專利名稱：：內(nèi)含rna病毒核酸的病毒樣顆粒及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及病毒基因工程領(lǐng)域，具體是一種內(nèi)含RNA病毒核酸的病毒樣顆粒及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus，HCV)、人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)、嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(Severeacuterespiratorysyndromecoronavirus，SARS-CoV)等RNA病毒是一類可致人類嚴(yán)重疾病的病原體，目前，針對這些病原體的檢測主要有兩類方法(CollinsML，etal.，NucleicAcidsRes.1997，25(15)2979-84；MulderJ，etal.，JClinMicrobiol.1994，32(2)292-300)，一類是基于抗原抗體的免疫測定方法，主要是檢測標(biāo)本中的病毒抗原或機(jī)體產(chǎn)生的抗體。另一類是應(yīng)用核酸檢測病人標(biāo)本中病毒的RNA。免疫學(xué)檢測是診斷病毒的常規(guī)方法，但是，相對于核酸檢測，免疫學(xué)檢測存在著窗口期長，且不能反映病毒感染者體內(nèi)病毒的復(fù)制情況等缺點(diǎn)。而核酸檢測由于其敏感性和特異性高，檢測窗口期短，又能夠直接反映感染體內(nèi)病毒載量(vanGemenB，etal.，JVirolMethods.1994(2)；49157-168)，因此，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于血液篩查，母嬰垂直感染診斷，病人的預(yù)后及抗病毒治療療效評估等各個方面(ZhangM，VersalovicJ，AmJClinPathol.2002，118SupplS26-32)。多種測定病毒RNA的方法已經(jīng)在臨床中得到應(yīng)用(JournotV，etal.，ControlClinTrials.2001，22(6)639-658)，如競爭性逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、核酸序列依賴的擴(kuò)增技術(shù)(nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA)、支鏈DNA(bDNA)信號放大系統(tǒng)和Real-time熒光定量PCR等。這些定量檢測方法的過程基本上為(1)樣本采集，(2)核酸提取(3)逆轉(zhuǎn)錄(4)擴(kuò)增(bDNA除外)(5)檢測。在樣本檢測過程中，上述技術(shù)容易受到以下多種因素的影響(YamWC，etal.，JCloinMicrobiol.2003，41(10)4521-4524)(1)樣本中的許多物質(zhì)，如糞便標(biāo)本中的膽鹽和多糖，血液中的血紅素及尿中的尿素，會對PCR反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用，機(jī)制可能是干擾Taq酶的聚合作用。(2)樣本處理過程中的某些因素，如分離過程中殘留的提取試劑如乙醇、酚、SDS等也能夠抑制擴(kuò)增反應(yīng)。人為操作的失誤會造成樣本核酸的丟失，使目的核酸量減少而導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性結(jié)果。(3)反應(yīng)體系的影響因素逆轉(zhuǎn)錄過程中的酶的活性偏低，不合適的貯藏條件所造成檢測的目的片段降解，引物設(shè)計不合理，熱循環(huán)過程未達(dá)到理想狀態(tài)等因素也會導(dǎo)致檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確。因此，歐洲標(biāo)準(zhǔn)委員會(TheEuropeanStandardsCommittee)和國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(InternationalStandardOrganization)建議，在做核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)時，除了將每一步中的錯誤影響因素降到最低外，還需要有嚴(yán)格的質(zhì)量控制措施，包括假陽性質(zhì)控，假陰性質(zhì)控和定量檢測的質(zhì)控(HoorfarJ，etal.，JClinMicrobiol.2003，41(12)5835)。此外，一個外標(biāo)定量測定方法還需要一個標(biāo)準(zhǔn)系列，用來確定同時處理的臨床標(biāo)本病毒含量。目前，國內(nèi)常使用的實(shí)時熒光定量PCR方法，基本上都為外標(biāo)定量方法。由于病毒潛在的傳染危險性及其RNA核酸的不穩(wěn)定性，目前應(yīng)用的質(zhì)控物如滅活的病毒顆粒，cDNA，質(zhì)粒DNA以及裸露的RNA，都難以達(dá)到此要求，所以研制無生物傳染危險性及穩(wěn)定的質(zhì)控物和標(biāo)準(zhǔn)品，不但對病毒RNA的RT-PCR檢測，而且對相應(yīng)的RT-PCR試劑盒的評價都具有重要意義。有人應(yīng)用牛腹瀉病毒(BVDV)作為檢測HCV的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品(vanGemenB，etal.，JVirolMethods.1994，49(2)157-167)，或者用HCV病毒顆粒作為檢測HCVRNA的標(biāo)準(zhǔn)品代替WHO提供的HCV標(biāo)準(zhǔn)品(PickettGG，PeabodyDS，NucleicAcidsRes.1993，21(19)4621-4626)，或者用HIV病毒顆粒作為通用的病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)品，但是，這些技術(shù)無法克服病毒顆粒傳染性、病毒顆粒制備運(yùn)輸困難等問題，也就是說病毒顆粒不是理想的標(biāo)準(zhǔn)品。已知某些RNA病毒如MS2噬菌體、煙草花葉病毒(TMV)的外殼可以使其RNA基因組耐受RNase。因此，如將作為標(biāo)準(zhǔn)品的RNA序列包裹到這些病毒外殼內(nèi)，就可以使特定的RNA序列免受環(huán)境中RNase的降解，同時，在應(yīng)用過程中還可以模擬病毒顆粒監(jiān)測核酸提取過程中的病毒裂解效率。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，制備內(nèi)含RNA病毒樣顆粒成為可能。MS2噬菌體屬于正極性單鏈RNA球形病毒，基因組全長3569nt，編碼成熟酶蛋白、包膜蛋白、復(fù)制酶蛋白和裂解蛋白等四種蛋白質(zhì)分子。噬菌體由180包膜蛋白單體、一分子成熟酶蛋白和一分子基因組RNA組成。在較早期的MS2噬菌體包膜蛋白的研究中，發(fā)現(xiàn)包膜蛋白與操縱子RNA序列有特異性相互作用，這種作用可引發(fā)噬菌體外殼的組裝，同時，將噬菌體基因組RNA包裝到包膜內(nèi)(Yen-LiebermanB，etal.，JClinMicrobiol.1996，34(11)2695-2701)。因此，如果將特定病毒RNA的cDNA克隆于MS2噬菌體包膜蛋白基因序列cDNA下游，然后將終止子插入外源cDNA下游，轉(zhuǎn)錄后得到帶有噬菌體操縱子RNA序列的特定病毒RNA轉(zhuǎn)錄本，操縱子RNA序列就可以引發(fā)噬菌體包膜蛋白組裝成外殼，并將攜帶有特定病毒RNA序列的部分噬菌體基因組包裝到包膜內(nèi)，構(gòu)成噬菌體病毒樣顆粒。不過，如果僅僅將特定病毒RNA的cDNA序列克隆于操縱子序列cDNA下游，然后用雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)噬菌體包膜蛋白后，所組裝噬菌體樣顆粒有缺陷，即缺乏成熟特性。這種有缺陷的噬菌體病毒樣顆粒不能防止RNase對內(nèi)包特定RNA的降解作用(DesireN，etal.，JClinMicrobiol.2001，39(4)1303-1310)，而且，組裝所得噬菌體樣顆粒內(nèi)含有宿主即大腸桿菌的核糖體RNA(rRNA)。主要原因是宿主rRNA前體中含有與MS2操縱子同源的序列，其rrnE轉(zhuǎn)錄本、rrnH轉(zhuǎn)錄本和rrnB轉(zhuǎn)錄本內(nèi)部16S與23SRNA序列之間的間隔序列等都有與MS2操縱子RNA同源的序列，這些同源序列可引發(fā)宿主rRNA的包裝。在構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體時，需將噬菌體成熟酶蛋白、包膜蛋白基因序列cDNA克隆表達(dá)于表達(dá)載體啟動子下游，這樣，經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)后，所表達(dá)的包膜蛋白不僅僅作為病毒樣顆粒的結(jié)構(gòu)成分，而且可作為基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子和pac信號對表達(dá)過程進(jìn)行調(diào)節(jié)(BagnarelliP，etal.，JMedVirol.1991，34(2)89-95)，使包膜蛋白的表達(dá)和RNA的轉(zhuǎn)錄協(xié)調(diào)一致，此時，組裝所得噬菌體樣顆粒具有成熟特性，從而具有RNase抗性。同時，轉(zhuǎn)錄表達(dá)協(xié)調(diào)進(jìn)行特異性識別包裝噬菌體基因組RNA，排除宿主rRNA的組裝。因此，考慮在噬菌體組裝的過程中，除了21聚RNA莖環(huán)特異性結(jié)合外，包膜蛋白內(nèi)表面有精氨酸/賴氨酸富集區(qū)可以與RNA非特異性作用，促進(jìn)包膜蛋白的組裝。Pasloske等(JClinMicrobiol.1998，36(12)3590-3594)利用MS2噬菌體RNA在自然界中能夠耐受RNase降解和在一般理化條件下保持穩(wěn)定的特性，來研究制備穩(wěn)定性好的RNA質(zhì)控品或標(biāo)準(zhǔn)品。最初他們將目的片段(質(zhì)控RNA)插入到MS2噬菌體基因組中，構(gòu)建成含reRNA的，有活性的MS2噬菌體。但是，這類reRNA因在有活性的MS2噬菌體內(nèi)，會因?yàn)镸S2恢復(fù)野生型而丟失插入片段；重組的MS2還能夠增殖，從而造成量的難以確定，MS2的增殖還容易造成實(shí)驗(yàn)室的污染。而且MS2的復(fù)制酶是一個保真性很差的聚合酶，很容易在RNA復(fù)制過程中摻入錯誤的堿基，從而造成質(zhì)控序列的不穩(wěn)定。所以，在后來的研究中，他們采用了質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)HIV-1病毒樣顆粒。該表達(dá)載體含有以下序列成熟酶編碼序列，成熟酶核糖體結(jié)合位點(diǎn)，衣殼蛋白編碼序列，包裝位點(diǎn)，復(fù)制酶的部分起始位點(diǎn)，以及HIV-1質(zhì)控用的目的序列(142bp)。但該表達(dá)載體所表達(dá)的病毒樣顆粒中HIV-1質(zhì)控用的目的序列太小，不適合多種方法或含有多種檢測病毒RNA的RT-PCR試劑盒的應(yīng)用；同時病毒樣顆粒不是很穩(wěn)定，且不能產(chǎn)生具有HIV-1部分抗原的病毒樣顆粒，其應(yīng)用面較小。綜上所述，在RNA病毒的RT-PCR檢測中，由于影響實(shí)驗(yàn)過程的因素較多，如實(shí)驗(yàn)人員測定操作中的隨機(jī)誤差、擴(kuò)增儀孔間溫度的差異、標(biāo)本核酸提取后抑制物的殘留、待擴(kuò)增靶核酸的濃度、逆轉(zhuǎn)錄的效率以及試劑的問題等，這些因素均有可能會影響PCR擴(kuò)增的效率，進(jìn)而造成結(jié)果的偏差。因此，PCR測定必須使用質(zhì)控品進(jìn)行嚴(yán)格的室內(nèi)質(zhì)量控制才能保證結(jié)果的可靠性。此外，為進(jìn)行定量測定，還需要有定量的標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)還可以起到單管即時質(zhì)控的作用。一個穩(wěn)定可靠且無生物傳染危險性的RNA質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品，對于RNA病毒的RT-PCR高質(zhì)量的檢測具有重要價值。在這一點(diǎn)上，裸露的RNA或病毒顆粒及病毒替代品均難以做為理想的質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品，而采用分子克隆和原核表達(dá)方法構(gòu)建的內(nèi)含特定病毒RNA片段的噬菌體病毒樣顆粒則較好的解決了這些問題，其不但對于RNA病毒RT-PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)化，而且對于特定的mRNA的檢測等均有著潛在的應(yīng)用價值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題就是提供一種能夠穩(wěn)定可靠且無生物傳染危險性的RNA質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品的內(nèi)含RNA病毒核酸的耐RNase病毒樣顆粒。本發(fā)明另一個所要解決的技術(shù)問題是提供一種適用于多種方法或含有多種檢測病毒RNA的RT-PCR試劑盒所擴(kuò)增片段的內(nèi)含RNA病毒核酸的耐RNase病毒樣顆粒。目前，研究表明(ElbeikT，etal.，ExpertRevMolDiagn，2002；2(3)275-285)根據(jù)單獨(dú)表達(dá)的包膜蛋白組裝過程中具有不成熟的特性，不能得到耐RNase的病毒包膜，所以將MS2噬菌體的成熟酶蛋白和包膜蛋白的基因編碼序列以及其基因組部分包含基因調(diào)節(jié)元件序列的5’非編碼序列相應(yīng)的cDNA序列都連接到表達(dá)載體如pET28bT7啟動子下游，經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)得到成熟酶蛋白和包膜蛋白，在成熟酶以及噬菌體基因組RNA片段的協(xié)同作用下，包膜蛋白可以組裝為成熟的病毒樣顆粒，并具備耐RNase作用的特性。據(jù)此，本發(fā)明成功構(gòu)建了內(nèi)含MS2噬菌體的成熟酶蛋白和包膜蛋白的基因編碼序列以及其基因組部分包含基因調(diào)節(jié)元件序列的5’非編碼序列的表達(dá)載體，并經(jīng)原核表達(dá)后，得到的病毒樣顆粒具有耐RNase的特性。然后將HCVRNA、HIVRNA和SARS-CoVRNA等的cDNA序列構(gòu)建于該質(zhì)粒載體中的MS2噬菌體1.7kb基因組下游，經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)菌表達(dá)后，即可得到具有耐RNase的特性的內(nèi)含特定RNA的病毒樣顆粒，這種顆粒可作為特定RNA的RT-PCR測定的穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品，且無傳染性。MS2噬菌體RNA基因組序列全長為3.6kb，除去包裝的1.7kb的MS2序列，理論上還能包裝1.9kb的片段。但目前研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)包裝核酸片段的長度超過500bp時，病毒樣顆粒的包裝效率會大大下降(CindyR，etal.，ClinChem1999，45(12)2079-2085)，這樣現(xiàn)有的技術(shù)一般采用保守的做法，如Pasloske等只包裝了HIV-1質(zhì)控用的目的序列(142bp)，僅適用于Roche公司的檢測試劑盒。本發(fā)明突破內(nèi)含RNA病毒的核酸序列長度限制，提供含多種檢測方法所需的引物互補(bǔ)序列，具有廣泛的應(yīng)用價值。本發(fā)明提供的RNA病毒的核酸序列長度為150～1000bp，當(dāng)所包裝的片段長度大約1000bp，發(fā)現(xiàn)獲得的病毒樣顆粒在稀釋105倍后，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，仍能夠檢測到，其濃度在1010水平，已經(jīng)滿足實(shí)際應(yīng)用了。同時，在本發(fā)明在大量實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)總結(jié)了另一個所要解決的技術(shù)問題，就是提供一種具有內(nèi)含RNA病毒的部分抗原之內(nèi)含RNA病毒核酸的病毒樣顆粒。該病毒樣顆粒中內(nèi)含的RNA病毒核酸為保守編碼序列，序列長度在500～1000bp；本發(fā)明中優(yōu)選的序列為含有HIV-1病毒gag區(qū)序列。上述病毒樣顆粒的制備方法，該方法包含以下步驟構(gòu)建質(zhì)粒；設(shè)計RNA病毒引物序列；PCR擴(kuò)增，酶切得到目的片段；與質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化；病毒樣顆粒的誘導(dǎo)與表達(dá)。pNCCL1構(gòu)建方法及序列參見李金明等(中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2003，26(2)86-88)耐核糖核酸酶病毒樣顆粒的構(gòu)建和表達(dá)一文；根據(jù)所構(gòu)建載體的需要，在引物的上游引入限制性內(nèi)切酶HindIII酶切位點(diǎn)(下劃線部分)和保護(hù)性堿基，然后在Primer5.0軟件上運(yùn)行以匹配各引物的Tm值以及其它擴(kuò)增參數(shù)，設(shè)計合成引物；接著進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增純化；酶切得到目的片段與質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化；病毒樣顆粒的誘導(dǎo)與表達(dá)。本發(fā)明得到的內(nèi)含RNA病毒核酸的病毒樣顆粒，可以作為構(gòu)建和制備耐RNase的RNA病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的平臺。如可以直接作為RNA病毒核酸測定中的陽性質(zhì)控物和外標(biāo)定量測定的外標(biāo)定量標(biāo)準(zhǔn)；可以為RNA病毒核酸RT-PCR檢測試劑盒和實(shí)驗(yàn)室室間質(zhì)量評價提供無生物傳染危險性的樣本。如果對內(nèi)含RNA病毒核酸的病毒樣顆粒中的RNA病毒核酸檢測的目的片段進(jìn)行缺失、插入和突變等修飾，所獲得的病毒樣顆?？梢宰鳛镽NA病毒核酸定量測定中的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)和RNA病毒核酸RT-PCR測定的內(nèi)標(biāo)質(zhì)控物。在本發(fā)明中，RNA病毒核酸保守編碼區(qū)的蛋白也被證實(shí)表達(dá)于病毒樣顆粒上。表達(dá)有相應(yīng)抗原的病毒樣顆?？梢杂米餮芯坎《九c宿主細(xì)胞相互作用的模型，可以用來作為定向運(yùn)輸小分子藥物、反義RNA的工具。此外，在病毒樣顆粒表面表達(dá)有相應(yīng)的抗原表位可以用來研究疫苗。使用內(nèi)含特定RNA的病毒樣顆粒做為RNA病毒檢測的質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品，具有下述幾個方面的優(yōu)點(diǎn)(1)無生物傳染危險性。(2)作為RNART-PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品具有很好的穩(wěn)定性。由于這種病毒樣顆粒具有耐RNase的特點(diǎn)，因此可以避免被無所不在的RNase所降解，而這種降解對于RNA病毒的RT-PCR檢測來說是一個需要關(guān)注的問題。(3)對病原體內(nèi)RNA有很好的模擬作用。由于表達(dá)產(chǎn)物為噬菌體樣顆粒，具有很好的病毒顆粒模擬功能，因此，在核酸提取過程中，與標(biāo)本中真正病毒核酸的提取過程有很好的相似性。圖1、載體pNCCL1克隆/表達(dá)位點(diǎn)；圖2、HIVTA克隆經(jīng)HindIII酶切圖譜；圖3、pNCCL1-HIV經(jīng)NcoI和HindIII酶切后的圖譜圖4、表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)RNA提取后分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR反應(yīng)的電泳圖譜；1，2，3，4，5，6分別為1∶10至1∶106稀釋的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后PCR的電泳圖譜，1-5號管都能擴(kuò)增得到1000bp的條帶。7，8，9，9，10，11為1-5號樣本未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄直接進(jìn)行PCR反應(yīng)后的電泳；圖5、表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)DNaseI和RNaseA單酶或雙酶消化后的電泳圖譜1，2為表達(dá)產(chǎn)物4℃保存16h；337℃未加酶消化；4RNaseA消化；5DNaseI消化；6DNaseI和RNaseA雙酶消化；圖6、病毒樣顆粒置于45℃，3d后的電泳圖譜；圖7、pNCCL1-HIV載體的克隆/表達(dá)位點(diǎn)；圖8、P24抗原確認(rèn)實(shí)驗(yàn)1，2，3，4為表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)western-blot后的條帶，比對蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，位于97KD分子量附近；圖9、完整病毒樣顆粒的驗(yàn)證；1，2，3，4，5，6帶紋分別為表達(dá)產(chǎn)物原倍到1∶105的稀釋系列，RNA提取后經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄進(jìn)行PCR后的電泳圖譜；7，8分別為P24抗原試劑盒所帶的陰性血清，陽性質(zhì)控血清。9-16條帶分別為1-8號樣本，RNA提取后未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄就進(jìn)行PCR的電泳圖譜；圖10、SARS-CovTA克隆載體經(jīng)HindIII酶切電泳圖譜；圖11、表達(dá)載體PNCCL1-SARS-Cov經(jīng)HindIII，NcoI酶切后的電泳圖譜；圖12、PNCCL1-SARS經(jīng)NcoI，HindIII，XhoI酶切后的圖譜；圖13、表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)DnaseI和RNaseA單酶或雙酶消化16h后的電泳圖譜；圖14、表達(dá)產(chǎn)物耐性實(shí)驗(yàn)的電泳圖譜；圖15、病毒樣顆粒的電鏡照片，顯示結(jié)果正常。具體實(shí)施方式1、本發(fā)明實(shí)施例中選用的主要儀器如下PE2400PE5700ABI公司美國Line-Gene熒光定量PCR檢測系統(tǒng)杭州大和熱磁電子有限公司中國紫外投射分析儀北京儀城科技公司中國細(xì)胞破碎儀BransonsonicpowerCo.美國臺式高速離心機(jī)OserodeHeraeusInsrument德國臺式高速低溫離心機(jī)BeckmanIInstruments美國D-型超純水機(jī)USFELGARESERVOIR75L美國紫外分光光度計1601日本島津公司日本酶標(biāo)儀BIO-RAD公司美國DEM-III型自動酶標(biāo)洗扳機(jī)北京拓普分析儀器公司中國HW-8B型微量恒溫器上海浦江分析儀器廠中國SartoriusBP310S電子天平美國2、本發(fā)明實(shí)施例中選用的主要材料如下2.1生物材料菌株DH5αE.Coli.BL21-DE3E.Coli.(InvitrogenCorp.，U.S.A)質(zhì)粒pNCCL1構(gòu)建方法及序列參見李金明等(中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2003，26(2)86-88)耐核糖核酸酶病毒樣顆粒的構(gòu)建和表達(dá)一文；HIVgag質(zhì)粒，由中國疾病控制中心性病艾滋病中心惠贈，該質(zhì)粒上的gag基因由未經(jīng)培養(yǎng)的HIV-1陽性外周血中直接擴(kuò)增所得，該株為中國艾滋病毒E，B亞型代表株；P24單克隆抗體(華美公司購買)。SARS-CoVRNA，由中山達(dá)安公司惠贈。來源于SARS爆發(fā)期間病人樣本。SARS相關(guān)的新型冠狀病毒核酸擴(kuò)增熒光檢測試劑盒中山大學(xué)達(dá)安基因診斷中心提供2.2工具酶TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、RQ1脫氧核糖核酸酶1、核糖核酸酶(RNaseA)、限制性內(nèi)切酶XhoI、HindIII，購自Promega公司(美國)；NcoI購自NewEngland公司(美國)；2.3細(xì)菌培養(yǎng)與菌種保存2.3.1細(xì)菌培養(yǎng)(1)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)用取菌環(huán)取菌種，在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線接種，二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)37℃倒置培養(yǎng)過夜。(2)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)用取菌環(huán)挑取單個菌落接種于5ml液體培養(yǎng)基內(nèi)，置搖床37℃，140-180rpm搖菌過夜。2.3.2菌種保存(1)固體培養(yǎng)基菌種保存單個菌落在固體培養(yǎng)基上可以保存數(shù)月。(2)液體培養(yǎng)基菌種保存將新鮮菌液加入15％甘油，置于-70℃冰箱或液氮罐中長期保存。2.3.3質(zhì)粒提取小量堿裂解法提取質(zhì)粒(一般用于酶切驗(yàn)證)將單個菌落接種于5ml含有適當(dāng)抗生素的LB培養(yǎng)基內(nèi)(氨芐青霉素濃度為50μg/ml，卡那霉素濃度為30μg/ml)，37℃搖菌過夜。取1.5ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入微量離心管內(nèi)，12,000g離心30s，沉淀細(xì)菌，盡量棄去上清，加入STE混勻，洗滌細(xì)菌，以去除細(xì)菌代謝產(chǎn)物，4℃，12,000g離心30s。具體方法參見《分子克隆》，最后產(chǎn)物加入TE緩沖液溶解質(zhì)粒DNA，可以長期儲存于-20℃。2.3.4質(zhì)粒DNA中RNA的消化RNA初步消化在質(zhì)粒提取過程中，將質(zhì)粒DNA進(jìn)行沉淀之前，加入10-20μg/mlRNaseA37℃溫浴15-20分鐘，可以將質(zhì)粒DNA中的大部分RNA消化這種粗消化的質(zhì)粒DNA有多種用途，比如限制性內(nèi)切酶的初步消化，鑒定，目的片段的擴(kuò)增等等。RNA消化向DNA溶液中加入20μg/mlRNaseA在37℃溫浴15-30分鐘。也可以在TE緩沖液中加入一定濃度的RNaseA，本研究中采用的濃度為10-20μg/ml。2.3.5質(zhì)粒濃度的確定利用紫外分光光度計比色對純化后的質(zhì)粒DNA定量，測定260nm，280nm時的吸光度并計算兩者的比值。根據(jù)OD260/OD280的比值可以推算所得到的DNA樣本中DNA的純度，純度的比值應(yīng)該大于或者等于1.8。根據(jù)260nm吸光度(比色杯的厚度為1.0cm)推算出質(zhì)粒DNA濃度，所用的公式為A×50＝DNA的濃度值(μg/ml)。實(shí)施例1內(nèi)含HIV-1病毒核酸956bp的病毒樣顆粒的制備本發(fā)明所制備的病毒樣顆粒所含的HIV核酸片段，含有10種檢測HIVRT-PCR試劑盒所擴(kuò)增的片段，為針對HIV的定量PCR所擴(kuò)增的區(qū)域，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)片段集中在HIV基因組gag區(qū)1-956nt。如引物15’-GGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCAC3’-AGCCGAGCAAGCTTCACAGGAGGTAAAA所擴(kuò)增的長度為525bp本發(fā)明所用的HIVgag質(zhì)粒，由中國疾病控制中心性病艾滋病中心惠贈，該質(zhì)粒上的gag基因由未經(jīng)培養(yǎng)的HIV-1陽性外周血中直接擴(kuò)增所得，該株為中國艾滋病毒E，B亞型代表株CN54株；在MEDLINE網(wǎng)上搜索該株序列，利用引物設(shè)計軟件Primer5.0，設(shè)計擴(kuò)增HIV基因組gag區(qū)1-956nt，包括所需要的目的片段，同時還含有HIVgag區(qū)編碼蛋白的起始密碼子Met。引物分別為正義引物5’-AGAAGCTTATGGGTGCGAGAGCGT-3’；反義引物5’-ATAAGCCTTGGACCAACAAGGTGTCTGTC-3’。并根據(jù)所構(gòu)建載體的需要，在引物的上游引入限制性內(nèi)切酶HindIII酶切位點(diǎn)(下劃線部分)和保護(hù)性堿基，然后在Primer5.0軟件上運(yùn)行以匹配各引物的Tm值以及其它擴(kuò)增參數(shù)，并由北京賽百勝公司合成，合成引物為凍干DNA，用無菌去離子水(ddH2O)溶解至使用濃度10umol/l，-20℃保存。1.1目的片段的擴(kuò)增反應(yīng)體系如下gag質(zhì)粒1.0μldNTP混和物1.0μl10×擴(kuò)增緩沖液5.0μl10umol/l上游引物1.0μl10umol/l下游引物1.0μlTaq聚合酶0.4μl25mmol/lMg2+3.0μl加ddH2O補(bǔ)足至50μl反應(yīng)條件94℃，3min預(yù)變性；94℃45s；56℃45s；72℃2.0min；30個循環(huán)后72℃延伸5min。取5μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.4％瓊脂糖凝膠電泳觀察。1.2PCR產(chǎn)物的純化(1)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，用干凈的刀片切取含目的條帶的膠塊，膠塊要盡量小并盡量多含目的片段，放入1.5ml離心管中。稱量該膠的重量，盡量不超過150mg。不足100mg的加入ddH2O補(bǔ)至100mg。(2)按1mg相當(dāng)于1μl換算，以溶膠液∶膠重量比為3∶1的比例加入溶膠液。置50℃水浴10min，每2min振搖一次，使膠完全熔化。將混合液轉(zhuǎn)移至套在干凈接液管上的離心柱內(nèi)，12,000g，離心1min。(3)棄去接液管中的液體，重新插入離心柱。在離心柱上加洗柱液750μl，12,000g，離心30s。(4)加洗柱液250μl，重復(fù)步驟3。(5)將離心柱轉(zhuǎn)移到干凈的接液管上，空柱離心12,000g，2min。(6)重復(fù)步驟5。(7)將離心柱轉(zhuǎn)移到干凈的接液管上，加入60℃-70℃預(yù)熱的ddH2O30μl室溫放置1min，離心1min。所得溶液為回收的DNA溶液。1.3限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒DNA的消化本發(fā)明需要對TA克隆載體pBS-T，表達(dá)載體pNCCL1進(jìn)行酶切，其中表達(dá)載體pNCCL1的克隆/表達(dá)位點(diǎn)如圖1所示。本發(fā)明所用的限制性內(nèi)切酶為HindIII，XhoI和NcoI三種酶，各酶切條件如表1，2所示表1、Promega公司HindIII和XhoI酶切在不同緩沖液中的活性ABCDEMULTI-CORETMHindIII25-50％100％75-100％10-25％100％50-75％XhoI25-50％75-100％75-100％100％10-25％表2、NEB公司的NcoI在不同緩沖液中的活性NEBbuffer1234％Activity100％100％100％100％根據(jù)上述酶切緩沖液的條件，經(jīng)驗(yàn)證，當(dāng)采用單酶切時，各酶選用的緩沖液分別為HindIII為BufferE，XhoI為BufferD；當(dāng)HindIII，Nco1雙酶切或HindIII，XhoI，Nco1三酶切時，采用的為BufferB(單獨(dú)購自華美公司分裝的BufferB)；上述酶切體系為40μl，如下所示HindIIIBufferE4.0μl，HindIII4.0μl，BSA0.4μl，底物DNA31.6μl；XhoIBufferD4.0μl，XhoI4.0μl，BSA0.4μl，底物DNA31.6μl；HindIII，NcoI雙酶切BufferB4.0μl，HindIII2.0μl，XhoI2.0μl，BSA0.4μl，底物DNA31.6μl；HindIII，XhoI，NcoI三酶切BufferB4.0μl，HindIII2.0μl，XhoI2.0μl，NcoIBSA0.4μl，底物DNA29.6μl；酶切時間根據(jù)目的不同，實(shí)際操作中也有所不同若從TA克隆載體上獲得酶切目的片段，需要酶切過夜；若僅對克隆后的載體進(jìn)行酶切鑒定，酶切2-4小時即可；連接用表達(dá)載體pNCCL1需要酶切過夜。上述各體系的酶切溫度均為37℃。1.4目的片段DNA和TA克隆載體pBS-T或表達(dá)載體pNCCL1的連接，轉(zhuǎn)化及鑒定。1.4.1目的片段DNA和TA克隆載體pBS-T的連接，轉(zhuǎn)化及鑒定連接本發(fā)明采用天為時代的TA克隆試劑盒，連接體系如下pBS-T載體1.0μl，目的片段7.0μl，T4連接酶1.0μl，T4連接酶緩沖液1.0μl。連接1h。轉(zhuǎn)化從-70℃冰箱中取出克隆宿主感受態(tài)菌DH5a后，用手握化后置于冰浴10min。(1)將要轉(zhuǎn)化的DNA片段加入到裝有感受態(tài)細(xì)胞的管中(50μl感受態(tài)細(xì)胞需25ngDNA)，體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞的5％，輕輕旋轉(zhuǎn)幾次混勻內(nèi)容物，冰浴30min。(2)將管放入預(yù)加溫至42℃水浴放置90秒，不要搖動離心管。(3)快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1-2min。(4)每管加400μlSOC培養(yǎng)基，放置水浴箱使培養(yǎng)基加溫至37℃，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育45min，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因。(5)將適當(dāng)體積的已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到已經(jīng)含Amp抗生素的平板上。平板在涂布菌液之前，需要加入100μlX-gal，20μlIPTG，完全混勻后涂于平板上。(6)將平板置于室溫直至液體完全被吸收。(7)倒置平皿，于37℃培養(yǎng)12-16小時。轉(zhuǎn)化后的平板，藍(lán)白斑比例一般需要在1∶5到2∶1之間。鑒定挑取白斑接種于5mlAmp+LB培養(yǎng)基的50ml的培養(yǎng)管中，37℃，250rpm/min，培養(yǎng)6-8h后，提取質(zhì)粒。用HindIII進(jìn)行酶切，根據(jù)酶切后電泳圖譜進(jìn)行鑒定，電泳后可見1000bp的目的片段帶。酶切電泳圖譜如圖2所示。1.4.2目的片段DNA和表達(dá)載體pNCCL1的連接，轉(zhuǎn)化及鑒定目的片段來自于1.2，將TA克隆成功后的陽性菌落增菌后提取質(zhì)粒，用HindIII進(jìn)行酶切，瓊脂糖電泳后切膠回收目的片段，所得DNA片段即為HindIII完全酶切的目的片段。表達(dá)載體pNCCL1的酶切根據(jù)步驟1.4所示進(jìn)行純化。在連接前，對酶切后的目的片段DNA和酶切后的表達(dá)載體pNCCL1電泳進(jìn)行粗略定量，在兩條帶亮度相當(dāng)時，按以下體系進(jìn)行連接目的片段7.0μl，質(zhì)粒PNCCL11.0μl，T4DNA連接酶1.0μl，T4連接酶緩沖液1.0μl。4℃連接過夜。按步驟2.6.1操作轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21-DE3。不采用藍(lán)白斑篩選，而是應(yīng)用與擴(kuò)增目的片段一樣的反應(yīng)條件挑菌進(jìn)行PCR初篩，并設(shè)陽性菌對照。出現(xiàn)與目的片段大小一致，且目的帶非常亮的定為初篩陽性，取質(zhì)粒并用限制性內(nèi)切酶HindIII，NcoI對質(zhì)粒進(jìn)行酶切，得到1000bp，1700bp，及5200bp的帶，如圖3所示。陽性重組子測序結(jié)果經(jīng)PubMed網(wǎng)上，Blast后發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒中的插入片段與MS2和HIV的基因序列相一致(一致率100％)，未出現(xiàn)MS2讀碼框架的移碼現(xiàn)象，從而確定最終的陽性菌。1.5病毒樣顆粒的誘導(dǎo)與表達(dá)將1.4中所得的陽性菌接種于2ml含Kana+抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，130-180rpm/min搖菌過夜培養(yǎng)。然后取100μl過夜培養(yǎng)的菌液(處于對數(shù)生長期)接種于10ml含Kana+抗性的LB液體培養(yǎng)基，37℃，200rpm/min搖菌1.5h，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，使IPTG的終濃度為1mM/ml。誘導(dǎo)表達(dá)16小時，進(jìn)行超聲碎菌處理用1.5ml離心管取1.5ml菌液于4℃14,000r/min離心2min收集細(xì)菌，PBS洗滌三次后，加入0.25ml超聲處理緩沖液重懸細(xì)菌沉淀。用超聲細(xì)胞破碎儀小型超聲處理探針破碎細(xì)菌，然后將細(xì)菌破碎物置冰浴1min。重復(fù)上述破碎過程5-6次。將細(xì)菌破碎物4℃，14,000r/min離心2min，取上清轉(zhuǎn)移到另一干凈離心管中，得到本發(fā)明的含有HIV-1病毒核酸的病毒樣顆粒。實(shí)施例2、內(nèi)含HIV-1病毒核酸500bp的病毒樣顆粒制備本發(fā)明所制備的病毒樣顆粒所含的HIV核酸片段，含有5種檢測HIVRT-PCR試劑盒所擴(kuò)增的片段，為針對HIV的定量PCR所擴(kuò)增的區(qū)域?yàn)镠IV基因組gag區(qū)1-500nt。其他步驟同實(shí)施例1。實(shí)施例3、病毒樣顆粒內(nèi)含病毒RNA的鑒定實(shí)施例所得產(chǎn)物經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄和未做逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR反應(yīng)電泳結(jié)果如圖4所示；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄過程的稀釋系列，能夠擴(kuò)增出目的片段；而未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增的稀釋系列，未能擴(kuò)增出目的片段，證明VLPs內(nèi)包裝的核酸為RNA而非DNA。實(shí)施例4、HIV-1病毒核酸的病毒樣顆粒耐RNase的鑒定將實(shí)施例1中的PNCCL1-HIV經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主菌表達(dá)并超聲處理所獲得的噬菌體樣顆粒，分別進(jìn)行RNaseA(100U)消化、DNaseI(20U)消化、RNaseA(100U)和DNaseI(20U)雙酶聯(lián)合消化，未加DNaseI和RNaseA37℃消化以及4℃保存的未經(jīng)兩種酶消化，然后將三種酶消化產(chǎn)物和未進(jìn)行酶消化的表達(dá)產(chǎn)物一同電泳，電泳結(jié)果(圖5)顯示三種酶消化產(chǎn)物電泳圖譜各不相同，雙酶消化后產(chǎn)物電泳只有一條1000bp左右的帶紋。實(shí)施例5、HIV-1病毒核酸的病毒樣顆粒穩(wěn)定性的鑒定取步驟實(shí)施例1中得到的表達(dá)產(chǎn)物400μl，加入PEG600/NaCl100μl(v/v20％)，4℃，15000rpm/min離心1h，加入正常人陰性血清500μl。各取50μl分別置于四個Eppendorf管中，45℃，3d。電泳觀察表達(dá)產(chǎn)物中病毒樣顆粒的穩(wěn)定性。對超聲碎菌所得到的表達(dá)產(chǎn)物，按1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000，1∶100000，1∶1000000比例進(jìn)行稀釋后，各管分別加RNaseA和DNaseI雙酶聯(lián)合消化24h后，加入4M異硫氰酸胍鹽，1％的肌醇溶液終止酶切反應(yīng)。依照異硫氰酸胍鹽提取RNA的方法進(jìn)行樣本RNA提取，方法如下(1)加入150μl裂解液(4mol/LGuSCN，25mmol/l檸檬酸鈉pH7.0，0.5％肌醇，100mmol/Lβ-巰基乙醇)，加入50μl樣本，混勻后加入50μl氯仿。(2)4℃，13000rpm離心15min。(3)取與步驟(1)中相同數(shù)量的0.5ml滅菌離心管，加入100μl異丙醇，作好標(biāo)記。吸取步驟(2)中的上層液相轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中(不要碰到中間層，該層富含DNA和蛋白質(zhì))，顛倒混勻。(4)4℃，13000rpm離心15min。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體；加入300μl75％乙醇，顛倒洗滌。(5)4℃，13000rpm離心15min。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體；(6)離心5sec，將管底部少量液體用微量加樣器吸干。65℃烘箱烘干，但盡量避免過于干燥。(7)加入25μlddH2O溶解RNA，-20℃保存。然后進(jìn)行RT-PCR以引物5’-ATAAGCTTGGACCAACAAGGTGTCTGTC-3’為逆轉(zhuǎn)錄引物，按以下體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄取上述步驟(7)中的RNA溶液15.0μl；AMVbuffer，4.0μl；10mmol/l四種dNTP混合溶液，2.5μl；10umol/l引物，0.01μl；9U/μl逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV)，2.0μl；25mmol/lMg2+，1.0μl。42℃溫育1h后，93℃3min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。再按步驟3中的擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增。為驗(yàn)證擴(kuò)增反應(yīng)確為RNA所致，以不進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄而直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)管作為對照。1.4％瓊脂糖水平電泳驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物。電泳圖譜如圖6所示，仍然發(fā)現(xiàn)1000bp的亮帶。證明病毒樣顆粒穩(wěn)定性良好。實(shí)施例6、病毒樣顆粒表面所含蛋白的鑒定新構(gòu)建成功的表達(dá)載體pNCCL1-HIV的克隆位點(diǎn)如圖7所示如上圖所示內(nèi)切酶Nco1中出現(xiàn)起始密碼子ATG，恰好為MS2蛋白的起始密碼子。插入的MS2序列加上前后的HindIII位點(diǎn)，共1690nt。在HindIII位點(diǎn)前的第3個氨基酸編碼子，剛好為MS2噬菌體復(fù)制酶的起始密碼子ATG，距離插入的gag區(qū)的起始密碼子ATG剛好15個堿基，故沒有移碼突變。所以使得gag蛋白得到表達(dá)。在HIV-1病毒中，gag蛋白是P7，P17，P24的前體蛋白。因此只要驗(yàn)證gag蛋白中的任何一種蛋白存在，即可證明gag蛋白沒有移碼突變并得到完整表達(dá)。6.1P24蛋白的初步鑒定應(yīng)用MurexHIVAntigenMabVK868E77-01(P24抗原檢測試劑盒)來進(jìn)行初步鑒定。將步驟2.8所得到的病毒樣顆粒分別按1∶10，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800；1∶1600系列進(jìn)行稀釋，然后將稀釋系列樣本按試劑盒說明書進(jìn)行鑒定6.1.2P24蛋白的初步鑒定步驟(1)每孔加入100μl工作液1，再分別加入100μl樣本或陰陽性質(zhì)控。(2)避光，37℃孵育60min；洗板5次。(3)加入連接200μl工作液2。(4)避光，37℃孵育30min；洗板5次。(5)每孔加入200μl底物溶液。(6)室溫(15℃-30℃)孵育30min。(7)每孔加入50μl1-2mol/l的硫酸溶液以終止反應(yīng)，并輕輕搖勻。(8)5-15min內(nèi)，在450nm波長下讀取吸光度。6.1.3病毒樣顆粒的電鏡照片(圖15)顯示結(jié)構(gòu)正常。6.1.4P24蛋白的初步鑒定結(jié)果結(jié)果如表3、4表3、表達(dá)產(chǎn)物倍比稀釋后做P24初步鑒定樣本陽性陰性陰性空菌對照空菌對照1∶501∶10原倍OD值0.9890.0250.0060.5890.600OverOverOver表4、表達(dá)產(chǎn)物倍比稀釋后做P24初步鑒定樣本陽性陰性空菌對照1∶16001∶8001∶4001∶2001∶100OD值0.5070.0050.0050.2930.5580.9851.1621.816由上述表格可以看出，當(dāng)表達(dá)產(chǎn)物做1∶800稀釋后，仍呈陽性反應(yīng)，HIV-1P24抗原初步鑒定結(jié)果為陽性，且表達(dá)量在μg/ml水平以上。6.2通過Western-blot做P24抗原的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)鑒定(1)依步驟3.1超聲碎菌得到表達(dá)產(chǎn)物。(2)蛋白質(zhì)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳安裝玻璃板，配制12％分離膠，小心注入玻璃板間隙內(nèi)，上覆水層，隔離空氣，室溫聚合1-2h。傾去覆蓋物，吸水紙吸干殘留液體，配制5％濃縮膠，注入分離膠上端，小心插入梳子，避免氣泡產(chǎn)生，室溫聚合30min。將上步提取的樣品與上樣緩沖液混合，100℃加熱3min，上樣，100V恒壓電泳至溴酚蘭抵達(dá)分離膠底部。(3)轉(zhuǎn)膜蒸餾水清洗石墨板，擦干后，戴手套，剪6張3M濾紙和1張硝酸纖維素膜。濾紙和膜的大小要和凝膠的大小完全相等或小于凝膠。把硝酸纖維素膜漂浮于一盤去離子水的水面上，借毛細(xì)作用使膜從下往上潤濕后將膜完全浸沒于水中。浸泡5min以除去濾膜上殘留的氣泡并水化。在一平皿中加入少量的轉(zhuǎn)移緩沖液，把6張濾紙浸泡于其中。平放石墨電極的底座(+)，在石墨上放置3張經(jīng)轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡過的濾紙，對齊后用一玻璃棒在濾紙面上滾動，以排除氣泡。然后把硝酸纖維素膜放在濾紙上，要保證精確對齊避免在濾紙與硝酸纖維素膜之間留有氣泡。把凝膠移至去離子水中，略微漂洗一下，然后準(zhǔn)確平放于硝酸纖維素膜上，并排除氣泡。把另一組的3張濾紙放在凝膠上方，同樣確保各層精確對齊并避免氣泡。將轉(zhuǎn)移電泳槽上蓋扣到石墨電極-轉(zhuǎn)移膜膠復(fù)合體上。連接電源，0.6-1.0mA/cm2，接通電流，恒流電轉(zhuǎn)2h。(4)抗原抗體反應(yīng)a.將做好標(biāo)記的轉(zhuǎn)印后的硝酸纖維素膜經(jīng)PBST漂洗后，加入適當(dāng)?shù)姆忾]液中，4℃過夜。b.將硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移到用封閉液稀釋至適當(dāng)濃度的多抗血清或單抗腹水的稀釋液中，室溫振蕩1h。c.用PBST洗膜5次，加入以PBST緩沖液1∶30000稀釋的HRP-羊抗鼠或抗兔IgG，室溫振蕩1h。PBST洗膜5次，每次15min，然后再洗膜4次，每5min，充分洗膜將降低背景。d.將膜上多余的液體控干，放在一塊保鮮膜上，將等體積的luminal/enhancersolution和stableperoxidesolution混合，倒在膜的蛋白面上，室溫孵育5min。e.控干膜上多余的檢測試劑，用保鮮膜包好，將膜蛋白面向上放在片盒中，壓片，曝光1min，洗片，在此基礎(chǔ)上決定下一張片子的壓片時間。(5)結(jié)果應(yīng)用P24單克隆抗體作一抗，酶標(biāo)羊抗人IgG為二抗。結(jié)果如圖8與蛋白分子量Marker比對后發(fā)現(xiàn)，該帶位于97KD蛋白分子量標(biāo)記物附近。由于我們插入的片段核酸數(shù)為MS2(1690)插入片段與HIV(956)插入片段之和，根據(jù)公式估計表達(dá)蛋白的分子量110×(1690+956)/3＝97,020道爾頓。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明病毒樣顆粒表面的MS2噬菌體衣殼蛋白，成熟酶蛋白，HIV-1的gag蛋白是融合在一起的。6.3衣殼蛋白，gag蛋白與核酸RNA形成完整病毒樣顆粒的鑒定原理MurexHIVAntigenMabVK868E77-01(P24抗原檢測試劑盒)中的酶標(biāo)板經(jīng)HIV-1P24抗原多克隆抗體包被，將表達(dá)產(chǎn)物與多克隆抗體共溫浴1h，使P24多克隆抗體與病毒樣顆粒表面的P24抗原相結(jié)合。洗板10次去除其他物質(zhì)，加入100mmol/l的甘氨酸(pH3.0)洗脫抗原抗體的結(jié)合。然后采用“異硫氰酸胍結(jié)合酚-氯仿法”提取RNA的方法提取病毒樣顆粒的核酸RNA。經(jīng)RT-PCR反應(yīng)，檢測核酸中是否有HIV-1gag區(qū)的RNA，以未逆轉(zhuǎn)錄管做對照。6.3.1具體步驟(1)將表達(dá)產(chǎn)物按1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000，1∶100000，進(jìn)行稀釋后，分別標(biāo)記為2-6管，原倍表達(dá)產(chǎn)物標(biāo)記為1號管MurexHIVAntigenMabVK868E77-01試劑盒中的陰性對照，陽性對照分別標(biāo)記為7號，8號。(2)在每孔中加入100μl工作液1，再分別加入100μl樣本或陰陽性質(zhì)控。(3)避光，37℃孵育60min；洗板10次。(4)加入100mmol/l的甘氨酸(pH3.0)洗脫1min。(5)加入PEG6000，4℃沉淀3h，4℃，12,000rpm離心15min棄上清。(6)加入50μlTE(pH8.0)，將沉淀溶解。(7)參照步驟2.9.1中異硫氰酸胍結(jié)合酚-氯仿法”提取RNA的方法提取病毒樣顆粒的核酸RNA。(8)逆轉(zhuǎn)錄體系和條件參照步驟實(shí)施例3。(9)PCR擴(kuò)增，條件和體系參照實(shí)施例1，每份樣本設(shè)未逆轉(zhuǎn)錄管做對照。(10)將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.4％瓊脂糖凝膠電泳。6.3.2結(jié)果結(jié)果如圖9，由于在免疫吸附后經(jīng)過十次洗板，如果P24不是融合在病毒樣顆粒上而是游離，則不會將病毒樣顆粒吸附在96孔板上。因此，證明病毒樣顆粒中含有P24抗原。實(shí)施例7、內(nèi)含SARS冠狀病毒核酸的病毒樣顆粒的構(gòu)建與表達(dá)1.引物設(shè)計擴(kuò)增SARS-CoVRNA基因組部分序列(CHUK10，18026-18327)的引物對，該對引物擴(kuò)增區(qū)域?yàn)閃HO公布的七對引物(PCRprimersforSARSdevelopedbyWHOnetworklaboratories.GenevaWorldHealth.Organization，2003.AccessedApril17athttp//www.who.int/csr/sars/primers/en/)所在兩大主要區(qū)域之一，目前國內(nèi)外試劑盒擴(kuò)增檢測的片段多在此區(qū)域內(nèi)(吳新偉，程鋼，狄飚等，中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2003，26(5)300-302)。在上、下游引物5’端分別引入HindIII酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，合成帶酶切位點(diǎn)的引物上游引物，5’-AGAAGCTTACCTACACACCTCAGCGTTG-3’；下游引物，5’-ATAAGCTTTAACCAGTCGGTACAGCTAC-3’；然后，在Primer5.0軟件上運(yùn)行以匹配各引物的Tm值以及其它擴(kuò)增參數(shù)，并由北京賽百勝公司合成。2.SARS基因組目的片段的PCR擴(kuò)增，TA克隆及酶切產(chǎn)物純化同實(shí)施例1利用下游引物逆轉(zhuǎn)錄SARS-CovRNA，熱啟動法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，94℃45s；53℃45s；72℃1.0min；30個循環(huán)后延伸5min。2.0％瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果。切取目的條帶，膠回收后進(jìn)行TA克隆，藍(lán)白斑篩選后提取質(zhì)粒并用限制性內(nèi)切酶HindIII酶切，1.6％瓊脂糖凝膠電泳后再切膠回收得到目的片段。挑選白斑接種培養(yǎng)Amp+的LB培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒進(jìn)行HindIII酶切，電泳后可見300bp的目的片段帶，如圖10。3.表達(dá)載體PNCCL1-SARS-CoV質(zhì)粒的構(gòu)建用HindIII對PNCCL1質(zhì)粒進(jìn)行酶切，所得到的酶切產(chǎn)物直接用DNA純化試劑盒進(jìn)行純化。瓊脂糖凝膠電泳做粗略定量。按以下連接體系進(jìn)行連接目的片段7μl，質(zhì)粒1μl，T4DNA連接酶1μl，T4連接酶緩沖液1μl。4℃連接過夜。轉(zhuǎn)化細(xì)菌BL21-DE3E.Coli，挑菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用XhoI酶切，切下1000bp片段的定為陽性克隆。將陽性重組子送上海生工公司進(jìn)行測序，并確定插入片段的順反方向。表達(dá)載體PNCCL1的克隆/表達(dá)位點(diǎn)如圖1所示。用構(gòu)建的表達(dá)載體PNCCL1-SARS-CoV轉(zhuǎn)化細(xì)菌培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒并用限制性內(nèi)切酶HindIII，Nco1酶切，電泳圖譜如圖11所示。用限制性內(nèi)切酶Xho1，HindIII，Nco1對質(zhì)粒進(jìn)行酶切，得到300bp，721bp，970bp及5200bp的電泳條帶，如圖12所示。陽性重組子測序結(jié)果經(jīng)PubmedBlast后表明，重組質(zhì)粒中的插入片段與MS2和SARS-CoV的基因序列相一致(一致率100％)。4.內(nèi)含SARS-CoV部分RNA序列的耐RNase的病毒樣顆粒的原核表達(dá)及獲得接種1ml含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，200rm/min振蕩培養(yǎng)過夜，取培養(yǎng)液50μl接種5ml卡那霉素抗性培養(yǎng)基，200rm/min振蕩培養(yǎng)1.5小時，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，使IPTG的終濃度達(dá)到1mM/ml，誘導(dǎo)表達(dá)16小時，進(jìn)行超聲碎菌。即用1.5ml離心管取1.5ml菌液，4℃，14,000r/min離心2min收集細(xì)菌，用0.25ml超聲處理緩沖液重懸細(xì)菌沉淀。用超聲細(xì)胞破碎儀小型超聲處理探針破碎細(xì)菌，然后將細(xì)菌破碎物置冰浴1min。重復(fù)上述破碎過程5-6次。將細(xì)菌破碎物4℃，14,000r/min離心2min，取上清轉(zhuǎn)移到另一干凈離心管中。PNCCL1-SARS-Cov經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主菌表達(dá)并超聲處理所獲得的噬菌體樣顆粒，分別經(jīng)RNaseA消化、DNaseI消化、RNaseA和DNaseI雙酶聯(lián)合消化，未加DNaseI和RNaseA37℃孵育以及不加兩種酶4℃保存的噬菌體樣顆粒，然后將三種酶的消化產(chǎn)物和未經(jīng)酶消化的表達(dá)產(chǎn)物一同電泳，電泳結(jié)果顯示三種酶消化產(chǎn)物電泳圖譜各不相同，雙酶消化樣本只有一條1000bp左右的帶紋，如圖13所示。5.表達(dá)產(chǎn)物的鑒定取3份20μl表達(dá)產(chǎn)物分別進(jìn)行100URNaseA和2UDNaseI單酶及雙酶37℃消化40min，將消化的表達(dá)產(chǎn)物以及未消化的表達(dá)產(chǎn)物分別電泳，觀察比較未消化、各單酶消化以及雙酶消化后的電泳圖譜。同時對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行耐性實(shí)驗(yàn)取四管表達(dá)產(chǎn)物各20μl，加入100-200U的DNaseI，100URNaseA，37℃溫育4d；4℃保存，4d的表達(dá)產(chǎn)物兩管；室溫放置4d的一管；以及三管經(jīng)過如下處理的樣本表達(dá)產(chǎn)物各20μl，加入DNaseI100-200U，RNaseA100U，37℃溫育24h，經(jīng)95℃，5min熱裂解將包膜破壞釋放出RNA。在熱裂解后立即與上述幾種標(biāo)本同時進(jìn)行電泳.表達(dá)產(chǎn)物用RNaseA消化、DNaseI消化、RNaseA和DNaseI雙酶聯(lián)合消化24h后，加入4M異硫氰酸胍鹽，1％的肌醇溶液終止酶切反應(yīng)，用達(dá)安公司開發(fā)的SARS-CovRNA熒光RT-PCR試劑盒檢測，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。該試劑盒為實(shí)時熒光定量PCR試劑盒，引物為PF，5’-CGGCAAAATGAAAGAGCTCA-3’；PR，5’-CGCCGTAGGGAAGTGAAGCT-3’；探針序列為5’-CCCAGATGGTACTTCTATTACCTA-3’，反應(yīng)條件為93℃2min預(yù)變性，然后93℃15s，55℃15s，72℃20s，10個循環(huán)；然后93℃15s，58℃30s，30個循環(huán)。擴(kuò)增序列84bp(18164-18247，CHUK-10)。為驗(yàn)證擴(kuò)增反應(yīng)確為RNA所致，以不進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄而直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)管作為對照。表達(dá)產(chǎn)物耐性實(shí)驗(yàn)取四管表達(dá)產(chǎn)物各20μl，加入100-200U的DNaseI，100URNaseA，37℃溫育4d。表達(dá)產(chǎn)物耐性實(shí)驗(yàn)的電泳圖譜如圖14所示用達(dá)安試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果均呈陽性，病毒樣顆粒的濃度大于1010拷貝/ml。一管耐RNase表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過DNaseI和RNaseA酶切之后，分成兩份，分別進(jìn)行RNA提取，一份經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，另一份則不經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)而直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示不進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)管，擴(kuò)增結(jié)果呈陰性；而進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)管，擴(kuò)增結(jié)果呈強(qiáng)陽性。說明表達(dá)產(chǎn)物確含SARS-CoVRNA。權(quán)利要求1.內(nèi)含RNA病毒核酸的病毒樣顆粒，其特征在于該病毒樣顆粒耐RNase，含有外殼蛋白以及包含在內(nèi)的重組基因序列MS2噬菌體的成熟酶蛋白基因序列、衣殼蛋白基因序列、包裝位點(diǎn)基因序列、裂解蛋白和復(fù)制酶的起始位點(diǎn)基因序列、RNA病毒核酸序列。2.如權(quán)利要求1所述的病毒樣顆粒，其中該病毒樣顆粒含有的重組基因序列中的RNA病毒核酸序列長度為150～1000bp。3.如權(quán)利要求1或2所述的病毒樣顆粒，其中該病毒樣顆粒含有的重組基因序列中的RNA病毒核酸序列為丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒或嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒的核酸序列。4.如權(quán)利要求1所述的病毒樣顆粒，其特征在于該病毒樣顆粒含有外殼蛋白、內(nèi)含RNA病毒的部分抗原以及包含在內(nèi)的重組基因序列MS2噬菌體的成熟酶蛋白基因序列、衣殼蛋白基因序列、包裝位點(diǎn)基因序列、裂解蛋白和復(fù)制酶的起始位點(diǎn)基因序列、RNA病毒核酸保守編碼序列。5.如權(quán)利要求4所述的病毒樣顆粒，其特征在于該病毒樣顆粒含有HIV-1病毒的部分抗原，包含在內(nèi)的重組基因序列中的RNA病毒核酸保守編碼序列為500～1000bp，且含有g(shù)ag區(qū)序列。6.如權(quán)利要求1～5之任一所述的病毒樣顆粒的應(yīng)用是作為RNA病毒核酸測定中的陽性質(zhì)控物和RNA病毒外標(biāo)定量測定的外標(biāo)定量標(biāo)準(zhǔn)系列的應(yīng)用。7.如權(quán)利要求1～5之任一所述的病毒樣顆粒的應(yīng)用是作為RNA病毒RT-PCR檢測試劑盒和實(shí)驗(yàn)室室間質(zhì)量評價提供無生物傳染危險性的樣本的應(yīng)用。8.如權(quán)利要求1～5之任一所述的病毒樣顆粒的應(yīng)用是作為RNA病毒定量測定中的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)和RNA病毒RT-PCR測定的內(nèi)標(biāo)質(zhì)控物的應(yīng)用。9.如權(quán)利要求5所述的病毒樣顆粒的應(yīng)用是作為用作研究病毒與宿主細(xì)胞相互作用的模型，用來作為定向運(yùn)輸小分子藥物、反義RNA的工具，在病毒樣顆粒表面表達(dá)有相應(yīng)的抗原表位用來研究疫苗的應(yīng)用。10.如權(quán)利要求1～5之任一所述的病毒樣顆粒的制備方法，該方法包含以下步驟構(gòu)建質(zhì)粒；設(shè)計RNA病毒引物序列；PCR擴(kuò)增，酶切得到目的片段；與質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化；病毒樣顆粒的誘導(dǎo)與表達(dá)。全文摘要本發(fā)明屬于病毒基因工程領(lǐng)域，具體是一種內(nèi)含RNA病毒核酸的病毒樣顆粒及其制備方法與應(yīng)用。該病毒樣顆粒耐RNase，含有外殼蛋白以及包含在內(nèi)的重組基因序列MS文檔編號C12Q1/68GK1587420SQ20041006936公開日2005年3月2日申請日期2004年7月20日優(yōu)先權(quán)日2004年7月20日發(fā)明者李金明,王忠芳,王露楠,彭建明,鄧巍申請人:衛(wèi)生部北京醫(yī)院