(quán)利要求23的方法，所述方法還包括確定潛在的結(jié)合劑是否抑制試驗(yàn)激酶。
39.一種設(shè)計(jì)試驗(yàn)激酶抑制劑的方法，所述方法包括a)將試驗(yàn)激酶與已知其三維結(jié)構(gòu)的參照激酶進(jìn)行比較；b)鑒定變構(gòu)結(jié)合部位；c)設(shè)計(jì)靶向變構(gòu)結(jié)合部位的支架；d)根據(jù)支架提供化合物的混合物；e)通過(guò)對(duì)所述激酶進(jìn)行親和篩選來(lái)鑒定變構(gòu)部位的配體；f)在激酶測(cè)定中證明所述配體的激酶抑制活性。
40.權(quán)利權(quán)利39的方法，其中所述試驗(yàn)激酶和參照激酶是未活化的。
41.權(quán)利要求39的方法，其中所述試驗(yàn)激酶是全長(zhǎng)激酶。
42.權(quán)利要求39的方法，其中所述試驗(yàn)激酶包括含催化結(jié)構(gòu)域的全長(zhǎng)激酶的截短片段。
43.權(quán)利要求39的方法，其中所述試驗(yàn)激酶呈表現(xiàn)出低催化活性的基礎(chǔ)型。
44.權(quán)利要求39的方法，其中所述試驗(yàn)激酶是活化的。
45.權(quán)利要求39的方法，其中所述試驗(yàn)激酶相對(duì)于其生理激活狀態(tài)是部分活化的。
46.權(quán)利要求39的方法，其中步驟c)包括根據(jù)變構(gòu)結(jié)合部位的拓?fù)湫再|(zhì)和電子性能設(shè)計(jì)支架。
47.權(quán)利要求39的方法，其中所述基于支架的化合物的混合物由潛在激酶配體的質(zhì)量-編碼文庫(kù)組成。
48.權(quán)利要求39的方法，其中步驟e)包括下述步驟e1)將試驗(yàn)激酶與質(zhì)量-編碼文庫(kù)一起孵育以使所述文庫(kù)的配體與試驗(yàn)激酶結(jié)合；e2)使結(jié)合激酶的配體與未結(jié)合配體分離；e3)使激酶與結(jié)合配體分離；e4)用質(zhì)譜法鑒定所結(jié)合的化合物。
49.一種設(shè)計(jì)抑制劑的方法，所述方法包括a)將試驗(yàn)激酶與已知其三維結(jié)構(gòu)的參照激酶進(jìn)行比較；b)鑒定變構(gòu)結(jié)合部位；c)設(shè)計(jì)靶向變構(gòu)結(jié)合部位的支架；d)根據(jù)支架提供化合物的混合物。
50.權(quán)利要求49的方法，所述方法還包括e)通過(guò)對(duì)所述激酶進(jìn)行親和篩選來(lái)鑒定變構(gòu)部位的配體。
51.權(quán)利要求50的方法，所述方法還包括f)證明激酶的抑制活性。
52.一種設(shè)計(jì)試驗(yàn)激酶抑制劑的方法，所述方法包括a)用參照激酶的三維結(jié)構(gòu)確定DFG基序在試驗(yàn)激酶中的位置；b)通過(guò)DFG基序?yàn)镈FG-向外構(gòu)象來(lái)鑒定試驗(yàn)激酶中所形成的變構(gòu)結(jié)合部位，其中所述變構(gòu)部位在空間上不同于ATP結(jié)合部位和活化環(huán)；c)根據(jù)變構(gòu)結(jié)合部位設(shè)計(jì)支架；d)根據(jù)支架提供化合物的混合物；e)從化合物的混合物中篩選激酶結(jié)合劑；f)使激酶結(jié)合劑與非結(jié)合劑分離；g)用質(zhì)譜法鑒定激酶結(jié)合劑；h)任選在條件和時(shí)間都充分容許結(jié)合劑與激酶結(jié)合的情況下，使所述結(jié)合劑與所述激酶接觸；e)證明所述結(jié)合劑使所述激酶變得無(wú)功能或者功能減弱；從而鑒定出試驗(yàn)激酶的抑制劑。
53.一種設(shè)計(jì)試驗(yàn)激酶抑制劑的方法，所述方法包括a)用參照激酶的三維結(jié)構(gòu)確定DFG基序在試驗(yàn)激酶中的位置；b)鑒定由DFG基序?yàn)镈FG-向外構(gòu)象所形成的變構(gòu)結(jié)合部位，其中所述變構(gòu)結(jié)合部位在空間上不同于ATP結(jié)合部位和活化環(huán)；c)根據(jù)變構(gòu)結(jié)合部位設(shè)計(jì)支架；d)根據(jù)支架合成化合物的混合物；e)通過(guò)針對(duì)激酶親和篩選化合物的混合物來(lái)鑒定變構(gòu)部位的配體；g)證明激酶的抑制活性。
54.權(quán)利要求41、42、49、52或53中任一項(xiàng)的方法，其中所述試驗(yàn)激酶是未活化的。
55.權(quán)利要求39、49、52或53中任一項(xiàng)的方法，其中所述參照激酶選自具有以下蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)識(shí)符的激酶1kv1鏈a和1kv2鏈a。
56.權(quán)利要求39、49、52或53中任一項(xiàng)的方法，其中所述參照激酶選自具有以下蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)識(shí)符的激酶1iep鏈a、1iep鏈b、1fpu鏈a和1fpu鏈b。
57.權(quán)利要求39、49、52或53中任一項(xiàng)的方法，其中所述參照激酶具有蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)識(shí)符1irk。
58.權(quán)利要求39、49、52或53中任一項(xiàng)的方法，其中所述參照激酶選自具有以下蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)識(shí)符的激酶1g3n鏈a和1g3n鏈b。
59.權(quán)利要求39、49或52中任一項(xiàng)的方法，其中所述變構(gòu)結(jié)合部位在空間上不同于ATP結(jié)合部位和活化環(huán)。
60.權(quán)利要求13、23、39、49、52或53中任一項(xiàng)的方法，其中所述試驗(yàn)激酶是p38MAP激酶。
61.權(quán)利要求13、23、39、49、52或53中任一項(xiàng)的方法，其中所述試驗(yàn)激酶是c-ab1。
62.一種鑒定試驗(yàn)激酶抑制劑的方法，所述方法包括a)提供與試驗(yàn)激酶結(jié)合而不與試驗(yàn)激酶上的ATP結(jié)合部位物理結(jié)合的試驗(yàn)化合物，其中當(dāng)所述試驗(yàn)激酶的DFG基序?yàn)镈FG-向外位置時(shí)，所述試驗(yàn)化合物與所存在的變構(gòu)部位結(jié)合；b)確定ATP是否能與所述試驗(yàn)激酶上的ATP結(jié)合部位結(jié)合，其中由于試驗(yàn)化合物與試驗(yàn)激酶的變構(gòu)部位的結(jié)合而間接干擾了ATP與試驗(yàn)激酶的結(jié)合，鑒定出試驗(yàn)化合物為激酶抑制劑；c)任選在有或沒(méi)有結(jié)合試驗(yàn)激酶的抑制劑時(shí)進(jìn)行激酶測(cè)定，其中相對(duì)于沒(méi)有試驗(yàn)化合物時(shí)的激酶活性，有試驗(yàn)化合物時(shí)激酶活性降低，進(jìn)一步證明試驗(yàn)化合物就是試驗(yàn)激酶的抑制劑。
63.一種鑒定試驗(yàn)激酶抑制劑的方法，所述方法包括a)提供與試驗(yàn)激酶結(jié)合而不與試驗(yàn)激酶上的ATP結(jié)合部位物理結(jié)合的化合物；b)確定ATP是否能與試驗(yàn)激酶上的ATP結(jié)合部位結(jié)合，其中由于試驗(yàn)化合物與試驗(yàn)激酶的結(jié)合而干擾了ATP與試驗(yàn)激酶的結(jié)合，鑒定出試驗(yàn)激酶的抑制劑，其中所述試驗(yàn)化合物限定了試驗(yàn)激酶的DFG基序?yàn)镈FG-向外位置。
64.一種鑒定在空間上不同于ATP結(jié)合部位和活化環(huán)的變構(gòu)結(jié)合部位的方法，所述方法包括a)將試驗(yàn)激酶與已知其三維結(jié)構(gòu)的參照激酶進(jìn)行比較；b)根據(jù)DFG基序在參照激酶中的位置確定試驗(yàn)激酶中DFG基序的位置；c)測(cè)量α-C螺旋中α碳?xì)埢c試驗(yàn)激酶DFG基序的苯丙氨酸、亮氨酸或色氨酸的非主鏈重原子間的最短距離，其中大于11而小于20的距離就是試驗(yàn)激酶DFG基序?yàn)镈FG-向外構(gòu)象的特征；d)通過(guò)確定試驗(yàn)激酶的氨基酸位置類似于參照激酶的氨基酸X至Y，鑒定部分構(gòu)成由于DFG基序?yàn)镈FG-向外構(gòu)象所形成的凹口袋的氨基酸，其中通過(guò)對(duì)凹口袋的定位來(lái)鑒定變構(gòu)結(jié)合部位。
65.一種根據(jù)試驗(yàn)激酶抑制劑鑒定在空間上不同于ATP結(jié)合部位和活化環(huán)的變構(gòu)結(jié)合部位的方法，所述方法包括a)通過(guò)將試驗(yàn)激酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)與已知其三維結(jié)構(gòu)的激酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較來(lái)確定DFG基序在試驗(yàn)激酶中的位置；b)當(dāng)DFG基序?yàn)镈FG-向外位置時(shí)允許試驗(yàn)化合物與變構(gòu)部位結(jié)合；c)確定試驗(yàn)化合物是否抑制試驗(yàn)激酶的活性；d)確定試驗(yàn)化合物是否在DFG基序?yàn)镈FG-向外構(gòu)象時(shí)所形成的變構(gòu)部位結(jié)合試驗(yàn)激酶，其中試驗(yàn)化合物的結(jié)合致使DFG基序被限定為DFG-向外位置，從而鑒定出試驗(yàn)激酶的變構(gòu)結(jié)合部位。
66.權(quán)利要求33、52、53、64或65中任一項(xiàng)的方法，其中對(duì)DFG基序的定位包括多重序列比對(duì)。
67.權(quán)利要求65的方法，其中確定試驗(yàn)化合物是否抑制試驗(yàn)激酶的活性，包括激酶測(cè)定。
68.權(quán)利要求65的方法，其中確定試驗(yàn)化合物是否在DFG基序?yàn)镈FG-向外構(gòu)象時(shí)所形成的變構(gòu)部位結(jié)合試驗(yàn)激酶，包括標(biāo)記試驗(yàn)化合物。
69.權(quán)利要求65的方法，其中確定試驗(yàn)化合物是否在DFG基序?yàn)镈FG-向外構(gòu)象時(shí)所形成的變構(gòu)部位結(jié)合試驗(yàn)激酶，包括制備并分析與激酶結(jié)合的試驗(yàn)化合物的X-射線晶體。
70.一種抑制劑，所述抑制劑為權(quán)利要求13、23、39、49、52、53、62或63中任一項(xiàng)的方法中的抑制劑。
71.權(quán)利要求70的抑制劑，其中所述抑制劑不是p38MAPK抑制劑、c-ab1抑制劑或胰島素受體激酶抑制劑。
72.權(quán)利要求70的抑制劑，其中所述抑制劑抑制p38MAPK。
73.權(quán)利要求70的抑制劑，其中所述抑制劑抑制c-ab1。
74.權(quán)利要求70的抑制劑，其中所述抑制劑抑制胰島素受體激酶。
75.一種藥用組合物，所述組合物包含權(quán)利要求63或64的抑制劑。
76.一種試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求70的任一抑制劑。
77.一種抑制患者體內(nèi)激酶活性的方法，所述方法包括給予所述患者包含權(quán)利要求70的抑制劑的化合物的步驟。
78.權(quán)利要求77的方法，其中所述患者是哺乳動(dòng)物。
79.權(quán)利要求78的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
80.一種治療患者的激酶介導(dǎo)的疾病或疾病癥狀的方法，所述方法包括給予所述患者包含權(quán)利要求70的抑制劑的化合物。
81.權(quán)利要求80的方法，其中所述患者是哺乳動(dòng)物。
82.權(quán)利要求81的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
83.一種治療患者的疾病或疾病癥狀的方法，所述方法包括給予所述患者包含權(quán)利要求70的抑制劑的化合物的步驟。
84.權(quán)利要求83的方法，其中所述患者是哺乳動(dòng)物。
85.權(quán)利要求84的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
86.一種制備藥用組合物的方法，所述方法包括將權(quán)利要求70的抑制劑與一種或多種藥物可接受的載體混合。
87.權(quán)利要求70的抑制劑，其中還包括聯(lián)合應(yīng)用其它治療藥。
88.權(quán)利要求13、23、39、42、44、49、52或53中任一項(xiàng)的方法，其中DFG基序?yàn)镈FG-向外位置時(shí)誘導(dǎo)形成凹口袋，其中所述凹口袋的表面部分由氨基酸X至Y所構(gòu)成，其中X是部分構(gòu)成凹口袋的連續(xù)氨基酸序列中的第一個(gè)氨基酸，Y是部分構(gòu)成凹口袋的連續(xù)氨基酸序列中的最后一個(gè)氨基酸。
89.權(quán)利要求88的方法，其中氨基酸X至Y由PDB檢索代碼為1kv2的蛋白質(zhì)的Leu104至Ala111所組成。
90.權(quán)利要求88的方法，其中氨基酸X至Y由與PDB檢索代碼為1kv2的蛋白質(zhì)的Leu104至Ala111同源的氨基酸所組成，該同源性依據(jù)序列比對(duì)分析確定。
全文摘要
描述了靶(例如生物分子)的通用篩選系統(tǒng)。這種篩選可用來(lái)發(fā)現(xiàn)許多化合物，這些化合物能與天然存在的低活性或無(wú)活性狀態(tài)靶結(jié)合并且可作為靶功能抑制劑，如同在后續(xù)生物測(cè)定中所見(jiàn)到的一樣。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1791671SQ200480013273
公開(kāi)日2006年6月21日 申請(qǐng)日期2004年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月21日
發(fā)明者H·M·納什, K·馬森, C·莫亞萊米, E·溫特納, D·弗林, M·凱利, S·亞當(dāng)斯, Z·鄭, G·馬卡拉 申請(qǐng)人:先靈公司