專利名稱：：強(qiáng)直性脊柱炎易感性檢測(cè)方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地涉及低分子量多肽2(Lowmolecularmasspolypeptide-2，LMP2)的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)及其與強(qiáng)直性脊柱炎的相關(guān)性。本發(fā)明還涉及檢測(cè)這些SNP的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
：強(qiáng)直性脊柱炎又名別赫捷列夫氏(VonBechterev)病或馬-施二氏(Maritstrumpell)病，是一種慢性、進(jìn)行性，中軸關(guān)節(jié)受累的慢性炎癥性疾病。主要影響骨盆的骶髂關(guān)節(jié)、脊柱關(guān)節(jié)和椎旁組織。主要癥狀為下腰痛、脊椎僵硬及運(yùn)動(dòng)范圍受限、X線顯示兩側(cè)骶髂關(guān)節(jié)炎(sacroilitis)為其特征。由于該病一般先侵犯骶髂關(guān)節(jié)，并重點(diǎn)累及脊柱，最終導(dǎo)致脊柱骨性強(qiáng)直，故目前國內(nèi)外多稱之為強(qiáng)直性脊柱炎(AnkglosingSpondylitis，AS)。強(qiáng)直性脊柱炎有明顯的種族性，在不同民族中發(fā)病率的差異很大。印第安人發(fā)病率最高，北美印第安人發(fā)病率為2.7%6.3%。其次為白種人，白種人中發(fā)病率為0.1%1.4%。黃種人低于白種人,我國約為0.3%。而黑人發(fā)病率最低，約為白人的l/4,在非洲僅為0.2%。強(qiáng)直性脊柱炎好發(fā)于20至40歲的成年人，尤其是2030歲的青年男性。強(qiáng)直性脊柱炎呈常染色體顯性遺傳,有明顯的家族遺傳傾向，遺傳因素>90%。據(jù)調(diào)查，強(qiáng)直性脊柱炎病人親屬發(fā)病率比一般人高一倍左右，同胞復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)比為82。90。/。以上的AS病人具有HLA-B27陽性,在正常人群中陽性率為8。/。；子女HLA-B27陽性占50。/。，發(fā)生強(qiáng)直性脊柱炎的占25%。目前基本上已有定論，HLA-B27作為獨(dú)立的致病基因在AS的發(fā)病中起作用。因?yàn)樵贖LA-B27陽性個(gè)體中只有1。/。5X發(fā)展成為AS，提示還有其他基因參與AS的發(fā)病。近年來，單核苷酸多態(tài)性(SNP)和單倍型(haplotype)概念在多基因疾病研究中的廣泛運(yùn)用，為在分子水平上研究強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制開辟了全新的思路。同時(shí)，高通量、低成本的SNP檢測(cè)手段的不斷出現(xiàn)也為SNP大規(guī)模快速分型提供了可能。SNP的存在與否以及等位基因頻率存在人種及地域的差異，這就提示多基因疾病遺傳異質(zhì)性的存在，即同一疾病或性狀在不同的人群中可能是不同的遺傳因素造成的。另外，不同人群中SNP及其單倍型的類型和頻率存在的這種差異可能與不同人群對(duì)藥物及環(huán)境因素的反應(yīng)性不同密切相關(guān)。強(qiáng)直性脊柱炎作為一種遺傳因素起較大作用的疾病，尋找其相關(guān)基因進(jìn)而闡明強(qiáng)直性脊柱炎發(fā)病的遺傳機(jī)制已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)。雖然己有許多關(guān)于各種基因多態(tài)性與強(qiáng)直性脊柱炎的研究，但沒有證實(shí)LMP2基因與強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)性的報(bào)道，更沒有證實(shí)本發(fā)明所述的LMP2基因SNP與強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)性的報(bào)道。綜上所述，為了盡早診斷強(qiáng)直性脊柱炎，本領(lǐng)域迫切需要尋找強(qiáng)直性脊柱炎易感基因，并開發(fā)檢測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎的方法和試劑盒。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供一種輔助診斷(尤其是早期診斷)強(qiáng)直性脊柱炎的方法及檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供一種新的治療強(qiáng)直性脊柱炎的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種體外檢測(cè)樣品是否存在抗原肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(LMP2)的單核苷酸多態(tài)性的方法，它包括步驟(a)用LMP2基因特異性引物擴(kuò)增樣品的LMP2基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和(b)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性424位A—C和451位C—G;其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQIDN0:1。在另一優(yōu)選例中，所述的LMP2基因特異性引物具有SEQIDN0:2和3的序列。在另一優(yōu)選例中，所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為100-2000bp且含有SEQIDN0:1中第424和451位。在另一優(yōu)選例中，所述的樣品來自女性個(gè)體(人)。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎的試劑盒，它包括特異性擴(kuò)增LMP2基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，所述的引物擴(kuò)增出長度為100-2000bp且含有SEQIDN0:l中第424和451位的擴(kuò)增產(chǎn)物。在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還含有選自下組的試劑(a)與SEQIDN0:l中第424和451位的突變位點(diǎn)結(jié)合的探針；(b)識(shí)別SEQIDN0:l中第424和451位的突變位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶。在另一優(yōu)選例中，所述的突變位點(diǎn)是以下的單核苷酸多態(tài)性424位A—C和451位C—G;其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQIDN0:1。在另一優(yōu)選例中，所述的LMP2基因特異性引物具有SEQIDN0:2和3的序列。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種對(duì)個(gè)體的強(qiáng)直性脊柱炎易感性進(jìn)行診斷的方法，它包括步驟檢測(cè)該個(gè)體的LMP2基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常的LMP2基因或轉(zhuǎn)錄本相比較；其中，存在差異就表明該個(gè)體患強(qiáng)直性脊柱炎的可能性高于正常人群。在另一優(yōu)選例中，檢測(cè)的是LMP2基因，并與正常LMP2的核苷酸序列比較差異或者所述的個(gè)體是女性。在另一優(yōu)選例中，所述的差異是424位A—C和451位C—G;其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQIDN0:1。在另一優(yōu)選例中，所述的個(gè)體是人，尤其是女性。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，對(duì)大量候選基因的SNP進(jìn)行了測(cè)定和分析。首次發(fā)現(xiàn)和證明了LMP2的基因組序列與女性個(gè)體的強(qiáng)直性脊柱炎密切相關(guān)，其中關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，在LMP2的SEQIDN0:1中第424位的SNP(424位A—C)(記為rsl351383)和SEQIDNO:1中第451位的SNP(451位C—G)(記為rsl351382)所組成的單倍型(CG)，在女性對(duì)照組和病例組中的分布存在顯著性差異(代0.05)，因此可作為輔助性檢測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎(或其易感性)的一個(gè)輔助指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。在本發(fā)明中，個(gè)體指女性人。LMP2基因低分子量多肽2(lowmolecularmasspolyp印tide-2，LMP2)的序列是已知，其詳細(xì)序列和一些相關(guān)信息可參見網(wǎng)址http:〃www.ncbLnlm.nih.gov/Genebank/;http:〃而.ncbi.nlm.nih.gov/SNP。為了方便起見，在SEQIDNO:1給出LMP2中與本發(fā)明SNP相關(guān)的核苷酸序列。LMP2基因位于6P2L3，大小為5.7K，其編碼的產(chǎn)物屬于T1B家族(蛋白酶體B型家族)，是一種20s的核心e-亞單位。該基因受Y-干擾素誘導(dǎo)表達(dá)，其產(chǎn)物釋放免疫蛋白酶體中的催化亞單位-1(蛋白酶體e6亞基)。蛋白酶體是一種存在于胞質(zhì)和胞核內(nèi)的蛋白水解酶復(fù)合物，負(fù)責(zé)降解細(xì)胞內(nèi)大部分蛋白質(zhì)，在MHCI類分子包括HLA-B27分子的表達(dá)及相關(guān)抗原呈遞過程中起關(guān)鍵作用。MHCI類分子呈遞的抗原均來源于蛋白酶體的降解產(chǎn)物。蛋白酶體的功能受其結(jié)構(gòu)組成的調(diào)控，其核心部分是由a和P亞單位組成的四環(huán)狀圓柱形結(jié)構(gòu)，與PA28結(jié)合后成為免疫蛋白酶體。LMP2、LMP7及MECL1(multicatalyticendop印tidasecomplex-like1，多催化內(nèi)肽酶樣復(fù)合物-l)是P環(huán)中最重要的具有蛋白水解活性的亞單位，均能被IFN-Y誘導(dǎo)表達(dá)，改變降解蛋白質(zhì)的速度及切割位點(diǎn)，更有利于內(nèi)源性蛋白質(zhì)的降解和抗原的呈遞。LMP2基因的多態(tài)性影響著免疫蛋白酶體的功能狀態(tài)，引起降解內(nèi)源性蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗原肽的數(shù)量和性質(zhì)發(fā)生改變，其中可能包括能誘導(dǎo)AS發(fā)生的特異性抗原肽。除與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)以外，國內(nèi)外均有研究發(fā)現(xiàn)LMP2基因與B27陽性AS病人及其AAU(acuteanterioruveitis,急性前葡萄膜炎)的發(fā)生有關(guān)。具體而言，本發(fā)明揭示了LMP2基因內(nèi)含子l的Snprsl351383C和rsl351382G組成的單倍型具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)效應(yīng)，換言之，單倍型(AC)到單倍型(CG)的改變，增加了女性AS的易感性，與AS顯著相關(guān)。LMP2蛋白的多聚核苷酸可用于LMP2蛋白相關(guān)疾病的輔助診斷。在診斷方面，LMP2蛋白的多聚核苷酸可用于檢測(cè)LMP2蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下LMP2蛋白的異常表達(dá)。如LMP2DNA序列可用于對(duì)活檢標(biāo)本的雜交以判斷LMP2蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為"基因芯片")上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用LMP2蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測(cè)LMP2蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。檢測(cè)可以針對(duì)cDNA，也可針對(duì)基因組DNA。LMP2蛋白突變的形式包括與正常野生型LMP2DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測(cè)突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。最方便的檢測(cè)本發(fā)明SNP的方法，是通過用LMP2基因特異性引物擴(kuò)增樣品的LMP2基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；然后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性-424位A—C和451位C—G，其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQIDN0:1。應(yīng)理解，在本發(fā)明首次揭示了LMP2基因的SNP與強(qiáng)直性脊柱炎的相關(guān)性之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地設(shè)計(jì)出可特異性擴(kuò)增出含該SNP位置的擴(kuò)增產(chǎn)物，然后通過測(cè)序等方法確定是否存在424位A—C和451位C—G。通常，引物的長度為15-50bp，較佳地為20-30bp。雖然引物與模板序列完全互補(bǔ)是優(yōu)選的，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在引物與模板存在一定的不互補(bǔ)(尤其是引物的5'端)的情況下，也能夠特異性地?cái)U(kuò)增(即僅擴(kuò)增出所需的片段)。含有這些引物的試劑盒和使用這些引物的方法都在本發(fā)明范圍之內(nèi)，只要該引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物含有本發(fā)明SNP的對(duì)應(yīng)位置。一種優(yōu)選的引物對(duì)具有SEQIDN0:2和3的序列。雖然擴(kuò)增產(chǎn)物的長度沒有特別限制，但是通常擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為100-2000bp，較佳地為150-1500bp，更佳地為200-1000bp。這些擴(kuò)增產(chǎn)物都應(yīng)含有SEQIDN0:l中第424位和451位。由于本發(fā)明的SNP與強(qiáng)直性脊柱炎具有非常高的關(guān)聯(lián)性，因此不僅可用于早期輔助性診斷強(qiáng)直性脊柱炎，而且可以未雨綢繆地使一些攜帶者在未發(fā)病前就采取合理的預(yù)防措施，從而提高攜帶者的生存期和生存質(zhì)量，因此具有極其重大的應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)效益。當(dāng)然，最終還應(yīng)當(dāng)用常規(guī)檢測(cè)方法進(jìn)行確診。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例l1.1研究對(duì)象8病例樣本全部采集自門診病人，患者的診斷由仁濟(jì)醫(yī)院富有臨床經(jīng)驗(yàn)的風(fēng)濕病科醫(yī)師根據(jù)1984年提出修訂的紐約標(biāo)準(zhǔn)作出，并通過多次隨訪確診。對(duì)照樣本選自南方中心樣本庫中年齡、性別匹配，無關(guān)節(jié)炎病史的個(gè)體。在知情同意的基礎(chǔ)上隨機(jī)收集了40個(gè)女性病人和95個(gè)女性正常對(duì)照個(gè)體的外周血樣本。1.2實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果1.2.1DNA提取用常規(guī)酚氯仿法從人的外周血樣本中提取DNA，濃度校正至20ng/ul后，用于常規(guī)PCR擴(kuò)增。1.2.2PCR及測(cè)序引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中LMP2的基因組序列，設(shè)計(jì)和合成以下引物。具體引物如下表l所示。表l引物序列表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>1.2.3LMP2基因的PCR擴(kuò)增以提取的DNA為模板，用Taq酶，在GeneA即9700PCR儀上以Touchdown程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94'C預(yù)變性2分鐘，94。C變性30秒，63"C退火40秒，72。C延伸40秒，共10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度遞減0.5。C;以后94。C變性30秒，58。C退火40秒，72。C延伸40秒，共30個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸7分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。結(jié)果，分別獲得LMP2的擴(kuò)增產(chǎn)物。1.2.4SNP的發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)PCR產(chǎn)物經(jīng)Resin樹脂純化后，用ABI-3730DNA測(cè)序儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司appliedMosystems(ABI))進(jìn)行測(cè)序，用Polyphred軟件(美國華盛頓大學(xué)http:〃droog.mbt.Washington,edu/Polyphred.html)進(jìn)行序歹ij的判讀、基因分型和SNP確認(rèn)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)存在數(shù)個(gè)SNP，其中包括以下SNP:SEQIDN0:1中424位A—C(rsl351383)和451位C—G(RS1351382)。1.2.5SNP基因分型和關(guān)聯(lián)分析用直接單向測(cè)序法進(jìn)行SNP基因分型。即在強(qiáng)直性脊柱炎病人和正常對(duì)照組中進(jìn)行分型和關(guān)聯(lián)分析。對(duì)基因分型結(jié)果進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，列聯(lián)表進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。觀察基因型在病人和對(duì)照之間是否具有差異。分析結(jié)果如下在女性樣本中，在SEQIDN0:1中424位和451位上，對(duì)照和病例中(AA/CC、AC/CG、CC/GG)的分布分別為(87例、0例、8例)和(32例、1例、7例)，兩者具有顯著性差異，卡方檢驗(yàn)P=0.088。等位基因rsl351383C和rsl351382G所組成的單倍型(CG)在對(duì)照和病例中的頻率分別為8.42%和18.75%，P=0.015。上述結(jié)果表明LMP2基因的SEQIDN0:1中第424位和451位的單倍型(AC)到單倍型(CG)的改變，增加了女性個(gè)體強(qiáng)直性脊柱炎的易感性，與AS顯著相關(guān)。實(shí)施例2強(qiáng)直性脊柱炎易感性檢測(cè)試劑盒如實(shí)施例l所述，SEQIDN0:1中第424位和451位的單倍型(AC)到單倍型(CG)的改變與強(qiáng)直性脊柱炎疾病密切相關(guān)。因此，可基于這個(gè)突變?cè)O(shè)計(jì)LMP2基因特異性引物在以病人的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)。制備一試劑盒(100人次)，它含有名稱擊濃度有義引物SEQIDNO:2lOOpmol反義引物SEQIDNO:3lOOpmolPCR反應(yīng)液含Taq酶dNTP鎂離子PCR反應(yīng)緩沖液隨機(jī)挑選100個(gè)女性個(gè)體構(gòu)成的測(cè)試組，其中包括未知是否患強(qiáng)直性脊柱10炎的對(duì)象、己知患強(qiáng)直性脊柱炎病人和經(jīng)檢測(cè)無強(qiáng)直性脊柱炎的正常人。抽取測(cè)試組中待檢測(cè)對(duì)象的外周血3ml，使用常規(guī)方法(或使用特定的試劑盒)從血液中提取DNA。將強(qiáng)直性脊柱炎檢測(cè)試劑盒中的PCR引物稀釋到limol/U,以所提取的DNA為模板與所提供的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物純化后，用ABI3730DNA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，用Polyphred軟件進(jìn)行序列的判讀和SNP確認(rèn)?；蛘?，將擴(kuò)增產(chǎn)物與正常對(duì)照用變性高效液相色譜儀(DHPLC)進(jìn)行色譜分析，也可檢測(cè)出LMP2基因中424位A—C和451位C—G。檢測(cè)結(jié)果對(duì)于LMP2基因存在424位A—C和451位C—G的女性對(duì)象，進(jìn)一步通過常規(guī)方法檢測(cè)以確認(rèn)是否患有強(qiáng)直性脊柱炎情況。檢測(cè)結(jié)果表明，含"CG"單倍型的女性檢測(cè)對(duì)象的強(qiáng)直性脊柱炎易感性比例明顯高于正常人群(高出至少100%)。因此，這表明通過檢測(cè)上述二個(gè)位點(diǎn)是否存在(AC)向(CG)的改變，可進(jìn)行強(qiáng)直性脊柱炎的輔助性檢測(cè)。實(shí)施例3強(qiáng)直性脊柱炎易感性輔助性檢測(cè)重復(fù)實(shí)施例2的檢測(cè)，不同點(diǎn)在于隨機(jī)選取了90個(gè)女性(檢測(cè)前不知道是否有強(qiáng)直性脊柱炎癥狀)進(jìn)行檢測(cè)。制備一試劑盒(100人次)，它含有<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>抽取待檢測(cè)對(duì)象的外周血3ml,使用常規(guī)方法(或使用特定的試劑盒)從血液中提取DNA。將強(qiáng)直性脊柱炎檢測(cè)試劑盒中的PCR引物稀釋到limol/il，以所提取的DNA為模板與所提供的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物純化后，用ABI3730DNA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，用Polyphred軟件進(jìn)行序列的判讀和SNP確認(rèn)。結(jié)果同樣證實(shí)了，所有檢測(cè)的在SEQIDNO:1的424位和451位為"CG"單倍型的女性檢測(cè)對(duì)象的強(qiáng)直性脊柱炎易感性比例明顯高于女性正常人群(高出至少一倍)。這表明通過檢測(cè)上述二個(gè)位點(diǎn)是否存在(AC)向(CG)的改變，可在女性中進(jìn)行強(qiáng)直性脊柱炎的輔助性檢測(cè)。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>上海人類基因組研究中心<120〉強(qiáng)直性脊柱炎易感性檢測(cè)方法和試劑盒5<130>081328〈160〉3<170〉Patentlnversion3.4<210〉1〈211〉709<212>DNA<213>智人(Homosapiens)<400>1tctgccctacacacgttagcgccgcgcgcaaagcagccccgcagcacccaggcgcctcct60ggcggcgccgcga鄉(xiāng)ggcggggctgtcggctgcgcgttgtgcgctgtcccaggttggaa120accagtgccccaggcggcgaggagagcggtgccttgcagggatgctgcgggcgggagcac180caaccggggacttaccccgggcgggagaagtccacaccggggtaatgggtctgggcttga240gggttggcagaggggtggaggagatgcagcggccaggggaccctggaagcgcgcgcggag300aagtgaatgcagagaccaacgggagcgcagggaggtcgcctgtagcagccagcgcttgca360etcccgcaatgagcatagagtatttcttttctgaggggggtcgtctagagtgtccgtgaag420ggaacaggcacgcgaggctggtggaaaaagcgggtgctttgactcttagctggaagcgtc480aacgggaagctactctaaagcgctttcgctttcactctggtcccggacagtgggggctgg540tta犯tcaagaaagggggttggggatggtgcaaag柳tg鄉(xiāng)aaatggtgccctgggtg600a3gtag33cagcscttggg3ga3gga犯t3tsggcacttattg3g肪ggeiccasctcatc660acacagacttttgataaacttgccactgggcaactcttagcccaagcac709<210〉2〈211>20〈212〉腿<213〉引物<400>2tctgccctacacacgttagc20〈210〉3<211〉20<212>鵬<213〉引物<400〉3gtgcttgggctaagagttgc20權(quán)利要求1.一種體外檢測(cè)樣品是否存在抗原肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(LMP2)的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，包括步驟(a)用LMP2基因特異性引物擴(kuò)增樣品的LMP2基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和(b)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性424位A→C和451位C→G；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQIDNO1。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的LMP2基因特異性引物具有SEQIDN0:2和3的序列。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為100-2000bp且含有SEQIDNO:1中第424和451位。4.一種檢測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴(kuò)增LMP2基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，所述的引物擴(kuò)增出長度為100-2000bp且含有SEQIDN0:1中第424和451位的擴(kuò)增產(chǎn)物。5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，它還含有選自下組的試劑(a)與SEQIDN0:l中第424和451位的突變位點(diǎn)結(jié)合的探針；(b)識(shí)別SEQIDN0:l中第424和451位的突變位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶。6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的突變位點(diǎn)是以下的單核苷酸多態(tài)性424位A—C禾口451位C—G;其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQIDN0:1。7.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的LMP2基因特異性引物具有SEQIDN0:2和3的序列。8.—種對(duì)個(gè)體的強(qiáng)直性脊柱炎易感性進(jìn)行診斷的方法，其特征在于，它包括步驟檢測(cè)該個(gè)體的LMP2基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常的LMP2基因或轉(zhuǎn)錄本相比較；其中，存在差異就表明該個(gè)體患強(qiáng)直性脊柱炎的可能性高于正常人群。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，檢測(cè)的是LMP2基因，并與正常LMP2的核苷酸序列比較差異或者所述的個(gè)體是女性。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的差異是424位A—C和451位C—G;其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQIDN0:1。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎易感性的方法，它包括檢測(cè)該個(gè)體的LMP2基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常的LMP2基因或轉(zhuǎn)錄本相比較；其中，存在差異就表明該個(gè)體患強(qiáng)直性脊柱炎的可能性高于正常人群。本發(fā)明還公開了相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101525659SQ20081003422公開日2009年9月9日申請(qǐng)日期2008年3月5日優(yōu)先權(quán)日2008年3月5日發(fā)明者牛振民,蓉雷,薇黃申請(qǐng)人:上海人類基因組研究中心