專利名稱：預(yù)測中國人2型糖尿病易感性的試劑盒及引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)測2型糖尿病易感性的試劑盒及引物，更具體地，本發(fā)明涉及利用新鑒別的2型糖尿病易感基因KCNJ11(potassium inwardly-rectifying channel，subfamily J，member 11)的一個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點設(shè)計的預(yù)測2型糖尿病易感性的試劑盒和引物。本發(fā)明還涉及KCNJ11基因在制備預(yù)測2型糖尿病易感性的診斷劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大量流行病學(xué)資料表明，糖尿病是一種具有明顯遺傳傾向的復(fù)雜的多基因遺傳病。遺傳因素可明顯影響機(jī)體對胰島素的敏感性。目前對糖尿病易感基因的研究策略主要包括定位克隆法、候選基因法以及二者相結(jié)合的定位候選克隆法近年來，大多數(shù)研究者致力于通過定位克隆法尋找糖尿病相關(guān)基因，即尋找患病家系成員間共享的染色體DNA區(qū)域間的連鎖。已發(fā)現(xiàn)2型糖尿病中的一些相對較少見的單基因形式，稱為青年晚發(fā)型糖尿病(maturity-onset diabetes of the young，MODY)，是由于突變導(dǎo)致了β細(xì)胞功能低下。這些病人通常在青春期到成人早期發(fā)病，表現(xiàn)為葡萄糖反應(yīng)性胰島素分泌缺陷。這些致病基因中有6個分別編碼葡萄糖激酶、轉(zhuǎn)錄因子HNF1α、1β、4α及胰島素啟動因子(IPF1)，神經(jīng)細(xì)胞分化蛋白(NeuroD1)。這些基因突變最終導(dǎo)致高血糖血癥。這些單基因糖尿病的發(fā)病率還不確切，估計占所有2型糖尿病的5％。但是，單純利用定位克隆的策略來確定多基因遺傳病的成功報道尚不多見。
除定位克隆法外，目前對多基因遺傳病的相關(guān)基因進(jìn)行研究還有一種常用的方法-候選基因法，即直接研究疾病候選基因的變異與疾病表型之間的關(guān)系。該方法主要基于對家系或人群的病例-對照關(guān)聯(lián)分析。關(guān)聯(lián)分析不需要大的家系研究，而是比較某個或某一套標(biāo)記在患者和正常個體的分布程度。某種標(biāo)記如果在患病個體中分布十分明顯，那么就可以認(rèn)為該標(biāo)記與疾病表型相關(guān)聯(lián)。
但是，候選基因法中由于對致病基因所在位置沒有足夠了解，在選擇候選基因上存在較大的盲目性，主要針對與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的一些代謝通路進(jìn)行研究。將上述兩種方法相結(jié)合的定位候選克隆法在一定程度上彌補了任何單一一種方法的局限性，為目前多基因遺傳病研究中所普遍采用的策略。
目前糖尿病候選基因的選擇主要有兩個來源，一是與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的一些代謝通路，一是由定位克隆法所確定的染色體區(qū)域。2型糖尿病是一種多基因遺傳病，其易感性是多個基因相互作用的結(jié)果，因而本發(fā)明人以一種新的思路來選擇候選基因，即以本組以往研究所獲得的中國漢族人群2型糖尿病易感基因為靶基因，在其共表達(dá)基因和所處的代謝通路中尋找候選基因，以期構(gòu)建2型糖尿病易感基因網(wǎng)絡(luò)圖。
同遺傳病研究策略相對應(yīng)，其研究工具-多態(tài)性標(biāo)記也從第一代的限制性片段長度多態(tài)性(Restrictive Fragment Length Polymorphism，RFLP)，第二代的微衛(wèi)星標(biāo)記(Microsatellite Marker)發(fā)展到第三代的單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)。尤其在對多基因遺傳病進(jìn)行病例-對照關(guān)聯(lián)分析中，需要利用大量高密度的標(biāo)記物，前兩代多態(tài)性標(biāo)記已不能滿足這種要求。因此，近年來，SNP作為第三代遺傳圖譜的構(gòu)建者已越來越引起人們的廣泛關(guān)注。
單核苷酸多態(tài)性(SNP)主要是指基因組水平上由單核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90％以上。SNP在人類基因組中廣泛分布，平均每500-1000個堿基中就有1個，其總數(shù)估計可達(dá)300萬個甚至更多。近年來，隨著人類基因組及遺傳學(xué)研究的進(jìn)展，SNP在全面深入地了解個體和群體間基因組的變異或多態(tài)性及疾病研究等方面也越來越顯示出其重要意義。將SNP用于疾病易感基因定位的一個最大的優(yōu)點就是它的分布廣泛性。其次是它有比微衛(wèi)星更高的穩(wěn)定性，可以最大限度地減少遺傳過程中由于序列變異所導(dǎo)致的信息遺失。另外，SNP很容易實現(xiàn)高通量的分型，短時間內(nèi)可以產(chǎn)生大量的結(jié)果，這一點是微衛(wèi)星所無法比擬的。SNP的上述特點決定了它非常適合于進(jìn)行像糖尿病這樣的多基因疾病，尤其是多個微效基因所導(dǎo)致的疾病的定位研究。選擇合適的病例和正常對照，采取關(guān)聯(lián)分析的研究方法，對SNP而言，是非常適合的。
本發(fā)明人近幾年來一直從事中國北方漢族人群2型糖尿病(非胰島素依賴型糖尿病，NIDDM)易感基因定位研究。在先前本組進(jìn)行的候選定位克隆研究中，發(fā)現(xiàn)了6個中國漢族人2型糖尿病易感基因(PRKCZ，UTS2，CASP9，CDC212，PGD，SAC)，本發(fā)明人以一種新的思路，嘗試從上述基因所處通路中的功能相關(guān)基因及共表達(dá)基因中選擇合適的候選基因，利用SNP進(jìn)行病例-對照關(guān)聯(lián)分析，最終鑒定了一個中國漢族人群2型糖尿病易感基因(即KCNJ11基因)，以及該基因上的一個與中國漢族人2型糖尿病特別相關(guān)的SNP位點。由此經(jīng)過深入研究完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種預(yù)測2型糖尿病易感性的試劑盒，所述試劑盒包含基于圖1A或圖1B的序列設(shè)計的用于PCR擴(kuò)增的特異引物以及通過核酸擴(kuò)增進(jìn)行檢測的試劑盒所含的常規(guī)組件。所述引物針對圖中所示的SNP位點而設(shè)計，長度為18bp-28bp。優(yōu)選地，所述引物選自SEQ ID NO1-25組成的一組，更優(yōu)選地，所述引物為具有SEQ ID NO26-29所示序列的擴(kuò)增受阻突變體系(ARMS)引物。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于預(yù)測2型糖尿病易感性的引物，所述引物為基于圖1A或圖1B的序列設(shè)計的用于PCR擴(kuò)增的特異引物，所述引物針對圖中所示的SNP位點而設(shè)計，長度為18bp-28bp。優(yōu)選地，所述引物選自SEQ ID NO1-25組成的一組。根據(jù)本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的引物為SEQ ID NO26-29，所示的擴(kuò)增受阻突變體系(ARMS)引物。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了KCNJ11基因(內(nèi)向整流鉀離子通道，J亞基，11號)作為糖尿病易感基因在制備用于糖尿病診斷的診斷劑中的應(yīng)用，KCNJ11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO30所示。


圖1A示出本發(fā)明的SNP位點(R)所在的KCNJ11基因區(qū)域的核苷酸序列。
圖1B為圖1A序列的互補序列定義單核苷酸多態(tài)性(SNP)主要是指基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90％以上。
基因分型及等位基因頻率分布同一種群生物中，相同等位基因核苷酸序列順序分析，在此表示相同SNP位點在不同個體中的組成成分的確定，為基因分型。等位基因頻率是指所研究的同一種類等位基因里，所期望出現(xiàn)的等位基因占的比例，也就是出現(xiàn)變化的等位基因的所占比例。
疾病易感性(糖尿病易感性)人群對疾病容易感受的程度。
擴(kuò)增受阻突變體系(amplification refractory mutation system，ARMS)又稱等位基因特異性PCR(ASPCR)或特異性等位基因PCR擴(kuò)增(PASA)，該方法基于耐熱Taq DNA聚合酶缺乏3′→5′外切校正活性的特點，設(shè)計3′端的特異堿基分別互補于野生型和突變型等位基因的相對應(yīng)堿基的引物，通過PCR反應(yīng)和凝膠電泳即可檢測出DNA序列中已知點突變的一種新方法。其特點為快速、可重復(fù)性高、成本低且便于自動化。
病例-對照關(guān)聯(lián)分析是一種由因及果的回顧性研究。它是先按疾病狀態(tài)確定調(diào)查對象，分為病例和對照組，通過比較病例組與對照組間所研究的遺傳標(biāo)志出現(xiàn)頻率的差異而獲得該標(biāo)志與疾病間關(guān)聯(lián)的信息。
參數(shù)連鎖分析和非參數(shù)連鎖分析根據(jù)基因的重組率來計算兩個基因之間的染色體圖距即連鎖分析，用分類變量(離散變量)來進(jìn)行分析，把測量指標(biāo)按某一標(biāo)準(zhǔn)歸類，計數(shù)，然后進(jìn)行分析為參數(shù)分析，用實際測量后的結(jié)果進(jìn)行的分析為非參數(shù)連鎖分析。
KATP(ATP敏感性鉀通道)是受細(xì)胞內(nèi)ATP濃度調(diào)控的一種內(nèi)向整流鉀離子通道，通過與細(xì)胞代謝和生物電活動相耦聯(lián)，在分泌及肌肉收縮過程中發(fā)揮重要的生理和病理生理學(xué)功能。通過對克隆表達(dá)和天然型KATP特性的對比研究表明，KATP可分為以下5種類型①胰腺型，Kir6.2/SUR1②心肌和骨骼肌型，Kir6.2/SUR2A③血管平滑肌型，Kir6.2/SUR2B④腎臟型，Kir1.1/CFTR⑤線粒體型，Kir6.1/？。
本專利涉及的KCNJ11(potassium inwardly-rectifying channel，subfamily J，member 11)基因，又稱為BIR或Kir6.2(Chandy andGutman(1993)命名法中)，其編碼蛋白為一種內(nèi)向整流鉀離子通道，在胰腺高度表達(dá)，與磺脲類受體SUR1(一種廣泛應(yīng)用的降糖藥物的作用靶點)共同組成上述的胰腺β細(xì)胞內(nèi)的KATP，受G蛋白調(diào)控并在胰島素的釋放過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。KCNJ11的編碼蛋白含有390個氨基酸，由2個疏水的跨膜區(qū)段(分別位于第74～95和第145～166個氨基酸殘基之間)和H5區(qū)組成(位于第119～135氨基酸殘基之間)，后者也是由甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸組成。其胞內(nèi)羧基末端有2個PKA依賴的磷酸化位點(分別為第224位的蘇氨酸和363位的絲氨酸)，其胞內(nèi)氨基和羧基末端共有5個PKC依賴的磷酸化位點(分別為第3，37，36位的絲氨酸和335，344位的蘇氨酸)。它在胰腺高度表達(dá)，在心臟和骨骼肌相對低度表達(dá)。
KCNJ11的編碼基因長4.5kb，Locus ID3767，與磺脲類受體SUR1的編碼基因融合在一起，共定位于染色體11p15.1上，已證明KCNJ11基因的突變是家族遺傳性嬰兒低胰島素高葡萄糖血癥(PHHI)的重要病因(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/LocRpt.cgi？l＝3767)。在對歐洲白人的研究中發(fā)現(xiàn)，KCNJ11的E23K突變與2型糖尿病相關(guān)。
具體實施例方式
目前有多個公共數(shù)據(jù)庫儲存了幾百萬條SNP信息，人們可以通過多種方式，如以基因名、登記號、染色體號、功能級別等，進(jìn)行查尋。但是，這些數(shù)據(jù)庫中的SNP絕大多數(shù)只是“候選者”，而非經(jīng)過驗證的真正SNP。它們是利用計算機(jī)在對多個克隆序列進(jìn)行比對時發(fā)掘出來的，其中必然存在一部分假陽性SNP。另外，這些SNP大多數(shù)是利用高加索人和黑人測序?qū)ふ业腟NP，在中國人群中的分布有些不一定相同，我們利用中國漢族人群的糖尿病患者和正常對照，重新測序?qū)ふ襍NP。并利用我們在中國漢族糖尿病人群中發(fā)現(xiàn)的高頻的SNP進(jìn)行基因分型。
為尋找2型糖尿病易感基因，本發(fā)明人根據(jù)美國國家生物信息學(xué)(National Center for Biotechnology Information)中心公布的信息，嘗試從本組先前發(fā)現(xiàn)的6個中國漢族人2型糖尿病易感基因(PRKCZ，UTS2，CASP9，CDC212，PGD，SAC)所處通路中的功能相關(guān)基因及共表達(dá)基因中選擇了18個中國漢族人群2型糖尿病候選基因，對這些基因的外顯子，Promotor區(qū)2kb，以及臨近的內(nèi)含子的區(qū)域進(jìn)行測序篩查中國北方漢族人群中的SNP。并對其中部分高頻的SNP進(jìn)行基因分型，通過ARMS反應(yīng)、序列測定等方法對其在病例組及對照組進(jìn)行分型并進(jìn)行病例-對照關(guān)聯(lián)分析。
如以下實施例所詳細(xì)討論的，所選擇的72個高頻(等位基因頻率≥15％)的SNP位點中，KCNJ11基因內(nèi)選取了7個位點進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)本位點和糖尿病相關(guān)，它位于第二號外顯子的990位處的一個SNP位點(R，即G/A)，，NCBI中的編號是rs5213，其等位基因頻率分布在病例組和對照組中的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，提示這一SNP位點與2型糖尿病相關(guān)，進(jìn)一步得出結(jié)論，其所在基因KCNJ11基因為中國漢族人2型糖尿病的易感基因。
因此，本發(fā)明的一個方面涉及糖尿病易感基因KCNJ11基因在預(yù)測糖尿病易感性中的應(yīng)用?；贙CNJ11基因，可以獲得各種診斷劑和試劑盒以用于預(yù)測糖尿病易感性。
KCNJ11所在基因組序列如SEQ ID NO30所示，全長為6,458bp，本發(fā)明所揭示的SNP位點(R)位于該序列的4,107-4,976位之間，這一區(qū)域的核苷酸序列如圖1A所示，圖中R為SNP位點，其代表堿基G/A多態(tài)性，即該位點可以為G，也可以為A。這一區(qū)域的互補序列如圖1B所示，圖中R代表本發(fā)明的SNP位點的互補堿基，其代表堿基C/T。
本發(fā)明還涉及用于預(yù)測糖尿病易感性的引物。優(yōu)選地，所述引物基于圖1A的序列而設(shè)計，由此，PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物測序可以直接測得SNP位點。當(dāng)然，本發(fā)明的引物也可以基于圖1B的序列設(shè)計，這樣PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物測序得到SNP的互補堿基。優(yōu)選地，本發(fā)明的引物具有SEQ ID NO1-25所示的序列，特別優(yōu)選的是SEQ ID NO26-29所示的ARMS-PCR引物。下表1舉例示出了本發(fā)明的引物的一些組合，引物的解鏈溫度(Tm)以及這些組合得到的產(chǎn)物大小。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限于這些列出的引物及其組合。
表1 SEQ ID NO1-25所示的引物序列



本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含本發(fā)明的一或多種引物的試劑盒，該試劑盒用于檢測糖尿病的易感性。除了本發(fā)明的引物之外，所述試劑盒還包含運用PCR擴(kuò)增而進(jìn)行檢測的試劑盒的常規(guī)組件、試劑、緩沖液等，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些常規(guī)組件和檢測方法。
以下將參照實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實施例1、中國漢族人群2型糖尿病易感基因KCNJ11的鑒定及該基因內(nèi)SNP的相關(guān)研究
1、中國漢族人群2型糖尿病患者及正常對照標(biāo)本的收集本發(fā)明所用2型糖尿病組和正常組人群外周血樣(10ml)主要來自北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科門診。糖尿病病例可為散發(fā)，也可為糖尿病家系的成員(但此時每一家系中通常只有一個患者入選，同一家系中沒有任何血緣關(guān)系的成員可以選擇一個以上)；正常對照來自正常人群，要求其家庭三代以內(nèi)沒有糖尿病患者(包括I型糖尿病)，對照組與患病組年齡及性別相匹配。
2型糖尿病的診斷嚴(yán)格按照WHO于1985年頒發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。即空腹血葡萄糖濃度≥7.8mmol/L或餐后2小時血糖≥11.1mmol/L為糖尿病。OGTT的判斷標(biāo)準(zhǔn)為服糖后2小時血葡萄糖濃度＜7.8mmol/L為正常，≥11.1mmol/L為糖尿病，在7.8-11.1mmol/L之間為糖耐量低減(impaired glucose tolerance，IGT)。
入選的每個成員記錄一般情況，包括性別、出生年月、籍貫、身高、體重、心率、呼吸、血壓等項目，調(diào)查并在必要時行特殊檢查，以排除合并有高血壓、心臟病、動脈粥樣硬化等疾病。除上述項目外，對糖尿病患者還記錄發(fā)病年齡、既往最高體重、血脂、糖化血紅蛋白及糖尿病并發(fā)癥等項目，對正常對照組還測量空腹血糖并排除有糖尿病家族史者。
采集血樣前確保所有成員都了解采血目的，即有知情權(quán)，并在“知情同意書”上簽字。將收集的資料嚴(yán)格保密，不對外公布供血成員的姓名、年齡、疾病等所有資料。
共采集到714份標(biāo)本，其中病例組371份，對照組343份。兩組在性別、年齡上相匹配，糖尿病患者的平均年齡為53.01歲，正常對照采樣時的平均年齡為49.68歲。在所有成員中，男女的比例為361∶353，病例組男性190人，女性181人；對照組男性168人，女性175人。兩組成員的年齡分布情況如表2
表2 患病組和對照組成員的年齡構(gòu)成

2、候選基因的確定及候選基因中用于基因分型的SNP位點的選擇基于本組先前發(fā)現(xiàn)的6個中國漢族人2型糖尿病易感基因(PRKCZ，UTS2，CASP9，CDC212，PGD，SAC)，本發(fā)明人根據(jù)美國國家生物信息學(xué)中心(National Center for Biotechnology Information)公布的信息，在此6個基于所涉及通路中的功能相關(guān)基因及共表達(dá)基因中選擇了18個中國漢族人群2型糖尿病候選基因，對這些基因的外顯子、Promotor區(qū)2kb、臨近的內(nèi)含子的區(qū)域以及3’非翻譯區(qū)進(jìn)行測序篩查中國北方漢族人群中的SNP。并對其中72個高頻(等位基因頻率≥15％)的SNP通過ARMS反應(yīng)、序列測定等方法進(jìn)行基因分型。
3、SNP位點基因分型分析主要采用2種方法進(jìn)行SNP的分型擴(kuò)增受阻突變體系(amplificationrefractory mutation system，ARMS)分型及測序分型。
1).擴(kuò)增受阻突變體系(amplification refractory mutation system，ARMS)1.1)引物設(shè)計與合成利用Tetra-primer ARMS-PCR軟件進(jìn)行引物設(shè)計(http//cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/primerl.html)，針對KCNJ11基因中的7個SNP位點中的每一個SNP位點設(shè)計4條引物，分別為正向內(nèi)部引物、反向內(nèi)部引物、正向外部引物、反向外部引物。
ARMS-PCR引物設(shè)計原則引物長度在18～30base之間，Tm值在55～80℃之間。最適內(nèi)部PCR產(chǎn)物長度350bp，兩條內(nèi)部PCR產(chǎn)物長度之比為1.3-2。
1.2)ARMS PCR反應(yīng)及產(chǎn)物鑒定針對KCN11基因中的每一個高頻SNP位點進(jìn)行Tetra-prmer ARMS-PCR，反應(yīng)體系15μl，各組分如表3表3 ARMS PCR反應(yīng)體系名稱 原液濃度 加樣量(μl)Q-solution5× 3buffer10× 1.5primer*4 20μM 0.3×4Mgcl2 25mM 0.9dNTP 10mM 0.45HotstarTaq5units/μl0.12template 20ng/μl 1ddH2O 補齊至15μl注所使用的Q-solution、buffer、Mgcl2、HotstarTaq均由QIAGEN公司的HotstarTaq試劑盒提供采用Touch-down PCR，其程序如下94℃、12分鐘后，進(jìn)行12個循環(huán)的94℃30秒、(Tm+2℃)60秒(每一循環(huán)溫度下降0.5℃)、72℃50秒，隨后30個循環(huán)的94℃30秒、(Tm-3℃)30秒、72℃45秒，最后72℃10分鐘1次。反應(yīng)結(jié)束后用2％瓊脂糖電泳鑒定，在UV燈下觀察產(chǎn)物情況，并用紫外凝膠成像儀拍照，記錄時間、位點名稱、樣品號等。
1 .3)基因型判定及數(shù)據(jù)整理根據(jù)條帶數(shù)量及位置判定SNP基因型。將各位點分型結(jié)果整理為Excel格式以進(jìn)行統(tǒng)計處理。
(2)測序分型對于不適合用上述ARMS方法分型或分型結(jié)果不理想的位點進(jìn)行測序分型。
以上各SNP位點的分型均先在96個隨機(jī)選取的正常對照個體中進(jìn)行。
在病例組和對照組中，上述72個分型的SNP位點均符合Hardy-Weinberg平衡。鑒于KCNJ11基因序列較短6,458bp，對其進(jìn)行全基因測序，篩查得到高頻SNP位點7個，采用上述2中方法進(jìn)行基因分型，經(jīng)SPSS統(tǒng)計軟件11.0版(免費下載于http//linkage.rockefeller.edu/soft/)分析，有1個SNP位點位于KCNJ11基因第二個外顯子的第989位，在NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫中rs5213，等位基因頻率分布在兩組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，如表4所示。
表4 病例組與對照組SNP分型SPSS統(tǒng)計分析結(jié)果等位基因SNP C T A G 總計 P值病例組306 436742 0.002rs203849 對照組339 347686總計 645 7831428位于KCNJ11基因第二個外顯子中的1個SNP位點的等位基因頻率在病例組和對照組存在顯著差異，因此提示這一位點與2型糖尿病相關(guān)。進(jìn)而提示KCNJ11基因為一種新的糖尿病易感基因。
KCNJ11所在基因組序列如SEQ ID NO30所示，全長為6,458bp，本發(fā)明所揭示的SNP位點(R)位于該序列的4,107-4,976位之間，這一區(qū)域的核苷酸序列如圖1A所示，圖中R為SNP位點，其代表堿基G/A多態(tài)性，即該位點可以為G，也可以為A。這一區(qū)域的互補序列如圖1B所示，圖中R代表本發(fā)明的SNP位點的互補堿基，其代表堿基C/T。
基于這一SNP位點，可以設(shè)計適當(dāng)長度的引物，用于經(jīng)PCR擴(kuò)增而預(yù)測糖尿病易感性。
實施例2 預(yù)測糖尿病易感性引物的設(shè)計及糖尿病易感性的預(yù)測1.ARMS-PCR引物
ARMS-PCR引物設(shè)計遵循以下原則引物長度在18～30base之間，Tm值在55～80℃之間。最適內(nèi)部PCR產(chǎn)物長度350bp，兩條內(nèi)部PCR產(chǎn)物長度之比為1.3-2。針對KCNJ11基因中的這一SNP位點設(shè)計4條引物，如下表5所示表5 SEQ ID NO26-29所示的ARMS-PCR引物

以此組Tetra-primer ARMS-PCR引物對待測個體基因組DNA進(jìn)行ARMS-PCR反應(yīng)檢測SNP位點的序列。
2、普通PCR擴(kuò)增引物根據(jù)SNP位點所在的序列(圖1A和1B)，設(shè)計如SEQ ID NO1-25所示的引物。如表1所示進(jìn)行各種組合。以所述組合為引物，以得自待測個體血樣的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序檢測所述SNP位點的單核苷酸多態(tài)性。
SEQUENCE LISTING<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京諾賽基因組研究中心有限公司<120>預(yù)測中國人2型糖尿病易感性的試劑盒及引物<130>I20031212CB<160>30<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1cagcctactg gaagctctga c 21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2cttagccagg tgctttttca g 21<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>3gcttgatgag gaccacagcc tact 24<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>4aacaccctct ctcatcaact gccct 25<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>5aacaccctct ctcatcaact gcc 23<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>6acaccctctc tcatcaactg ccct 24<210>7<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>7agcttgatga ggaccacagc ctactg26
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權(quán)利要求
1.用于預(yù)測2型糖尿病易感性的引物，所述引物為基于圖1A或圖1B的序列而設(shè)計的用于PCR擴(kuò)增的特異引物，所述引物針對圖中所示的SNP位點R而設(shè)計，長度為18-28個核苷酸。
2.如權(quán)利要求1所述的引物，其包含選自SEQ ID NO1-25組成的一組的一種序列。
3.如權(quán)利要求2所述的引物，其為具有SEQ ID NO26-29所示的序列的ARMS-PCR引物。
4.用于預(yù)測2型糖尿病易感性的試劑盒，其包含如權(quán)利要求1-3任一項所述的引物。
5.KCNJ11基因在制備用于預(yù)測2型糖尿病易感性的診斷劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預(yù)測2型糖尿病易感性的試劑盒及引物，更具體地，本發(fā)明涉及利用新鑒別的2型糖尿病易感基因KCNJ11的一個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點設(shè)計的預(yù)測2型糖尿病易感性的試劑盒和引物。本發(fā)明還涉及KCNJ11基因在制備預(yù)測2型糖尿病易感性的診斷劑中的應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK1721549SQ200410068958
公開日2006年1月18日 申請日期2004年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月15日
發(fā)明者張永偉, 劉卓, 左瑾, 孟雁, 方福德, 沈巖, 強(qiáng)伯勤 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 北京諾賽基因組研究中心有限公司