專利名稱：輔酶nadh的光化學(xué)再生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是涉及一種NADH的光化學(xué)再生方法，屬于輔酶再生技術(shù)。
背景技術(shù)：
在酶的六大類型中，30％～35％為氧化還原酶。大部分氧化還原酶催化作用的發(fā)揮需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶(NAD(P)+、NAD(P)H)作為氧化劑或還原劑直接參與反應(yīng)。然而，NAD(P)+和NAD(P)H的價格昂貴，通常比酶促反應(yīng)所得產(chǎn)物要貴得多。因此，從技術(shù)經(jīng)濟(jì)性的角度來看，對輔酶進(jìn)行再生并循環(huán)使用是很有必要的。此外，輔酶再生能夠簡化產(chǎn)物的分離，并有利于酶促反應(yīng)向正反應(yīng)方向移動。
目前已有的再生方法包括酶法、電化學(xué)法、光化學(xué)法等。酶法再生的優(yōu)點(diǎn)在于反應(yīng)速率快，選擇性高，再生體系與合成體系兼容性好。但所用酶往往比較昂貴，且體系涉及兩種或兩種以上酶。酶的最適應(yīng)用條件往往不一致，給過程優(yōu)化帶來困難。電化學(xué)法的再生能量來自于潔凈的電能，與酶法相比成本低。電化學(xué)法中氧化還原電勢的控制和反應(yīng)過程的監(jiān)測都較為容易。但是它與酶促合成體系的兼容性差，選擇性低(尤其是對于還原態(tài)輔酶的再生)，因此電化學(xué)法比較適合于氧化態(tài)輔酶的再生。光化學(xué)法再生輔酶利用的是廉價且潔凈的光能，通常需要光敏劑、電子媒介物和電子供體。光化學(xué)再生法目前還未獲得理想的效果，其再生效率很低，但具有廣闊的潛在應(yīng)用前景。
現(xiàn)有的NADH光化學(xué)再生法常采用金屬絡(luò)合物，如Ru(II)-三(二嘧啶)(Ru(bpy)32+)、Zn(II)-N-(四甲基吡啶)卟啉(Zn-TMPy4+)或半導(dǎo)體(TiO2、CdS)為光敏劑，在電子媒介物甲基紫晶(MV2+)和酶(鐵氧化還原酶FDR或硫辛酰胺脫氫酶LipDH)存在下將NAD+還原為NADH。這些方法都存在著嚴(yán)重的不足光敏劑Ru(bpy)32+和Zn-TMPy4+在光體系下極不穩(wěn)定，易發(fā)生光降解；TiO2雖然在光體系下很穩(wěn)定，而且無毒、價格便宜，但TiO2是寬禁帶半導(dǎo)體，只能被波長較短的紫外光(λ＜387nm)激發(fā)，而這部分光只占到太陽光的8％，能量利用率低；CdS雖然能夠被可見光激發(fā)，但它在光體系下易發(fā)生光腐蝕；電子媒介物MV2+是有毒物質(zhì)，容易污染產(chǎn)物，且MV+具有很強(qiáng)的還原性，不僅能將NAD+還原，在有些情況下還能將酶促合成的產(chǎn)物還原。將無機(jī)半導(dǎo)體顆粒CdS直接與氫化酶的活性中心相連接，使電子直接在酶與半導(dǎo)體間傳遞雖然可以避免使用甲基紫晶，但氫化酶價格昂貴且不穩(wěn)定，而且將CdS與其活性中心相連的反應(yīng)過程復(fù)雜。此外，上述方法都需要有酶的參與，從而再生的成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種輔酶NADH的光化學(xué)再生方法。該方法過程簡單，再生成本較低。
本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。以可見光或紫外光為光源，實(shí)現(xiàn)輔酶NADH的光化學(xué)再生方法，其特征在于以1mol輔酶NAD+為基準(zhǔn)，加入1～5mol的水、抗壞血酸、甲酸鈉、EDTA或巰基乙醇電子供體，加入0.4～2.5mol的銠金屬絡(luò)合物[Cp*Rh(bpy)(H2O)]，加入含碳量為18.3～49.2％的100～600mol的TiO2光催化劑，在溫度25～37℃，pH值在6.5～7.5條件下，反應(yīng)得到NADH。
本發(fā)明提出的光化學(xué)再生NADH的優(yōu)點(diǎn)在于含碳的TiO2能吸收可見光，與摻雜貴金屬(Mo、Co、Pt)以降低TiO2激發(fā)能的方法相比，摻碳的方法更為簡單，成本較低，是一種新型材料，此前從未用于NADH的再生；NADH的光化學(xué)再生在可見光照射下進(jìn)行，能量利用率高，而且避免了紫外光對酶的影響；不需要有毒電子媒介物甲基紫晶的參與；不需要酶的參與，不僅降低了成本，而且避免了再生酶與合成酶最適條件不同而使體系難以控制的弊病。


圖1為NADH純品的質(zhì)譜圖。
圖2為NAD+純品的質(zhì)譜圖。
圖3為反應(yīng)產(chǎn)物混合物的質(zhì)譜圖，圖3中豐度在710.2處為產(chǎn)物NADH的特征峰。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一分別稱取80mg含碳量分別為0、18.3％、27.5％、39.7％和49.2％的五種TiO2催化劑，在T＝37℃、pH＝6.5下進(jìn)行光照實(shí)驗(yàn)，[Cp*Rh(bpy)(H2O)]2+起始濃度為0.2mM，NAD+起始濃度0.2mM，反應(yīng)總體積為50mL，反應(yīng)進(jìn)行11小時。
(1)在λ≤365nm(紫外光)光照下反應(yīng)。
(2)在λ≥400nm(可見光)光照下反應(yīng)。
產(chǎn)物NADH由質(zhì)譜進(jìn)行定性測量，NADH的特征峰為733.2、732.3和710.2；由于NADH在340nm處有強(qiáng)吸收，因此NADH的濃度由紫外-可見分光光度計(jì)測量。每次取樣0.6mL，稀釋至3mL后在紫外-可見分光光度計(jì)上測量340nm處的吸光度。
實(shí)施例二稱取80mg含碳量49.2％的TiO2樣品，在λ≥400nm(可見光)光照下反應(yīng)，反應(yīng)體積為50mL。通過測量反應(yīng)10h后NAD+的轉(zhuǎn)化率，考察了pH值、反應(yīng)溫度、NAD+濃度、[Cp*Rh(bpy)(H2O)]2+濃度等反應(yīng)條件對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響。反應(yīng)條件及NAD+轉(zhuǎn)化率列于下表表1 反應(yīng)體系pH值對NAD+轉(zhuǎn)化率的影響序號pH T/℃NAD+濃度/mM 銠絡(luò)合物濃度/mMNAD+轉(zhuǎn)化率％1 6.031 0.2 0.2 39.92 6.531 0.2 0.2 25.83 7.031 0.2 0.2 17.84 7.531 0.2 0.2 14.35 8.031 0.2 0.2 11.2表2 溫度對NAD+轉(zhuǎn)化率的影響序號pH T/℃NAD+濃度/mM 銠絡(luò)合物濃度/mMNAD+轉(zhuǎn)化率％1 6.525 0.2 0.2 11.22 6.528 0.2 0.2 17.03 6.531 0.2 0.2 25.8
4 6.534 0.2 0.2 39.05 6.537 0.2 0.2 57.4表3 NAD+濃度對NAD+轉(zhuǎn)化率的影響序號pH T/℃NAD+濃度/mM 銠絡(luò)合物濃度/mMNAD+轉(zhuǎn)化率％1 6.531 0.1 0.2 19.82 6.531 0.2 0.2 25.83 6.531 0.3 0.2 30.54 6.531 0.4 0.2 33.35 6.531 0.5 0.2 34.2表4[Cp*Rh(bpy)(H2O)]2+濃度對NAD+轉(zhuǎn)化率的影響序號pH T/℃NAD+濃度/mM 銠絡(luò)合物濃度/mMNAD+轉(zhuǎn)化率％1 6.531 0.2 0.1 15.72 6.531 0.2 0.2 25.83 6.531 0.2 0.3 34.14 6.531 0.2 0.4 38.95 6.531 0.2 0.5 40.9本發(fā)明采用含碳TiO2和銠金屬絡(luò)合物為催化劑，以可見光或紫外光為光源，實(shí)現(xiàn)了輔酶NADH的再生，實(shí)驗(yàn)中，NAD+的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到57.4％。
權(quán)利要求
1 一種輔酶NADH的光化學(xué)再生方法，該方法是以可見光或紫外光為光源，實(shí)現(xiàn)輔酶NADH的光化學(xué)再生，其特征在于以1mol輔酶NAD+為基準(zhǔn)，加入1～5mol的水、抗壞血酸、甲酸鈉、EDTA或巰基乙醇電子供體，加入0.4～2.5mol的銠金屬絡(luò)合物，加入含碳量為18.3～49.2％的100～600mol的TiO2光催化劑，在溫度25～37℃，pH值在6.5～7.5條件下，反應(yīng)得到NADH。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種輔酶NADH的光化學(xué)再生方法。屬于輔酶再生技術(shù)。以可見光或紫外光為光源，實(shí)現(xiàn)輔酶NADH的光化學(xué)再生方法，其特征在于以含碳的TiO
文檔編號C12N9/00GK1597940SQ20041002022
公開日2005年3月23日 申請日期2004年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月3日
發(fā)明者姜忠義, 吳洪, 呂陳秋 申請人:天津大學(xué)