專利名稱：一維生物芯片及其在基因、蛋白表達分析中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微全分析系統(tǒng)領(lǐng)域，具體涉及一種基于微流控的基因或蛋白串性分析技術(shù)。
背景技術(shù)：
微全分析系統(tǒng)(μ-TAS，又稱芯片實驗室，Lab-on-chip)現(xiàn)已成為當今生命科學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)展最快的重要前沿之一。具備微型化、集成化、多功能以及高通量等特性的微全分析系統(tǒng)使得系統(tǒng)研究一個生物體系的基因表達及蛋白表達成為可能，并將革命性地改變生物醫(yī)學(xué)檢驗與疾病診斷。目前國內(nèi)外芯片技術(shù)大致朝著兩個方向發(fā)展一類是微流控芯片，主要以分析化學(xué)和分析生物化學(xué)為基礎(chǔ)，以微機電加工技術(shù)為依托，以微管道網(wǎng)絡(luò)為結(jié)構(gòu)特征，是當前微全分析系統(tǒng)發(fā)展的重點；一類是基于二維點陣式的、高通量大規(guī)模并行分析方法的微陣列芯片，主要以生物技術(shù)為基礎(chǔ)，以親和結(jié)合技術(shù)為核心，以在芯片表面固定一系列高密度的、有序并且可尋址的識別分子陣列為結(jié)構(gòu)特征，是高通量地獲取相關(guān)生物信息的一種新型技術(shù)手段。從目前的文獻報道看，這兩種芯片技術(shù)擁有各自的技術(shù)優(yōu)勢和研究領(lǐng)域，雖然發(fā)展迅速，卻沒有實現(xiàn)交叉和融合，一些相關(guān)技術(shù)的發(fā)展仍待跟進。如今，生命科學(xué)的發(fā)展已經(jīng)深入到單細胞、亞細胞、單分子這樣的層次，實現(xiàn)單細胞水平上的基因、蛋白表達分析已成為生命科學(xué)研究的一個重大挑戰(zhàn)。這一重大科學(xué)目標的實現(xiàn)亟需適合其需求的相關(guān)平臺技術(shù)的突破和發(fā)展。因此，發(fā)展芯片技術(shù)、構(gòu)建新型芯片技術(shù)平臺，提高檢測靈敏度和目標分子特異性識別能力，實現(xiàn)單細胞水平上的基因、蛋白表達分析，是當前研究者們不懈努力的一個方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提出和構(gòu)建一種新型生物芯片，將微流控芯片與基于高通量并行分析方法的陣列芯片原理結(jié)合起來，成為基于微流控串行分析技術(shù)的一種新型芯片平臺技術(shù)，以提高檢測靈敏度和目標分子特異性識別能力，實現(xiàn)單細胞水平上的基因、蛋白表達譜分析。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)發(fā)明目的的。一維生物芯片，包括聚二甲基硅氧烷片基和玻片片基，在陽模板上用聚二甲基硅氧烷澆注的一維生物芯片PDMS片基中的微通道的兩端分別與儲液池相通，微通道上設(shè)置了若干個互相連通的小室，小室內(nèi)放置表面可以修飾各種相同或不相同生物分子的微顆粒。小室內(nèi)放置的可以修飾各種生物分子的微顆?？梢允枪桀w粒，也可以是聚苯乙烯類有機物聚合的顆粒。一維生物芯片用于基因、蛋白表達的分析方法包括微顆粒中的硅顆粒用堿活化或氨基化、羧基化處理，微顆粒在修飾前用生物素與親和素或親和素與戊二醛或單一的戊二醛或溴化氰進行預(yù)處理，然后加入各種已知的生物分子，以及將修飾了不同生物分子的微顆粒逐個移入微通道的小室后，用潔凈的玻片粘合封裝。
(1)、蛋白的表達分析為按待分析蛋白要求，選取已知的一維蛋白芯片，取微量的待分析的目標分子置于芯片一側(cè)儲液池中，以平均20mm/min的壓力驅(qū)動或300v/cm的電驅(qū)動方式，使樣品流經(jīng)微通道進入小室，經(jīng)30～10分鐘后，用二次水沖洗儲液池和微通道中的多余樣品溶液，然后以同樣條件的壓力驅(qū)動或電驅(qū)動方式將待分析目標分子的一抗兔抗單或多克隆抗體與熒光標記的二抗山羊抗兔IgG，以1∶100比例的抗體稀釋液稀釋后依次由儲液池進入微通道與小室中的微顆粒作用，20分鐘后用二次水洗凈儲液池和微通道，反應(yīng)后的芯片用熒光成像檢測；(2)、基因的表達分析為按待分析基因要求，選取已知的一維基因芯片，取微量待分析的靶DNA的TM雜交緩沖液置于芯片的一側(cè)儲值池中，以平均20mm/min的壓力驅(qū)動方式使樣品溶液流經(jīng)微通道進入小室，20分鐘后用二次水沖洗儲液池和微通道，洗去多余樣品溶液，以同樣條件的壓力驅(qū)動方式將熒光標記的報告探針的Mg2+濃度為200mM的10mM TM雜交緩沖液流經(jīng)微通道，與小室中的靶DNA雜交，20分鐘后用二次水洗凈儲液池和微通道，反應(yīng)后的芯片用熒光成像檢測。
下面結(jié)合附圖進一步詳述本發(fā)明。


圖1為一維生物芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為CNE2細胞中p53蛋白的表達結(jié)果；圖3為不同細胞中p53蛋白的表達結(jié)果；圖4為一維生物芯片檢測p53蛋白的校正曲線；圖5為一維生物芯片用于基因表達譜的研究。
首先制作一維生物芯片的掩膜和陽模板，然后在陽模板上采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)澆注的方式制作成一維生物芯片的PDMS片基。一維生物芯片PDMS片基上的微管道網(wǎng)絡(luò)設(shè)計區(qū)別于傳統(tǒng)的微流控芯片，在于微分離通道上設(shè)置了多個小室，不同的小室放置表面修飾了不同生物分子的微顆粒，修飾的生物分子可以是不同的抗體，也可以是不同的分子探針(如分子信標，三明治探針等)，分別構(gòu)成一維蛋白質(zhì)芯片和一維基因芯片。采用顯微操縱方式將修飾了生物分子的微顆粒放置到微通道的小室里，首先，用一套進口的拉針、燒針和磨針系統(tǒng)制作微吸管，然后將微吸管裝在固定在倒置顯微鏡上的顯微操縱系統(tǒng)上，在顯微條件下，將微顆粒逐個移入微通道的小室，每個小室對應(yīng)某種已知的、特定的修飾微顆粒，不同的芯片可以進行不同的編碼，識別和捕獲樣品溶液中的多種目標分子。
芯片最后的封裝是將放置了修飾顆粒的PDMS片基與玻片片基進行粘合。將待分析目標分子和試劑溶液進入芯片微通道可采用壓力驅(qū)動或電驅(qū)動兩種方式，當樣品流經(jīng)設(shè)置了多個小室的微通道時，微顆?？梢蕴禺愋缘刈R別和捕獲多種目標分子，在一維生物芯片中，這些目標分子是無須進行電泳分離的，因此也無須考慮電泳分離條件的一系列優(yōu)化問題。反應(yīng)后的芯片用熒光成像系統(tǒng)進行檢測。
如圖1所示的一維生物芯片的結(jié)構(gòu)，1、6是直徑為1～2mm的圓形儲液池，一端作樣品池，另一端作廢液池，微通道2由多個小室3構(gòu)成，小室寬為80μm，微通道深均為60μm，卡口4寬20μm。小室中放置的微顆粒5為微米級硅顆粒或有機聚合物顆粒(如聚苯乙烯顆粒)，直徑約40μm，顆粒表面用實驗室方法修飾上特定的生物分子，如抗體，分子探針等。
微顆粒修飾生物分子的方法如下微顆粒表面修飾分子信標探針(Molecular beacon，簡稱MB)或三明治探針(Sandwichprobe)二氧化硅顆粒取直徑40μm二氧化硅顆粒約10mg置于0.5ml Ep管中，加入500μl0.01M NaOH活化20min，用二次水清洗3次；活化后的顆粒，加入80μl 0.1～1.0mg/mlbiotin-BSA，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩12～48h，然后用二次水清洗3次，這樣顆粒上結(jié)合了biotin分子；加入80μl 0.1～1.0mg/ml streptavidin(或avidin)，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩1～4h，用二次水清洗3次，streptavidin(或avidin)因與顆粒上的biotin分子作用而結(jié)合到了顆粒表面；加入50μl 0.1～1.0M的連接了biotin的MB或三明治探針，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩1～4h，MB或三明治探針通過biotin與streptavidin(或avidin)的作用修飾到顆粒表面；用TM緩沖液清洗3次，之后懸浮于TM中備用(4℃)。
氨基化二氧化硅顆粒取直徑40μm氨基化二氧化硅顆粒約10mg置于0.5ml Ep管中，加入80μl 0.1～1.0mg/ml streptavidin(或avidin)，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩4～24h，用二次水清洗3次；加入100μl 4％戊二醛，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩1～4h，用二次水清洗3次，這樣通過戊二醛交聯(lián)的方法將streptavidin(或avidin)結(jié)合到了顆粒表面；加入50μl 0.1～1.0M的連接了biotin的MB或三明治探針，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩1～4h，MB或三明治探針通過biotin與streptavidin(或avidin)的作用修飾到顆粒表面；用TM緩沖液清洗3次，之后懸浮于TM中備用(4℃)。
有機聚合物顆粒取直徑40μm聚苯乙烯顆粒約10mg置于0.5ml Ep管中，加入80μl0.1～1.0mg/ml biotin-BSA，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩12～48h，然后用二次水清洗3次，這樣顆粒上結(jié)合了biotin分子；加入80μl 0.1～1.0mg/ml streptavidin(或avidin)，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩1～4h，用二次水清洗3次，streptavidin(或avidin)因與顆粒上的biotin分子作用而結(jié)合到了顆粒表面；加入50μl 0.1～1.0μM的連接了biotin的MB或三明治探針，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩1～4h，MB或三明治探針通過biotin與streptavidin(或avidin)的作用修飾到顆粒表面；用TM緩沖液清洗3次，之后懸浮于TM中備用(4℃)。
微顆粒表面修飾單克隆抗體二氧化硅顆粒取直徑40μm二氧化硅顆粒約10mg置于0.5ml Ep管中，加入200μl 2MNa2C03溶液，活化15～30min，再加入100μl 1g/ml CNBr乙腈溶液，繼續(xù)反應(yīng)30min。將反應(yīng)后的顆粒用冰水充分洗滌3次，10mM PBS緩沖液充分洗滌3次。往Ep管中加入100μl4～100μg/ml鼠抗單克隆抗體，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩24～48h，這樣通過CNBr交聯(lián)的方法將鼠抗單克隆抗體修飾到了顆粒表面。將反應(yīng)后的顆粒用10mM PBS緩沖液清洗3次，加入含0.1％～3％BSA的10mM PBS緩沖液，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩6～24h，將顆粒表面的多余活性位點進行封閉。取出，于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 氨基化二氧化硅顆粒取直徑40μm氨基化二氧化硅顆粒約10mg置于0.5ml Ep管中，加入100μl 4％戊二醛，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩1～4h，用二次水清洗3次；加入100μl 4～100μg/ml鼠抗單克隆抗體，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩6～24h，這樣通過戊二醛交聯(lián)的方法將鼠抗單克隆抗體修飾到了顆粒表面。將反應(yīng)后的顆粒用10mM PBS緩沖液清洗3次，加入含0.1％～3％BSA的10mM PBS緩沖液，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩6～24h，將顆粒表面的多余活性位點進行封閉。取出，于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 有機聚合物顆粒取直徑40μm聚苯乙烯顆粒約10mg置于0.5ml Ep管中，加入100μl4～100μg/ml鼠抗單克隆抗體，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩12～48h，這樣鼠抗單克隆抗體就修飾到了顆粒表面。用10mM PBS緩沖液清洗3次，加入含0.1％～3％BSA的10mM PBS緩沖液，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩6～24h，將顆粒表面的多余活性位點進行封閉。取出，于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明將微流控芯片與基于高通量并行分析方法的陣列芯片原理結(jié)合起來，發(fā)展成基于微流控串行分析技術(shù)的一種新型芯片平臺技術(shù)，這種芯片設(shè)計的特點，兼具有微流控技術(shù)與陣列分析的優(yōu)點，如試樣用量極微，自動化程度高，不易污染，高通量等?；瘜W(xué)與生物修飾過程中運用了生物納米技術(shù)和分子探針技術(shù)，目的是拓展芯片中的化學(xué)、生物信號放大技術(shù)和信號傳感技術(shù)，大大提高檢測靈敏度和目標分子特異性識別能力，為在“芯片實驗室”上實現(xiàn)單細胞水平上的基因、蛋白表達譜分析，為腫瘤研究和藥物篩選提供一個強有力的研究手段。
具體實施例方式
實施例1(一維生物芯片的構(gòu)造及其在細胞蛋白表達譜的研究應(yīng)用)有機聚合物顆粒表面修飾單克隆抗體取直徑40μm聚苯乙烯顆粒約10mg置于0.5mlEp管中，加入100μl 20μg/ml鼠抗單克隆抗體，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩24h。用10mM PBS緩沖液清洗3次，加入含0.1％～3％BSA的10mM PBS緩沖液，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩12h。取出，于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 在已經(jīng)制作好的陽模板上用聚二甲基硅氧烷(PDMS)澆注一維生物芯片的PDMS片基，置于75℃烘箱40分鐘左右，待固化后取出，將PDMS片基從陽模板上剝離下來。將PDMS片基置于Leica倒置顯微鏡下，在顯微條件下，采用顯微操縱方式將上述表面修飾一系列相關(guān)表達蛋白的鼠抗單克隆抗體的直徑為40μm聚苯乙稀顆粒放置到PDMS片基的微通道的小室里，每個小室對應(yīng)已知的、特定的修飾微顆粒，用以識別和捕獲樣品溶液中的多種目標分子。將放置了鼠抗單克隆抗體修飾顆粒的PDMS片基與非常潔凈的玻片片基進行粘合完成芯片的封裝。
取3μl從腫瘤細胞中抽提出來的蛋白質(zhì)樣品溶液，置于樣品池中，在壓力驅(qū)動下以平均20mm/min的流速從芯片的微通道中流過，與微顆粒發(fā)生作用，20分鐘后用二次水沖洗樣品池和微通道，洗去多余的樣品溶液。然后同樣以壓力驅(qū)動方式分別將目標分子的兔抗多克隆抗體(一抗，Santa Cruz產(chǎn)品，濃縮液按1∶100用抗體稀釋液稀釋，一次消耗僅需3μl)、Cy3標記的山羊抗兔IgG(二抗，Sigma試劑，濃縮液按1∶100用抗體稀釋液稀釋，一次消耗僅需3μl)依次引入微通道中與微顆粒發(fā)生作用，試劑每次在微通道中停留20分鐘，然后用二次水洗去。最終在微顆粒表面特異性地結(jié)合上Cy3熒光標記物。通過熒光成像檢測，可以獲得腫瘤細胞中一系列相關(guān)蛋白的表達譜信息。
實施例2(一維生物芯片檢測腫瘤細胞CNE2中p53蛋白的表達)氨基化二氧化硅顆粒表面修飾單克隆抗體取直徑40μm氨基化二氧化硅顆粒約10mg置于0.5ml Ep管中，加入100μl 4％戊二醛，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩2h，用二次水清洗3次；加入100μl 20μg/ml鼠抗P53單克隆抗體，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩12h。將反應(yīng)后的顆粒用10mM PBS緩沖液清洗3次，加入含0.1％～3％BSA的10mM PBS緩沖液，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩12h。取出，于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 在已經(jīng)制作好的陽模板上用聚二甲基硅氧烷(PDMS)澆注一維生物芯片的PDMS片基，置于75℃烘箱40分鐘左右，待固化后取出，將PDMS片基從陽模板上剝離下來。將PDMS片基置于Leica倒置顯微鏡下，在顯微條件下，采用顯微操縱方式將直徑為40μm左右表面修飾鼠抗P53的氨基化二氧化硅顆粒放置到PDMS片基的微通道的小室里，再將放置了鼠抗p53修飾顆粒的PDMS片基與非常潔凈的玻片片基進行粘合完成芯片的封裝。
在顯微條件下，用微吸管移取50個CNE2細胞到樣品池中，加入0.1％SDS溶液將細胞溶膜裂解。樣品以電驅(qū)動方式引入微通道中，與微顆粒發(fā)生作用，電壓控制在約300v/cm，進樣時間10分鐘。然后用二次水沖洗儲液池和微通道，洗去多余的樣品溶液。樣品池換上3μl兔抗p53多克隆抗體(一抗，SantaCruz產(chǎn)品，濃縮液按1∶100用抗體稀釋液稀釋)，在300v/cm電壓控制下一抗進入微通道中與微顆粒發(fā)生作用，10分鐘后用二次水沖洗干凈儲液池和微通道。最后樣品池換上3μl FITC標記的羊抗兔IgG(二抗，Santa Cruz產(chǎn)品，濃縮液按1∶100用抗體稀釋液稀釋)，在300v/cm電壓控制下二抗進入微通道中與微顆粒發(fā)生作用，10分鐘后用二次水沖洗干凈儲液池和微通道。這樣在微顆粒表面最終特異性地結(jié)合上FITC熒光標記物。另用一塊芯片做對照實驗，除了不加樣品外，其余步驟同上一致。將反應(yīng)后的芯片置于熒光倒置顯微鏡增強型CCD(ICCD)成像系統(tǒng)下，對微顆粒成像，可獲得高靈敏的熒光圖像，如圖2所示。結(jié)果表明，加樣后用一維生物芯片靈敏地檢測出了CNE2細胞的p53蛋白，芯片中的鼠抗p53修飾顆粒因特異性地識別CNE2細胞的p53蛋白而發(fā)出熒光，檢測的細胞個數(shù)為50個，而未加樣的一維生物芯片檢測結(jié)果呈陰性，此結(jié)果與傳統(tǒng)的western blotting的實驗結(jié)果一致。
實施例3(一維生物芯片檢測幾種細胞中p53蛋白的表達)二氧化硅顆粒表面修飾單克隆抗體取直徑40μm二氧化硅顆粒約10mg置于0.5ml Ep管中，加入200μl 2M Na2C03溶液，活化15～30min，再加入100μl 1g/ml CNBr乙腈溶液，繼續(xù)反應(yīng)30min。將反應(yīng)后的顆粒用冰水充分洗滌3次，10mM PBS緩沖液充分洗滌3次。往Ep管中加入100μl 20μg/ml鼠抗P53單克隆抗體，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩24h。將反應(yīng)后的顆粒用10mM PBS緩沖液清洗3次，加入含0.1％～3％BSA的10mM PBS緩沖液，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩12h。取出，于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 在已經(jīng)制作好的陽模板上用聚二甲基硅氧烷(PDMS)澆注一維生物芯片的PDMS片基，置于75℃烘箱40分鐘左右，待固化后取出，將PDMS片基從陽模板上剝離下來。將PDMS片基置于Leica倒置顯微鏡下，在顯微條件下，采用顯微操縱方式將直徑為40μm左右表面修飾鼠抗p53單克隆抗體的二氧硅顆粒放置到PDMS片基的微通道的小室里，再將放置了鼠抗p53修飾顆粒的PDMS片基與非常潔凈的玻片片基進行粘合完成芯片的封裝。
對4種培養(yǎng)的細胞CNE2、A549、敲除了p53基因的CHO(以CHO-p53表示)以及正常成纖維細胞(Fibroblast)分別進行蛋白質(zhì)的抽提，分別取3μl從4種細胞中抽提出來的蛋白質(zhì)樣品溶液，各置于4塊芯片的樣品池中，在壓力驅(qū)動下以平均20mm/min的流速從芯片的微通道中流過，與微顆粒發(fā)生作用，20分鐘后用二次水沖洗樣品池和微通道，洗去多余的樣品溶液。然后同樣以壓力驅(qū)動方式分別將兔抗p53多克隆抗體(一抗，SantaCruz產(chǎn)品，濃縮液按1∶100用抗體稀釋液稀釋，一次消耗3μl)、Cy3標記的山羊抗兔IgG(二抗，Sigma試劑，濃縮液按1∶100用抗體稀釋液稀釋，一次消耗3μl)依次引入微通道中與微顆粒發(fā)生作用，試劑每次在微通道中停留20分鐘，然后用二次水洗去。最終在微顆粒表面特異性地結(jié)合上Cy3熒光標記物。將反應(yīng)后的芯片置于熒光倒置顯微鏡CCD成像系統(tǒng)下，對微顆粒成像，并用熒光圖像分析軟件進行分析，可獲得如圖3所示的不同細胞中p53蛋白的表達情況。從圖3可以看出，敲除了p53基因的CHO細胞，p53蛋白的表達呈陰性，結(jié)果與理論相符，而正常成纖維細胞(Fibroblast)和腫瘤細胞CNE2、A549均有p53蛋白的表達。這些結(jié)果與傳統(tǒng)的western blotting的實驗結(jié)果一致。
配制一系列不同濃度的p53蛋白的標準溶液(濃度單位是nM)0.1；0.5；1.0；5.0；10；50；100。按同上的方法將不同濃度的p53蛋白的標準溶液用壓力驅(qū)動的方式分別引入芯片中進行檢測，可獲得如圖4所示的一維生物芯片檢測p53蛋白的校正曲線。圖4表明，實施例3在0.1～10nM的p53蛋白的檢測范圍內(nèi)具有很大的響應(yīng)斜率，靈敏度高。以3倍信噪比作為信號檢出限，檢測下限達到了0.05nM。
實施例4(一維生物芯片應(yīng)用于基因表達譜研究)二氧化硅顆粒表面修飾三明治探針(Sandwich probe)取直徑40μm二氧化硅顆粒約10mg置于0.5ml Ep管中，加入500μl 0.01M NaOH活化20min，用二次水清洗3次；活化后的顆粒，加入80μl 1mg/ml biotin-BSA，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩24h，然后用二次水清洗3次；加入80μl 1mg/ml streptavidin(或avidin)，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩2h，用二次水清洗3次；加入50μl 1μM的連接了biotin的三明治探針，置于低溫搖床(4℃，＞300rpm)搖蕩2h，用TM緩沖液清洗3次，之后懸浮于TM中備用(4℃)。
在已經(jīng)制作好的陽模板上用聚二甲基硅氧烷(PDMS)澆注一維生物芯片的PDMS片基，置于75℃烘箱40分鐘左右，待固化后取出，將PDMS片基從陽模板上剝離下來。將PDMS片基置于Leica倒置顯微鏡下，在顯微條件下，采用顯微操縱方式將直徑為40μm左右的二氧化硅顆粒放置到PDMS片基的微通道的小室里，二氧化硅顆粒為三種不同修飾顆粒，表面修飾三明治DNA捕獲探針分別是p53(5’-ACACGCACCTCAAAGCAAT-Biotin-3’)、p21(5’-CCATCAATGACCAC-biotin-3’)和nm23(5’-ATGAAGGTACGCTC-biotin-3’)。將放置了修飾顆粒的PDMS片基與非常潔凈的玻片片基進行粘合完成芯片的封裝。
取3μl樣品溶液置于樣品池中，樣品溶液是含0.1nM p53(5’-GCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGG-3’)、p21(5’-GTGGTCATTGATGGGGAG ACGTGCCTGT-3’)和nm23(5’-GAGCGTACCTTCATTGCGATCAAACCAG-3’)靶DNA的TM雜交緩沖液(10mM)，雜交緩沖液中Mg2+濃度為200mM。在壓力驅(qū)動下樣品溶液以平均20mm/min的流速從芯片的微通道中流過，與微顆粒上的DNA捕獲探針進行雜交，20分鐘后用二次水沖洗樣品池和微通道，洗去多余的樣品溶液。樣品池換上3μl四甲基羅丹明(TAMRA)標記的0.1nM p53、p21和nm23熒光報告探針p53(5’-(TAMRA)-AACCAGGACAGGCACAA-3’)、p21(5’-TAMRA-ACAGGCACGTCTCC-3’)和nm23(5’-TAMRA-CTGGTTTGATCGCA-3’)(10mM的TM雜交緩沖液，Mg2+濃度為200mM)，在壓力驅(qū)動下進入微通道中與微顆粒上結(jié)合的靶DNA進行雜交，20分鐘后用二次水沖洗干凈儲液池和微通道。這樣在微顆粒表面最終特異性地結(jié)合上TAMRA熒光標記物。另用一塊芯片做對照實驗，除了不加樣品外，其余步驟同上一致。將反應(yīng)后的芯片置于熒光倒置顯微鏡ICCD成像系統(tǒng)下，對微顆粒成像，并用熒光圖像分析軟件進行分析，可獲得如圖5所示的三種基因的表達結(jié)果。結(jié)果表明，用一維生物芯片靈敏地檢測出了三種目標DNA，芯片中三種修飾顆粒上的DNA捕獲探針和熒光報告探針因特異性地識別p53、p21和nm23靶DNA使修飾顆粒發(fā)出熒光，與各自的濃度對應(yīng)，熒光強度基本一致。在本實施例中獲得的檢測下限達到了0.01nM。
權(quán)利要求
1.一種一維生物芯片，包括聚二甲基硅氧烷片基和玻片片基，其特征在于陽模板上用聚二甲基硅氧烷澆注的一維生物芯片PDMS片基中的微通道(2)的兩端分別與儲液池(1)、(6)相通，微通道(2)上設(shè)置了若干個互相連通的小室(3)，小室(3)內(nèi)放置表面可以修飾各種相同或不相同生物分子的微顆粒(5)。
2.按權(quán)利要求書1所述的一種一維生物芯片，其特征在于小室(3)內(nèi)放置的可以修飾各種生物分子的微顆粒(5)可以是硅顆粒，也可以是聚苯乙烯類有機聚合物顆粒。
3.一種如權(quán)利要求1所述的一維生物芯片在基因、蛋白表達分析中的應(yīng)用，其特征在于該一維生物芯片用于基因、蛋白表達的分析方法包括微顆粒中的硅顆粒用堿活化或氨基化、羧基化處理，微顆粒在修飾前用生物素與親和素或親和素與戊二醛或單一的戊二醛或溴化氰進行預(yù)處理，然后加入各種已知的生物分子，以及將修飾了不同生物分子的微顆粒逐個移入微通道的小室后，用潔凈的玻片粘合封裝，其特征在于(1)、蛋白的表達分析為按待分析蛋白要求，選取已知的一維蛋白芯片，取微量的待分析的目標分子置于芯片一側(cè)儲液池(1)或(6)中，以平均20mm/min的壓力驅(qū)動或300v/cm的電驅(qū)動方式，使樣品流經(jīng)微通道(2)進入小室(3)，經(jīng)30～10分鐘后，用二次水沖洗儲液池和微通道中的多余樣品溶液，然后以同樣條件的壓力驅(qū)動或電驅(qū)動方式將待分析目標分子的一抗兔抗多克隆抗體與熒光標記的二抗山羊抗兔IgG，以1∶100比例的抗體稀釋液稀釋后依次由儲液池進入微通道與小室中的微顆粒作用，20分鐘后用二次水洗凈儲液池和微通道，反應(yīng)后的芯片用熒光成像檢測；(2)、基因的表達分析為按待分析基因要求，選取已知的一維基因芯片，取微量待分析的靶DNA的TM雜交緩沖液置于芯片的一側(cè)儲液池(1)或(6)中，以平均20mm/min的壓力驅(qū)動方式使樣品溶液流經(jīng)微通道(2)，進入小室(3)，20分鐘后用二次水沖洗儲液池和微通道，洗去多余樣品溶液，以同樣條件的壓力驅(qū)動方式將熒光標記的報告探針的Mg2+濃度為200mM的10mM TM雜交緩沖液流經(jīng)微通道，與小室中的靶DNA雜交，20分鐘后用二次水洗凈儲液池和微通道，將反應(yīng)后的芯片用熒光成像檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及微全分析系統(tǒng)的串行分析技術(shù)。一維生物芯片是在微流控芯片微分離通道上設(shè)置多個小室，不同的小室放置表面修飾了不同生物分子的微顆粒；在進行基因或蛋白分析時，當樣品流經(jīng)設(shè)置了多個小室的微通道，微顆粒特異性地識別和捕獲多種目標分子，然后引入帶熒光標記的試劑，微顆粒表面最終特異性地結(jié)合上熒光標記物，再用熒光成像檢測。本發(fā)明設(shè)計的一維生物芯片不僅具微流控技術(shù)與陣列分析的優(yōu)點，而且提高了檢測靈敏度和目標分子特異性識別能力，為實現(xiàn)單細胞水平上的基因、蛋白表達分析，為腫瘤研究和藥物篩選提供一個強有力的研究手段。
文檔編號C12Q1/68GK1635146SQ200410046790
公開日2005年7月6日 申請日期2004年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月23日
發(fā)明者王柯敏, 周雷激, 譚蔚泓, 左新兵, 文建輝, 陳韻晴, 張何 申請人:湖南大學(xué)